Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Sinaptik çeşitlilik bütün hücreli yama-kelepçe Elektrofizyoloji kullanarak değerlendirilmesi

Published: April 23, 2019 doi: 10.3791/59461

Summary

Burada, Bütün hücre yama kelepçe Elektrofizyoloji akut beyin dilimler halinde kullanarak fonksiyonel sinaptik çeşitlilik değerlendirmek için bir iletişim kuralı mevcut.

Abstract

Merkezi sinir sistemi nöronlar bir çift sık sık birden çok sinaptik kişiler ve/veya fonksiyonel nörotransmitter yayın siteleri (sinaptik çeşitlilik) oluşturur. Sinaptik plastik ve değişiklikler geliştirme boyunca ve sinaptik iletimi etkinliği için önemli bir belirleyici olmak farklı fizyolojik koşullarda olduğunu. Burada, Bütün hücre yama kelepçe Elektrofizyoloji akut beyin dilimler halinde kullanarak belirli bir postsinaptik nöron üzerine sonlandırma sinapslarda çokluğu derecesini tahmin etmek için deneyler anahat. Özellikle, Gerilim Tipi Kelepçe kayıt spontan eksitatör postsinaptik akımları (sEPSCs) genliği ve minyatür eksitatör postsinaptik akımları (mEPSCs) arasında fark karşılaştırmak için kullanılır. Bu yöntem arkasında çeşitlilik gösteren afferent girişleri her sinaptik temas oluşur zaman uyumlu sürümü nedeniyle büyük, Aksiyon potansiyeli bağımlı sEPSCs gösterecektir teoridir. Buna ek olarak, (zaman uyumsuz olan) aksiyon potansiyeli bağımsız yayın daha küçük genlik mEPSCs oluşturur. Bu makalede birtakım deneyler ve analizler sinaptik çeşitlilik varlığını karakterize için özetliyor ve teknik sınırlamaları ve gereksinimleri verilmektedir. Bu teknik vivo etkiler sinaptik kişiler farklı beyin bölgeleri'organizasyonu nasıl farklı davranış, farmakolojik ya da çevresel müdahaleleri araştırmak için uygulanabilir.

Introduction

Sinaptik iletimi nöronlar arasındaki iletişim için temel bir mekanizmadır ve dolayısıyla, beyin işlev. Sinaptik iletimi aynı zamanda değişken ve onun etkinliğini de yanıt düzenleyici sinyaller1gibi bir etkinlik bağlı şekilde değiştirebilirsiniz. Böylece, sinaptik fonksiyon incelenmesi nörolojik araştırma anahtar bir odağı olmuştur. Bütün hücre yama kelepçe Elektrofizyoloji anlamak, tasarlayarak Deneysel Tasarımlar ve veri analizleri, derinlemesine biyofiziksel ve moleküler mekanizmaları sinaptik iletimi için bize sağlar çok yönlü bir tekniktir. Yaygın olarak kullanılan bir yaklaşım, belki teknik ve kavramı sayesinde, minyatür eksitatör/inhibitör postsinaptik akımların ölçülmesi basitliğidir (bana / IPSCs) gerilim altında yapılandırma2,3, kelepçe 4 , 5 , 6. bireysel ÇATOM presynaptic terminalden 7 serbest bırakmak onların anılan sıraya göre nörotransmitter bağlama cevaben iyonlar aracılığıyla postsinaptik ionotropic reseptörleri (örneğin AMPA ve GABAA reseptörleri) akışını temsil . Kayıt voltaj Na+ kanal engelleyici Tetradotoksin varlığında (TTX) elde edilir çünkü serbest aksiyon potansiyeli bağımsızdır ve normalde nörotransmitter içeren tek bir sinaptik vezikül içerir. Bu duymadığını, ÇATOM ortalama genliği yaygın sayı ve bir tek yayın sitesi karşı postsinaptik reseptörleri işlevini temsil eden quantal boyutu için kaba bir tahmin olarak kullanılır. Öte yandan, ÇATOM sıklığını postsinaptik hücre ve onların ortalama yayın olasılık üzerine sonlandırma sinapslarda toplam sayısı bir arada temsil etmek için kabul edilir. Ancak, bu parametreler başka bir değişken-multiplicativity sinapslar veya sinaptik çeşitlilik ölçüyor musunuz — hangisi sinaptik iletimi etkinliği için önemli.

Sinaptik iletimi7,8,9quantal teorisi üzerinde bağlı olarak, bir çift nöronların arasında belirli bir bağlantı gücü üç faktöre bağlıdır: fonksiyonel sinapslarda (N) sayısı postsinaptik yanıt-e doğru serbest bırakmak-in tek sinaptik vezikül (quantal boyutu; Q) ve nörotransmitter yayın (Pr) olasılığı. Sinaptik çeşitlilik Niçin eşdeğerdir. Sinaptik çeşitlilik geliştirilmesi veya çarpma sinapslarda budama boyunca geliştirme ve farklı hastalık Birleşik3,4,6,10plastiktir. Bu nedenle, sinaptik çeşitlilik karakterize sağlık ve hastalığında sinaptik iletimi etkinliğini anlamak için önemli sonuçları vardır. Elektron mikroskobu gibi teknikleri sinaptik çeşitlilik yapısal kanıtı aynı postsinaptik nöron11,12üzerine aynı axon kaynaklanan birden fazla sinaptik kişi tespit ederek belirleyebilir, 13,14. Ancak, bu yapısal olarak tanımlanan multisynapses işlevsel olarak sessiz15,16olabilir. N kesin fonksiyonel inceleme gerektirir teknik olarak Elektrofizyolojik yaklaşımlar, belirli bir bağlantı birden çok fonksiyonel yayın siteleri olup olmadığını belirleyebilir eşleştirilmiş bütün hücreli kayıtları gibi zorlu ve en az tek bir sözde axon işe hedefliyoruz stimülasyon yaklaşımlar.

Bu protokol için başlangıçta Hsia ark2tarafından geliştirilmiş bir yöntem benimseyerek sinaptik çeşitlilik tahmin etmek için basit bir yöntem açıklanmaktadır. Bu teknik kendiliğinden PSC'ler (sPSCs) ve belirli bir neuron için tüm girişleri arasında sinaptik çeşitlilik derecesini tahmin etmek için bize izin verir tüm hücreli yama kelepçe Elektrofizyoloji kullanarak ÇATOM ölçümü içerir.  Gibi önceden tanımlanmış, sinaptik çeşitlilik belirli bir öncesi ve postsinaptik nöron arasındaki sinapslar sayısını yansıtır. Birden çok sinapslarda senkronizasyonu içinde bir aksiyon potansiyeli tarafından işe, büyük genlik PSC üreten bireysel (yani quantal) PSC zamansal toplamı yüksek bir olasılık olacak.  ÇATOM kayıtları (hangi aksiyon potansiyelleri TTX tarafından engellenen), geçici bireysel (zaman uyumlu) ÇATOM toplamı olasılığı düşüktür. Bu mantığı kullanarak, sinaptik çeşitlilik (Aksiyon potansiyeli bağımlı sürümüyle) sPSC genlik ÇATOM genlik için karşılaştırarak tahmin edilebilir.

