Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Evaluering av Synaptic mangfold bruker hele-celle Patch-klemme elektrofysiologi

Published: April 23, 2019 doi: 10.3791/59461
Automatic Translation
1, 1,2,3
1Neuroscience Program, Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario, 2Robarts Research Institute, Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario, 3Department of Physiology and Pharmacology, Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å vurdere funksjonelle synaptic multiplisiteten bruker hele-celle oppdateringen klemme elektrofysiologi i akutt hjernen skiver.

Abstract

I det sentrale nervesystemet, et par av neurons ofte danner flere synaptic kontakter og/eller funksjonelle nevrotransmitter release nettsteder (synaptic mangfold). Synaptiske mangfold er plast og endringer i utvikling og i ulike fysiologiske forhold, er en viktig determinant for effekten av synaptic overføring. Her skissere vi eksperimenter for å estimere graden av mangfoldet av synapser avslutning på en gitt postsynaptic Nevron bruker hele-celle oppdateringen klemme elektrofysiologi i akutt hjernen skiver. Spesielt brukes spenning-klemme opptak til å sammenligne forskjellen amplituden til spontan eksitatoriske postsynaptic strøm (sEPSCs) og miniatyr eksitatoriske postsynaptic strøm (mEPSCs). Teorien bak denne metoden er at afferente innganger som viser mangfold vises store, action potensial-avhengige sEPSCs grunn til synkron utgivelsen som oppstår på hver synaptic kontakt. Derimot genererer handling potensial-uavhengig utgivelse (som er asynkron) mindre amplituden mEPSCs. Denne artikkelen skisserer en rekke eksperimenter og analyser som karakteriserer eksistensen av synaptic mangfold og diskuterer krav og begrensninger av teknikken. Denne teknikken kan brukes for å undersøke hvordan forskjellige atferdsmessige, farmakologiske eller miljømessige tiltak vivo påvirker organiseringen av synaptic kontakter i ulike hjernen områder.

Introduction

Synaptiske overføring er en fundamental mekanisme for kommunikasjon mellom nerveceller, og derfor hjernefunksjonen. Synaptiske overføring er også labilt og kan endre effekt i en aktivitet-avhengige måte også som svar på modulatory signaler1. Derfor har undersøke synaptiske funksjon vært et viktig fokus nevrovitenskap forskning. Hele celle oppdateringen klemme elektrofysiologi er en allsidig teknikk som gjør det muliggjør for oss å forstå, utarbeide eksperimentell design og data analyser, grundig Biofysiske og molekylære mekanismer av synaptic overføring. En brukte tilnærming, kanskje på grunn av enkelhet av teknikk og konsept, er måling av miniatyr eksitatoriske/hemmende postsynaptic strøm (meg / IPSCs) under spenning klemme konfigurasjon2,3, 4 , 5 , 6. individuelle mPSCs representerer flyten av ioner gjennom postsynaptic ionotropic reseptorer (f.eks AMPA og GABAA reseptorer) svar binding av sine respektive nevrotransmittere utgitt fra presynaptic terminal 7 . Fordi opptaket er oppnådd i nærvær av spenning-gated Na+ kanal blokkering tetrodotoxin (TTX), utgivelsen er handlingen potensial-uavhengig og innebærer vanligvis en enkelt synaptic vesicle som inneholder nevrotransmitter. Basert på denne forutsetningen, er gjennomsnittlig amplituden til mPSCs mye brukt som en grov anslag for quantal størrelsen, som representerer antallet og funksjonaliteten til postsynaptic reseptorer motstridende en singelutgivelse nettsted. Frekvensen for mPSCs regnes derimot, representerer en kombinasjon av antall synapser avslutning på postsynaptic cellen og deres gjennomsnittlige utgivelsen sannsynlighet. Men disse parameterne ikke mål en annen variabel-multiplicativity synapser eller synaptic mangfold, som er viktig for effekten av synaptic overføring.

Basert på quantal teorien om synaptic overføring7,8,9, styrken i en gitt sammenheng mellom neurons er avhengig av tre faktorer: antall funksjonelle synapser (N), den postsynaptic svar på utgivelsen av en enkelt synaptic vesicle (quantal størrelse; Q) og sannsynligheten for nevrotransmitter-løslate (P-r). Synaptiske mangfold tilsvarer N. Utviklingen av synaptic mangfold eller beskjæring av multiplikativ synapser er plast i utvikling og i ulike sykdom stater3,4,6,10. Derfor har karakteriserer synaptic mangfoldet viktige implikasjoner for å forstå effekten av synaptic overføring i helse og sykdom. Teknikker, som elektronmikroskop kan identifisere strukturelle bevis på synaptic mangfold av oppdager flere synaptic kontakter fra samme axon på de samme postsynaptic Nevron11,12, 13,14. Disse strukturelt identifisert multisynapses kan imidlertid være funksjonelt stille15,16. Presis funksjonelle undersøkelse av N krever teknisk utfordrende elektrofysiologiske tilnærminger, slik som sammenkoblede hele celle innspillinger som kan identifisere om en gitt tilkobling har flere funksjonell løslate områder og minimal stimulering tilnærminger som mål å rekruttere et enkelt antatte axon.

I denne protokollen beskriver vi en enkel metode for å estimere synaptic mangfold ved å vedta en metode opprinnelig utviklet av Hsia et al2. Denne teknikken innebærer måling av spontane PSCer (sPSCs) og mPSCs med hele celle oppdateringen klemme elektrofysiologi, som tillater oss å estimere graden av synaptic mangfold på tvers av alle innganger til en gitt Nevron.  Som tidligere definert, synaptic mangfold gjenspeiler antall synapser mellom en gitt før og postsynaptic Nevron. Hvis flere synapser er rekruttert i synkronisering av en handling potensial, blir det en høy sannsynlighet for timelige summering av personlige (dvs. quantal) PSCer, genererer en større amplitude PSC.  I mPSC opptak (i hvilken handling potensialer blokkeres av TTX), sannsynligheten for timelige summering av personlige (ikke-synkron) mPSCs er lav. Bruker denne begrunnelsen, kan synaptic mangfold beregnes ved å sammenligne sPSC amplituden (med handlingen potensial-avhengige utgivelse) til mPSC amplituden.

For å undersøke eksistensen av mangfold beskriver vi fire eksperimenter og deres analyser med glutamatergic EPSCs som eksempel. Imidlertid den samme fremgangsmåten kan brukes for rask GABAergic/glycinergic-overføring (IPSCs). En kort begrunnelse for hvert eksperiment beskrives nedenfor. Som forklart ovenfor, kan først synaptic mangfold beregnes ved å sammenligne amplituden til sEPSCs til mEPSCs. Det er to krav til denne tilnærmingen; 1) presynaptic axons må skyte et tilstrekkelig antall handling potensialer under opptak, og 2) Pr må være høy slik at flere synapser løslate nevrotransmitter ved ankomsten av en handling potensial. For å møte disse kravene, er sEPSCs første gang registrert i lav Ca2 + kunstig cerebrospinalvæske (aCSF), og deretter registreres i nærvær av en lav konsentrasjon av K+ kanal antagonist, 4-Aminopyridine (4-AP) øke handling potensielle skyte og Pr. Handlingen potensial avfyring blokkeres av TTX og Pr redusert med en spenning-gated Ca2 + kanal blokker Cd2 +. Amplituden til sEPSCs (med 4AP) er sammenlignet med mEPSC (4AP, TTX og Cd2 +). I andre forsøket, er Ca2 + erstattet av ekvimolare Sr2 + i aCSF å desynchronize vesicle utgivelsen. Ca2 + er nødvendig for synkron utgivelsen av blemmer, bør erstatning med Sr2 + fjerne den store amplituden sEPSCs som mangfold. Tredje mechanistically, mangfold kan resultere fra flere synaptic kontakter til samme postsynaptic Nevron eller multivesicular release (dvs. flere blemmer utgitt innen en enkelt synaptic kontakt)17,18. For å skille mellom de to typene mangfold, bruker tredje forsøket en lav affinitet, rask dissociating konkurransedyktig antagonist av AMPA reseptorer, γ-D-glutamylglycine (γ-DGG)17,18 til å bestemme om store sEPSC er et resultat av timelige summering av uavhengige synapser eller multivesicular løslate opptrer på en overlappende befolkning på postsynaptic reseptorene. Hvis store amplituden hendelsene oppstår fra multivesicular utgivelse, blir γ-DGG mindre effektiv på hemme større sammenlignet med mindre sEPSCs, mens store sEPSCs som oppstår fra timelige summering av flere synaptic kontakter vil bli like påvirket av DEN BLE-DGG. I fjerde forsøket brukes en mer fysiologiske metoden til å forbedre handling potensial skyting, nemlig afferente synaptic stimulering. Pakker med synaptic aktivitet kan transiently økning/lette spontan handling potensial skyting og slipp sannsynligheten stimulert afferente. Derfor kan denne tilnærmingen mangfold å manifestere i en mer fysiologiske måte.

Følgende protokollen beskriver metoden for å gjennomføre disse eksperimentene i musen hypothalamus vev. Spesielt brukes corticotropin slippe hormone (CRH) nevroner i paraventricular kjernen i hypotalamus (PVN). Vi beskriver fremgangsmåtene for å gjennomføre hele celle oppdateringen klemme electrophysiology og forklare de bestemte eksperimentene for å teste for synaptic mangfold.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøk godkjennes av dyr omsorg komiteen av The University of Western Ontario i samsvar med kanadiske Rådet for dyr omsorg retningslinjer (AUP #2014-031).

1. løsninger

  1. Kutting løsning
    1. Se tabell 1 for sammensetningen av kutting løsningen.
    2. Forberede en 20 x lagerløsning på forhånd og lagre den på 4 ° C i opptil 1 måned.
    3. 1 x kutting løsning, oppløse NaHCO3, glukose og sukrose i ddH2O og Legg 20 x lager. Sikre osmolaritet er mellom 315-320 mOsm og lagre løsningen for mer enn 1 uke på 4 ° C.
    4. Fyll kanner med 100 mL kutting løsning og dekke dem med parafilm. Chill løsningen i en fryser til løsningen blir delvis frosset (ca 20 min i-80 ° C fryseren). Bruke en gass spredning tube, boble både kanner av slicing løsning med 95% O2/5% CO2 for 20 min på is.
Løsning konsentrasjoner (mM)
Kutting Vanlig aCSF Lav Ca2 + aCSF SR+ aCSF Pipetter/intern
NaCl 87 126 126 126 -
KCl 2.5 2.5 2.5 2.5 8
CaCl2 0,5 2.5 0,5 - -
SrCl2 - - - 2.5 -
MgCl2 7 1.5 2.5 1.5 2
NaH2PO4 1.25 1.25 1.25 1.25 -
NaHCO3 25 26 26 26 -
Glukose 25 10 10 10 -
Sukrose 75 - - - -
K-gluconate - - - - 116
Na-gluconate - - - - 12
HEPES - - - - 10
K2-EGTA - - - - 1
K2ATP - - - - 4
Na3GTP - - - - 0,3

Tabell 1: Sammensetningen av ulike løsninger.

  1. aCSF (for skive utvinning og vedlikehold)
    1. Se tabell 1 for sammensetningen av aCSF.
    2. Forberede en 20 x lagerløsning på forhånd og lagre den på 4 ° C i opptil 1 måned.
    3. 1 x aCSF, oppløsning NaHCO3 og glukose i ddH2O og Legg 20 x lager. Kontroller osmolaritet er mellom 298-300 mOsm. Bruk løsningen innen 1 dag.
  2. aCSF (lav Ca2 + for opptak)
    1. Se tabell 1 for sammensetningen av lav Ca2 + aCSF.
    2. Forberede en 20 x lagerløsning på forhånd og lagre den på 4 ° C i opptil 1 måned.
    3. For 1 x lav Ca2 + aCSF, oppløsning NaHCO3 og glukose i ddH2O og legge til 20 x (CaCl2 og MgCl2 gratis) lager, CaCl2 og MgCl2 til angitt konsentrasjoner. Kontroller osmolaritet er mellom 298-300. Bruk løsningen innen 1 dag.
  3. aCSF (Sr2 + for opptak)
    1. Se tabell 1 for sammensetningen av Sr2 + aCSF.
    2. Forberede en 20 x lagerløsning på forhånd og lagre den på 4 ° C i opptil 1 måned.
    3. For 1 x Sr2 + aCSF, oppløsning NaHCO3 og glukose i ddH2O og legge til 20 x (CaCl2 og MgCl2 gratis) lager, SrCl2 og MgCl2 til angitt konsentrasjoner. Kontroller osmolaritet er mellom 298-300. Bruk løsningen innen 1 dag.
  4. Intern løsning
    1. Se tabell 1 for sammensetningen av K-gluconate basert interne løsningen.
    2. For å gjøre 20 mL intern løsning, legge til 15 mL molekylærbiologi klasse vann en 50 mL tube. Utføre de påfølgende trinnene på isen.
    3. Klargjør følgende løsninger før tiden til 1 M lager konsentrasjoner i molekylærbiologi klasse vann. Legge til (i mL): 2.32 K-gluconate, 0,24 Na-gluconate, 0,20 HEPES, 0,16 KCl, 0,05 K2-EGTA, 0.04 MgCl2 til 50 mL røret.
    4. Legg 100 µL av 0,3 M Na3GTP.
    5. Veie 44.08 mg K2ATP i en 2 mL microcentrifuge rør og legge 1 mL molekylærbiologi klasse vann, legg deretter til 50 mL tube.
    6. Justere pH 7.2-7,4 med 1 M KOH. Kontroller osmolaritet er mellom 283-289 mOsm.

2. Skjær forberedelse

  1. Utarbeide verktøy
    1. Legge til 200 mL aCSF utvinning kammeret (konstruert fra en 250 mL kanne med 4 brønner og netting) og plasser utvinning kammeret i et vannbad (35 ° C).
    2. Dekke kammer med en parafin film og stadig boble i aCSF med 95% O2/5% CO2 bruker spredning røret for minst 20 min.
    3. Forberede dissection ved sette opp verktøy (skalpell, vinklet fine saks, pinsett, fin maling pensel, plast skje).
    4. Fyll en 60 mL sprøyte med ca 15 mL iskaldt slicing løsningen fra trinn 1.1.4.
    5. Forberede disseksjon plattformen ved å plassere et filter papir på lokket på en frisk plate.
    6. Forberede kutting kammeret ved å plassere den i ice skuffen og fylle skuffen med is.
    7. Angi vibratome ved å sikre et engangsblad i holderen.
    8. Gjøre en overføring pipette ved å bryte spissen av en Pasteur pipette og plassere en gummi pære over brutt slutten.
  2. Dissekere musen hjernen
    1. Bedøve dyr i et kammer mettet med 4% isoflurane til spinal reflekser er fraværende.
    2. Halshugge dyret bruker en guillotine og raskt fjerne hjernen.
      1. Gjøre en midtlinjen snitt med nei 22 skalpell blad fra rostral til caudal.
      2. Sidelengs Skrell hodebunnen på hver side av hodet.
      3. Bruk fint saks til å klippe skallen på ene siden fra caudal til rostral (inkludert siden av frontal bein), bruker forsiktighet for ikke for å skade hjernen.
      4. Bruk tang til å løfte skallen stykket av hjernen og kjøler raskt ned hjernen med 15 mL iskaldt slicing bruker sprøyten fra trinn 2.1.4.
      5. Løft hjernen av skallen.
      6. Sted hjernen i en av kanner fylt med iskaldt slicing løsning (fra trinn 1.1.4) frikirkelige 95% O2/5% CO2.
  3. Forberede skiver av musen hypothalamus
    1. Blokkere hjernen for ønsket hjernen området og kuttet vinkel (f.eks for koronale hypothalamus skiver, klippe av vevet rostral til optikk chiasm og caudal til pons med et blad og sikre caudal blokken har et flatt underlag vinkelrett på undersiden av hjernen).
    2. Med en kutt filter papir, plukke opp hjernen fra den fremre siden og lim den bakre siden å holde platen ved hjelp av øyeblikkelig lim.
    3. Raskt plassere holde platen i kutting kammeret og fylle kammeret med kutting løsning fra andre begeret i trinn 1.1.4.
    4. Sikre kutting kammer og is skuffen på vibratome.
    5. Definere kutting området (fremre og bakre til hjernen) og begynne kutting 250 µm tykkelse koronale skiver. Anbefalt parametere: fart 0.10 mm/s, amplitude 2 mm.
    6. Trim skiver til riktig størrelse for ønsket hjernen området.
    7. Gjenopprette skiver på 35 ° C i 30-45 minutter. Deretter fjerner utvinning kammeret fra oppvarming bad og tillate skiver gjenopprette ved romtemperatur for en ytterligere 30 min. holde skiver ved romtemperatur for resten av dagen og fortsette å boble bad stadig med 95% O2/5% CO2 .

3. hele celle Patch ClampRecording

  1. Trekke oppdateringen Pipetter
    1. Med de foreslåtte parameterne for hele-cellen opptak fra pipette puller's manual, trekke oppdateringen Pipetter fra tykke vegger glass til en pipette motstand av 3-5 MΩ.
    2. Bruker en microsyringe (kommersielle eller hjemmelaget), fylle en pipette tips med filtrerte intern løsning. Å gjøre en microsyringe, brenne spissen av en 1 mL sprøyte og tillate spissen faller skaper en lang fine tips.
  2. Få hele celle-konfigurasjon
    1. Plass opptak pipette like over det skive og forskyvning pipette gjeldende i spenning klemme modus. Liten positivt trykk gjelder pipette og lås stopcock.
    2. Velg en sunn celle med en intakt membran og tilnærming cellen med pipette. Positiv trykket bør føre til en liten forstyrrelse i vev (dvs. en langsom bølge i vevet når du angir).
    3. Sakte Fortsett å bringe pipette nærmere til cellen med en diagonal bevegelse til pipette danner en liten smilehull på cellens overflate.
    4. Låsen positivt trykk. Cellen begynner å danne en sel og motstand øker over 1 GΩ. Spenning klemme, hold cellen i-68 mV.
    5. Litt trekk fra cellen diagonalt for å fjerne overflødig press fra cellen.
    6. Kompensere for rask og treg pipette kapasitans.
    7. Bruke en kort sugekraft gjennom røret koblet til pipette innehaveren å bryte gjennom cellen og få hele celle konfigurasjon.
    8. Bytt til celle modus på membranen test vinduet i en elektrofysiologi datainnsamling og analyseprogramvare (f.eks Clampex).
    9. Før hver spenning klemme opptak, membran teste samme programmvre og registrere de relevante parameterne i en lab-bok (membran motstand, tilgang motstand og kapasitans).
    10. Opprettholde temperaturen i innspillingen badet på 27-30 ° C og flyt på 1,5-2.0 mL/min for etterfølgende eksperimenter.

4. mangfold eksperimenter

  1. Eksperiment 1: estimere mangfold bruker 4-AP
    1. Spenning klemme, hold cellen i-68 mV. Bruke samme programvare, spille inn i sEPSCs mens perfusing badet med lav Ca2 + aCSF. Posten for minst 5 min etter starten av hele celle konfigurasjon for å sikre stabil planlagt opptak som synaptic aktiviteten kan være høy etter gjennombrudd av membranen.
    2. Bruker brønnene, legge til 4-AP på aCSF og bad gjelder 30 µM 4-AP. posten sEPSCs på minst 10 min å oppnå full narkotika effekten.
    3. Legge til 0,5 µM TTX og 10 µM Cd2 + aCSF med 4-AP og registrere mEPSCs på minst 10 min.
    4. Frakoblet analyse, bruke den siste 1 min av planlagte umiddelbart før søknaden 4-AP (i lav Ca2 + aCSF), 10 min 4-AP programmet og 10 min TTX programmet.
  2. Eksperiment 2: desynchronize vesicle løslate bruker Sr2 +
    1. Mens perfusing bad med normal Ca2 + aCSF (det samme som bad aCSF) posten sEPSCs i minst 5 minutter.
    2. Bytte fra den vanlige Ca2 + aCSF og begynne perfusing Sr2 + aCSF (fra trinn 1.4) og registrere sEPSCs.
    3. For offline analyse, for å avgjøre om de store amplituden sEPSCs grunn til synkron utgivelsen av blemmer, sammenligne den siste 1 min til opprinnelig plan (i normal aCSF) til 10th minutt av Sr2 + aCSF-program.
  3. Eksperiment 3: teste multivesicular løslate bruker Den ble- DGG
    1. I lav Ca2 + aCSF posten sEPSCs i minst 5 minutter.
    2. Legge til 30 µM 4-AP aCSF gjennom perfusjon systemet. Registrere sEPSCs på minst 10 min.
    3. Legge til 200 µM γ-DGG i aCSF med 4-AP og registrere sEPSCs på minst 10 min.
    4. En kontroll eksperiment i en egen celle, utfører trinn 1-3 men bruker en lav konsentrasjon (125 nM) av DNQX i stedet for γ-DGG.
    5. For offline analyse, analysere siste min av hvert legemiddel program.
  4. Eksperiment 4: Stimulere afferente innganger for å øke handling potensial avfyring.
    1. Post sEPSCs i normale Ca2 + aCSF.
    2. Stimulere afferente bruker en monopolar glass elektrode fylt med aCSF med en hastighet på 20 Hz for 2 s og gjenta 10 ganger med et Inter burst intervall på 20 sek.
    3. For analyse, bruke 5000 ms før første stimulans som grunnlinjen sammenlignet med 10-300 ms etter siste stimulans og deretter ta gjennomsnittlig amplitude og frekvens endre over 10 prøvelser.

5. analyse

  1. Analysere sEPSCs og mEPSCs i et program som oppdager og analyserer synaptic strøm (f.eks Mini analyse programvare).
    1. Bruker denne programvaren, bruk foreslåtte gjenkjenning for å oppdage AMPA reseptoren EPSCs (eller GABA Receptor EPSCs hvis spiller hemmende strøm).
    2. Bruk Nonstop analysefunksjonen for å oppdage EPSCs i innspillingen.
    3. Manuelt avsøke hver innspilling for å sikre at programmet er nøyaktig oppdage hver hendelse (f.eks sikre hendelser ikke blir savnet eller telt to ganger).
    4. Eksportere hendelsesdataene kopiere det til utklippstavlen og lime den inn i en data programvare (f.eks Excel)
    5. Beregne gjennomsnittlig frekvens og/eller amplitude for hver behandling og utfører de relevante statistiske analysene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Over protokollen beskriver en metode for å bruke hele celle oppdateringen klemme elektrofysiologi for å undersøke graden av synaptic mangfold, bruke musen hypothalamus nevroner som et eksempel. Denne stykke forberedelse teknikken skal gi friske levedyktig celler som ikke har en hoven membran eller kjernen (figur 1). Hvert trinn i protokollen er viktig for helsen til vev og kvaliteten på opptakene.

Figure 1
Figur 1: friske og usunn vev følgende skjær forberedelse. Skjær elektrofysiologi utarbeidelse av PVN under differensial forstyrrelser kontrast optikk på 40 x forstørrelse. Rød pilspisser angir friske celler, og svart pilspisser angir usunn celler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2 viser begrunnelsen for å identifisere synaptic mangfold bruker oppdateringen klemme elektrofysiologi. Synaptiske mangfold kan skyldes enten flere synaptic kontakt mellom nerveceller (figur 2A venstre) eller ved multivesicular utgivelse på et gitt synaptic område (figur 2A høyre). I begge disse situasjonene, ville en handling potensial i presynaptic Nevron framprovosere stor postsynaptic svar (sEPSC) på grunn av timelige summering av flere synaptic hendelser. Men i fravær av presynaptic handling potensialer (f.eks i nærvær av TTX og Cd2 + blokkere Na+-avhengige og Ca2 +-avhengige handling potensial avfyring), vesicula nevrotransmitter-løslate er asynkron. Resultatet postsynaptic svaret blir mindre (figur 2B: AP-uavhengig). Hvis to neurons ikke stiller mangfold (dvs. har bare én synaptic kontakt/nei multivesicular utgivelse) vil det ikke være noen forskjell i postsynaptic svaret mellom action potensial-avhengige og handling potensial-uavhengig utgivelsen av nevrotransmitter (figur 2C).

Figure 2
Figur 2: Skjematisk diagram illustrerer konsekvensene av ulike synaptic organisasjoner på postsynaptic strømninger. (A, B) I en synapse mangfold, en handling potensial og påfølgende Ca utløser2 + tilstrømningen synkron fusjon av flere synaptic blemmer som resulterer i store, multiquantal EPSCs. Synaptiske mangfold kan skyldes multisynapse kontakt eller multivesicular versjon på en enkelt synapse (A). I nærvær av TTX og Cd2 +, action potensial-uavhengig vesicle fusion er asynkron og forårsaker liten uniquantal EPSCs (B). (C) i synapser uten mangfold, både handlingen potensial-avhengige og -uavhengig vesicle fusion resulterer i uniquantal EPSCs. Dette tallet er endret fra figur 1A av vår forrige rapport6. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Eksperiment 1 brukes 4-AP til badekaret å øke handling potensial skyte og slipp sannsynlighet. For å sikre at 4-AP øker spontan handling potensial avfyring, kan hyppigheten av EPSCs sammenlignes mellom sEPSCs og mEPSCs (figur 3A, C). Fordi sEPSCs er en kombinasjon av både handlingen potensial-avhengige og - uavhengig, fungerer forskjellen i frekvensen av sEPSC og mEPSC som en proxy for spontane handling potensielle skyte i presynaptic axons. Vi bruker en vilkårlig kuttet av av > 15% forskjell i frekvens sEPSC å mEPSC å sikre at det finnes et tilstrekkelig antall handling potensial-avhengige hendelser for analyse av mangfold. Hvis EPSCs i lav Ca2 + tilstanden og betingelsen TTX (mEPSC) er lignende i frekvens og amplitude (dvs. ingen spontan handling potensielle avfyring lav Ca2 + tilstanden), forskjellen mellom den lave Ca2 + planlagte sEPSC og 4 -AP kan også brukes for analyse av mangfold.

I et eksempel øker resultatet som vises i Figur 3, 4-AP både amplitude og hyppigheten av sEPSCs. Anvendelse av TTX og Cd2 + reduserer både amplitude og frekvens. Som beskrevet ovenfor viser forskjellen i amplituden mellom sEPSCs og mEPSCs synaptic mangfold. I hypothalamus nevroner vi undersøke her, amplitude og hyppigheten av den opprinnelige TTX er det samme (Figur 3 c, D), antyder at de planlagte sEPSCs inneholder svært få handling potensial-avhengige EPSCs. Følgelig kan etterfølgende eksperimenter sammenligne forskjellen mellom planlagte og 4-AP måle mangfold.

Figure 3
Figur 3:. 4-AP programmet avslører synaptic mangfold. (A) prøven spor av sEPSCs registrert i lav Ca2 + aCSF under grunnlinjen og etter 4-AP (30 μM) program og påfølgende TTX (0,5 μM) og Cd2 + (10 μM) program. (B) distribusjon av sEPSC amplitude fra innspillingen vises i (A). (C, D) Sammendrag av gjennomsnittlig frekvens (C) og amplituden (D) mellom opprinnelig plan (grå), 4-AP (rød) og TTX + Cd2 + (blå). P < 0.005, ** P < 0,01. Dette tallet er endret fra figur 2 vår forrige rapport6. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Metoden beskrevet ovenfor beregner gjennomsnittlig mangfoldet av synapser avslutning på postsynaptic neurons: det kan ikke oppdager endringer i mangfold som oppstå en liten andel av synapser. Likevel, i vår siste undersøkelse, denne metoden viste endringer i mangfoldet av glutamat synapser på hypothalamus nevroner mellom normal og kronisk stresset forhold6.

Substitusjon av Ca2 + med ekvimolare Sr2 + i aCSF desynchronizes handling potensial-avhengige utgivelsen av nevrotransmitter blemmer 19, 20. Derfor, hvis store amplituden sEPSCs summering av handlingen potensial-avhengige synkronisert vesicula nevrotransmitter utgivelsen (dvs. mangfold), erstatte Ca2 + med Sr2 + vil redusere amplituden til EPSCs. Som vist i Figur 4, Sr2 + aCSF reduserer andelen av store amplituden hendelser (figur 4B), og som en konsekvens synker gjennomsnittlig amplituden (figur 4C). Når cellene ikke stiller mangfold, vil desynchronizing vesicle utgivelsen har ingen innvirkning på EPSC amplituden.

Figure 4
Figur 4: Sr2 + desynchronizes store multiquantal arrangementer. (A) representant spor sammenligning mellom normal Ca2 + aCSF og Sr2 + aCSF. SR2 + aCSF desynchronizes vesicle utgivelsen og reduserer amplituden til multiquantal synkrone hendelser som sett i en representant amplituden distribusjon (B) og amplituden endringen for alle celler (C) * P < 0,05. Dette tallet er endret fra Figur 3 vår forrige rapport6. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Den ble-DGG, en rask dissociating konkurransedyktig antagonist av AMPA reseptorer, kan brukes til å bestemme om mangfold skyldes at multivesicular eller flere synaptic kontakter. Som multivesicular versjonen fungerer på en overlappende befolkning av postsynaptic reseptorer, innebærer i store amplituden EPSCs av glutamat i den synaptiske kløften. Med andre ord, er konsentrasjonen av glutamat i den synaptiske kløften høyere enn som resultatene fra uniquantal utgivelse. På den annen side, må multisynaptic kontakter uniquantal EPSCs på hvert synaptic nettsted. Hvis store amplituden EPSCs oppstår fra multivesicular utgivelse, vil de større EPSCs bli mindre påvirket av γ-DGG antagonisme (på grunn av høyere glutamat konsentrasjon) sammenlignet med mindre amplituden EPSCs (figur 5A rett, B-D). Hvis store amplituden EPSCs er på grunn av samlede synkron uniquantal EPSCs (multisynapse kontakter), påvirker den ble-DGG tilsvarende amplituden til alle EPSCs (figur 5A venstre, E-G). I motsetning til γ-DGG, DNQX som er høy affinitet, sakte dissociating AMPA/kainate reseptor antagonist forårsaker en jevn nedgang over alle store og små amplituden EPSCs ((figur 5 H)-J). Følsomheten til γ-DGG og DNQX kan kvantifiseres som forholdet mellom gjennomsnittlig EPSC amplituden dividert med maksimalt (gjennomsnitt av de største 20 EPSCs) EPSC amplitude ()figur 5 K, L).

Figure 5
Figur 5: bruke γ-DGG for å undersøke multivesicular utgivelsen. (A) skjema illustrerer to modeller av mangfold. Venstre: timelige summering av uniquantal-overføring som mål uavhengig bestander av postsynaptic reseptorer. Store og små EPSCs oppnås ved en lignende glutamat konsentrasjon i den synaptiske kløften og derfor er like følsom for γ-DGG. Høyre: multiquantal overføring som mål en overlappende befolkning på postsynaptic reseptorene. Store EPSCs skyldes høyere glutamat konsentrasjon i kløften enn mindre sEPSCs og er derfor mindre følsomme til γ-DGG. Vises nederst i modellen er hypotetisk relative amplituder. (B) prøven spor fra et opptak der det var en økning i gjennomsnittlig sEPSC amplitude følgende 4-AP program (4-AP responder). (C) kumulativ tomten for EPSC amplitude for opptak i (B). (D) kumulativ tomten for normalisert EPSC amplitude (EPSC/EPSCMAX) før og etter bruk av γ-DGG fra innspillingen vises i (B). (E) prøve spor fra et opptak der var det ingen endring i mener sEPSC amplituden etter 4-AP program (ikke 4-AP feriesvaret). (F) kumulative EPSC amplitude for opptak i (E). (G) kumulative EPSC/EPSCMAX plot for opptak i (E). (H) prøven spor fra et opptak fra baseline og etter 4-AP og DNQX programmet. (jeg) den kumulative EPSC amplitude for opptak i (H). (J) kumulative EPSC/EPSCMAX plot for opptak i (H). (K) Sammendrag betyr EPSC/EPSCMAX etter γ-DGG (i 4-AP responder og ikke-responder grupper) eller DNQX program normalisert til pre-γ-DGG/DNQX (dvs. innlegg-4-AP). (L) tomter innlegg-4-AP mener EPSC amplitude (normalisert til pre-4-AP) mot innlegg-γ-DGG/DNQX bety EPSC/EPSCMAX (normalisert til post-4-AP). P < 0.005. Dette tallet er endret fra Figur 4 av vår forrige rapport6. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Styrken i synaptic overføring kan transiently økes ved støt synaptic aktivitet. Undersøke mangfold under flere fysiologiske forhold, kan afferente stimulering brukes til å øke handling potensial skyting og slipp sannsynlighet. Hvis mangfold, skal afferente stimulering gi en kort økning i EPSC amplituden (figur 6AD). Hvis multiplisiteten ikke er tilstede, vil aktivitet drevet øker i handlingen potensial avfyring ikke øke EPSC amplituden.

Figure 6
Figur 6: høyfrekvente stimulering avslører synaptic mangfold. (A) prøven spor av sEPSCs før og etter afferente synaptic stimulering. (B) tomt sEPSC amplitude før og etter synaptic stimulering (20 Hz, 2 s) fra innspillingen vises i (A). (C, D) Sammendrag av sEPSC frekvens (C) og amplituden (D) endringer etter synaptic stimulering. P < 0,001, * P < 0,05. Dette tallet er endret fra figur 5 av vår forrige rapport6. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En viktig forutsetning for en vellykket oppdatering klemme elektrofysiologi eksperimentet er å få sunn skiver/celler. Våre beskrevet protokollen er optimalisert for hypothalamus skiver som inneholder PVN neurons. Andre hjernen områder kan kreve endret løsninger og slicing metoder21,22,23,24. Opptaket, er det avgjørende å bare godta stabil opptak ved å kontinuerlig overvåke egenskaper som membran, kapasitans og tilgang. En økning i tilgang motstand kan redusere EPSC amplitude og derfor forvirre amplituden målinger. Følgelig forkastes celler med tilgang motstand verdier som overstiger 20 MΩ eller øke med mer enn 20% under opptak. Tilsvarende en nedgang i (eller en lav) membran motstand kan medføre dårlig plass-klemme, og derfor kan redusere amplituden. Neurons i målsystemet vårt (parvocellular PVN nevroner) har en høy membran motstand mellom 500 MΩ og 1 GΩ, og vi kaste celler med membran motstand under 500 MΩ. Kvalitetskontroll avskjær bør opprettes for bestemte typer nerveceller under studien. Som denne protokollen avhengig av forskjellen i amplituden før og etter stoffet søknader, er det viktig å sikre at amplituden endringen er på grunn av narkotika-bruk og ikke endringene i membranen motstand og tilgang motstand. Hypothalamus nevroner vi studere i denne protokollen er små i størrelse (celle kapasitans er ca 15 pF i mus og membran motstand er rundt 1 GΩ), og K-gluconate basert intern løsning fungerer godt for å få høy kvalitet EPSCs/IPSCs6,25 . For neurons med større Cellestørrelse og lav input motstand, kan cesium basert intern løsning brukes til å sikre en god plass-klemme2.

En bestemt forutsetning av benytter denne metoden for å måle mangfoldet er at cellene skyte et tilstrekkelig antall spontan handling potensialer for å sammenligne handling potensial-avhengige hendelser til mEPSCs. Dette kan sikres ved å sammenligne forskjellen i frekvensen av EPSCs i fravær og tilstedeværelsen av TTX og Cd2 +. I hypothalamus skiver som inneholder PVN, har vi funnet at anvendelsen av 4-AP er effektivt å framprovosere handling potensial avfyring. En annen metode, utviklet av Hsia og kolleger2, bruker høy Ca2 + aCSF å øke handling potensial avfyring, i stedet for 4-AP. Mens denne metoden var vellykket i hippocampus skiver, vi fant at høy Ca2+ var mindre effektiv enn 4-AP å tilrettelegge handling potensial avfyring i hypothalamus skiver6. Faktisk har det vært vist at høye, ekstracellulære Ca2 + konsentrasjonen avtar iboende excitability av neurons og axons ved å endre Na+ konduktans26,27. Dette kan forklare hvorfor i noen skiver, høy Ca2 + aCSF er ikke effektivt øke EPSC hyppigheten.

En begrensning av denne metoden, som er en del alle skive oppdateringen klemme elektrofysiologi, er at mange, langtrekkende anslag til postsynaptic neurons kuttet i skive forberedelser. For å observere handlingen potensialene, er det sannsynlig at presynaptic axons og cellen legemer må bevart i stykket. Derfor er mangfold målingen skjev til synaptic tilkobling som beholdes i stykket. Langs samme linje, kan retning kutting forårsake enkelte bestander av anslag bevart mens andre er kuttet28. Disse begrensningene har en generell effekt av underslår mangfoldet av afferente innganger.

Beskrevet protokollen inneholder en metode for å estimere graden av synaptic mangfold på tvers av alle innganger til en gitt Nevron. Andre elektrofysiologi teknikker, slik som par opptak eller minimal stimulering av et enkelt axon kan identifisere om en gitt tilkobling har flere kontakter, men disse eksperimentene er ofte vanskelig og ikke mulig på alle systemer. Videre, de kan ikke gi en generell indikasjon på organiseringen av alle innganger til en gitt Nevron som de bare isolere ett par av neurons. Nåværende protokollen bruker grunnleggende patch-klemme elektrofysiologi metoder for å vurdere graden av mangfold på tvers av alle innganger til en gitt Nevron.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre

Acknowledgments

JS fikk Ontario Graduate Scholarship. W.I. fikk en ny etterforsker Fellowship fra Mental Health Research Canada. Dette arbeidet er støttet av drift tilskudd til W.I naturvitenskap Engineering Research Council of Canada (06106-2015 RGPIN) og Canadian Institute for Health Research (PJT 148707).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL syringe BD 309659
10 blade Fisher Scientific/others 35698
22 blade VWR/others 21909-626
22 μM syringe filters Milipore 09-719-000
Adson foreceps Harvard Instruments 72-8547
Angled sharp scissors Harvard Instruments 72-8437
Clampex Molecular Devices pClamp 10
Double edge blade VWR 74-0002
Filter paper Sigma/others 1001090
Fine paintbrush Fisher/various 15-183-35/various
Gas Dispersion Tube VWR LG-8680-120
Isoflurane Fresenius Kabi/others M60303
Krazy glue various various
Mini analysis Synaptosoft MiniAnalysis 6
Osmomoter Wescor Inc Model 5600
Parafilm Sigma PM-996
Pasteur pipette VWR 14672-200
ph meter Mettler Toledo FE20-ATC
Rubber bulb VWR 82024-550
Scalpel handle No. 3 Harvard Instruments 72-8350
Scalpel handle No. 4 Harvard Instruments 72-8356
Single edge blade VWR 55411-050
Vibratome slicer Leica VT1200S
Water Purification System Millipore Milli-Q Academic A10
Well plate lid Fisher/various 07-201-590/various
Chemicals/reagents
4-AP Sigma 275875
BAPTA molecular probes B1204
CaCl2*2H2O Sigma C7902
CdCl2 sigma 202908
DNQX Tocris 189
EGTA Sigma E3889
glucose Sigma G5767
HEPES Sigma H3375
K2-ATP Sigma A8937
KCl Sigma P9333
K-gluconate Sigma G4500
MgCl2*6H2O Sigma M2670
Molecular biology grade water Sigma W4502-1L
Na3GTP Sigma G8877
NaCl Bioshop SOD001.1
Na-gluconate Sigma S2054
NaH2PO4 Sigma 71504
NaHCO3 Sigma S6014
Picrotoxin sigma P1675
SrCl Sigma 255521
sucrose Bioshop SUC507.1
TTX Alamone Labs T-550
yDGG Tocris 6729-55-1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abbott, L. F., Nelson, S. B. Synaptic plasticity: taming the beast. Nature Neuroscience. 3 (Supp), 1178-1183 (2000).
  2. Hsia, A. Y., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Development of Excitatory Circuitry in the Hippocampus. Journal of Neurophysiology. 79 (4), 2013-2024 (1998).
  3. Zhan, Y., et al. Deficient neuron-microglia signaling results in impaired functional brain connectivity and social behavior. Nature neuroscience. 17 (3), 400-406 (2014).
  4. Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science (New York, N.Y). 333 (6048), 1456-1458 (2011).
  5. Schrader, L. A., Tasker, J. G. Presynaptic Modulation by Metabotropic Glutamate Receptors of Excitatory and Inhibitory Synaptic Inputs to Hypothalamic Magnocellular Neurons. Journal of Neurophysiology. 77 (2), 527 (1997).
  6. Salter, E. W., Sunstrum, J. K., Matovic, S., Inoue, W. Chronic stress dampens excitatory synaptic gain in the paraventricular nucleus of the hypothalamus. The Journal of Physiology. 596 (17), 4157-4172 (2018).
  7. Redman, S. Quantal analysis of synaptic potentials in neurons of the central nervous system. Physiological Reviews. 70 (1), 165-198 (1990).
  8. Del Castillo, J., Katz, B. Quantal components of the end-plate potential. The Journal of physiology. 124 (3), 560-573 (1954).
  9. Stevens, C. F. Quantal release of neurotransmitter and long-term potentiation. Cell. 72 Suppl, 55-63 (1993).
  10. Deger, M., Helias, M., Rotter, S., Diesmann, M. Spike-timing dependence of structural plasticity explains cooperative synapse formation in the neocortex. PLoS computational biology. 8 (9), e1002689 (2012).
  11. van den Pol, A. N., Wuarin, J. P., Dudek, F. E. Glutamate, the dominant excitatory transmitter in neuroendocrine regulation. Science (New York, N.Y). 250 (4985), 1276-1278 (1990).
  12. Miklós, I. H., Kovács, K. J. Reorganization of synaptic inputs to the hypothalamic paraventricular nucleus during chronic psychogenic stress in rats. Biological Psychiatry. 71 (4), 301-308 (2012).
  13. Korn, H., Triller, A., Mallet, A., Faber, D. S. Fluctuating responses at a central synapse: n of binomial fit predicts number of stained presynaptic boutons. Science (New York, N.Y.). 213 (4510), 898-901 (1981).
  14. Tracey, D. J., Walmsley, B. Synaptic input from identified muscle afferents to neurones of the dorsal spinocerebellar tract in the cat. The Journal of physiology. 350, 599-614 (1984).
  15. Lin, J. W., Faber, D. S. Synaptic transmission mediated by single club endings on the goldfish Mauthner cell. II. Plasticity of excitatory postsynaptic potentials. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 8 (4), 1313-1325 (1988).
  16. Atwood, H. L., Tse, F. W. Changes in binomial parameters of quantal release at crustacean motor axon terminals during presynaptic inhibition. The Journal of physiology. 402, 177-193 (1988).
  17. Li, G. L., Keen, E., Andor-Ardó, D., Hudspeth, A. J., von Gersdorff, H. The unitary event underlying multiquantal EPSCs at a hair cell’s ribbon synapse. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (23), 7558-7568 (2009).
  18. Wadiche, J. I., Jahr, C. E. Multivesicular release at climbing fiber-Purkinje cell synapses. Neuron. 32 (2), 301-313 (2001).
  19. Oliet, S. H., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Bidirectional control of quantal size by synaptic activity in the hippocampus. Science (New York, N.Y.). 271 (5253), 1294-1297 (1996).
  20. Inoue, W., et al. Noradrenaline is a stress-associated metaplastic signal at GABA synapses. Nature Neuroscience. 16 (5), 605-612 (2013).
  21. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute Brain Slice Methods for Adult and Aging Animals: Application of Targeted Patch Clamp Analysis and Optogenetics. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). , 1183-242 (2014).
  22. Richerson, G. B., Messer, C. Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing. Experimental neurology. 131 (1), 133-143 (1995).
  23. Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice. Journal of neuroscience methods. 171 (1), 118-125 (2008).
  24. Ye, J. H., Zhang, J., Xiao, C., Kong, J. Q. Patch-clamp studies in the CNS illustrate a simple new method for obtaining viable neurons in rat brain slices: glycerol replacement of NaCl protects CNS neurons. Journal of neuroscience methods. 158 (2), 251-259 (2006).
  25. Gunn, B. G., et al. Dysfunctional astrocytic and synaptic regulation of hypothalamic glutamatergic transmission in a mouse model of early-life adversity: relevance to neurosteroids and programming of the stress response. Journal of Neuroscience. 33 (50), 19534-19554 (2013).
  26. Su, H., Alroy, G., Kirson, E. D., Yaari, Y. Extracellular calcium modulates persistent sodium current-dependent burst-firing in hippocampal pyramidal neurons. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 21 (12), 4173-4182 (2001).
  27. Frankenhaeuser, B., Hodgkin, A. L. The action of calcium on the electrical properties of squid axons. The Journal of physiology. 137 (2), 218-244 (1957).
  28. Xiong, G., Metheny, H., Johnson, B. N., Cohen, A. S. A Comparison of Different Slicing Planes in Preservation of Major Hippocampal Pathway Fibers in the Mouse. Frontiers in neuroanatomy. 11, 107 (2017).

Tags

Nevrovitenskap problemet 146 hele celle patch-klemme elektrofysiologi ex vivo synaptic overføring synaptic gevinst mangfold paraventricular kjernen av hypothalamus corticotropin-releasing hormone hypothalamus
Evaluering av Synaptic mangfold bruker hele-celle Patch-klemme elektrofysiologi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sunstrum, J. K., Inoue, W.… More

Sunstrum, J. K., Inoue, W. Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology. J. Vis. Exp. (146), e59461, doi:10.3791/59461 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter