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Neuroscience

Valutazione di molteplicità sinaptica utilizzando cellule intere Patch-clamp Elettrofisiologia

Published: April 23, 2019 doi: 10.3791/59461
Automatic Translation
1, 1,2,3
1Neuroscience Program, Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario, 2Robarts Research Institute, Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario, 3Department of Physiology and Pharmacology, Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per la valutazione funzionale molteplicità sinaptica utilizzando cellule intere patch ed elettrofisiologia di morsetto in fettine di cervello acuto.

Abstract

Nel sistema nervoso centrale, un paio di neuroni formano spesso più contatti sinaptici e/o siti di rilascio di neurotrasmettitore funzionale (molteplicità sinaptica). Molteplicità di sinaptica è di plastica e cambiamenti nel corso dello sviluppo e in differenti condizioni fisiologiche, essendo un fattore determinante per l'efficacia della trasmissione sinaptica. Qui, descriviamo gli esperimenti per stimare il grado di molteplicità di sinapsi che chiude su un dato neurone postsinaptico usando cellule intere patch ed elettrofisiologia di morsetto in fettine di cervello acuto. In particolare, registrazione di tensione-morsetto viene utilizzato per confrontare la differenza tra l'ampiezza delle correnti postsinaptiche eccitatori spontanee (sEPSC) e in miniatura eccitatori postsinaptici correnti (mIPSCs). La teoria dietro questo metodo è che input afferente che esibiscono molteplicità mostrerà sEPSC grande, potenziale d'azione-dipendente a causa del rilascio sincrono che si verifica a ogni contatto sinaptico. Al contrario, rilascio potenziale di azione indipendente (che è asincrona) genererà più piccola ampiezza mIPSCs. Questo articolo definisce una serie di esperimenti e analisi per caratterizzare l'esistenza di molteplicità sinaptica e vengono illustrati i requisiti e le limitazioni della tecnica. Questa tecnica può essere applicata per studiare come i diversi interventi comportamentali, farmacologici o ambientali in vivo influenzano l'organizzazione dei contatti sinaptici in aree differenti del cervello.

Introduction

Trasmissione sinaptica è un meccanismo fondamentale per la comunicazione tra neuroni e quindi, funzione cerebrale. Trasmissione sinaptica anche è labile e può cambiare la sua efficacia in maniera dipendente di attività anche come in risposta a segnali modulatoria1. Così, esaminando funzione sinaptica è stato dei principali obiettivi di ricerca in neuroscienza. Elettrofisiologia di cellule intere patch clamp è una tecnica versatile che permette di comprendere, di elaborare disegni sperimentali e analisi dei dati, approfondite meccanismi biofisici e molecolari della trasmissione sinaptica. Un approccio comunemente utilizzato, forse a causa della semplicità del concetto e tecnica, è la misura delle correnti postsinaptico eccitatorio/inibitorio in miniatura (mE / IPSCs) nell'ambito della tensione morsetto configurazione2,3, 4 , 5 , 6. mPSCs individuali rappresentano il flusso di ioni attraverso recettori ionotropici postsinaptici (ad es. recettori AMPA e GABAA ) in risposta all'associazione dei loro rispettivi neurotrasmettitori rilasciati dal terminale presinaptico 7 . Perché la registrazione si ottiene in presenza della tensione-gated Na+ canale bloccanti della tetrodotossina (TTX), l'uscita è indipendente dal potenziale d'azione e prevede normalmente una singolo delle vescicole sinaptiche che contiene del neurotrasmettitore. Basato su questo presupposto, l'ampiezza media di mPSCs è ampiamente usato come una stima grezza per la dimensione quantal, che rappresenta il numero e la funzionalità dei recettori postsinaptici opposte di un singolo sito. D'altra parte, la frequenza di mPSCs è considerata di rappresentare una combinazione del numero totale delle sinapsi che chiude sulla cellula postsinaptica e loro probabilità di rilascio medio. Tuttavia, questi parametri non misurare un'altra variabile-multiplicativity di sinapsi, o molteplicità sinaptica — che è importante per l'efficacia della trasmissione sinaptica.

Basato sulla teoria quantal della trasmissione sinaptica7,8,9, la forza di una determinata connessione tra una coppia di neuroni è dipendente da tre fattori: il numero delle sinapsi funzionali (N), il risposta postsinaptica al rilascio di una singola vescicola sinaptica (quantal dimensione; Q) e la probabilità di rilascio di neurotrasmettitore (Pr). Sinaptica molteplicità equivale a N. Lo sviluppo di molteplicità sinaptica o la potatura delle sinapsi moltiplicative è plastica nel corso dello sviluppo e nella malattia diversi stati3,4,6,10. Per questo motivo, che caratterizzano la molteplicità sinaptica ha implicazioni importanti per comprendere l'efficacia della trasmissione sinaptica nella salute e nella malattia. Tecniche, come il microscopio elettronico possono identificare prove strutturali di molteplicità sinaptica rilevando più contatti sinaptici provenienti dall'assone stesso sulla stesso neurone postsinaptico11,12, 13,14. Tuttavia, questi multisynapses strutturalmente identificati possono essere funzionalmente silenzioso15,16. Esame preciso funzionale di N richiede tecnicamente impegnativi approcci elettrofisiologici, come accoppiati registrazioni della intero-cellula che possono identificare se una determinata connessione dispone di più siti di rilascio funzionale e minimale approcci di stimolazione che mirano a reclutare un singolo assone putativo.

In questo protocollo, descriviamo un metodo semplice per stimare la molteplicità sinaptica adottando un metodo sviluppato originariamente da Hsia et al2. Questa tecnica prevede la misura di spontanea PSC (sPSCs) e mPSCs usando cellule intere patch clamp ed elettrofisiologia, che ci permette di stimare il grado di molteplicità sinaptica attraverso tutti gli ingressi ad un dato neurone.  Come definito in precedenza, sinaptica molteplicità riflette il numero di sinapsi tra un dato neurone pre- e postsinaptico. Se più sinapsi sono reclutate in sincronia di un potenziale di azione, ci sarà un'alta probabilità di temporale sommatoria di singoli sportelli unici (cioè quantali), generando una maggior ampiezza PSC.  Nelle registrazioni mPSC (in cui i potenziali di azione sono bloccati da TTX), la probabilità di temporale sommatoria di singoli mPSCs (asincrono) è bassa. Utilizzando questa logica, molteplicità sinaptica può essere stimata confrontando l'ampiezza sPSC (con rilascio di potenziale di azione-dipendente) per l'ampiezza di mPSC.

Per esaminare l'esistenza di molteplicità Descriviamo quattro esperimenti e loro analisi utilizzando glutamatergic EPSC come esempio. Tuttavia, lo stesso approccio può essere utilizzato per la veloce trasmissione GABAergica/glycinergic (IPSCs). Una breve spiegazione razionale per ogni esperimento è descritto di seguito. In primo luogo, come spiegato sopra, molteplicità sinaptica può essere stimata confrontando l'ampiezza del sEPSC a mIPSCs. Ci sono due requisiti per questo approccio; 1) presinaptici assoni devono sparare un numero sufficiente di potenziali d'azione durante la registrazione, e 2) Pr deve essere alta in modo che le sinapsi più rilasciare neurotrasmettitore dopo l'arrivo del potenziale d'azione. Per soddisfare questi requisiti, sEPSC sono per la prima volta in basso Ca2 + artificiale del liquido cerebrospinale (aCSF) e poi registrato in presenza di una bassa concentrazione dell'antagonista canale K+ , 4-aminopiridina (4-AP) per aumentare l'azione infornamento potenziale e Pr. Quindi di infornamento del potenziale di azione è bloccato da TTX e Pr sono diminuite di una tensione-gated Ca2 + antagonista Cd2 +. L'ampiezza del sEPSC (con 4AP) è paragonato a quello di mEPSC (con 4AP, TTX e Cd2 +). Nel secondo esperimento, Ca2 + è sostituito da equimolare Sr2 + in aCSF a desincronizzarsi rilascio vescicola. Come Ca2 + è necessario per il rilascio sincrono delle vescicole, sostituzione con Sr2 + dovrebbe eliminare il sEPSC di grande ampiezza che sono indicativi di molteplicità. In terzo luogo, meccanicistico, molteplicità può derivare da entrambi più contatti sinaptici alla stesso neurone postsinaptico o multivesicular rilascio (cioè più vescicole rilasciate all'interno di un singolo contatto sinaptico)17,18. Per differenziare tra i due tipi di molteplicità, il terzo esperimento utilizza una bassa affinità, veloce dissociazione antagonista competitivo dei recettori AMPA, γ-D-glutamylglycine (γ-DGG)17,18 per determinare se grande sEPSC sono il risultato della somma temporale di sinapsi indipendente o multivesicular rilascio che agisce su una popolazione di sovrapposizione dei recettori postsinaptici. Se gli eventi di grande ampiezza derivano dalla release multivesicular, γ-DGG sarà meno efficace ad inibire più grande sEPSC rispetto ai più piccoli, mentre grandi sEPSC che derivano dalla sommatoria temporale dei contatti sinaptici multipli allo stesso modo saranno interessati da Γ-DGG. Nel quarto esperimento, un metodo più fisiologico viene utilizzato per migliorare il potenziale di azione sparando, vale a dire afferente stimolazione sinaptica. Scoppi di attività sinaptica possono transitoriamente aumento/facilitare la probabilità di infornamento e rilascio di potenziale di azione spontanea delle afferenze stimolata. Questo approccio permette quindi di molteplicità di manifestare in maniera più fisiologica.

Il seguente protocollo descrive il metodo per lo svolgimento di questi esperimenti nel tessuto ipotalamico del mouse. In particolare, corticotropina liberantesi ormone (CRH) neuroni del nucleo paraventricolare dell'ipotalamo (PVN) sono utilizzati. Descriviamo le procedure per lo svolgimento di elettrofisiologia di cellule intere patch clamp e spiegare gli esperimenti specifici per testare per molteplicità sinaptica.

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Protocol

Tutti gli esperimenti sugli animali sono approvati dal comitato di cura di animale della University of Western Ontario in conformità con il canadese Consiglio sugli orientamenti di cura degli animali (AUP n. 2014-031).

1. soluzioni

  1. Soluzione per affettare
    1. Fare riferimento alla tabella 1 per la composizione della soluzione per affettare.
    2. Preparare una soluzione stock 20x in anticipo e conservare a 4 ° C per 1 mese.
    3. Per soluzione 1x per affettare, sciogliere NaHCO3, glucosio e saccarosio in ddH2O e aggiungere il brodo di 20x. Garantire che l'osmolarità è tra 315-320 mOsm e conservare la soluzione per non più di 1 settimana a 4 ° C.
    4. Riempire due becher con 100 mL di soluzione di affettare e coprirli con parafilm. Raffreddare la soluzione in un congelatore fino a quando la soluzione diventa parzialmente congelata (circa 20 min in congelatore a-80 ° C). Utilizzando un tubo di dispersione di gas, bubble entrambi beakers affettare soluzione con 95% O25% CO2 per 20 minuti sul ghiaccio.
Concentrazioni di soluzione (mM)
Affettare ACSF normale Basso Ca2 + aCSF ACSF SR+ Pipetta/interno
NaCl 87 126 126 126 -
KCl 2.5 2.5 2.5 2.5 8
CaCl2 0,5 2.5 0,5 - -
SrCl2 - - - 2.5 -
MgCl2 7 1.5 2.5 1.5 2
NaH2PO4 1.25 1.25 1.25 1.25 -
NaHCO3 25 26 26 26 -
Glucosio 25 10 10 10 -
Saccarosio 75 - - - -
K-gluconato - - - - 116
Na-gluconato - - - - 12
HEPES - - - - 10
K2-EGTA - - - - 1
K2ATP - - - - 4
Na3GTP - - - - 0.3

Tabella 1: Composizione di varie soluzioni.

  1. aCSF (per fetta recupero e manutenzione)
    1. Fare riferimento alla tabella 1 per la composizione della aCSF.
    2. Preparare una soluzione stock 20x in anticipo e conservare a 4 ° C per 1 mese.
    3. Per 1 x aCSF, sciogliere NaHCO3 e glucosio in ddH2O e aggiungere il brodo di 20x. Garantire che l'osmolarità è tra 298-300 mOsm. Utilizzare la soluzione entro 1 giorno.
  2. aCSF (basso Ca2 + per la registrazione)
    1. Fare riferimento alla tabella 1 per la composizione del basso Ca2 + aCSF.
    2. Preparare una soluzione stock 20x in anticipo e conservare a 4 ° C per 1 mese.
    3. Per 1 x basso Ca2 + aCSF, sciogliere NaHCO3 e glucosio in ddH2O e aggiungere 20 (CaCl2 e MgCl2 gratis) stock e CaCl2 MgCl2 a specificato concentrazioni. Garantire che l'osmolarità è tra 298-300. Utilizzare la soluzione entro 1 giorno.
  3. aCSF (Sr2 + per la registrazione)
    1. Fare riferimento alla tabella 1 per la composizione di Sr2 + aCSF.
    2. Preparare una soluzione stock 20x in anticipo e conservare a 4 ° C per 1 mese.
    3. Per 1 x Sr2 + aCSF, sciogliere NaHCO3 e glucosio in ddH2O e aggiungere 20 (CaCl2 e MgCl2 gratis) stock, SrCl2 e MgCl2 a specificato concentrazioni. Garantire che l'osmolarità è tra 298-300. Utilizzare la soluzione entro 1 giorno.
  4. Soluzione interna
    1. Fare riferimento alla tabella 1 per la composizione della soluzione interna K-gluconato basato.
    2. Per rendere 20 mL di soluzione interna, aggiungere 15 mL di acqua di grado di biologia molecolare per un tubo da 50 mL. Eseguire i passaggi successivi sul ghiaccio.
    3. Preparare le seguenti soluzioni prima del tempo per 1m stock concentrazioni nella biologia molecolare acqua di grado. Aggiungere (in mL): 2,32 K-gluconato, 0.24 Na-gluconato, 0,20 HEPES, 0.16 KCl, 0,05 K2-EGTA, 0.04 MgCl2 per il tubo da 50 mL.
    4. Aggiungere 100 µ l di 0,3 M Na3GTP.
    5. Pesare 44,08 mg di K2ATP in un tubo del microcentrifuge 2 mL e aggiungere 1 mL di acqua di grado di biologia molecolare, quindi aggiungere alla provetta da 50 mL.
    6. Regolare il pH a 7,2-7,4 con 1 M di KOH. Garantire che l'osmolarità è tra 283-289 mOsm.

2. fetta preparazione

  1. Preparare strumenti
    1. Aggiungere 200 mL di aCSF alla camera di recupero (costruita da un becher da 250 mL con 4 pozzi e reticolato) e posizionare la camera di recupero in un bagno d'acqua (35 ° C).
    2. Coprire la camera con un film di paraffina e costantemente bolla il aCSF con 95% O25% CO2 utilizzando un tubo di dispersione di vetro per almeno 20 min.
    3. Preparare per la dissezione impostando gli strumenti (bisturi, forbici bene angolate, forcipe, pennello fine, cucchiaio di plastica).
    4. Riempire una siringa da 60 mL con circa 15 mL di soluzione per affettare ghiacciata dal punto 1.1.4.
    5. Preparare la piattaforma di dissezione inserendo un filtro di carta sul coperchio di una piastra ben.
    6. Preparare la camera per affettare collocandolo nel vassoio di ghiaccio e riempire il vassoio con ghiaccio.
    7. Impostare il vibratome fissando una lametta monouso del portalama.
    8. Rendere una pipetta di trasferimento rompendo la punta di una pipetta di Pasteur e posizionando un bulbo di gomma sopra l'estremità rotta.
  2. Sezionare il cervello del topo
    1. Anestetizzare l'animale in una camera saturata di 4% isoflurane, fino a quando i riflessi spinali sono assenti.
    2. Decapitare l'animale utilizzando una ghigliottina e rimuovere rapidamente il cervello.
      1. Fare un'incisione del midline con una lama per bisturi n ° 22 da rostral alla caudale.
      2. Lateralmente e sbucciare il cuoio capelluto su ciascun lato della testa.
      3. Uso di forbice per tagliare il cranio su un lato da caudale rostrale (inclusi il lato delle ossa frontali), prestando attenzione a non per danneggiare il cervello.
      4. Uso forcipe per sollevare il pezzo di cranio off il cervello e raffreddare rapidamente il cervello con 15 mL di soluzione per affettare ghiacciata usando la siringa dal punto 2.1.4.
      5. Sollevare il cervello dal cranio.
      6. Posto il cervello in uno dei bicchieri riempiti con soluzione ghiacciata per affettare (dal punto 1.1.4), gorgogliare con 95% O25% CO2.
  3. Preparare fette dell'ipotalamo del mouse
    1. Bloccare il cervello per l'area del cervello desiderata e angolo di taglio (ad es., per le fette ipotalamiche coronale, tagliare il tessuto rostrale del chiasma e caudale al ponte con una lama e garantire il blocco caudale ha una superficie piana perpendicolare alla base del cervello).
    2. Utilizzando un pezzo di carta da filtro, pick up il cervello dal lato anteriore e lato posteriore alla lamiera di supporto utilizzando colla istantanea per colla.
    3. Rapidamente posizionare la piastra nella camera di affettare e riempire la camera con affettare soluzione da secondo Becher al punto 1.1.4.
    4. Fissare il vassoio camera e ghiaccio per affettare il del vibratome.
    5. Definire l'area per affettare (anteriore e posteriore al cervello) e iniziare affettare 250 µm fette di spessore della corona. Parametri consigliati: 0.10 mm/s, ampiezza di velocità 2 mm.
    6. Tagliare le fette la dimensione desiderata per l'area del cervello desiderata.
    7. Recuperare le fette a 35 ° C per 30-45 min. Quindi, rimuovere la camera di recupero dal bagno riscaldamento e consentire le fette di recuperare a temperatura ambiente per un minimo di 30 ulteriori fette di mantenere a temperatura ambiente per il resto della giornata e continua a propagarsi il bagno costantemente con 95% O25% CO2 .

3. cellule intere Patch ClampRecording

  1. Tirare le pipette di patch
    1. Utilizzando i parametri suggeriti per la registrazione da manuale di puller pipetta della intero-cellula, tirare pipette patch da vetro murata spessore per una resistenza di pipetta di 3-5 MΩ.
    2. Con una microsiringa (commerciale o fatti in casa), riempire un puntale filtrato soluzione interna. Per rendere una microsiringa, bruciare la punta di una siringa da 1 mL e permettere che la punta a cadere creando una multa lunga suggerimento.
  2. Ottenere la configurazione di cellule intere
    1. Inserire la pipetta di registrazione appena sopra la pipetta fetta e offset corrente in modalità tensione morsetto. Applicare una leggera pressione positiva per la pipetta e bloccare il rubinetto.
    2. Selezionare una cellula sana con una membrana intatta e avvicinarsi alla cella con la pipetta. La pressione positiva dovrebbe causare una leggera dispersione nel tessuto (cioè un'onda lenta nel tessuto entrando).
    3. Lentamente continuare a portare la pipetta più vicino alla cella tramite un movimento diagonale fino a quando la pipetta forma una fossetta sulla superficie delle cellule.
    4. Rilasciare il blocco di pressione positiva. La cella inizierà a formare un sigillo e la resistenza aumenta sopra 1 GΩ. Nel morsetto di tensione, tenere la cella a -68 mV.
    5. Tirare leggermente dalla cella diagonale per rimuovere l'eccesso di pressione dalla cella.
    6. Compensare la capacitanza pipetta veloce e lento.
    7. Applicare una breve aspirazione attraverso il tubo collegato al titolare della pipetta di rompere attraverso la cella e ottenere la configurazione di cellule intere.
    8. Passare alla modalità di cella sulla membrana prova finestra in un elettrofisiologia acquisizione dati e software di analisi (ad esempio, Clampex).
    9. Prima di ogni morsetto di tensione registrazione, eseguire un test di membrana utilizzando lo stesso software e registrare i parametri pertinenti in un libro di laboratorio (resistenza di membrana, accesso resistenza e capacità).
    10. Mantenere la temperatura del bagno registrazione a 27 – 30 ° C e la portata a 1,5 – 2,0 mL/min per esperimenti successivi.

4. molteplicità esperimenti

  1. Esperimento 1: stima molteplicità utilizzando 4-AP
    1. Nel morsetto di tensione, tenere la cella a -68 mV. Utilizzando lo stesso software, registrare il sEPSC mentre che irrora il bagno con basso Ca2 + aCSF. Record per almeno 5 minuti dopo l'inizio della configurazione di cellule intere per garantire una registrazione della linea di base stabile come l'attività sinaptica può essere elevato poco dopo lo sfondamento della membrana.
    2. Usando una micropipetta, aggiungere 4-AP per il aCSF e vasca applicare 30 µM 4-AP Record sEPSC per almeno 10 minuti ottenere l'effetto della droga completo.
    3. Aggiungere 0,5 µM TTX e 10 µM Cd2 + aCSF con AP-4 e registrare il mIPSCs per almeno 10 min.
    4. Per l'analisi offline, è necessario utilizzare l'ultimo min 1 della linea di base immediatamente prima dell'applicazione della 4-AP (in basso Ca2 + aCSF), il 10 di applicazione AP-4 e il 10 min di applicazione TTX.
  2. Esperimento 2: desincronizzarsi rilascio vescicola mediante Sr2 +
    1. Mentre che irrora il bagno con normale Ca2 + aCSF (lo stesso il bagno aCSF) record sEPSC per almeno 5 min.
    2. Passare dal Ca2 + aCSF normale e iniziare che irrora Sr2 + aCSF (dal punto 1.4) e record sEPSC.
    3. Per l'analisi offline, per determinare se il sEPSC di grande ampiezza sono a causa del rilascio sincrono delle vescicole, confrontare l'ultimo min 1 della linea di base (in normale aCSF) per il 10° minuto di applicazione Sr2 + aCSF.
  3. Esperimento 3: test per rilascio multivesicular utilizzando Γ- DGG
    1. In basso Ca2 + aCSF record sEPSC per almeno 5 min.
    2. Aggiungere 30 µM 4-AP aCSF attraverso il sistema di perfusione. SEPSC record per almeno 10 min.
    3. Aggiungere 200 µM γ-DGG aCSF con AP-4 e registrare il sEPSC per almeno 10 min.
    4. Come un esperimento di controllo in una cella separata, eseguire i passaggi 1-3 ma applicare una bassa concentrazione (125 nM) di DNQX invece di γ-DGG.
    5. Per l'analisi offline, analizzare gli ultimi minuti di ogni applicazione della droga.
  4. Esperimento 4: Stimolare afferenti ingressi per aumentare il potenziale di azione infornamento.
    1. Record sEPSC in Ca2 + aCSF normale.
    2. Stimolare le afferenze utilizzando un elettrodo monopolare vetro riempito con aCSF a una frequenza di 20 Hz per 2 s e ripetere 10 volte con un intervallo Inter-raffica di 20 sec.
    3. Per l'analisi, utilizzare il ms 5.000 prima il primo stimolo come base di riferimento e confrontare con il 10-300 ms dopo lo stimolo finale e poi prendere la variazione di ampiezza e frequenza media oltre 10 prove.

5. analisi

  1. Analizzare sEPSC e mIPSCs utilizzando un programma che rileva e analizza delle correnti sinaptiche (ad es., software di analisi di Mini).
    1. Usando questo software, utilizzare i parametri di rilevamento suggerito per la rilevazione EPSC recettore AMPA (o EPSC di recettore GABA in caso di registrazione correnti inibitorie).
    2. Utilizzare la funzione di analisi senza scali per rilevare EPSC nella registrazione.
    3. Manualmente la scansione di ogni registrazione per garantire che il programma è rilevare con precisione ogni evento (ad esempio, garantire eventi non vengono perse o contato due volte).
    4. Esportare i dati di evento copiarlo negli Appunti e incollarlo in un software di gestione dati (ad esempio, Excel)
    5. Calcolare la frequenza media e/o ampiezza per ogni trattamento farmacologico ed eseguire analisi statistiche pertinenti.

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Representative Results

Il protocollo di cui sopra descrive un metodo per l'utilizzo di elettrofisiologia morsetto della intero-cellula patch per esaminare il grado di molteplicità sinaptica, usando neuroni ipotalamici del mouse come un esempio. Questa tecnica di preparazione di fetta dovrebbe produrre sane cellule vitali che non hanno una membrana gonfie o nucleo (Figura 1). Ogni passaggio nel protocollo è importante per la salute del tessuto e la qualità delle registrazioni.

Figure 1
Figura 1: seguito di tessuto sano e affettare preparazione. Preparazione di elettrofisiologia del PVN sotto ottica contrasto differenziale di interferenza della fetta a 40 ingrandimenti. Le frecce rosse indicano le cellule sane, e le frecce nere indicano cellule malate. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

La figura 2 illustra la logica per identificare molteplicità sinaptica utilizzando patch ed elettrofisiologia del morsetto. Molteplicità di sinaptica può derivare da entrambi più contatto sinaptico tra una coppia di neuroni (sinistra di Figura 2A), o dal rilascio multivesicular presso un determinato sito sinaptico (Figura 2A a destra). In entrambe queste situazioni, un potenziale di azione nel neurone presinaptico sarebbe suscitare una grande risposta postsinaptica (sEPSC) a causa di temporale sommatoria di più eventi sinaptici. Tuttavia, in assenza di potenziali d'azione presinaptici (ad es. in presenza di TTX e Cd2 + per bloccare Na+-dipendente e Ca2 +-infornamento del potenziale di azione dipendente), il rilascio di neurotrasmettitore vescicolare è asincrono. Di conseguenza, la risposta postsinaptica diventa più piccola (Figura 2B: AP-indipendente). Se due neuroni non esibiscono molteplicità (cioè hanno solo un rilascio di contatto/no multivesicular sinaptico) non ci sarà alcuna differenza nella risposta postsinaptica tra il rilascio potenziale di azione-dipendenti e indipendenti del potenziale d'azione di neurotrasmettitore (Figura 2).

Figure 2
Figura 2: Diagramma schematico che illustra le conseguenze delle diverse organizzazioni sinaptiche su correnti postsinaptiche. (A, B) In una sinapsi con molteplicità, un potenziale di azione e la conseguente Ca2 + afflusso innesca sincrono fusione delle vescicole sinaptiche multiple che si traducono in EPSC grande, multiquantal. Molteplicità di sinaptica può derivare da contatto multisynapse o multivesicular rilascio ad una singola sinapsi (A). In presenza di TTX e Cd2 +, fusione della vescicola indipendenti del potenziale d'azione è asincrona e provoca piccole uniquantal EPSC (B). (C) nelle sinapsi senza molteplicità, sia potenziale d'azione-dipendente e - indipendenti fusione della vescicola si traduce in uniquantal EPSCs. Questa figura è stata modificata da Figura 1A della nostra precedente relazione6. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Nell'esperimento 1, 4-AP è applicato al bagno per aumentare il potenziale di azione di infornamento e probabilità di rilascio. Per garantire che 4-AP sta aumentando il potenziale di azione spontanea di infornamento, la frequenza di EPSC possa essere confrontata tra sEPSC e mIPSCs (Figura 3A, C). Perché sEPSC sono una combinazione di eventi sia potenziale d'azione-dipendente e - indipendenti, la differenza nella frequenza degli sEPSC e mEPSC funge da proxy per il potenziale di azione spontanea di infornamento negli assoni presinaptici. Usiamo un taglio arbitrario fuori di > 15% differenza di frequenza tra sEPSC a mEPSC per garantire che un numero sufficiente di eventi di potenziale di azione-dipendente è presente per l'analisi di molteplicità. Se l'EPSC nella bassa Ca2 + condizione e la condizione TTX (mEPSC) sono simili in frequenza ed ampiezza (cioè nessun potenziale d'azione spontanea di infornamento nella condizione di Ca2 + bassa), la differenza tra il basso Ca2 + basale sEPSC e 4 -AP può anche essere utilizzato per l'analisi di molteplicità.

In un esempio risultato mostrato in Figura 3, 4-AP aumenta l'ampiezza e la frequenza di sEPSC. Successiva applicazione del TTX e Cd2 + diminuisce l'ampiezza e la frequenza. Come descritto in precedenza, la differenza nell'ampiezza tra sEPSC e mIPSCs indica molteplicità sinaptica. In neuroni ipotalamici che esaminiamo qui, l'ampiezza e la frequenza della linea di base e condizioni TTX sono lo stesso (Figura 3, D), suggerendo che la linea di base sEPSC contengono pochissimi dipendenti dal potenziale d'azione EPSC. Di conseguenza, esperimenti successivi possono confrontare la differenza tra previsione e 4-AP per misurare la molteplicità.

Figure 3
Figura 3:. 4-AP applicazione rivela molteplicità sinaptica. Campione (A) tracce di sEPSC registrati in basso Ca2 + aCSF durante la linea di base e dopo l'applicazione di 4-AP (30 μM) e successive TTX (0,5 μM) e applicazione Cd2 + (10 μM). (B) la distribuzione di ampiezza sEPSC dalla registrazione mostrata in (A). (C, D) Riepilogo della frequenza media (C) e ampiezza (D) tra baseline (grigio), 4-AP (rosso) e TTX + Cd2 + (blu). P < 0,005, * * P < 0.01. Questa figura è stata modificata da Figura 2 della nostra precedente relazione6. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Il metodo sopra descritto stima la molteplicità media delle sinapsi che chiude sui neuroni postsinaptici: potrebbe non rilevare modifiche nella molteplicità che si verificano per una piccola percentuale delle sinapsi. Tuttavia, nel nostro recente studio, questo metodo ha rivelato cambiamenti nella molteplicità delle sinapsi di glutammato a neuroni ipotalamici tra normale e cronicamente stressato circostanze6.

Sostituzione di Ca2 + con equimolare Sr2 + nella aCSF desynchronizes rilascio potenziale di azione-dipendente di vescicole di neurotrasmettitore 19, 20. Pertanto, se il sEPSC di grande ampiezza sono la sommatoria di rilascio di neurotrasmettitore vescicolare sincronizzato di potenziale di azione-dipendente (cioè, molteplicità), sostituendo Ca2 + con Sr2 + diminuirà l'ampiezza dell'EPSC. Come si vede in Figura 4, Sr2 + aCSF diminuisce la percentuale di eventi di grande ampiezza (Figura 4B) e di conseguenza diminuisce l'ampiezza media (Figura 4). Quando le cellule non manifestano molteplicità, desynchronizing rilascio vescicola non avrà alcun effetto sull'ampiezza EPSC.

Figure 4
Figura 4: Sr2 + desynchronizes grandi eventi multiquantal. (A) confronto rappresentativo traccia tra Ca2 + aCSF normale e Sr2 + aCSF. SR2 + aCSF desynchronizes rilascio vescicola e diminuisce l'ampiezza di multiquantal eventi sincroni come visto in una distribuzione di ampiezza rappresentativo (B) e il cambiamento di ampiezza per tutte le celle (C) * P < 0.05. Questa figura è stata modificata da Figura 3 della nostra precedente relazione6. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Γ-DGG, un veloce dissociazione antagonista competitivo dei recettori AMPA, può essere utilizzato per determinare se la molteplicità è dovuto il rilascio multivesicular o più contatti sinaptici. Multivesicular rilascio agisce su una popolazione di sovrapposizione dei recettori postsinaptici, la grande ampiezza EPSC comporta la messa in comune del glutammato nella fessura sinaptica. In altre parole, la concentrazione di glutammato nella fessura sinaptica è superiore a quella che deriva dal rilascio di uniquantal. D'altra parte, contatti multisinaptici avrebbe uniquantal EPSC in ogni sito sinaptica. Se la grande ampiezza EPSC derivano dalla versione multivesicular, il più grande EPSC sarà meno colpito da antagonismo γ-DGG, (a causa di più alta concentrazione di glutammato), rispetto alla più piccola ampiezza EPSC (Figura 5A giusta, B-D). Se la grande ampiezza EPSC sono dovuto la sommatoria di sincrono uniquantal EPSC (multisynapse contatti), γ-DGG avrà un impatto allo stesso modo l'ampiezza di tutti EPSC (Figura 5A sinistro, E-G). A differenza di γ-DGG, DNQX che è un'alta affinità, lenta dissociazione antagonista del recettore AMPA/kainato provoca una diminuzione uniforme in tutte le grande e piccola ampiezza EPSC (Figura 5 H-J). La sensibilità di γ-DGG e DNQX può essere quantificata come il rapporto tra l'ampiezza media di EPSC diviso per il valore massimo (la media del più grande 20 EPSC) ampiezza EPSC (Figura 5 K, L).

Figure 5
Figura 5: utilizzando γ-DGG per sondare rilascio multivesicular. (A) schemi che illustrano due modelli di molteplicità. A sinistra: sommatoria temporale della trasmissione di uniquantal destinato a popolazioni indipendenti dei recettori postsinaptici. Grandi e piccoli EPSC vengono raggiunti da una simile concentrazione di glutammato nella fessura sinaptica e quindi sono ugualmente sensibili a γ-DGG. A destra: multiquantal trasmissione che colpisce una popolazione sovrapposizione dei recettori postsinaptici. Grande EPSC sono dovuti a più alta concentrazione di glutammato nella fenditura che sEPSC più piccoli e pertanto sono meno sensibili a γ-DGG. I valori indicati nella inferiore del modello sono ipotetiche ampiezze relative. Campione (B) le tracce da una registrazione in cui c'era un aumento nell'ampiezza media sEPSC dopo l'applicazione di 4-AP (4-AP risponditore). (C) cumulativo trama per ampiezza EPSC per la registrazione illustrata in (B). (D) cumulativo trama per un'ampiezza EPSC normalizzata (EPSC/EPSCMAX) prima e dopo l'applicazione di γ-DGG dalla registrazione illustrata in (B). (E) esempio ripercorre da una registrazione dove non c'era nessun cambiamento nell'ampiezza media sEPSC seguendo 4-AP applicazione (4-AP non-responder). (F) cumulativo EPSC ampiezza per la registrazione mostrata nella (E). (G) cumulativo EPSC/EPSCMAX trama per la registrazione mostrata nella (E). (H) esempio traccia da una registrazione dalla linea di base, così come dopo 4-AP e DNQX applicazione. (I) l'EPSC cumulativo ampiezza per la registrazione mostrata in (H). (J) cumulativo EPSC/EPSCMAX trama per la registrazione mostrata in (H). (K) sintesi di significare EPSC/EPSCMAX dopo applicazione DNQX o γ-DGG (in 4-AP risponditore e gruppi non responsivi) normalizzato a pre-γ-DGG/DNQX (cioè post-4-AP). (L) appezzamenti di alberino-4-AP significano ampiezza EPSC (normalizzata alla pre-4-AP) contro i media post-γ-DGG/DNQX EPSC/EPSCMAX (normalizzata alla post-4-AP). P < 0,005. Questa figura è stata modificata da Figura 4 della nostra precedente relazione6. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

La forza della trasmissione sinaptica può essere aumentata transitoriamente da scoppi di attività sinaptica. Per studiare la molteplicità in altre condizioni fisiologiche, stimolazione afferente può essere utilizzata per aumentare il potenziale di azione infornamento e probabilità di rilascio. Se la molteplicità è presente, stimolazione afferente dovrebbe causare un breve aumento nell'ampiezza EPSC (Figura 6A-D). Se la molteplicità non è presente, attività guidata aumenti nel potenziale di azione di infornamento non aumenterà l'ampiezza EPSC.

Figure 6
Figura 6: stimolazione ad alta frequenza rivela molteplicità sinaptica. Campione (A) tracce di sEPSC prima e dopo stimolazione sinaptica afferente. (B) terreno di ampiezza sEPSC prima e dopo stimolazione sinaptica (20 Hz, 2 s) dalla registrazione mostrata in (A). (C, D) Riepilogo di frequenza sEPSC (C) e cambiamenti di ampiezza (D) dopo stimolazione sinaptica. P < 0,001, * P < 0.05. Questa figura è stata modificata da Figura 5 della nostra precedente relazione6. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Un importante requisito per un esperimento di successo patch clamp Elettrofisiologia è ottenere fette/cellule sane. Il nostro protocollo descritto è ottimizzato per fette ipotalamici che contengono neuroni PVN. Altre aree potrebbero richiedere di cervello per volta soluzioni e affettare metodi21,22,23,24. Per la registrazione, è fondamentale per accettare solo registrazioni stabile monitorando costantemente le proprietà della cella come la resistenza della membrana, accesso della capacità e della resistenza. Un aumento nella resistenza di accesso può diminuire l'ampiezza EPSC e quindi confondere misure di ampiezza. Di conseguenza, le celle con valori di resistenza di accesso che superano 20 MΩ o aumentano di più del 20% durante la registrazione vengono scartate. Allo stesso modo, una diminuzione in (o un basso) membrana resistenza può provocare scarsa spazio-morsetto e, di conseguenza, può fare diminuire l'ampiezza. I neuroni nel nostro sistema di destinazione (parvocellulare neuroni PVN) hanno una resistenza di membrana alta tra 500 MΩ e 1 GΩ, e scartiamo le cellule con resistenze di membrana sotto 500 MΩ. Qualità controllo cut-off dovrebbe essere stabilito per specifici tipi di neuroni in fase di studio. Come questo protocollo si basa sulla differenza nell'ampiezza prima e dopo le applicazioni farmacologiche, è importante assicurare che il cambiamento di ampiezza è dovuta all'applicazione di droga e non per i cambiamenti nella resistenza di membrana e accesso. I neuroni ipotalamici che studiamo in questo protocollo sono di piccole dimensioni (capacità di cella è circa 15 pF in topi e la resistenza della membrana è circa 1 GΩ) e K-gluconato basato soluzione interna funziona bene per ottenere alta qualità EPSC/IPSCs6,25 . Per i neuroni con dimensioni maggiori di cella e resistenza dell'input basso, soluzione interna al cesio basato utilizzabile per garantire un buono spazio-morsetto2.

Un requisito specifico dell'utilizzo di questo metodo per misurare la molteplicità è che le cellule di fuoco un numero sufficiente di potenziali di azione spontanei al fine di confrontare gli eventi l'azione potenziale-dipendente di mIPSCs. Questo può essere assicurato confrontando la differenza nella frequenza di EPSC in assenza e in presenza di TTX e Cd2 +. In fette ipotalamici che contengono PVN, abbiamo trovato che l'applicazione di 4-AP è efficiente per suscitare infornamento del potenziale di azione. Un altro metodo, introdotto da Hsia e colleghi2, utilizza alta Ca2 + aCSF per aumentare il potenziale di azione sparando, piuttosto che 4-AP. Mentre questo metodo riusciva nelle fette hippocampal, abbiamo trovato che l'alto Ca2+ era meno efficiente di 4-AP nel facilitare il potenziale di azione di infornamento in fette ipotalamico6. Infatti, è stato dimostrato che extracellulare, alta Ca2 + concentrazione diminuisce intrinseca eccitabilità dei neuroni ed assoni alterando la conduttanza Na+ 26,27. Questo potrebbe spiegare perché alcune fette, alta Ca2 + aCSF non è efficace per aumentare la frequenza EPSC.

Una limitazione di questo metodo, che è inerente a tutte le fetta patch ed elettrofisiologia di morsetto, è che molti, a lungo raggio le proiezioni dei neuroni postsinaptici sono tagliate in fetta preparati. Al fine di osservare i potenziali di azione, è probabile che gli assoni presinaptici e corpi cellulari devono essere mantenute nella fetta. Di conseguenza, la misura di molteplicità è inclinata a connettività sinaptica che è conservato all'interno della slice. Lungo la stessa linea, la direzione di taglio può causare determinate popolazioni di proiezioni essere conservato, mentre altri sono mozzata28. Queste limitazioni hanno un effetto generale di sottovalutare la molteplicità degli input afferente.

Il protocollo descritto fornisce un metodo per stimare il grado di molteplicità sinaptica attraverso tutti gli ingressi ad un dato neurone. Altre tecniche di elettrofisiologia, quali registrazioni accoppiate o stimolazione minima di un singolo assone possono identificare se una determinata connessione ha più contatti, ma questi esperimenti sono spesso difficili e non è possibile in tutti i sistemi. Inoltre, non possono dare un'indicazione generale dell'organizzazione di tutti gli ingressi ad un dato neurone come essi isolare solo una coppia di neuroni. Il presente protocollo utilizza base patch-clamp Elettrofisiologia metodi per valutare il grado di molteplicità attraverso tutti gli ingressi ad un dato neurone.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare

Acknowledgments

J.S. ricevuto Ontario Graduate Scholarship. W.I. ha ricevuto un nuovo investigatore Fellowship dal Canada di ricerca sulla salute mentale. Questo lavoro è supportato da sovvenzioni di funzionamento a w. i da scienze naturali e ingegneria Research Council of Canada (06106-2015 RGPIN) e il Canadian Institute for Health Research (PJT 148707).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL syringe BD 309659
10 blade Fisher Scientific/others 35698
22 blade VWR/others 21909-626
22 μM syringe filters Milipore 09-719-000
Adson foreceps Harvard Instruments 72-8547
Angled sharp scissors Harvard Instruments 72-8437
Clampex Molecular Devices pClamp 10
Double edge blade VWR 74-0002
Filter paper Sigma/others 1001090
Fine paintbrush Fisher/various 15-183-35/various
Gas Dispersion Tube VWR LG-8680-120
Isoflurane Fresenius Kabi/others M60303
Krazy glue various various
Mini analysis Synaptosoft MiniAnalysis 6
Osmomoter Wescor Inc Model 5600
Parafilm Sigma PM-996
Pasteur pipette VWR 14672-200
ph meter Mettler Toledo FE20-ATC
Rubber bulb VWR 82024-550
Scalpel handle No. 3 Harvard Instruments 72-8350
Scalpel handle No. 4 Harvard Instruments 72-8356
Single edge blade VWR 55411-050
Vibratome slicer Leica VT1200S
Water Purification System Millipore Milli-Q Academic A10
Well plate lid Fisher/various 07-201-590/various
Chemicals/reagents
4-AP Sigma 275875
BAPTA molecular probes B1204
CaCl2*2H2O Sigma C7902
CdCl2 sigma 202908
DNQX Tocris 189
EGTA Sigma E3889
glucose Sigma G5767
HEPES Sigma H3375
K2-ATP Sigma A8937
KCl Sigma P9333
K-gluconate Sigma G4500
MgCl2*6H2O Sigma M2670
Molecular biology grade water Sigma W4502-1L
Na3GTP Sigma G8877
NaCl Bioshop SOD001.1
Na-gluconate Sigma S2054
NaH2PO4 Sigma 71504
NaHCO3 Sigma S6014
Picrotoxin sigma P1675
SrCl Sigma 255521
sucrose Bioshop SUC507.1
TTX Alamone Labs T-550
yDGG Tocris 6729-55-1

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References

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Sunstrum, J. K., Inoue, W. Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology. J. Vis. Exp. (146), e59461, doi:10.3791/59461 (2019).

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