Çeşitlilik varlığını incelemek için dört deneyleri ve onların analizleri glutamatergic EPSCs örnek olarak kullanarak açıklar. Ancak, aynı yaklaşımı-ebilmek var olmak kullanılmış için hızlı GABAergic/glycinergic iletim (IPSCs). Her deneme için kısa bir gerekçe aşağıda açıklanmıştır. İlk olarak, yukarıda açıklandığı gibi sinaptik çeşitlilik sEPSCs mEPSCs için genliği karşılaştırarak tahmin edilebilir. Bu yaklaşım için iki gereksinim vardır; 1) presynaptic akson kayıt sırasında aksiyon potansiyelleri yeterli sayıda yangın gerekir ve böylece birden çok sinapslarda sinir bir aksiyon potansiyeli girişte yayın 2) Pr yüksek olmalıdır. Bu gereksinimleri karşılamak üzere, sEPSCs ilk düşük Ca2 + yapay serebrospinal sıvı (aCSF) kaydedilir ve düşük konsantrasyon K+ kanal antagonisti, 4-eylem artırmak için Aminopyridine (4-AP) huzurunda kaydedildi potansiyel ateş ve Pr. O zaman aksiyon potansiyeli ateş TTX ve Pr bir voltaj Ca2 + kanal engelleyici tarafından Cd2 +azalmış tarafından engellendi. SEPSCs (4AP ile) genliği bu mEPSC karşılaştırılır (4AP, TTX ve Cd2 +). İkinci denemede Ca2 + ekimolar Sr2 + vezikül yayın desynchronize aCSF olarak değiştirilir. CA2 + veziküller zaman uyumlu sürümü için gerekli olduğu gibi değiştirme ile Sr2 + çokluğu işaret etmektedir büyük genlik sEPSCs ortadan kaldırmak gerekir. Üçüncü olarak, mechanistically, çeşitlilik birden çok sinaptik ilgili kişiler aynı postsinaptik nöron veya multivesicular açıklaması (içinde tek bir sinaptik kişiyi serbest Yani çoklu veziküller) neden olabilir17,18. Çeşitlilik iki tür arasında ayırt etmek için üçüncü deneme kullandığı bir düşük benzeşme, hızlı dissociating rekabetçi antagonist AMPA reseptör, γ-D-glutamylglycine (γ-DGG)17,büyük olup olmadığını belirlemek için18 sEPSC multivesicular serbest postsinaptik reseptörleri örtüşen bir popülasyon üzerinde hareket veya bağımsız sinapslarda zamansal özetleme sonucudur. Büyük genlik olayları multivesicular yayınlamasını ortaya çıkarsa, birden fazla sinaptik kişi zamansal toplamı ortaya büyük sEPSCs benzer şekilde etkilenecek ise γ-DGG büyük kıyasla daha küçük sEPSCs, engelleme daha az etkili olacak γ-DGG. Dördüncü denemede daha fizyolojik bir yöntem aksiyon potansiyeli ateş, yani afferent sinaptik uyarma arttırmak için kullanılır. Sinirsel aktivite patlamaları geçici artış/uyarılan afferents spontan aksiyon potansiyeli ateş ve yayın olasılığını kolaylaştırabilir. Bu nedenle, bu yaklaşım daha fizyolojik bir şekilde tezahür etmeye çeşitlilik sağlar.

Aşağıdaki iletişim kuralı bu deneyler fare hipotalamik doku yöntemler açıklanmıştır. Özellikle, kortikotropin serbest hormon (İBB) nöronlar hipotalamus (PVN) paraventricular çekirdeği kullanılır. Biz bütün hücreli yama kelepçe Elektrofizyoloji yürütmek için yordamlar açıklar ve sinaptik çeşitlilik için test etmek için belirli deneyler açıklamak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm hayvan deneyleri hayvan bakımı Komitesi, University of Western Ontario'dan uygun olarak hayvan bakım kuralları (AUP #2014-031) Kanada Konseyi tarafından onaylanır.

1. çözümler

  1. Çözüm Dilimleme
    1. Dilimleme çözüm kompozisyon için Tablo 1 ' e bakın.
    2. 20 x hisse senedi çözüm önceden hazırlamak ve 4 ° C'de 1 ay için saklayın.
    3. 1 x Dilimleme çözüm, NaHCO3, glikoz ve sukroz GKD2O içinde dağıtılması ve 20 x hisse senedi ekleyin. OSMOLARİTE 315-320 mOsm arasında olduğundan emin olun ve çözüm en fazla 1 hafta 4 ° C'de depolayın
    4. İki kadehler çözüm Dilimleme 100 mL ile doldurulması ve onları parafilm ile kaplayın. Çözüm bir dondurucu içinde chill kadar çözüm kısmen (yaklaşık 20 dk-80 ° C dondurucu) donmuş olur. Dağılım tüp gaz kullanarak kabarcık çözüm ile % 95'i O2/5% CO2 20 dk için buza Dilimleme her iki kadehler.
Çözüm konsantrasyonları (mM)
Dilimleme Normal aCSF Düşük Ca2 + aCSF SR+ aCSF Pipet/iç
NaCl 87 126 126 126 -
KCl 2.5 2.5 2.5 2.5 8
CaCl2 0,5 2.5 0,5 - -
SrCl2 - - - 2.5 -
MgCl2 7 1.5 2.5 1.5 2
NaH2PO4 1,25 1,25 1,25 1,25 -
NaHCO3 25 26 26 26 -
Glikoz 25 10 10 10 -
Sükroz 75 - - - -
K-glukonat - - - - 116
Na-glukonat - - - - 12
HEPES - - - - 10
K2-EGTA - - - - 1
K2ATP - - - - 4
Na3GTP - - - - 0,3

Tablo 1: Çeşitli çözümler bileşimi.

  1. aCSF (için dilim kurtarma ve bakım)
    1. Tablo 1 ' e aCSF kompozisyon için başvurun.
    2. 20 x hisse senedi çözüm önceden hazırlamak ve 4 ° C'de 1 ay için saklayın.
    3. 1 x aCSF, NaHCO3 ve glikoz GKD2O çözmek ve 20 x hisse senedi ekleyin. OSMOLARİTE 298-300 mOsm arasında olduğundan emin olun. Çözüm 1 gün içinde kullanın.
  2. aCSF (düşük Ca2 + kayıt için)
    1. Tablo 1 ' e düşük Ca2 + aCSF kompozisyon için başvurun.
    2. 20 x hisse senedi çözüm önceden hazırlamak ve 4 ° C'de 1 ay için saklayın.
    3. NaHCO3 ve ddH2O glikoz düşük Ca2 + aCSF x 1 için dağıtılması ve 20 x (CaCl2 ve MgCl2 ücretsiz) eklemek hisse senedi, CaCl2 ve MgCl2 ' ye belirtilen konsantrasyonlarda. OSMOLARİTE 298-300 arasında olduğundan emin olun. Çözüm 1 gün içinde kullanın.
  3. aCSF (Sr2 + kayıt için)
    1. Sr2 + aCSF kompozisyon için Tablo 1 ' e bakın.
    2. 20 x hisse senedi çözüm önceden hazırlamak ve 4 ° C'de 1 ay için saklayın.
    3. NaHCO3 ve glikoz GKD2O Sr2 + aCSF x 1 için dağıtılması ve 20 x (CaCl2 ve MgCl2 ücretsiz) eklemek hisse senedi, SrCl2 ve MgCl2 ' ye belirtilen konsantrasyonlarda. OSMOLARİTE 298-300 arasında olduğundan emin olun. Çözüm 1 gün içinde kullanın.
  4. İç çözüm
    1. Tablo 1 ' e K-glukonat dayalı iç çözüm kompozisyon için başvurun.
    2. 20 mL iç çözeltisi yapmak için 50 mL tüp 15 mL moleküler biyoloji sınıf su ekleyin. Sonraki adımları buz üzerinde gerçekleştirin.
    3. Aşağıdaki çözümleri önde-in zaman 1 M hisse senedi konsantrasyonları Moleküler biyolojide sınıf su hazırlamak. (ML) ekleme: 2,32 K-glukonat, 0,24 Na-glukonat, 0.20 HEPES, 0.16 KCl, 0,05 K2-EGTA, 50 mL tüp 0,04 MgCl2 .
    4. 0,3 M Na3GTP 100 µL ekleyin.
    5. K2ATP bir 2 mL microcentrifuge tüp 44.08 mg tartmak ve moleküler biyoloji sınıf su 1 mL ekleyin, sonra 50 mL tüp için ekleyin.
    6. PH 7.2-7.4 ile 1 M KOH için ayarlayın. OSMOLARİTE 283-289 mOsm arasında olduğundan emin olun.

2. dilim hazırlık

  1. Araçları hazırlamak
    1. ACSF 200 mL (250 mL kabı 4 wells ve örgü ile inşa) kurtarma Odası'na ekleyin ve kurtarma odası bir su banyosu (35 ° C) yerleştirin.
    2. Odası parafin film ile kapak ve sürekli en az 20 dk bir cam dağılım tüp kullanarak % 95'i O2/5% CO2 aCSF kabarcık.
    3. Diseksiyon için aletler (neşter, açılı iyi makas, pens, iyi boya fırçası, plastik kaşık) ayarlayarak hazırlayın.
    4. Buz gibi Dilimleme eriyik--dan adım 1.1.4 yaklaşık 15 mL ile 60 mL şırıngaya doldur.
    5. Diseksiyon platform iyi bir tabak kapağı üzerinde bir filtre kağıdı koyarak hazırlamak.
    6. Buz tepsiye yerleştirip tepsiyi buz ile doldurma Dilimleme odası hazırlamak.
    7. Vibratome kadar tek kullanımlık bir bıçak bıçak tutucu güvence tarafından ayarlayın.
    8. Pasteur pipet ucu kırma ve Lastik ampul kırık sonuna yerleştirerek bir transfer pipet yapmak.
  2. Fare beynini incelememize
    1. Omurilik refleksleri yok olana %4 isoflurane ile doymuş bir odasında hayvan anestezi.
    2. Bir Giyotin kullanarak hayvan başını kesmek ve hızlı bir şekilde beyin kaldırın.
      1. Kaudal için gelen rostral No. 22 neşter bıçak ile bir ensizyon olun.
      2. Yanal kafa derisi başın her iki tarafta kabuğu.
      3. Kullanım iyi makas kafatası rostral (frontal kemik kenarına da dahil olmak üzere), için bir taraftan Kaudal üzerinde kesmek için beyin zarar vermemeye dikkat kullanarak.
      4. Kafatası parçası kaldırmak için kullanım forseps beyin kapalı ve beyin 15 mL şırınga adım 2.1.4 kullanarak buz gibi Dilimleme çözeltisi ile hızlı bir şekilde serin.
      5. Beyin kafatası dışarı kaldırın.
      6. Yer ile buz gibi Dilimleme eriyik (--dan adım 1.1.4) dolu kadehler birinde beyin ile % 95'i O2/5% CO2bubbled.
  3. Fare hipotalamus dilim hazırlamak
    1. Beyin için istenen beyin alan engellemek ve açı kesme (örneğin, koronal hipotalamik dilimler için optik hemisferlerine rostral ve bir bıçak kullanarak pons Kaudal doku kapalı trim ve Kaudal blok düz yüzey dik beynin tabanına sahip emin olmak).
    2. Filtre kağıdı kesilmiş bir parça kullanılarak, beyin ön taraftan almak ve anlık tutkal kullanarak holding plaka arka tarafına yapıştırın.
    3. Hızlı bir şekilde tutarak plaka Dilimleme odanın içine koyun ve odası kimden adım 1.1.4 ikinci kabı çözüm Dilimleme ile doldurun.
    4. Vibratome Dilimleme odası ve buz tepsiye güvenli.
    5. Dilimleme alanını (anterior ve posteiror beyne) tanımlamak ve 250 µm kalınlık koronal dilimleri Dilimleme başlar. Parametreleri tavsiye: 0.10 mm/s, genlik hız 2 mm.
    6. İstenen beyin bölgesi için uygun büyüklükte dilimlere kesin.
    7. 30-45 dk 35 ° C'de dilimleri yeniden elde etmek. Sonra kurtarma odası ısınma banyo gelen kaldırmak ve ek bir 30 dakika süreyle oda sıcaklığında günün geri kalanı için oda sıcaklığında tutmak dilimleri yeniden elde etmek dilimleri izin ve sürekli % %95 O2/5 ile banyo kabarcık devam CO2 .

3. bütün hücreli yama ClampRecording

  1. Yama Pipetler çekin
    1. Bütün hücre pipet çektirme 's Manuel kayıt için önerilen parametreleri kullanarak, 3-5 MΩ bir pipet direnç için yama Pipetler kalın duvarlı cam çek.
    2. Microsyringe (ticari veya ev yapımı), dolgu bir pipet ucu ile filtre uygulanmış iç çözüm kullanarak. Bir microsyringe yapmak, 1 mL şırınga ucu yanık ve ipucu oluşturma düşmeye izin verin uzun güzel bir ipucu.
  2. Bütün hücre yapılandırmasını almak
    1. Kayıt pipet hemen üstünde dilim ve ofset pipet gerilim kelepçe modunda geçerli yerleştirin. Pipet için hafif pozitif basınç uygulayın ve stopcock kilitle.
    2. Sağlam bir membran ile sağlıklı bir hücre seçin ve pipet içeren hücreyi yaklaşım. Pozitif basınç (yani bir yavaş dalga doku girerken) dokusunda hafif bir rahatsızlık neden olmamalıdır.
    3. Yavaş yavaş daha yakın pipet pipet hücre yüzeyinde küçük bir çukur oluşturur kadar Diyagonal hareket kullanarak cep getirmek devam edin.
    4. Pozitif basınç kilidi serbest bırakmak. Hücre bir mühür oluşmaya başlayacak ve direniş 1 GΩ artacaktır. Hücre-68, gerilim kelepçe tutun mV.
    5. Hücreye çapraz olarak aşırı basınç hücreden kaldırmak için uzak biraz çek.
    6. Hızlı ve yavaş pipet kapasite için telafi.
    7. Kısa bir emme hücre kırmak ve bütün hücre yapılandırmasını almak için pipet sahibine bağlı tüp yoluyla uygulanır.
    8. Hücre moda membran üzerinde test penceresinde bir Elektrofizyoloji veri toplama ve analiz yazılımı (örneğin, Clampex).
    9. Kayıt her gerilim kelepçe, daha önce aynı yazılımı kullanarak bir membran testi gerçekleştirmek ve ilgili parametreleri bir laboratuvar kitabı (membran direnç, erişim direnç ve kapasite) kaydedin.
    10. 27 – 30 ° C'de kayıt banyo ve Debi 1.5-2.0 mL/dk sonraki deneyler için sıcaklığını korumak.

4. çeşitlilik deneyler

  1. Deney 1: 4-AP kullanarak çeşitlilik tahmin ediliyor.
    1. Hücre-68, gerilim kelepçe tutun mV. Aynı yazılımı kullanarak, sEPSCs düşük Ca2 + aCSF ile banyo Ventriküler kaydedin. Sinirsel aktivite membran atılım kısa bir süre sonra yüksek olsa da istikrarlı temel kayıt emin olmak için bütün hücreli yapılandırma başladıktan sonra en az 5 dk kaydı.
    2. Bir micropipette kullanarak aCSF için 4-AP ekleyin ve banyo 30 µM 4-AP. kayıt sEPSCs tam uyuşturucu etkisi elde etmek en az 10 dk için geçerlidir.
    3. 0.5 µM TTX ve 10 µM Cd2 + 4-AP ile aCSF ekleyin ve kaydetmek için en az 10 dk mEPSCs.
    4. Çevrimdışı analiz için son 1 dk hemen önce 4-AP (içinde düşük Ca2 + aCSF), 4-AP uygulama 10 dk ve 10 dk TTX uygulamasının uygulama temellerin kullanın.
  2. Deney 2: Sr2 + kullanarak vezikül yayın desynchronize
    1. Normal Ca2 + aCSF (banyo aCSF ile aynı) kayıt sEPSCs en az 5 min için banyo Ventriküler süre.
    2. Normal Ca2 + aCSF geçmek ve Sr2 + aCSF (Kimden adım 1.4) ve kayıt sEPSCs Ventriküler başlar.
    3. Çevrimdışı analiz için büyük genlik sEPSCs veziküller zaman uyumlu sürümü nedeniyle olup olmadığını belirlemek için son 1 dk 10inci dakikaya Sr2 + aCSF uygulamasının (içinde normal aCSF) temellerin karşılaştırın.
  3. Deney 3: multivesicular yayın kullanmak için test γ- DGG
    1. Düşük Ca2 + aCSF kayıt sEPSCs içinde en az 5 min için.
    2. 30 µM 4-AP aCSF perfüzyon sistemi aracılığıyla ekleyin. Kayıt sEPSCs en az 10 dakika için.
    3. ACSF 4-AP ile 200 µM γ-DGG ekleyin ve kaydetmek için en az 10 dk sEPSCs.
    4. Bir denetim deney ayrı bir hücrede adımları gerçekleştirirken 1-3 ama geçerli bir düşük konsantrasyon (125 nM), γ-DGG yerine DNQX.
    5. Çevrimdışı için her ilaç uygulamanın son dk analizi.
  4. Deney 4: Aksiyon potansiyeli ateş artırmak için afferent girdileri uyarmak.
    1. Normal Ca2 + aCSF kayıt sEPSCs.
    2. ACSF de 20 Hz oranda 2 s ve tekrar için 10 kez 20 sn arası seri bir aralığı ile dolu bir monopolar cam elektrot kullanarak afferents uyarmak.
    3. Analiz için ilk uyarıcı önce 5.000 ms taban çizgisi olarak kullanın ve 10-300 ms sonra son uyarıcı karşılaştırın ve ortalama genlik ve frekans değişikliği 10 deneme gerçekleştirin.

5. analiz

  1. SEPSCs ve mEPSCs algılar ve sinaptik akımları (örneğin, Mini analiz yazılımı) çözümleyen bir program kullanarak analiz.
    1. Bu yazılımı kullanarak, önerilen tespit parametrelerden AMPA reseptör EPSCs (veya GABA reseptör inhibitör akımları kaydediliyorsa EPSCs) algılamak için kullanın.
    2. EPSCs kayıt algılamak için durmadan analiz işlevini kullanın.
    3. El ile tarama program doğru her olay algılama sağlamak için her kayıt (örneğin, olaylar değil varlık sağlamak cevapsız ya da iki kez sayılır).
    4. Olay verileri panoya kopyalayarak ve veri yönetimi yazılımı (örneğin, Excel) yapıştırın
    5. Ortalama frekansını ve/veya genlik her ilaç tedavisi için hesaplamak ve ilgili istatistiksel analizleri gerçekleştirebilirsiniz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Yukarıdaki Protokolü fare hipotalamik nöronlar örnek olarak kullanarak sinaptik çeşitlilik derecesini incelemek için bütün hücreli yama kelepçe Elektrofizyoloji kullanarak bir yöntem açıklanır. Bu dilim hazırlama tekniği bir şişmiş membran veya çekirdek (şekil 1) sahip olmayan sağlıklı hücrelerin verim. İletişim kuralı her adımda doku ve kalite kayıtları sağlığı için önemlidir.

Figure 1
Şekil 1: sağlıklı ve sağlıksız doku şu dilim hazırlık. PVN fark girişim kontrast optik altında hazırlanması Elektrofizyoloji 40 x büyütme oranında dilim. Kırmızı ok uçları sağlıklı hücreleri gösterir ve siyah ok uçları sağlıksız hücreleri gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2 sinaptik çeşitlilik yama kelepçe Elektrofizyoloji kullanarak tanımlamak için gerekçe göstermektedir. Sinaptik çeşitlilik nöronların (şekil 2A sol) veya belirli bir sinaptik siteye (şekil 2A değil)'multivesicular piyasaya tarafından bir çift arasında birden fazla ya da sinaptik temas neden olabilir. Bu durumların ikisinde birden çok sinaptik olayı zamansal özetleme nedeniyle büyük bir postsinaptik yanıt (sEPSC) presynaptic nöron bir aksiyon potansiyeli temin. Ancak, presynaptic aksiyon potansiyelleri yokluğunda (huzurunda Na+engellemek için örneğin TTX ve Cd2 + -bağımlı ve Ca2 +-bağımlı aksiyon potansiyeli ateş), veziküler nörotransmitter sürümüdür zaman uyumsuz. Sonuç olarak, postsinaptik yanıt küçülür (şekil 2B: AP-bağımsız). Eğer iki neurons çeşitlilik gösteren değil (yani sadece bir sinaptik iletişim/Hayır multivesicular yayın var) arasında bir fark yoktur postsinaptik yanıt aksiyon potansiyeli bağlı ve aksiyon potansiyeli bağımsız sürümü olacak nörotransmitter (şekil 2C).

Figure 2
Resim 2: Şematik diyagramı postsinaptik akımları farklı sinaptik örgütler sonuçlarını gösteren. (A, B) Çeşitlilik, bir aksiyon potansiyeli ve bunu takip eden Ca ile sinaps içinde zaman uyumlu büyük, multiquantal EPSCs neden birden çok sinaptik veziküller füzyonu2 + akını tetikler. Sinaptik çeşitlilik multisynapse kişi veya tek synapse (A)'multivesicular piyasaya neden olabilir. Huzurunda TTX ve Cd2 +, Aksiyon potansiyeli bağımsız vezikül füzyon zaman uyumsuzdur ve küçük uniquantal EPSCs (B) neden olur. (C) çeşitlilik olmadan sinapslarda içinde hem aksiyon potansiyeli bağlı ve - bağımsız vezikül füzyon sonuçları uniquantal EPSCs. Bu şekil--dan bizim önceki rapor6 şekil 1A değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Deney 1, 4-AP aksiyon potansiyeli ateş artırmak ve olasılık serbest bırakmak için banyo için uygulanır. Bu 4-AP ateş kendiliğinden aksiyon potansiyeli artmaktadır emin olmak için EPSCs frekans sEPSCs ve mEPSCs (şekil 3A, C) arasında karşılaştırılabilir. SEPSCs hem aksiyon potansiyeli bağlı ve - bağımsız olaylar bir arada olduğu için sEPSC ve mEPSC frekans farklılığı spontan aksiyon potansiyeli presynaptic akson ateş için bir proxy olarak hizmet vermektedir. Biz rasgele bir kesim kapalı > %15 arasında bir fark vardır sıklıkla sEPSC mEPSC aksiyon potansiyeli bağımlı olaylar yeterli sayıda çeşitlilik analizi için mevcut olduğundan emin olmak için kullanın. Eğer düşük Ca2 + durumda ve TTX (mEPSC) koşulu EPSCs benzer frekans ve genlik (yani hiçbir kendiliğinden eylem düşük Ca2 + durumda ateş potansiyeli), düşük Ca2 + temel sEPSC ve 4 arasındaki fark -AP de çeşitlilik analizi için kullanılabilir.

Örnek olarak şekil 3' te, 4-AP gösterilen sonuç genlik ve sEPSCs sıklığı artar. TTX ve Cd2 + sonraki uygulama frekans ve genlik azalır. Yukarıda açıklandığı gibi genlik sEPSCs ve mEPSCs arasındaki farkı sinaptik çeşitlilik gösterir. Biz burada incelemek hipotalamik nöronlar, genlik ve sıklığını temel ve TTX koşulları (şekil 3 c, D), aynı temel sEPSCs çok az aksiyon potansiyeli bağımlı EPSCs içeren öneriyoruz. Buna göre sonraki deneyler temel ve çeşitlilik ölçmek için 4-AP arasındaki fark karşılaştırabilirsiniz.

Figure 3
Şekil 3:. 4-AP uygulama ortaya koymaktadır sinaptik çeşitlilik. (A)örnek izleri, temel sırasında ve sonrasında 4-AP (30 mikron) uygulama ve sonraki TTX düşük Ca2 + aCSF içinde kaydedilen sEPSCs (0.5 mikron) ve Cd2 + (10 mikron) uygulama. (B) sEPSC genlik (A) gösterilen kayıt üzerinden dağıtım. (C, D) Kötü frekans (C) Özet ve genlik (D) arasındaki temel (gri), 4-AP (kırmızı) ve TTX + Cd2 + (mavi). P < 0.005, ** P < 0,01. Bu şekil--dan bizim önceki rapor6 Şekil 2 değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Yukarıda açıklanan yöntemi postsinaptik nöronlar sonlandırma sinapslarda ortalama çokluğu tahmin ediyor: Bu sinapsların küçük bir oranda ortaya çeşitlilik içinde değişiklikler algılamayabilir. Yine de, bizim son çalışmada, hipotalamik nöronlar arasında normal ve kronik, Glutamat sinapslarda çokluğu değişimler koşulları6vurguladı bu yöntem ortaya koydu.

Ca2 + ile ekimolar Sr2 + aCSF içinde ikame aksiyon potansiyeli bağımlı yayın nörotransmitter veziküller 19, 20desynchronizes. Büyük genlik sEPSCs aksiyon potansiyeli bağımlı eşitlenmiş veziküler nörotransmitter yayın (yani, çeşitlilik), Ca2 + Sr ile yerine toplamı varsa bu nedenle,2 + EPSCs genliği azalır. Görüldüğü gibi şekil 4, Sr2 + aCSF büyük genlik olaylar (şekil 4B) oranı azaltır ve sonuç olarak ortalama genlik (şekil 4 c) azalır. Ne zaman hücre çeşitlilik gösteren değil, vezikül yayın desynchronizing EPSC genlik üzerinde hiçbir etkisi olmayacaktır.

Figure 4
Şekil 4: Sr2 + büyük multiquantal olaylar desynchronizes. (A)temsilcisi izleme normal Ca2 + aCSF ve Sr2 + aCSF arasında karşılaştırma. SR2 + aCSF vezikül yayın desynchronizes ve temsilcisi genlik dağıtım (B) ve genlik değişiklik tüm hücreler (C) görüldüğü gibi multiquantal zaman uyumlu olaylar genliği azalır * P < 0,05. Bu rakam dan bizim önceki rapor6 şekil 3 değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Γ-DGG, AMPA reseptör, hızlı bir dissociating rekabetçi antagonist çokluğu nedeniyle multivesicular serbest bırakmak ya da birden fazla sinaptik kişi olup olmadığını belirlemek için kullanılabilir. Multivesicular yayın postsinaptik reseptörleri örtüşen bir popülasyon üzerinde eylemler olarak büyük genlik EPSCs içerir Glutamat sinaptik yarık içinde havuzu oluşturma. Başka bir deyişle, sinaptik yarık Glutamat konsantrasyonu sonuçlarının uniquantal açıklaması daha yüksektir. Öte yandan, multisynaptic kişi uniquantal EPSCs her sinaptik sitesinde kaydedilmiş olur. Multivesicular serbest bırakmak--dan büyük genlik EPSCs ortaya çıkarsa, daha küçük genlik EPSCs (şekil 5A doğru B-D) göre γ-DGG husumet (nedeniyle daha yüksek Glutamat konsantrasyonu) tarafından büyük EPSCs daha az etkilenebilir. Büyük genlik zaman uyumlu uniquantal EPSCs (multisynapse kişi) toplamı nedeniyle EPSCs iseniz, γ-DGG benzer şekilde tüm EPSCs (şekil 5A sol, E-G) genliği etkisi olacaktır. γ-DGG aksine yüksek bir yakınlık olan DNQX yavaş dissociating AMPA/kainate reseptör antagonisti Tekdüzen bir düşüş neden bütün irili ufaklı genlik arasında EPSCs ()şekil 5 H-J). γ-DGG ve DNQX duyarlılık oranı en yüksek (en büyük 20 EPSCs ortalama) tarafından bölünmüş ortalama EPSC genlik olarak sayısal EPSC genlik ()şekil 5 K, L).

Figure 5
Şekil 5: multivesicular yayın soruşturma için γ-DGG kullanarak. (A)şemaları iki modelleri çeşitlilik gösteren. Sol: bağımsız nüfus postsinaptik reseptörleri hedefleyen uniquantal iletim zamansal toplamı. Büyük ve küçük EPSCs sinaptik yarık içinde benzer bir Glutamat konsantrasyonu tarafından elde ve bu nedenle γ-DGG için eşit derecede duyarlıdır. Sağ: postsinaptik reseptörlerinin örtüşen bir popülasyon hedefleyen multiquantal iletim. Büyük EPSCs yarık daha yüksek Glutamat konsantrasyonu daha küçük sEPSCs kaynaklanır ve bu nedenle γ-DGG için daha az duyarlıdır. Model alt kısmında gösterilir varsayımsal göreli genlikleri değerlerdir. (B) örnek izleri üzerinden 4-AP uygulama takip ortalama sEPSC genlik bir artış olduğu bir kayıt (4-AP Yanıtlayıcı). (C) (B) gösterilen kayıt için genliği EPSC için toplu mezar. (D) için normalleştirilmiş EPSC genlik (EPSC/EPSCMAX) önce ve sonra γ-DGG uygulama (B) gösterilen kayıt üzerinden toplu mezar. (E) örnek izleri eşlikleri(vokal) nerede 4-AP takip ortalama sEPSC genlik bir değişiklik uygulama (sigara 4-AP cevap). (F) toplu EPSC genlik (E) gösterilen kayıt için. (G) toplu EPSC/EPSCMAX Arsa (E) gösterilen kayıt için. (H) örnek bir kayıt taban çizgisinden yanı sıra 4-AP ve DNQX uygulama sonra gelen izler. (ben) toplu EPSC genlik (H) gösterilen kayıt için. (J) toplu EPSC/EPSCMAX Arsa (H) gösterilen kayıt için. Demek EPSC/EPSCMAX γ-DGG (içinde 4-AP Yanıtlayıcı ve sigara-cevaplayıcı grupları) veya DNQX uygulama sonra özetini (K) pre-γ-DGG/DNQX için (yani mesaj-4-AP) normalleştirilmiş. Post-4-AP (L) araziler (pre-4-AP için normalleştirilmiş) EPSC genlik post-γ-DGG/DNQX demek EPSC/EPSC (post-4-AP için normalleştirilmiş)MAX karşı demek. P < 0.005. Bu şekil--dan bizim önceki rapor6 şekil 4 değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Sinaptik iletim gücünü geçici sinirsel aktivite patlamaları tarafından artırılabilir. Daha fazla fizyolojik koşullar altında çeşitlilik araştırmak için afferent stimülasyon aksiyon potansiyeli ateş artırmak ve olasılık serbest bırakmak için kullanılabilir. Çeşitlilik varsa, afferent stimülasyon EPSC genlik (şekil 6A-D) kısa bir artışa neden. Çeşitlilik yoksa, etkinlik artar aksiyon potansiyeli içinde ateş tahrik EPSC genlik artırmaz.

Figure 6
Şekil 6: yüksek frekans stimülasyon ortaya koymaktadır sinaptik çeşitlilik. (A)örnek izleri sEPSCs öncesi ve sonrası afferent sinaptik uyarma. (B) arsa sEPSC genlik öncesi ve sonrası sinaptik uyarma (20 Hz, 2 s) (A) gösterilen kayıt üzerinden. (C, D) SEPSC frekans (C) ve sinaptik uyarma takip genlik (D) değişikliklerin özetini. P < 0,001, * P < 0,05. Bu şekil--dan bizim önceki rapor6 şekil 5 değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Başarılı yama kelepçe Elektrofizyoloji deneme için bir önemli şart sağlıklı dilimleri/hücre almaktır. Bizim açıklanan protokol PVN nöronlar içeren hipotalamik dilimler için optimize edilmiştir. Diğer beyin alanları gerektirebilir çözümleri ve dilimleme yöntemleri21,22,23,24değiştiren. Kayıt için yalnızca hücre özellikleri membran direnç gibi sürekli izleyerek istikrarlı kayıtları kabul önemlidir kapasitans ve erişim direnç. Erişim direnç artışı EPSC genlik azaltmak ve bu nedenle genlik ölçümleri yıkmak. Buna göre 20 MΩ, ifade ya da kayıt sırasında fazla % 20 oranında artış erişim direnç değerleri içeren hücreleri atılır. Benzer şekilde, bir düşüş içinde (veya düşük) membran direnç zavallı uzay-kelepçe içinde neden olabilir ve bu nedenle, genlik düşürebilir. Bizim hedef sistem (parvocellular PVN nöronlar) nöronlarda 500 MΩ ve 1 GΩ arasında yüksek membran direnç var ve biz hücre membran Dirençleri 500 MΩ aşağıda ile atın. Kalite kontrol kesintileri nöronların altında eğitim belirli türleri için kurulmalıdır. Bu iletişim kuralı önce ve sonra ilaç uygulamaları genlik arasındaki farkı kullanır gibi genlik değişiklik ilaç uygulama nedeniyle değil de, membran direnç ve erişim direnç sağlamak önemlidir. Biz bu protokol için çalışma hipotalamik nöronlar küçük içinde büyüklük (hücre kapasitans farelerde yaklaşık 15 pF ve membran direnç yaklaşık 1 GΩ) ve yüksek kaliteli EPSCs/IPSCs6,25 elde etmek için iyi K-glukonat dayalı iç çözüm çalışmaları . Daha büyük hücre boyutu ve düşük giriş direnci ile nöronlar için dayalı sezyum iç çözüm iyi uzay-kelepçe2sağlamak için kullanılabilir.

Çokluğu ölçmek için bu yöntemi kullanarak bir belirli hücreleri mEPSCs aksiyon potansiyeli bağımlı olaylarına karşılaştırmak üzere spontan aksiyon potansiyelleri yeterli sayıda yangın gereksinimdir. Bu devamsızlık ve varlığı TTX ve Cd2 +EPSCs frekans farklılığı karşılaştırma tarafından sağlanmış olur. PVN içeren hipotalamik dilimler halinde 4-AP uygulanması aksiyon potansiyeli ateş temin için verimli olduğunu bulduk. Başka bir yöntem, Hsia ve meslektaşları2tarafından öncülük yüksek Ca2 + aCSF aksiyon potansiyeli ateş, 4-AP yerine artırmak için kullanılır. Bu yöntem Hipokampal dilimler halinde başarılı iken, biz bu bulunan yüksek Ca2+ daha az aksiyon potansiyeli hipotalamik dilimleri6' ateş kolaylaştırma 4-AP daha verimli. Gerçekten de, yüksek, hücre dışı Ca2 + konsantrasyonu Na+ gürültülerinden26,27değiştirerek nöronlar ve akson içsel uyarılabilirlik azalır kanıtlanmıştır. Bu neden bazı dilimler halinde yüksek Ca2 + aCSF EPSC frekans artırmada etkili olmadığını açıklayabilir.

Bir bütün dilim yama kelepçe Elektrofizyoloji için doğasında vardır, bu yöntemin çok sayıda, uzun mesafe projeksiyon postsinaptik nöronlar için dilim hazırlıkları kesilir kısıtlamadır. Aksiyon potansiyelleri incelemek için presynaptic akson ve hücre organları dilimi saklanması gerekir muhtemeldir. Bu nedenle, dilim içinde korunur sinaptik bağlantı çeşitlilik ölçüm çarpık. Aynı hat boyunca Dilimleme doğrultusunda projeksiyonlar diğerleri kesik28iken korunmuş gibi belirli nüfus neden olabilir. Bu sınırlamalar afferent girişleri çokluğu küçümseyen bir genel etkisi vardır.

Açıklanan iletişim kuralı belirli bir neuron için tüm girişleri arasında sinaptik çeşitlilik derecesini tahmin etmek için bir yöntem sağlar. Eşleştirilmiş kayıtları veya en az bir tek axon uyarılması gibi diğer Elektrofizyoloji teknikleri verilen bağlantı birden çok kişi vardır ama bu deneyler çoğu kez zor ve tüm sistemleri mümkün değil olup olmadığını belirleyebilirsiniz. Ayrıca, onlar sadece bir çift nöronların izole gibi belirli bir neuron girdileri her şeyden kuruluşun genel bir göstergesi göstermez. Belirli bir neuron için tüm girişleri arasında çeşitlilik derecesini değerlendirmek için temel yama-kelepçe Elektrofizyoloji yöntemleri mevcut protokolünü kullanır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa yoktur

Acknowledgments

JS Ontario lisansüstü öğrenim bursu aldım. W.I. zihinsel sağlık araştırma Kanada'dan yeni bir araştırmacı bursu aldı. Bu eser hibe W.I için Doğa Bilimleri ve mühendislik Araştırma Konseyi Kanada (06106-2015 RGPIN) ve Kanada Enstitüsü Sağlık Araştırma (PJT 148707) tarafından desteklenen işletim.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL syringe BD 309659
10 blade Fisher Scientific/others 35698
22 blade VWR/others 21909-626
22 μM syringe filters Milipore 09-719-000
Adson foreceps Harvard Instruments 72-8547
Angled sharp scissors Harvard Instruments 72-8437
Clampex Molecular Devices pClamp 10
Double edge blade VWR 74-0002
Filter paper Sigma/others 1001090
Fine paintbrush Fisher/various 15-183-35/various
Gas Dispersion Tube VWR LG-8680-120
Isoflurane Fresenius Kabi/others M60303
Krazy glue various various
Mini analysis Synaptosoft MiniAnalysis 6
Osmomoter Wescor Inc Model 5600
Parafilm Sigma PM-996
Pasteur pipette VWR 14672-200
ph meter Mettler Toledo FE20-ATC
Rubber bulb VWR 82024-550
Scalpel handle No. 3 Harvard Instruments 72-8350
Scalpel handle No. 4 Harvard Instruments 72-8356
Single edge blade VWR 55411-050
Vibratome slicer Leica VT1200S
Water Purification System Millipore Milli-Q Academic A10
Well plate lid Fisher/various 07-201-590/various
Chemicals/reagents
4-AP Sigma 275875
BAPTA molecular probes B1204
CaCl2*2H2O Sigma C7902
CdCl2 sigma 202908
DNQX Tocris 189
EGTA Sigma E3889
glucose Sigma G5767
HEPES Sigma H3375
K2-ATP Sigma A8937
KCl Sigma P9333
K-gluconate Sigma G4500
MgCl2*6H2O Sigma M2670
Molecular biology grade water Sigma W4502-1L
Na3GTP Sigma G8877
NaCl Bioshop SOD001.1
Na-gluconate Sigma S2054
NaH2PO4 Sigma 71504
NaHCO3 Sigma S6014
Picrotoxin sigma P1675
SrCl Sigma 255521
sucrose Bioshop SUC507.1
TTX Alamone Labs T-550
yDGG Tocris 6729-55-1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abbott, L. F., Nelson, S. B. Synaptic plasticity: taming the beast. Nature Neuroscience. 3 (Supp), 1178-1183 (2000).
  2. Hsia, A. Y., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Development of Excitatory Circuitry in the Hippocampus. Journal of Neurophysiology. 79 (4), 2013-2024 (1998).
  3. Zhan, Y., et al. Deficient neuron-microglia signaling results in impaired functional brain connectivity and social behavior. Nature neuroscience. 17 (3), 400-406 (2014).
  4. Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science (New York, N.Y). 333 (6048), 1456-1458 (2011).
  5. Schrader, L. A., Tasker, J. G. Presynaptic Modulation by Metabotropic Glutamate Receptors of Excitatory and Inhibitory Synaptic Inputs to Hypothalamic Magnocellular Neurons. Journal of Neurophysiology. 77 (2), 527 (1997).
  6. Salter, E. W., Sunstrum, J. K., Matovic, S., Inoue, W. Chronic stress dampens excitatory synaptic gain in the paraventricular nucleus of the hypothalamus. The Journal of Physiology. 596 (17), 4157-4172 (2018).
  7. Redman, S. Quantal analysis of synaptic potentials in neurons of the central nervous system. Physiological Reviews. 70 (1), 165-198 (1990).
  8. Del Castillo, J., Katz, B. Quantal components of the end-plate potential. The Journal of physiology. 124 (3), 560-573 (1954).
  9. Stevens, C. F. Quantal release of neurotransmitter and long-term potentiation. Cell. 72 Suppl, 55-63 (1993).
  10. Deger, M., Helias, M., Rotter, S., Diesmann, M. Spike-timing dependence of structural plasticity explains cooperative synapse formation in the neocortex. PLoS computational biology. 8 (9), e1002689 (2012).
  11. van den Pol, A. N., Wuarin, J. P., Dudek, F. E. Glutamate, the dominant excitatory transmitter in neuroendocrine regulation. Science (New York, N.Y). 250 (4985), 1276-1278 (1990).
  12. Miklós, I. H., Kovács, K. J. Reorganization of synaptic inputs to the hypothalamic paraventricular nucleus during chronic psychogenic stress in rats. Biological Psychiatry. 71 (4), 301-308 (2012).
  13. Korn, H., Triller, A., Mallet, A., Faber, D. S. Fluctuating responses at a central synapse: n of binomial fit predicts number of stained presynaptic boutons. Science (New York, N.Y.). 213 (4510), 898-901 (1981).
  14. Tracey, D. J., Walmsley, B. Synaptic input from identified muscle afferents to neurones of the dorsal spinocerebellar tract in the cat. The Journal of physiology. 350, 599-614 (1984).
  15. Lin, J. W., Faber, D. S. Synaptic transmission mediated by single club endings on the goldfish Mauthner cell. II. Plasticity of excitatory postsynaptic potentials. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 8 (4), 1313-1325 (1988).
  16. Atwood, H. L., Tse, F. W. Changes in binomial parameters of quantal release at crustacean motor axon terminals during presynaptic inhibition. The Journal of physiology. 402, 177-193 (1988).
  17. Li, G. L., Keen, E., Andor-Ardó, D., Hudspeth, A. J., von Gersdorff, H. The unitary event underlying multiquantal EPSCs at a hair cell’s ribbon synapse. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (23), 7558-7568 (2009).
  18. Wadiche, J. I., Jahr, C. E. Multivesicular release at climbing fiber-Purkinje cell synapses. Neuron. 32 (2), 301-313 (2001).
  19. Oliet, S. H., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Bidirectional control of quantal size by synaptic activity in the hippocampus. Science (New York, N.Y.). 271 (5253), 1294-1297 (1996).
  20. Inoue, W., et al. Noradrenaline is a stress-associated metaplastic signal at GABA synapses. Nature Neuroscience. 16 (5), 605-612 (2013).
  21. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute Brain Slice Methods for Adult and Aging Animals: Application of Targeted Patch Clamp Analysis and Optogenetics. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). , 1183-242 (2014).
  22. Richerson, G. B., Messer, C. Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing. Experimental neurology. 131 (1), 133-143 (1995).
  23. Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice. Journal of neuroscience methods. 171 (1), 118-125 (2008).
  24. Ye, J. H., Zhang, J., Xiao, C., Kong, J. Q. Patch-clamp studies in the CNS illustrate a simple new method for obtaining viable neurons in rat brain slices: glycerol replacement of NaCl protects CNS neurons. Journal of neuroscience methods. 158 (2), 251-259 (2006).
  25. Gunn, B. G., et al. Dysfunctional astrocytic and synaptic regulation of hypothalamic glutamatergic transmission in a mouse model of early-life adversity: relevance to neurosteroids and programming of the stress response. Journal of Neuroscience. 33 (50), 19534-19554 (2013).
  26. Su, H., Alroy, G., Kirson, E. D., Yaari, Y. Extracellular calcium modulates persistent sodium current-dependent burst-firing in hippocampal pyramidal neurons. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 21 (12), 4173-4182 (2001).
  27. Frankenhaeuser, B., Hodgkin, A. L. The action of calcium on the electrical properties of squid axons. The Journal of physiology. 137 (2), 218-244 (1957).
  28. Xiong, G., Metheny, H., Johnson, B. N., Cohen, A. S. A Comparison of Different Slicing Planes in Preservation of Major Hippocampal Pathway Fibers in the Mouse. Frontiers in neuroanatomy. 11, 107 (2017).

Tags

Neuroscience sayı: 146 tüm hücreli yama-kelepçe Elektrofizyoloji ex vivo sinaptik iletimi sinaptik kazanç çeşitlilik paraventricular çekirdek hipotalamus kortikotropin releasing hormon hipotalamus
Sinaptik çeşitlilik bütün hücreli yama-kelepçe Elektrofizyoloji kullanarak değerlendirilmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sunstrum, J. K., Inoue, W.More

Sunstrum, J. K., Inoue, W. Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology. J. Vis. Exp. (146), e59461, doi:10.3791/59461 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter