Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Evaluering af Synaptic mangfoldighed ved hjælp af hele-celle Patch-klemme Elektrofysiologi

Published: April 23, 2019 doi: 10.3791/59461

Summary

Vi præsenterer her, en protokol for at vurdere den funktionelle synaptic mangfoldighed ved hjælp af hele-celle patch klemme Elektrofysiologi i akut hjernen skiver.

Abstract

I det centrale nervesystem, et par af neuroner ofte danner flere synaptic kontakter og/eller funktionelle neurotransmitter frigivelse sites (synaptic mangfoldighed). Synaptic multipliciteten er plast og ændringer i hele udvikling og i forskellige fysiologiske betingelser, er en afgørende faktor for effekten af synaptisk transmission. Her, skitsere vi eksperimenter til vurdering af graden af mangfoldighed af synapser afslutning på en given postsynaptiske neuron bruger hele-celle patch klemme Elektrofysiologi i akut hjernen skiver. Specifikt, bruges spænding-clamp optagelse til at sammenligne forskellen mellem amplitude af spontan excitatoriske postsynaptiske strømme (sEPSCs) og miniature excitatoriske postsynaptiske strømme (mEPSCs). Teorien bag denne metode er, at afferente indgange, der udviser mangfoldighed vil vise store, aktionspotentialet-afhængige sEPSCs på grund af den synkrone udgivelse, der opstår på hver synaptic kontakt. Derimod vil aktionspotentialet-selvstændig frigivelsen (som er asynkron) generere mindre amplitude mEPSCs. Denne artikel beskriver et sæt af forsøg og analyser til at karakterisere eksistensen af synaptic mangfoldighed og omhandler de krav og begrænsninger af teknikken. Denne teknik kan anvendes til at undersøge, hvordan forskellige adfærdsmæssige, farmakologiske eller miljømæssige interventioner i vivo påvirker organisationen af synaptic kontakter i forskellige hjernen områder.

Introduction

Synaptisk transmission er en grundlæggende mekanisme for kommunikation mellem neuroner, og dermed hjernens funktion. Synaptisk transmission er også labil og kan ændre dens effekt i en aktivitet-afhængige måde så godt som reaktion på modulerende signaler1. Således har undersøgelse synaptiske funktion været et centralt fokus for neuroscience research. Hele-celle patch klemme Elektrofysiologi er en alsidig teknik, der gør det muligt for os at forstå, ved udtænke eksperimentelle design og dataanalyse, dybdegående biofysiske og molekylære mekanismer af synaptisk transmission. Et almindeligt anvendte tilgang, måske på grund af enkelheden i den teknik og koncept, er måling af miniature excitatoriske/hæmmende postsynaptiske strømme (mig / IPSCs) under spændingen klemme konfiguration2,3, 4 , 5 , 6. individuelle mPSCs repræsenterer strømmen af ioner gennem postsynaptiske ionotropic receptorer (fx AMPA og GABA-A receptorer) som svar på bindingen af deres respektive neurotransmittere frigivet fra den præsynaptiske terminal 7 . Fordi optagelsen er fremstillet i overværelse af spænding-gated Na+ kanal blokker tetrodotoxin (TTX), frigivelse er aktionspotentialet-uafhængig og indebærer normalt en enkelt synaptic vesikel, der indeholder neurotransmitter. Baseret på denne antagelse, er den gennemsnitlige amplitude af mPSCs meget udbredt som et groft estimat for quantal størrelse, som repræsenterer nummer og funktionalitet af postsynaptiske receptorer imod en enkelt udgivelse site. På den anden side anses hyppigheden af mPSCs for at repræsentere en kombination af det samlede antal synapser afslutning på den postsynaptiske celle og deres gennemsnitlige release sandsynlighed. Men disse parametre ikke måle en anden variabel-multiplicativity synapser, eller synaptic mangfoldighed — som er vigtige for effektiviteten af synaptisk transmission.

Baseret på den quantal teori om synaptisk transmission7,8,9, styrken af en given forbindelse mellem et par af neuroner er afhængig af tre faktorer: antallet af funktionelle synapser (N), den postsynaptiske reaktion på frigivelsen af en enkelt synaptic vesikel (quantal størrelse; Q) og sandsynligheden for neurotransmitter frigivelse (Pr). Synaptic multipliciteten er svarende til N. Udviklingen af synaptic mangfoldighed eller beskæring af multiplikativ synapser er plast i hele udvikling og i forskellige sygdom stater3,4,6,10. Derfor har karakteriserer synaptic mangfoldighed stor betydning for at forstå effekten af synaptisk transmission i sundhed og sygdom. Teknikker, såsom elektronmikroskopi kan identificere strukturelle beviser synaptic mangfoldighed ved at afsløre flere synaptic kontakter med oprindelse fra den samme axon på samme postsynaptiske neuron11,12, 13,14. Disse strukturelt identificerede multisynapses kan dog være funktionelt tavse15,16. Præcise funktionelle undersøgelse af N kræver teknisk udfordrende elektrofysiologiske tilgange, såsom parrede hele-celle optagelser, der kan identificere, om en given forbindelse har flere funktionelle frigivelse sites og minimal stimulation tilgange, der har til formål at rekruttere en enkelt formodede axon.

I denne protokol beskriver vi en simpel metode til vurdering af synaptic mangfoldighed ved at vedtage en metode, oprindeligt udviklet af Hsia mfl2. Denne teknik indebærer måling af spontan PSC'er (sPSCs) og mPSCs ved hjælp af hele-celle patch klemme Elektrofysiologi, som tillader os at vurdere graden af synaptic mangfoldighed på tværs af alle indgange til en given neuron.  Som tidligere definerede, synaptic mangfoldighed afspejler antallet af synapser mellem en given præ- og postsynaptiske neuron. Hvis flere synapser rekrutteres i synchrony af en handling potentiale, vil der være stor sandsynlighed for temporal summation af individuelle (dvs. quantal) PSC'er, generere en større amplitude PSC.  I mPSC optagelser (i hvilken handling potentialer er blokeret af TTX), sandsynligheden for temporal summation af individuelle (ikke-synkron) mPSCs er lavt. Ved hjælp af denne logik, kan synaptic mangfoldighed estimeres ved at sammenligne sPSC amplitude (med aktionspotentialet-afhængige release) til mPSC amplitude.

For at undersøge forekomsten af mangfoldighed beskrive vi fire eksperimenter og deres analyser ved hjælp af glutamatergic EPSCs som eksempel. Men samme tilgang kan bruges til hurtigt GABAergic/glycinergic transmission (IPSCs). En kort begrundelse for hvert forsøg er beskrevet nedenfor. Først, som forklaret ovenfor, synaptic mangfoldighed kan estimeres ved at sammenligne amplitude af sEPSCs til mEPSCs. Der er to krav for denne fremgangsmåde; 1) præsynaptiske axoner skal fyre et tilstrækkeligt antal handling potentialer under optagelsen, og 2) Pr skal være høj, så flere synapser frigive neurotransmitter ved ankomsten af en aktionspotentialet. For at opfylde disse krav, er sEPSCs først indspillet i lave Ca2 + kunstige cerebrospinalvæske (aCSF), og derefter optaget i overværelse af en lav koncentration af K+ kanal antagonist, 4-Aminopyridine (4-AP) at øge handling potentielle fyring og Pr. Derefter er aktionspotentialet fyring blokeret af TTX og Pr faldt med en spænding-gated Ca2 + -kanal blokker Cd2 +. Amplituden af sEPSCs (med 4AP) er sammenlignet med mEPSC (med 4AP, TTX og Cd2 +). I det andet forsøg, er Ca2 + erstattet af equimolar Sr2 + i aCSF til desynchronize vesikel frigivelse. Som Ca2 + er påkrævede til synkron udgivelsen af vesikler, bør udskiftning med Sr2 + fjerne de store amplitude sEPSCs, der er vejledende for mangfoldighed. Tredje, mekanisk, mangfoldighed kan skyldes enten flere synaptic kontakter til samme postsynaptiske neuron eller multivesicular release (dvs. flere vesikler frigivet inden for en enkelt synaptic kontaktperson)17,18. For at skelne mellem de to typer af mangfoldighed, bruger den tredje eksperiment en lav affinitet, hurtig miljøomkostningerne konkurrencedygtige antagonist af AMPA-receptorer, γ-D-glutamylglycine (γ-DGG)17,18 at afgøre, om store sEPSC er resultatet af den temporal summation af uafhængige synapser eller multivesicular release handler på en overlappende befolkning af postsynaptiske receptorer. Hvis de store amplitude begivenheder opstår fra multivesicular release, bliver γ-DGG mindre effektive til at hæmme større i forhold til mindre sEPSCs, store sEPSCs, der opstår fra den temporal summation af flere synaptic kontakter vil ligeledes berøres af Γ-DGG. I den fjerde eksperiment bruges en mere fysiologiske metode til at forbedre aktionspotentialet fyring, nemlig afferente synaptic stimulation. Byger af synaptic aktivitet kan forbigående stigning/lette spontan aktionspotentialet fyring og frigivelse sandsynligheden for den stimuleret afferenter. Derfor, denne tilgang giver mangfoldighed til at manifestere i en mere fysiologisk måde.

Følgende protokol beskriver metoden til at gennemføre disse forsøg i mus hypothalamus væv. Specifikt, anvendes corticotropin frigive hormon (CRH) neuroner i paraventricular kernen i hypothalamus (PVN). Vi beskriver procedurer til at gennemføre hele-celle patch klemme Elektrofysiologi og forklare de konkrete eksperimenter til test af synaptic mangfoldighed.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøg er godkendt af animalsk omhu Udvalget af The University of Western Ontario i overensstemmelse med den canadiske Rådet om dyrs pleje retningslinjer (op #2014-031).

1. løsninger

  1. Udskæring løsning
    1. Se tabel 1 for sammensætningen af den udskæring løsning.
    2. Forberede en 20 x stamopløsning på forhånd og gemme det ved 4 ° C i op til 1 måned.
    3. 1 x udskæring løsning, opløses NaHCO3, glucose og saccharose i ddH2O og tilsættes 20 x lager. Sikre osmolaritet er mellem 315-320 mOsm og gemme løsningen for ikke mere end 1 uge ved 4 ° C.
    4. Fylde to bægre med 100 mL udskæring løsning og dække dem med parafilm. Chill løsning i en fryser, indtil løsningen bliver delvis frosset (ca. 20 min. i-80 ° C fryser). Ved hjælp af en gas dispersion tube, boble begge bægerglas af udskæring løsning med 95% O2/5% CO2 i 20 min. på is.
Løsning koncentrationer (mM)
Udskæring Normal aCSF Lav Ca2 + aCSF SR+ aCSF Pipette/intern
NaCl 87 126 126 126 -
KCl 2.5 2.5 2.5 2.5 8
CaCl2 0,5 2.5 0,5 - -
SrCl2 - - - 2.5 -
MgCl2 7 1.5 2.5 1.5 2
NaH2PO4 1,25 1,25 1,25 1,25 -
NaHCO3 25 26 26 26 -
Glukose 25 10 10 10 -
Saccharose 75 - - - -
K-gluconat - - - - 116
Na-gluconat - - - - 12
HEPES - - - - 10
K2-EGTA - - - - 1
K2ATP - - - - 4
Na3GTP - - - - 0,3

Tabel 1: Sammensætningen af forskellige løsninger.

  1. aCSF (for skive genopretning og vedligeholdelse)
    1. Se tabel 1 for sammensætningen af aCSF.
    2. Forberede en 20 x stamopløsning på forhånd og gemme det ved 4 ° C i op til 1 måned.
    3. 1 x aCSF, opløse NaHCO3 og glucose i ddH2O og Tilføj 20 x lager. Sikre osmolaritet er mellem 298-300 mOsm. Brug løsning inden for 1 døgn.
  2. aCSF (lav Ca2 + til optagelse)
    1. Se tabel 1 for sammensætningen af den lave Ca2 + aCSF.
    2. Forberede en 20 x stamopløsning på forhånd og gemme det ved 4 ° C i op til 1 måned.
    3. For 1 x lave Ca2 + aCSF, opløses NaHCO3 og glucose i ddH2O og tilsættes 20 x (CaCl2 og MgCl2 gratis) bestand, CaCl2 og MgCl2 til angivet koncentrationer. Sikre osmolaritet er mellem 298-300. Brug løsning inden for 1 døgn.
  3. aCSF (Sr2 + til optagelse)
    1. Se tabel 1 for sammensætningen af Sr2 + aCSF.
    2. Forberede en 20 x stamopløsning på forhånd og gemme det ved 4 ° C i op til 1 måned.
    3. For 1 x Sr2 + aCSF, opløses NaHCO3 og glucose i ddH2O og tilsættes 20 x (CaCl2 og MgCl2 gratis) bestand, SrCl2 og MgCl2 til angivet koncentrationer. Sikre osmolaritet er mellem 298-300. Brug løsning inden for 1 døgn.
  4. Intern løsning
    1. Se tabel 1 for sammensætningen af K-gluconat baseret indre løsning.
    2. For at gøre 20 mL intern standardopløsning, skal du tilføje 15 mL vand af Molekylærbiologisk Institut til en 50 mL tube. Udføre de efterfølgende skridt på isen.
    3. Forbered de følgende løsninger før tid til 1 M stock koncentrationer i molekylær biologi klasse vand. Tilføje (i mL): 2.32 K-gluconat, 0,24 Na-gluconat, 0,20 HEPES, 0,16 KCl, 0,05 K2-EGTA, 0,04 MgCl2 til 50 mL tube.
    4. Tilsæt 100 µL af 0,3 M Na3GTP.
    5. Vejer 44.08 mg K2ATP i et 2 mL microcentrifuge rør og tilsættes 1 mL vand af Molekylærbiologisk Institut, derefter tilføje til 50 mL tube.
    6. PH indstilles til 7.2-7.4 med 1 M KOH. Sikre osmolaritet er mellem 283-289 mOsm.

2. skive forberedelse

  1. Forberede værktøjer
    1. 200 mL aCSF tilsættes til recovery salen (fremstillet af et 250 mL baegerglas med 4 brønde og netting) og placere opsving kammer i et vandbad (35 ° C).
    2. Dække kammer med en paraffin film og konstant boble i aCSF med 95% O2/5% CO2 ved hjælp af en dispersion glasrør i mindst 20 min.
    3. Forberede dissektion ved at oprette værktøjer (skalpel, vinklet fine saks, pincet, fin pensel, plast skeen).
    4. Fyld en 60 mL sprøjte med ca. 15 mL iskold udskæring løsningen fra trin 1.1.4.
    5. Forberede dissektion platform ved at placere et filtrerpapir på låget af en godt plade.
    6. Forberede den udskæring kammer ved at placere det i bakken is og fylde bakken med is.
    7. Oprettet af vibratome ved at sikre en engangs klinge i klingeholderen.
    8. Foretage en overførsel pipette ved at bryde spidsen af Pasteur pipette og placere en gummi pære over den knækkede ende.
  2. Dissekere mus hjernen
    1. Bedøver dyret i et kammer, mættet med 4% isofluran indtil spinale reflekser er fraværende.
    2. Hug hovedet af dyret ved hjælp af en guillotine og hurtigt fjerne hjernen.
      1. Gøre en midterlinjen snit med en No. 22 skalpel blade fra rostralt til caudale.
      2. Sideværts skræl hovedbunden på hver side af hovedet.
      3. Brug fine saks til at klippe kraniet på den ene side fra caudale til rostralt (herunder siden af de frontale knogler), ved hjælp af forsigtighed ikke for at skade hjernen.
      4. Brug pincet til at løfte kraniet stykke fra hjernen og cool hurtigt hjerne med 15 mL iskold udskæring løsning ved hjælp af sprøjte fra trin 2.1.4.
      5. Løft hjernen ud af kraniet.
      6. Sted hjerne i en af bægre fyldt med iskolde udskæring løsning (fra trin 1.1.4) boblede med 95% O2/5% CO2.
  3. Forberede skiver af musen hypothalamus
    1. Blokere hjerne for ønskede hjernen område og skære vinkel (f.eks. for koronale hypothalamus skiver, trim off væv rostralt for den optiske chiasm og caudale pons ved hjælp af en vinge og sikre den caudale blok har en flad overflade vinkelret på bunden af hjernen).
    2. Ved hjælp af et snit stykke filtrerpapir, afhente hjernen fra den forreste side og lim den bageste side til bedriften pladen ved hjælp af instant lim.
    3. Hurtigt bedriften pladen anbringes i udskæring kammer og fylde salen med udskæring løsning fra det andet bægerglas taktfast 1.1.4.
    4. Sikre den udskæring kammer og ice bakke på vibratome.
    5. Definere den udskæring område (anterior og posterior til hjernen) og begynde udskæring 250 µm tykkelse koronale skiver. Anbefalede parametre: hastighed 0,10 mm/s, amplitude 2 mm.
    6. Trim skiver til en passende størrelse til området ønskede hjernen.
    7. Genskab skiver ved 35 ° C i 30-45 min. Derefter fjerne opsving salen fra opvarmning badet og tillader skiver til at inddrive ved stuetemperatur i en yderligere 30 min. hold skiver ved stuetemperatur for resten af dagen og fortsætte til boble bad hele tiden med 95% O2/5% CO2 .

3. hele-celle Patch ClampRecording

  1. Trække patch pipetter
    1. Ved hjælp af de anbefalede parametre for hele-celle optagelse fra pipette puller manual, trække patch pipetter fra tyk walled glas til en pipette modstand af 3-5 MΩ.
    2. Ved hjælp af mikrosprøjte (kommercielle eller hjemmelavet), Fyld en pipette tip med filtreret intern løsning. Mikrosprøjte, brænde spidsen af en 1 mL sprøjte og tillade tip at falde skaber en lang fine tip.
  2. Få det hele-celle konfiguration
    1. Placere optagelse pipette lige over den skive og offset pipette nuværende i spænding klemme tilstand. Gælde pipetten lille overtryk og låse hanen.
    2. Vælg en sund celle med en intakt membran og tilgang celle med en pipette. De overtryk bør medføre en mindre forstyrrelse i væv (dvs. en langsom bølge i væv ved indtastning af).
    3. Langsomt fortsætte med at bringe pipette tættere til cellen ved hjælp af en diagonal bevægelse, indtil pipetten danner en lille dimple på cellens overflade.
    4. Frigøre det overtryk. Cellen vil begynde at danne en forsegling og modstanden vil stige over 1 GΩ. I spænding klemme, holde cellen ved-68 mV.
    5. Træk lidt væk fra cellen diagonalt til at fjerne overskydende pres fra cellen.
    6. Kompensere for den hurtige og langsomme pipette kapacitans.
    7. Anvend et kort sugning gennem røret tilsluttet pipette indehaveren til at bryde igennem cellen og få hele-celle konfiguration.
    8. Skift til celle mode på membranen test vindue i en Elektrofysiologi dataopsamling og analyse software (f.eks. Clampex).
    9. Før hver spænding klemme optagelse, udføre en membran test benytter den samme software og registrere de relevante parametre i en lab bog (membran modstand, adgang modstand og kapacitans).
    10. Holde temperaturen af optagelse bad ved 27-30 ° C og strømningshastighed på 1,5-2,0 mL/min. for efterfølgende forsøg.

4. mangfoldighed eksperimenter

  1. Eksperiment 1: estimering af mangfoldighed ved hjælp af 4-AP
    1. I spænding klemme, holde cellen ved-68 mV. Benytter den samme software, optage sEPSCs mens perfusing bad med lav Ca2 + aCSF. Rekord for mindst 5 min efter start af hele-celle konfiguration for at sikre en stabil basislinje optagelse som synaptic aktiviteten kan være høje kort efter gennembrud af membranen.
    2. Med en mikropipette, tilføje 4-AP til aCSF og bad anvende 30 µM 4-AP. posten sEPSCs i mindst 10 min at opnå fuld drug virkning.
    3. Tilsæt 0,5 µM TTX og 10 µM Cd2 + til aCSF med 4-AP og registrere mEPSCs i mindst 10 min.
    4. Brug den sidste 1 min af baseline umiddelbart før anvendelsen af 4-AP (i lave Ca2 + aCSF), 10 min af 4-AP ansøgning og 10 min af TTX ansøgning til offline analyse.
  2. Eksperiment 2: desynchronize vesikel release ved hjælp af Sr2 +
    1. Mens perfusing bad med normal Ca2 + aCSF (det samme som badekar aCSF) optage sEPSCs i mindst 5 min.
    2. Skifte fra den normale Ca2 + aCSF og begynder perfusing Sr2 + aCSF (fra trin 1.4) og optage sEPSCs.
    3. For offline analyse, for at afgøre, om de store amplitude sEPSCs på grund af den synkrone frigivelse af vesikler, sammenligne de sidste 1 min af baseline (i normal aCSF) til 10th minut af Sr2 + aCSF ansøgning.
  3. Eksperiment 3: test for multivesicular frigivelse ved hjælp af Γ- DGG
    1. I lave Ca2 + aCSF optage sEPSCs i mindst 5 min.
    2. Tilføje 30 µM 4-AP til aCSF gennem perfusion system. Optage sEPSCs i mindst 10 min.
    3. Tilføje 200 µM γ-DGG til aCSF med 4-AP og registrere sEPSCs i mindst 10 min.
    4. Som et kontrol-eksperiment i en separat celle, skal du udføre trin 1-3 men anvender en lav koncentration (125 nM) af DNQX i stedet for γ-DGG.
    5. Offline analyse, analysere de sidste min af hver enkelt drug application.
  4. Eksperiment 4: Stimulere afferente input for at øge aktionspotentialet fyring.
    1. Optage sEPSCs i normale Ca2 + aCSF.
    2. Stimulere afferenter ved hjælp af en monopolære glas elektrode fyldt med aCSF med en sats på 20 Hz for 2 s og Gentag 10 gange med et indbyrdes brast interval på 20 sek.
    3. For analyse, bruge 5.000 ms før den første stimulus som baseline og sammenligne med 10-300 ms efter den endelige stimulus og derefter tage den gennemsnitlige amplitude og frekvens Skift over 10 forsøg.

5. analyse

  1. Analysere sEPSCs og mEPSCs ved hjælp af et program, der registrerer og analyserer synaptic strømme (f.eks. Mini analyse software).
    1. Brug af denne software, bruge foreslåede påvisning parametre til påvisning af AMPA-receptoren EPSCs (eller GABA Receptor EPSCs hvis du optager hæmmende strømninger).
    2. Brug Nonstop analyse funktion til at registrere EPSCs i optagelsen.
    3. Manuelt scanne hver optagelse for at sikre, at programmet er præcist afsløre hver begivenhed (f.eks. sikre begivenheder ikke bliver savnet eller talt to gange).
    4. Eksporter begivenhed data ved at kopiere det til Udklipsholder og indsætte det i et data management software (fx Excel)
    5. Beregner den gennemsnitlige hyppighed og/eller amplitude for hver behandling og udføre de relevante statistiske analyser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den ovennævnte protokol beskriver en metode til at bruge hele-celle patch klemme Elektrofysiologi for at undersøge graden af synaptic mangfoldighed, ved hjælp af musen hypothalamus neuroner som eksempel. Denne skive forberedelse teknik bør give sunde levedygtige celler, der ikke har en opsvulmede membran eller kerne (figur 1). Hvert trin i protokollen er vigtig for sundheden for væv og kvaliteten af optagelserne.

Figure 1
Figur 1: sund og usundt væv følgende skær forberedelse. Skær Elektrofysiologi forberedelse af PVN under differential interferens kontrast optik på 40 x forstørrelse. Rød pilespidser angive raske celler, og sort pilespidser angive usunde celler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2 illustrerer rationale for at identificere synaptic mangfoldighed ved hjælp af patch klemme Elektrofysiologi. Synaptic mangfoldighed kan skyldes enten flere synaptic kontakt mellem et par af neuroner (figur 2A venstre) eller ved multivesicular udgivelse på en given synaptic websted (figur 2A til højre). I begge disse situationer, ville en handling potentiale i det præsynaptiske neuron fremkalde et stort postsynaptiske svar (sEPSC) på grund af den tidsmæssige summation af flere synaptic begivenheder. Men i mangel af præsynaptiske handling potentialer (f.eks. tilstedeværelse af TTX og Cd2 + til at blokere for Na+-afhængige og Ca2 +-afhængige aktionspotentialet fyring), vesikulær neurotransmitter frigivelse er asynkron. Som et resultat, den postsynaptiske svar bliver mindre (figur 2B: AP-uafhængig). Hvis to neuroner ikke udviser mangfoldighed (dvs. har kun én synaptic kontakt/nej multivesicular release) der vil være nogen forskel i den postsynaptiske svar aktionspotentialet-afhængige og aktionspotentialet-selvstændig frigivelsen af neurotransmitter (figur 2 c).

Figure 2
Figur 2: Skematisk diagram illustrerer konsekvenserne af forskellige synaptic organisationer på postsynaptiske strømninger. (A, B) I en synapse med mangfoldighed, en aktionspotentialet og den efterfølgende Ca udløser2 + tilstrømning synkron fusion af flere synaptiske vesikler, der resulterer i store, multiquantal EPSCs. Synaptic mangfoldighed kan skyldes multisynapse kontakt eller multivesicular release på en enkelt synapse (A). Idet TTX og Cd2 +, aktionspotentialet-uafhængig vesikel fusion er asynkron og forårsager små uniquantal EPSCs (B). (C) i synapser uden mangfoldighed, både aktionspotentialet-afhængig og -uafhængig vesikel fusion resulterer i uniquantal EPSCs. Dette tal er blevet ændret fra figur 1A af vores forrige rapport6. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

I forsøg 1 anvendes 4-AP til bad at øge aktionspotentialet fyring og frigive sandsynlighed. For at sikre, at 4-AP er stigende spontan aktionspotentialet fyring, kan hyppigheden af EPSCs sammenlignes mellem sEPSCs og mEPSCs (figur 3A, C). Fordi sEPSCs er en kombination af både aktionspotentialet-afhængig og -uafhængig begivenheder, fungerer forskel i hyppigheden af sEPSC og mEPSC som en proxy for spontan aktionspotentialet fyring i de præsynaptiske axoner. Vi bruge en vilkårlig cut off > 15% forskel i hyppigheden mellem sEPSC til mEPSC til at sikre, at et tilstrækkeligt antal aktionspotentialet-afhængige begivenheder er til stede til analyse af mangfoldighed. Hvis EPSCs i den lave Ca2 + tilstand og betingelsen TTX (mEPSC) er ens i frekvens og amplitude (dvs. ingen spontan aktionspotentialet fyring i den lave Ca2 + betingelse), forskellen mellem lav Ca2 + baseline sEPSC og 4 -AP kan også bruges til analyse af mangfoldighed.

I et eksempel øger resultatet vist i figur 3, 4-AP både amplitude og frekvens af sEPSCs. Efterfølgende anvendelse af TTX og Cd2 + falder både amplitude og frekvens. Som beskrevet ovenfor, angiver forskellen i amplitude mellem sEPSCs og mEPSCs synaptic mangfoldighed. I hypothalamus neuroner vi undersøger her, amplitude og frekvens af baseline og TTX betingelser er de samme (figur 3 c, D), tyder på, at de oprindelige sEPSCs indeholder meget få aktionspotentialet-afhængige EPSCs. Derfor kan efterfølgende eksperimenter sammenligne forskellen mellem baseline og 4-AP til at måle mangfoldighed.

Figure 3
Figur 3:. 4-AP ansøgning afslører synaptic multiplicitet. (A) prøve spor af sEPSCs indspillet i lave Ca2 + aCSF under grundlinjen, og efter 4-AP (30 μM) ansøgningen, og efterfølgende TTX (0,5 μM) og Cd2 + (10 μM)-program. (B) fordelingen af sEPSC amplitude fra optagelse vist i (A). (C, D) Sammendrag af den gennemsnitlige hyppighed (C) og amplitude (D) mellem baseline (grå), 4-AP (rød) og TTX + Cd2 + (blå). P < 0,005, ** P < 0,01. Dette tal er blevet ændret fra figur 2 af vores forrige rapport6. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Den ovenfor beskrevne metode estimerer den gennemsnitlige mangfoldighed af synapser afslutning på de postsynaptiske neuroner: det kan ikke registrere ændringer i mangfoldighed, der opstår en lille andel af synapser. Ikke desto mindre, i vores undersøgelse for nylig, denne metode afslørede, ændringer i mangfoldigheden af glutamat synapser på hypothalamus neuroner mellem normal og kronisk stressede forhold6.

Substitution af Ca2 + med equimolar Sr2 + i aCSF desynchronizes aktionspotentialet-afhængige frigivelse af neurotransmitter vesikler 19, 20. Derfor, hvis store amplitude sEPSCs er summen af aktionspotentialet-afhængige synkroniserede vesikulære neurotransmitter frigivelse (dvs. mangfoldighed), erstatte Ca2 + med Sr2 + vil falde amplitude af EPSCs. Som det ses i figur 4, Sr2 + aCSF falder andelen af stor amplitude begivenheder (figur 4B), og som følge heraf falder den gennemsnitlige amplitude (figur 4 c). Når cellerne ikke udviser mangfoldighed, vil desynchronizing vesikel frigivelse have nogen virkning på EPSC amplitude.

Figure 4
Figur 4: Sr2 + desynchronizes store multiquantal begivenheder. (A) repræsentative trace sammenligning mellem normal Ca2 + aCSF og Sr2 + aCSF. SR2 + aCSF desynchronizes vesikel frigivelse og reducerer amplitude af multiquantal synkrone hændelser, som det ses i en repræsentativ amplitude distribution (B) og amplitude ændringen for alle celler (C) * P < 0,05. Dette tal er blevet ændret fra figur 3 af vores forrige rapport6. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Γ-DGG, en hurtig dissociating konkurrencedygtige antagonist af AMPA-receptorer, kan bruges til at afgøre, om mangfoldighed er på grund af den multivesicular release eller flere synaptic kontakter. Multivesicular release handlinger på en overlappende befolkning af postsynaptiske receptorer, stor amplitude EPSCs indebærer en sammenlægning af glutamat i den synaptiske kløft. Med andre ord, er koncentrationen af glutamat i den synaptiske kløft højere end det, som resulterer fra uniquantal release. På den anden side ville multisynaptic kontakter have uniquantal EPSCs paa enhver synaptic. Hvis den store amplitude EPSCs opstår fra multivesicular release, vil de større EPSCs mindre påvirket af γ-DGG antagonisme (på grund af højere glutamat koncentration) i forhold til mindre amplitude EPSCs (figur 5A højre, B-D). Hvis den store amplitude EPSCs skyldes summation af synkrone uniquantal EPSCs (multisynapse kontakter), påvirker γ-DGG ligeledes amplitude af alle EPSCs (figur 5A venstre, E-G). I modsætning til γ-IgG, DNQX, som er en høj affinitet, langsom miljøomkostningerne AMPA/kainate receptor antagonist forårsager en ensartet fald på tværs af alle store og lille amplitude EPSCs ()figur 5 H-J). Følsomheden over for γ-DGG og DNQX kan kvantificeres som forholdet mellem den gennemsnitlige EPSC amplitude divideret med maksimalt (gennemsnittet af de største 20 EPSCs) EPSC amplitude ()figur 5 K, L).

Figure 5
Figur 5: ved hjælp af γ-DGG for at sonde multivesicular release. (A) skemaer illustrerer to modeller af mangfoldighed. Venstre: temporal summation af uniquantal transmission, der er rettet mod uafhængige populationer af postsynaptiske receptorer. Store og små EPSCs er opnået ved en lignende glutamat koncentration i den synaptiske kløft og derfor er lige så følsomme over for γ-DGG. Højre: multiquantal transmission, der er rettet mod en overlappende befolkning af postsynaptiske receptorer. Store EPSCs er forårsaget af højere glutamat koncentration i kløft end mindre sEPSCs og er derfor mindre følsomme over for γ-DGG. Værdier, der vises nederst på model er hypotetiske relative amplituder. (B) prøve spor fra en optagelse, hvor der var en stigning på gennemsnitlig sEPSC amplitude efter 4-AP ansøgning (4-AP responder). (C) kumulativ plot for EPSC amplitude til optagelse vist i (B). (D) kumulativ plot for normaliserede EPSC amplitude (EPSC/EPSCMAX) før og efter anvendelsen af γ-DGG fra optagelse vist i (B). (E) prøve spor fra en optagelse, hvor var der ingen ændring i de gennemsnitlige sEPSC amplitude efter 4-AP ansøgning (4-AP ikke-responder). (F) kumulativ EPSC amplitude til optagelse vist i (E). (G) akkumuleret EPSC/EPSCMAX plot for optagelsen vises i (E). (H) prøve spor fra en optagelse fra baseline, samt efter 4-AP og DNQX anvendelse. (jeg) den kumulative EPSC amplitude til optagelse vist i (H). (J) kumulativ EPSC/EPSCMAX plot for optagelsen vises i (H). (K) Resumé af betyder EPSC/EPSCMAX efter γ-DGG (i 4-AP responder og ikke-responder grupper) eller DNQX ansøgning normaliseret til pre-γ-DGG/DNQX (dvs. post-4-AP). (L) Plots af post-4-AP betyde EPSC amplitude (normaliseret til pre-4-AP) mod post-γ-DGG/DNQX betyder EPSC/EPSCMAX (normaliseret til post-4-AP). P < 0,005. Dette tal er blevet ændret fra figur 4 af vores forrige rapport6. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Styrken af synaptisk transmission kan være forbigående steg med byger af synaptic aktivitet. For at undersøge mangfoldighed under flere fysiologiske tilstande, kan afferente stimulation bruges til at øge aktionspotentialet fyring og frigive sandsynlighed. Hvis multipliciteten er til stede, bør afferente stimulation medføre en kort stigning i EPSC amplitude (figur 6A-D). Hvis multipliciteten ikke er til stede, vil aktivitet drevet stigninger i aktionspotentialet fyring ikke øge EPSC amplitude.

Figure 6
Figur 6: højfrekvente stimulation afslører synaptic multiplicitet. (A) prøve spor af sEPSCs før og efter afferente synaptic stimulation. (B) plot af sEPSC amplitude før og efter synaptic stimulation (20 Hz, 2 s) fra optagelse vist i (A). (C, D) Resumé af sEPSC frekvens (C) og amplitude (D) ændringer efter synaptic stimulation. P < 0,001, * P < 0,05. Dette tal er blevet ændret fra figur 5 af vores forrige rapport6. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En vigtig forudsætning for en vellykket patch klemme Elektrofysiologi eksperiment er at opnå sund skiver/celler. Vores beskrevne protokol er optimeret til hypothalamus skiver, der indeholder PVN neuroner. Andre hjernen områder kan kræve modificerede løsninger og udskæring metoder21,22,23,24. For optagelsen, det er afgørende at kun acceptere stabile optagelser af konstant overvågning celleegenskaber såsom membran modstand, kapacitans og adgang modstand. En stigning i access modstand kan reducere EPSC amplitude og derfor forvirre amplitude målinger. Derfor er celler med adgang modstand værdier, der overstiger 20 MΩ eller stige med mere end 20% under optagelsen kasseret. På samme måde en nedgang i (eller en lav) membran modstand kan resultere i dårlig plads-clamp, og derfor kan nedsætte amplitude. Neuroner i vores målsystemet (parvocellular PVN neuroner) har en høj membran modstand mellem 500 MΩ og 1 GΩ, og vi kassere celler med membran resistenser under 500 MΩ. Kvalitetskontrol cut-offs bør fastsættes for specifikke typer for neuroner under undersøgelsen. Da denne protokol er baseret på forskellen i amplitude før og efter narkotika applikationer, er det vigtigt at sikre, at amplitude ændringen som følge af narkotika anvendelse og ikke til ændringer i membranen modstand og adgang modstand. Hypothalamus neuroner vi studere i denne protokol er små i størrelse (celle kapacitans er ca. 15 pF i mus og membran modstand er omkring 1 GΩ), og K-gluconat baseret indre løsning fungerer godt for at opnå høj kvalitet EPSCs/IPSCs6,25 . For neuroner med større Cellestørrelse og lav input modstand, kan cæsium baseret indre løsning bruges til at sikre en god plads-klemme2.

Et specifikt krav for at bruge denne metode til at måle mangfoldigheden er, at cellerne brand et tilstrækkeligt antal spontan handling potentialer for at sammenligne aktionspotentialet-afhængige begivenheder til mEPSCs. Dette kan sikres ved at sammenligne forskellen i hyppigheden af EPSCs i fravær og tilstedeværelsen af TTX og Cd2 +. I hypothalamus skiver, der indeholder PVN, har vi fundet, at anvendelsen af 4-AP er effektiv til at fremkalde aktionspotentialet fyring. En anden metode, banebrydende Hsia og kolleger2, bruger høj Ca2 + aCSF at øge aktionspotentialet fyring, i stedet for 4-AP. Mens denne metode lykkedes i hippocampus skiver, vi fandt, at den høje Ca2+ var mindre effektive end 4-AP i lette aktionspotentialet fyring i hypothalamus skiver6. Faktisk har været vist, at høj, ekstracellulære Ca2 + koncentrationen falder iboende ophidselse af neuroner og axoner ved at ændre Na+ ledningsevne26,27. Dette kan forklare, hvorfor i nogle skiver, høj Ca2 + aCSF er ikke effektiv til at øge EPSC frekvens.

En begrænsning af denne metode, der er forbundet til alle skive patch klemme Elektrofysiologi, er, at mange, langtrækkende fremskrivninger til de postsynaptiske neuroner er skåret i Skive præparater. For at observere handling potentialer, er det sandsynligt, at de præsynaptiske axoner og celle organer skal bevares i Skive. Derfor er mangfoldighed måling skæv synaptisk forbindelse, der er bevaret i Skive. Langs den samme linje, kan retning af udskæring forårsage visse bestande af fremskrivninger skal bevares, mens andre er afhuggede28. Disse begrænsninger har en generel virkning af undervurderer mangfoldighed af afferente indgange.

Den beskrevne protokol indeholder en metode til vurdering af graden af synaptic mangfoldighed på tværs af alle indgange til en given neuron. Andre Elektrofysiologi teknikker, som parret optagelser eller minimal stimulation af et enkelt axon kan identificere, om en given forbindelse har flere kontakter, men disse forsøg er ofte vanskelige og ikke muligt i alle systemer. Yderligere, de kan ikke give en samlet angivelse af organisationen af alle indgange til en given neuron som de isolere kun et par af neuroner. Denne protokol bruger grundlæggende patch-clamp Elektrofysiologi metoder til at vurdere graden af mangfoldighed på tværs af alle indgange til en given neuron.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at videregive

Acknowledgments

J.S. modtaget Ontario Graduate stipendium. W.I. modtog en ny efterforsker stipendium fra Mental Health Research Canada. Dette arbejde støttes af driftstilskud til W.I fra naturvidenskab og Engineering Research Council of Canada (06106-2015 RGPIN) og det canadiske Institut for sundhedsforskning (PJT 148707).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL syringe BD 309659
10 blade Fisher Scientific/others 35698
22 blade VWR/others 21909-626
22 μM syringe filters Milipore 09-719-000
Adson foreceps Harvard Instruments 72-8547
Angled sharp scissors Harvard Instruments 72-8437
Clampex Molecular Devices pClamp 10
Double edge blade VWR 74-0002
Filter paper Sigma/others 1001090
Fine paintbrush Fisher/various 15-183-35/various
Gas Dispersion Tube VWR LG-8680-120
Isoflurane Fresenius Kabi/others M60303
Krazy glue various various
Mini analysis Synaptosoft MiniAnalysis 6
Osmomoter Wescor Inc Model 5600
Parafilm Sigma PM-996
Pasteur pipette VWR 14672-200
ph meter Mettler Toledo FE20-ATC
Rubber bulb VWR 82024-550
Scalpel handle No. 3 Harvard Instruments 72-8350
Scalpel handle No. 4 Harvard Instruments 72-8356
Single edge blade VWR 55411-050
Vibratome slicer Leica VT1200S
Water Purification System Millipore Milli-Q Academic A10
Well plate lid Fisher/various 07-201-590/various
Chemicals/reagents
4-AP Sigma 275875
BAPTA molecular probes B1204
CaCl2*2H2O Sigma C7902
CdCl2 sigma 202908
DNQX Tocris 189
EGTA Sigma E3889
glucose Sigma G5767
HEPES Sigma H3375
K2-ATP Sigma A8937
KCl Sigma P9333
K-gluconate Sigma G4500
MgCl2*6H2O Sigma M2670
Molecular biology grade water Sigma W4502-1L
Na3GTP Sigma G8877
NaCl Bioshop SOD001.1
Na-gluconate Sigma S2054
NaH2PO4 Sigma 71504
NaHCO3 Sigma S6014
Picrotoxin sigma P1675
SrCl Sigma 255521
sucrose Bioshop SUC507.1
TTX Alamone Labs T-550
yDGG Tocris 6729-55-1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abbott, L. F., Nelson, S. B. Synaptic plasticity: taming the beast. Nature Neuroscience. 3 (Supp), 1178-1183 (2000).
  2. Hsia, A. Y., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Development of Excitatory Circuitry in the Hippocampus. Journal of Neurophysiology. 79 (4), 2013-2024 (1998).
  3. Zhan, Y., et al. Deficient neuron-microglia signaling results in impaired functional brain connectivity and social behavior. Nature neuroscience. 17 (3), 400-406 (2014).
  4. Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science (New York, N.Y). 333 (6048), 1456-1458 (2011).
  5. Schrader, L. A., Tasker, J. G. Presynaptic Modulation by Metabotropic Glutamate Receptors of Excitatory and Inhibitory Synaptic Inputs to Hypothalamic Magnocellular Neurons. Journal of Neurophysiology. 77 (2), 527 (1997).
  6. Salter, E. W., Sunstrum, J. K., Matovic, S., Inoue, W. Chronic stress dampens excitatory synaptic gain in the paraventricular nucleus of the hypothalamus. The Journal of Physiology. 596 (17), 4157-4172 (2018).
  7. Redman, S. Quantal analysis of synaptic potentials in neurons of the central nervous system. Physiological Reviews. 70 (1), 165-198 (1990).
  8. Del Castillo, J., Katz, B. Quantal components of the end-plate potential. The Journal of physiology. 124 (3), 560-573 (1954).
  9. Stevens, C. F. Quantal release of neurotransmitter and long-term potentiation. Cell. 72 Suppl, 55-63 (1993).
  10. Deger, M., Helias, M., Rotter, S., Diesmann, M. Spike-timing dependence of structural plasticity explains cooperative synapse formation in the neocortex. PLoS computational biology. 8 (9), e1002689 (2012).
  11. van den Pol, A. N., Wuarin, J. P., Dudek, F. E. Glutamate, the dominant excitatory transmitter in neuroendocrine regulation. Science (New York, N.Y). 250 (4985), 1276-1278 (1990).
  12. Miklós, I. H., Kovács, K. J. Reorganization of synaptic inputs to the hypothalamic paraventricular nucleus during chronic psychogenic stress in rats. Biological Psychiatry. 71 (4), 301-308 (2012).
  13. Korn, H., Triller, A., Mallet, A., Faber, D. S. Fluctuating responses at a central synapse: n of binomial fit predicts number of stained presynaptic boutons. Science (New York, N.Y.). 213 (4510), 898-901 (1981).
  14. Tracey, D. J., Walmsley, B. Synaptic input from identified muscle afferents to neurones of the dorsal spinocerebellar tract in the cat. The Journal of physiology. 350, 599-614 (1984).
  15. Lin, J. W., Faber, D. S. Synaptic transmission mediated by single club endings on the goldfish Mauthner cell. II. Plasticity of excitatory postsynaptic potentials. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 8 (4), 1313-1325 (1988).
  16. Atwood, H. L., Tse, F. W. Changes in binomial parameters of quantal release at crustacean motor axon terminals during presynaptic inhibition. The Journal of physiology. 402, 177-193 (1988).
  17. Li, G. L., Keen, E., Andor-Ardó, D., Hudspeth, A. J., von Gersdorff, H. The unitary event underlying multiquantal EPSCs at a hair cell’s ribbon synapse. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (23), 7558-7568 (2009).
  18. Wadiche, J. I., Jahr, C. E. Multivesicular release at climbing fiber-Purkinje cell synapses. Neuron. 32 (2), 301-313 (2001).
  19. Oliet, S. H., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Bidirectional control of quantal size by synaptic activity in the hippocampus. Science (New York, N.Y.). 271 (5253), 1294-1297 (1996).
  20. Inoue, W., et al. Noradrenaline is a stress-associated metaplastic signal at GABA synapses. Nature Neuroscience. 16 (5), 605-612 (2013).
  21. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute Brain Slice Methods for Adult and Aging Animals: Application of Targeted Patch Clamp Analysis and Optogenetics. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). , 1183-242 (2014).
  22. Richerson, G. B., Messer, C. Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing. Experimental neurology. 131 (1), 133-143 (1995).
  23. Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice. Journal of neuroscience methods. 171 (1), 118-125 (2008).
  24. Ye, J. H., Zhang, J., Xiao, C., Kong, J. Q. Patch-clamp studies in the CNS illustrate a simple new method for obtaining viable neurons in rat brain slices: glycerol replacement of NaCl protects CNS neurons. Journal of neuroscience methods. 158 (2), 251-259 (2006).
  25. Gunn, B. G., et al. Dysfunctional astrocytic and synaptic regulation of hypothalamic glutamatergic transmission in a mouse model of early-life adversity: relevance to neurosteroids and programming of the stress response. Journal of Neuroscience. 33 (50), 19534-19554 (2013).
  26. Su, H., Alroy, G., Kirson, E. D., Yaari, Y. Extracellular calcium modulates persistent sodium current-dependent burst-firing in hippocampal pyramidal neurons. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 21 (12), 4173-4182 (2001).
  27. Frankenhaeuser, B., Hodgkin, A. L. The action of calcium on the electrical properties of squid axons. The Journal of physiology. 137 (2), 218-244 (1957).
  28. Xiong, G., Metheny, H., Johnson, B. N., Cohen, A. S. A Comparison of Different Slicing Planes in Preservation of Major Hippocampal Pathway Fibers in the Mouse. Frontiers in neuroanatomy. 11, 107 (2017).

Tags

Neurovidenskab spørgsmålet 146 hele-celle patch-clamp Elektrofysiologi ex vivo synaptisk transmission synaptic gevinst mangfoldighed paraventricular kernen i hypothalamus corticotropin-releasing hormon hypothalamus
Evaluering af Synaptic mangfoldighed ved hjælp af hele-celle Patch-klemme Elektrofysiologi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sunstrum, J. K., Inoue, W.More

Sunstrum, J. K., Inoue, W. Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology. J. Vis. Exp. (146), e59461, doi:10.3791/59461 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter