Summary
On décrit un modèle d’animal de rongeur simple et fiable pour la stéatohépatite non alcoolisée (NASH), obtenu par le logement non-SPF des animaux et l’administration d’un régime spécifique riche en graisses. Nous décrivons l’identification des sous-ensembles de cellules immunitaires hépatiques et adipeuses pour récapituler les conditions immunologiques humaines en exposant les souris aux germes de l’environnement.
Abstract
L’obésité est associée à une inflammation chronique de bas grade et à une résistance à l’insuline, contribuant à une prévalence croissante des maladies métaboliques chroniques, telles que le diabète de type 2 et la stéatohépatite non alcoolisée (NASH). Des recherches récentes ont établi que les cellules immunitaires pro-inflammatoires infiltrent le tissu adipeux hypertrophique obèse et le foie. Compte tenu de l’importance émergente des cellules immunitaires dans le contexte de l’homéostasie métabolique, il est nécessaire de quantifier et de caractériser leur modification au cours du développement du diabète de type 2 et de la NASH. Cependant, les modèles animaux qui induisent des caractéristiques pathophysiologiques typiques de la NASH humaine sont clairsemés.
Dans cet article, nous fournissons un protocole détaillé pour identifier les sous-ensembles de cellules immunitaires isolés du foie et du tissu adipeux dans un modèle de souris fiable de NASH, établi par le logement des souris de régime riche en graisses (HFD) dans des conditions non-spécifiques sans agent pathogène (SPF) barrière pendant au moins sept semaines. Nous démontrons la manipulation des souris dans des conditions non-SPF, la digestion des tissus et l’identification des macrophages, des cellules tueuses naturelles (NK), des cellules dendritiques, des sous-ensembles de cellules B et T par cytométrie en flux. Des diagrammes de cytométrie de flux représentatifs de souris SPF HFD et de souris non-SPF sont fournis. Pour obtenir des données fiables et interprétables, l’utilisation d’anticorps, de méthodes précises et précises pour la digestion tissulaire et la bonne blocage dans les expériences de cytométrie en flux sont des éléments critiques.
L’intervention pour rétablir l’exposition à l’antigène physiologique chez les souris en les abritant dans des conditions non-SPF et une exposition non spécifique aux antigènes microbiens pourrait fournir un outil pertinent pour étudier le lien entre les altérations immunologiques, l’alimentation induite l’obésité et les complications liées à long terme.
Introduction
L’obésité est un trouble multifactoriel et un facteur de risque majeur pour le développement de maladies cardiaques, accident vasculaire cérébral, stéatohépatite non alcoolisée (NASH), diabète de type 2 (Diabetes) et certains types de cancer. La prévalence de l’obésité augmente rapidement à l’échelle mondiale. Aujourd’hui, 2,1 milliards personnes, soit près de 30% de la population mondiale, sont obèses ou en surpoids1. La résistance à l’insuline associée à l’obésité peut conduire à un diabète, lorsque les cellules bêta des îlots pancréatiques épuisés ne parviennent pas à compenser le besoin accru d’insuline pour maintenir l’homéostasie du glucose2.
Le tissu adipeux est composé de divers types de cellules, y compris les adipocytes, les cellules endothéliales, les fibroblastes et les cellules immunitaires. Pendant la progression de l’obésité, les changements dans le nombre et l’activité des cellules immunitaires peuvent conduire à une inflammation de bas grade du tissu adipeux hypertrophique3,4. Plus précisément, il a été constaté que la consommation excessive d’énergie, accompagnée de niveaux chroniquement élevés de glucose sanguin, de triglycérides et d’acides gras libres, conduit à l’hypoxie adipocytes, au stress du réticulum endoplasmique, à la fonction mitochondriale altérée et sécrétion de cytokine améliorée, entraînant l’activation de cellules immunitaires adipeuses pro-inflammatoires5,6. Les recherches passées ont principalement porté sur l’immunité innée, mais plus récemment, les cellules immunitaires adaptatives (cellules T et B) sont apparues comme des régulateurs importants de l’homéostasie du glucose. Ils possèdent des fonctions inflammatoires (y compris les cellules t+ 1 + t, les cellules r et B) ou principalement des tâches régulatrices (y compris les cellules t (Treg) régulatrices, les cellules de la cellule) et peuvent à la fois exacerber ou protéger contre la résistance à l’insuline7,8 , le 9.
En outre, plusieurs mécanismes ont été proposés pour expliquer comment l’obésité augmente la stéatohépatite, y compris une augmentation de la production de cytokines par le tissu adipeux10. La Nash, la forme progressive de la maladie du foie gras non alcoolisée et une lourde charge sanitaire dans les pays développés, est histologiquement caractérisée par des hépatocytes gonflé, l’accumulation de lipides, la fibrose et l’inflammation péricellulaire et peut progresser vers une cirrhose, une maladie hépatique de stade final ou un carcinome hépatocellulaire. Plusieurs régimes (par exemple le régime de méthionine et de choline déficient11) sont connus pour induire la pathologie hépatique de Nash-like dans des modèles animaux non-humains, mais la plupart de ces approches ne récapitulent pas les conditions humaines de la Nash et de son métabolisme conséquences, car elles nécessitent soit une élimination génique spécifique, des manipulations diététiques non physiologiques, soit un manque de résistance à l’insuline typique de la NASH humaine. En outre, notre compréhension des mécanismes sous-jacents des maladies métaboliques est actuellement basée sur des expériences réalisées avec des souris de laboratoire hébergées dans des conditions spécifiques à l’agent pathogène (SPF) standard. Ces installations barrières sont anormalement hygiéniques et ne considèrent pas la diversité microbienne que les humains doivent rencontrer, ce qui peut expliquer les difficultés du processus de traduction des études animales aux approches cliniques12,13 , le 14.
Pour étudier les différents sous-ensembles de cellules immunitaires dans le tissu adipeux et le foie pendant le développement de la résistance à l’insuline et de la NASH dans un modèle avancé de souris reproduisant des conditions immunologiques humaines, des souris ont été logées dans des cages individuelles en semi stérile conditions sans barrière. Les souris logées dans des conditions exposées à l’antigène ont développé une pathologie hépatique similaire à celle de NASH après 15 semaines d’alimentation en graisses (HFD)13. Comparativement aux souris fps appariées par âge, ils ont développé une stéatose macrovésiculaire, une infiltration hépatique et l’activation des cellules immunitaires.
Ce manuscrit décrit une analyse de cytométrie de flux robuste pour définir et compter les sous-ensembles de cellules immunitaires du tissu adipeux de souris et du foie dans un modèle de NASH. L’analyse de la cytométrie en flux permet la détection simultanée de plusieurs paramètres de cellules individuelles, contrairement aux approches RT-PCR ou immunohistochimie.
En résumé, notre étude offre un modèle de souris de HFD à court terme pour étudier le développement de la résistance à l’insuline et de la NASH et les mécanismes sous-jacents qui présente également la fidélité à la condition humaine.
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Protocol
Cette étude a été réalisée conformément au guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire des instituts nationaux de la santé et de la Loi sur le bien-être des animaux, sous la supervision de notre Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux. Les protocoles sur les animaux ont été conduits conformément aux directives éthiques institutionnelles de la charité Berlin, en Allemagne, et ont été approuvés par le Landesamt für Gesundheit und Soziales et sont conformes aux directives d’arrivée.
1. modèle animal de stéatohépatite induite par le régime alimentaire
- Transférer les souris (C57Bl/6J, mâle) à un logement non-SPF à l’âge de 4 semaines et les exposer continuellement à un large éventail de pathogènes/antigènes environnementaux. Garantir l’exposition par la manipulation quotidienne des animaux de laboratoire que les antigènes sont distribués par le passage de l’air de cette façon.
- Maintenir les souris (C57Bl/6J, mâle, 12 semaines) dans des systèmes de cage ouverts avec des filtres conventionnels sur un cycle de 12 h:12 h lumière/obscurité à une température de 22 ° c. Ne pas irradier ou autoclave régime expérimental et la literie. Accès à l’installation de logement des animaux sans masque ni filet de cheveux. Portes ouvertes entre les chambres d’animaux. N’utilisez pas de douche à air.
- Garantir la manutention quotidienne des animaux de laboratoire et des salles de commutation sur une base régulière afin que les antigènes soient distribués par passage d’air. Compléter le logement sale avec une exposition microbienne quotidienne non spécifique aux antigènes de la litière des animaux de laboratoire de mammifères logés dans des chambres à côté des souris de laboratoire.
- Mesurez les proportions de la mémoire CD44-CD62L- effecteur CD4+ et des cellules T+ + T dans le sang et la rate en utilisant la cytométrie en flux (comme décrit dans refefence13).
Remarque: À cet égard, nous avons défini une augmentation de 20% de la mémoire effectrice de cellules t+ t à partir de cellules de t+ t comme preuve d’une exposition microbienne suffisante. - Commencer HFD (60 kJ% de lipides, 19 kJ% de protéines et 21 kJ% de glucides et la consommation d’eau ad libitum avec 6% de saccharose avec des souris mâles C57Bl/6J âgées de cinq semaines pendant 7-15 jours. Le HFD devrait contenir 60% kJ de graisse (comme décrit ci-dessus) afin d’induire le développement de la résistance à l’insuline tout au long de l’expérience.
Remarque: La coloration de l’hématoxyline doit être effectuée et les caractéristiques histologiques comme le ballonnement des hépatocytes, les corps de Mallory Denk, l’infiltration des cellules immunitaires et la stéatose macrovésiculaire doivent être trouvés pour démontrer la pathologie hépatique de la NASH (comme indiqué dans la référence 13).
2. préparation des réactifs et des solutions
- Préparer 70% d’éthanol, une solution saline tamponnée au phosphate (PBS, sans calcium et magnésium) additionnée de 0,5% de BSA et de tampon de lyse (chlorure d’ammonium et de potassium).
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Tampon de coloration
- Dissoudre 10 mL de sérum de veau fœtal (FCS) dans 500 mL de PBS pour obtenir 2% de PBS de FCS. Placez le tampon de coloration sur la glace avant utilisation.
- Stocker la solution dans une bouteille en plastique à 4 ° c.
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Solution de collagénase pour la digestion des tissus adipeux
- Dissoudre 2,5 g d’albumine sérique bovine (BSA) dans 500 mL de PBS pour obtenir un 0,5% de BSA/PBS.
- Dissoudre 74,5 g de CaCl2 dans 10 mL de 0,5% BSA/PBS pour obtenir une solution CaCl2 de 10 mm.
- Ajouter 1 mg de collagénase de type II (voir tableau des matériaux) à chaque mL de 0,5% de BSA avec 10 mm de CaCl2 PBS.
- Préparer 3 mL de solution de synthèse de collagénase par g d’échantillon de tissu adipeux. Préparez une solution de collagénase fraîche pour chaque isolement.
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Collagenase solution pour la digestion des tissus hépatiques
- Dissoudre 2,5 g de BSA dans 500 mL de solution saline équilibrée de Hank (HBSS) pour obtenir 0,5% de BSA HBSS.
- Ajouter 10 mL de FCS dans 500 mL de 0,5% de BSA/HBSS pour obtenir 2% de FCS 0,5% de BSA/HBSS.
- Ajouter 0,5 mg de collagénase de type IV (voir tableau des matériaux) à chaque ml de 2% de FCS 0,5% de BSA/HBSS.
- Ajouter 0,02 mg de DNase par mL de solution de collagénase de 2% FCS 0,5% de BSA/HBSS.
- Préparer 13 mL de solution de digestion par collagénase par échantillon de tissu hépatique.
- Préparez une solution de collagénase fraîche pour chaque isolement.
3. génération de suspensions à cellule unique
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Digestion tissulaire adipeuse
- Euthanasier les souris par anesthésie isoflurane suivie d’une dislocation cervicale. Vaporisez la poitrine avec 70% d’éthanol. Faites soigneusement une incision centrale de 5-6 cm à travers le tégument et la paroi abdominale sur toute la longueur de la cage thoracique pour exposer la cavité pleurale et le cœur.
Remarque: Ne pas endommager les organes sous-jacents et garder les pointes de ciseaux vers le haut. - Injecter au moins 10 mL de solution saline à 0,9% dans l’apex du ventricule gauche à l’aide d’une aiguille de 26 G.
Remarque: La perfusion réussie est notée par blanchiment du foie. - Ouvrez la cavité péritonéale avec des ciseaux et découpez les tampons de graisse perigonadal de chaque côté avec de fines ciseaux incurvés. Disséquer les tissus gonadiques avec de fines ciseaux incurvés et peser le tissu adipeux.
- Effectuer la dissociation mécanique à l’aide de ciseaux et couper le tissu adipeux en morceaux fins dans une boîte de Petri à 4 ° c. Transférer le tissu adipeux à 50 mL de tubes à centrifuger coniques et rincer la boîte de Petri avec 1 mL de 0,5% de BSA/PBS.
- Ajouter 3 mL de solution de synthèse tissulaire adipeuse (préparée à l’étape 2,3) par gramme de tissu adipeux. Incuber la solution de tissu adipeux à 37 ° c pendant 20 min sous agitation douce (200 tr/min).
- Ajouter 5 mL de 0,5% de BSA/PBS par gramme de tissu adipeux et placer sur la glace. Triturer la solution de nombreuses fois avec une pipette sérologique de 10 mL et la passer à travers un tamis (100 μM) à l’aide d’un piston.
- Centrifuger à 500 x g pendant 10 min à 4 ° c.
- Retirer la fraction adipocytaire flottante par pipetage. Resuspendre le culot cellulaire (fraction vasculaire stromale) dans 1 mL de tampon de lyse ACK (voir tableau des matériaux). Ajouter 10 mL de 2% FCS PBS.
- Centrifuger à 500 x g pendant 10 min à 4 ° c.
- Décanter le surnageant et Resuspendre le culot cellulaire en 250 μL de 2% FCS PBS.
- Comptez le nombre de cellules viables sur un hémocytomètre à l’aide de l’exclusion bleue de trypan.
- Euthanasier les souris par anesthésie isoflurane suivie d’une dislocation cervicale. Vaporisez la poitrine avec 70% d’éthanol. Faites soigneusement une incision centrale de 5-6 cm à travers le tégument et la paroi abdominale sur toute la longueur de la cage thoracique pour exposer la cavité pleurale et le cœur.
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Digestion tissulaire du foie
- Stocker le foie dans un tube de centrifugation conique rempli de PBS et transporter sur la glace.
- Effectuer la dissociation mécanique à l’aide de tampons de seringues dans une boîte de Petri à 4 ° c. Mettre le tissu hépatique disséqué dans un tube de centrifugation conique de 50 mL contenant 10 mL de solution tiède de digestion du foie. Rincer la boîte de Petri avec 3 mL de solution de digestion du foie.
- Incuber la solution de tissu hépatique à 37 ° c pendant 20 min sous agitation douce (200 tr/min).
- Ajouter 20 mL de HBSS. Triturer la solution de nombreuses fois avec une pipette sérologique de 10 mL et la passer à travers un tamis (100 μM) à l’aide d’un piston.
- Centrifuger à 500 x g pendant 10 min à 4 ° c. Décanter le surnageant et Resuspendre le culot cellulaire dans 20 mL de HBSS.
- Centrifuger à 30 x g pendant 1 min à température ambiante pour éliminer la matrice des hépatocytes. Jetez le culot de la cellule.
- Centrifuger le surnageant à 500 x g pendant 10 min à 4 ° c. Résuspendez le culot dans 10 mL de solution moyenne de gradient de densité à faible viscosité de 33% (voir tableau des matériaux) dans HBSS suivie d’une centrifugation (800 x g; 30 min; température ambiante; pas de frein).
- Résuspendez le culot dans 1 mL de tampon de lyse ACK et incubez pendant 4 min à température ambiante. Ajouter ensuite 10 mL de HBSS.
Remarque: Pour jeter le surnageant aspirer le surnageant avec interphase (hépatocytes) très soigneusement avec une pipette de transfert (autant que possible sans prendre le culot avec les cellules immunitaires et les érythrocytes). - Passer les cellules à travers une passoire de 30 μm dans un tube de centrifugation conique de 15 mL et centrifuger à 500 x g pendant 10 min à 4 ° c. Décanter le surnageant et Resuspendre le culot cellulaire en 250 μL de 2% FCS PBS.
- Comptez le nombre de cellules viables sur un hémocytomètre à l’aide de l’exclusion bleue de trypan.
4. coloration de surface
- Préparer le mélange d’anticorps pour les sous-ensembles de lymphocytes T (Panel 1) et les cellules immunitaires innées (Panel 2), comme décrit dans le tableau 1 et le tableau 2. Les volumes sont optimisés pour un échantillon (100 μL) en ce qui concerne les concentrations d’anticorps.
Remarque: Les lymphocytes et les cellules immunitaires innées présentent des différences d’autofluorescence et doivent être analysés séparément. - Utiliser jusqu’à 3 x 106 cellules dans 100 μl dans un tube en polystyrène FACS pour la coloration de surface. Pour bloquer les récepteurs FC, ajouter 10 μL d’anticorps anti-CD16/CD32 (dilué 1:100) et incuber pendant 10 min sur la glace. Utilisez un échantillon de contrôle négatif non teinté pour ajuster la dispersion latérale (SSC) et la dispersion vers l’avant (FSC) pour déterminer l’emplacement de la population de cellules négatives.
- Vortex et ajouter le volume approprié de mélange d’anticorps pour le Panel 1 et le Panel 2. Ajouter 1 μL de colorant de viabilité à chaque échantillon pour permettre la discrimination des cellules vivantes et mortes. Incuber pendant 20 min à 4 ° c et à l’abri de la lumière.
- Laver deux fois avec 2 mL de 2% FCS PBS et centrifuger à 300 x g pendant 5 min à 4 ° c.
- Resuspendre le culot cellulaire en 300 μL de 2% FCS PBS et conserver à 4 ° c jusqu’à l’analyse FACS.
Remarque: Avant de commencer les cellules de passage de mesure à travers un tamis de 30 μm dans le tube FACS de polystyrène et le vortex. La cytométrie en flux a été réalisée avec des cellules étiquetées stockées dans 2% FCS PBS à 4 ° c pendant 1-3 h. les cellules doivent être analysées dès que possible pour optimiser les résultats.
5. compensation de cytométrie en flux, acquisition et gating
- Exécuter un échantillon de contrôle négatif non teinté pour définir le FSC et le SSC et ajuster les tensions du cytomètre de flux pour détecter les populations de leucocytes et pour distinguer entre les débris et les cellules viables. Exclure les débris et les cellules mortes.
Remarque: La viabilité des suspensions cellulaires du foie pourrait être inférieure à la viabilité des suspensions cellulaires du tissu adipeux perigonadal en raison d’une étape supplémentaire de séparation de la densité. - Exécuter des échantillons de contrôle teinté unique pour la compensation multi-couleurs.
Remarque: Des billes de capture d’anticorps pourraient également être employées pour ajuster pour le chevauchement spectral si le nombre de cellules d’une population d’intérêt de cellule est trop faible pour compenser utilisant des cellules. Pour détecter les signaux d’autofluorescence possibles des cellules fluorescence moins un (FMO) des contrôles pour chaque anticorps sont recommandées mais n’ont pas été appliquées dans ce protocole. - Commencez la mesure, collectez le nombre approprié d’événements (au moins 50 000 événements) et enregistrez des données expérimentales.
- Exportez les fichiers de données FCS pour l’analyse et définissez la stratégie de blocage. Porte sur CD45+ leucocytes pour identifier les populations cellulaires ultérieures.
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Representative Results
Le protocole décrit permet de caractériser les marqueurs de surface des cellules immunitaires innées et adaptatives isolées du tissu adipeux périigonadique murin et du foie dans un modèle de NASH induite par le régime alimentaire. Dans ce modèle, la NASH a été induite par l’administration de HFD plus de saccharose (6%) dans l’eau potable pendant 7 à 15 semaines chez les souris C57Bl/6J, comme indiqué précédemment13. Il est important de noter que les souris ont été logées dans des conditions semi stériles et, par conséquent, exposées à des antigènes environnementaux tout au long de l’expérience. Les souris nourries par HFD sont hébergées dans des conditions SPF et les souris diète de Chow hébergées sous SPF et non-SPF ont servi de témoins. L’alimentation en HFD a entraîné un gain de poids corporel significatif déjà après 7 semaines dans les deux groupes. Une différence significative de poids corporel a été observée pour la première fois à la semaine 4 (P < 0,001) et est restée significative pendant les semaines expérimentales suivantes. Cependant, aucune différence significative dans la prise de poids n’a été montrée entre les souris SPF et non-SPF après 7 semaines13. La fraction vasculaire stromale et les cellules immunitaires du tissu adipeux perigonadal et des foies de souris mâles nourries d’un HFD pendant 7 semaines ont été isolées par digestion par collagénase. Les cellules immunitaires ont été étiquetées avec des anticorps primaires conjugués au fluorophore et des proportions de lymphocytes T, de cellules B, de macrophages, de cellules NK, de cellules dendritiques et de granulocytes ont été quantifiées par analyse de cytométrie en flux. La figure 1illustre la gating des sous-populations de lymphocytes T, y compris la discrimination par doublet et la coloration de viabilité, dans la graisse périigonadique murin. Les leucocytes CD45+ sont d’abord contrôlés pour les CD4 et les 1, et sont ensuite contrôlés pour CD44 et CD62L pour discriminer entre la mémoire centrale naïve, la mémoire effecteur et les cellules T effecteur. Les cellules CD44+ ont ensuite été caractérisées avec CD127, KLRG1 et DP-1. La figure 2 fournit la stratégie de blocage pour l’analyse des cellules B, des granulocytes, des cellules NK, des macrophages et des cellules dendritiques.
Les résultats représentatifs de la coloration extracellulaire des lymphocytes T dans le foie murin des souris exposées HFD comparativement aux souris HFD SPF sont démontrés dans la figure 3A. En effet, un pourcentage plus élevé de cellules CD4+ et+ t de mémoire effectrice peut être détecté chez les souris exposées à HFD, alors que les cellules de CD4 + et de t+ t des lymphocytes intra-hépatiques naïfs ont été significativement plus faibles en exposition comparativement aux souris SPF à la semaine 7 (figure 3A).
Pour valider ces résultats, la réponse inflammatoire hépatique associée à l’exposition à l’antigène a été étudiée par coloration hématoxyline/éosine de sections hépatiques de souris de 15 semaines nourries13. Une stéatose sévère, y compris l’augmentation de grosses gouttelettes lipidiques entraînant une stéatose macrovésiculaire, une inflammation lobulaire, un ballonnement hépatocellulaire et une structure lobulaire détruite, a été trouvée chez les souris exposées HFD alors que seulement quelques souris SPF affichaient une graisse légère l’accumulation dans le foie (figure 3B). Comme indiqué dans la figure 3C, le pourcentage de cellules NK était plus élevé dans le tissu adipeux périigonadal des souris exposées à la HFD, alors que les souris HFD SPF présentaient des pourcentages plus élevés de cellules dendritiques. Aucune différence significative n’a été constatée pour les macrophages et les monocytes. Au total, ces résultats confirment une stéatose hépatique plus sévère chez les souris exposées à la HFD et des différences mineures dans le tissu adipeux entre les souris exposées à la HFD et celles de l’IPS.
Le tableau 1 montre les anticorps utilisés dans le panneau 1. Les anticorps utilisés dans l’analyse de cytométrie en flux pour la coloration extracecullaire des cellules B, des macrophages, des cellules NK, des cellules dendritiques et des granulocytes sont représentés dans le tableau 2.
Figure 1 : Représentation schématique de la stratégie de blocage utilisée dans l’analyse de cytométrie en flux des cellules immunitaires adipeuses (Panel 1). Premièrement, les cellules sont fermées sur des singlets. Ensuite, les débris sont exclus en utilisant la zone de dispersion vers l’avant (FSC-A) et la zone de dispersion latérale (SSC-A) et en choisissant la taille correcte. Les cellules sont également caractérisées par l’expression de CD45. Les cellules viables sont sélectionnées en utilisant un marqueur de cellules vivantes/mortes qui est un colorant fluorescent réactif à l’amine qui n’est pas destiné aux cellules vivantes, mais qui est destiné aux cellules avec des membranes compromises. Les lymphocytes t ont été divisés en lymphocytes T cytotoxiques (+) et en lymphocytes t-Helper (CD4+) et subdivisés en cellules naïves (CD44+CD62L-), mémoire centrale (CD44+CD62L+), mémoire effecteur (CD44+CD62L- ) et effecteur (CD44-CD62L+) T cells. Enfin, les cellules CD44+ sont fermées sur KLRG1, CD127 et DP-1. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
La figure 2 : Représentation schématique de la stratégie de blocage utilisée dans l’analyse de cytométrie en flux des cellules immunitaires adipeuses (Panel 2). La gating des cellules dendritiques était basée sur l’expression CD11b et CD11c. Les autres populations suivantes ont été définies: cellules B, cellules NK, macrophages, monocytes et granulocytes. Les données ont été analysées après acquisition avec le logiciel approprié. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Analyse de cytométrie en flux représentatif de cellules T isolées du tissu adipeux périigonadique murin et du foie. (A) les cellules CD4 + et+ T de foies murins à partir de souris HFD de 7 semaines maintenues sous SPF et les conditions exposées ont été analysées par cytométrie en flux. B) coloration représentative de 15 semaines de SPF HFD et de souris exposées. L’infiltration des cellules immunitaires et des hépatocytes ballonnés (pointe de flèche) illustrent la NASH. (C) pourcentages de cellules immunitaires innées adipeuses en pourcentage des leucocytes chez les souris HFD maintenues sous SPF ou exposées pendant 7 semaines. n = 6-10 souris par groupe. L’importance a été déterminée à l’aide de la mesure à deux voies ANOVA multiple. Les données sont représentées en moyenne ± SEM. * * P < 0,01, * * * P < 0,001. Ce chiffre a été modifié depuis le refefence13. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Tableau 1: anticorps utilisés dans la cytométrie en flux pour la coloration extracellulaire (Panel 1). La quantité d’anticorps décrite est pour l’analyse d’un échantillon.
Tableau 2: anticorps utilisés dans la cytométrie en flux pour la coloration extracellulaire (Panel 2). La quantité d’anticorps décrite est pour l’analyse d’un échantillon.
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Discussion
La stéatohépatite a une forte association avec des anomalies métaboliques telles que l’obésité, la résistance à l’insuline et la dyslipidémie15. Plusieurs études indiquent que l’inflammation tissulaire adipeuse peut conduire la pathogenèse du diabète de type 2, y compris les niveaux altérés des cellules du système immunitaire inné et adaptatif4,5,16,17 . En outre, il a été constaté que l’obésité module l’activation des voies immunitaires, ce qui peut conduire à des complications hépatiques18. Il y a un intérêt croissant dans la caractérisation des phénotypes de cellules immunitaires dans la réponse adipeuse et inflammatoire du foie parce que chaque sous-population de cellules immunitaires contribue d’une manière différente au développement de la résistance à l’insuline et de la stéatohépatite.
Cette méthode donne des informations détaillées sur la façon d’isoler et de quantifier les quantités relatives de cellules immunitaires du tissu adipeux périigonadal et du foie. En outre, les méthodes montrent comment maintenir HFD nourris des souris dans des conditions non-SPF afin d’induire la stéatohépatite. Le protocole peut être utilisé pour étudier les fonctions des cellules immunitaires et pour étudier les associations de cellules immunitaires spécifiques entre différents tissus dans un environnement microbiologiquement normalisé.
Dans notre étude actuelle, l’alimentation en HFD des souris non-SPF a entraîné le développement de la résistance à l’insuline et de la stéatohépatite, alors que les souris HFD SPF ont développé une résistance à l’insuline, une stéatose hépatique légère, mais pas une stéatohépatite telle que déterminée par immunohistochimie. De plus, les sous-ensembles de cellules immunitaires adipeuses et hépatiques différaient significativement entre les souris HFD exposées et SPF, ce qui confirme notre compréhension de l’importance des différentes conditions de logement. En résumé, nous pourrions montrer que l’exposition microbienne à la flore commensale pourrait influencer de façon spectaculaire les propriétés immunologiques des souris C57Bl/6. Des travaux antérieurs ont montré que la diversité et la fonction du microbiome intestinal sont affectées par l’obésité induite par l’alimentation19,20 et que la fonction de barrière intestinale et la perméabilité intestinale dépendent des conditions de logement21. Nous visons à aborder le lien entre la colonisation intestinale et l’inflammation adipeuse et hépatique dans une publication à venir.
Plusieurs points doivent être examinés pendant la phase de planification des méthodes proposées. Premièrement, des suspensions à une seule cellule sont nécessaires pour tous les essais de cytométrie en flux et la viabilité des cellules peut être affectée par le niveau de dissociation tissulaire mécanique et la durée de la digestion des tissus enzymatiques. Afin d’éviter la destruction de l’épitope d’anticorps et de maximiser le rendement des cellules dissociées fonctionnellement viables, le type de tissu, l’âge de l’animal, les modifications génétiques, les concentrations d’enzymes, la température et les temps d’incubation devraient être prises en considération.
Deuxièmement, notre protocole a été optimisé pour déterminer quantitativement les différents phénotypes de cellules immunitaires des souris obèses nourries par HFD avec l’inflammation du tissu adipeux et la stéatohépatite. Comme l’intégrité tissulaire, le nombre de cellules immunitaires et, par conséquent, la qualité de la digestion tissulaire, pourrait être affectée par des processus inflammatoires, le protocole et la collagénase utilisés devraient être optimisés pour d’autres tissus que le foie ou le tissu adipeux dans des expériences spécifiques concernant les méthodes de dissection, les temps d’incubation ou la collagénase utilisée pour digérer le tissu. Troisièmement, il est important pour le protocole que différents groupes expérimentaux sont inclus chaque jour pour éliminer les effets en raison de la variation quotidienne du dosage de cytométrie en flux (température, temps d’incubation, etc.).
Cependant, il existe certaines limitations importantes de la méthode décrite. Afin de discriminer les signaux positifs versus négatifs pour ajuster correctement les barrières pour identifier les cellules positives pour des marqueurs de surface spécifiques dans les échantillons expérimentaux, les contrôles de fluorescence moins un (FMO) (un contrôle FMO contient tous les fluorochromes dans un panneau, à l’exception de celui qui est mesuré) aurait dû être utilisé. Dans cette expérience, les données pourraient être correctement compensées et le blocage était clair, mais nous recommandons d’ajouter des contrôles FMO à la configuration expérimentale, dans la mesure du possible. En outre, FOXP3, qui doit être teinté intracellulaire nécessitant une perméabilization de la membrane cellulaire, aurait dû être utilisé pour quantifier les lymphocytes T réglementaires, car il permet une définition plus précise que l’utilisation de CD25 et CD127 (tableau 2). Même si la cytométrie en flux permet la quantification simultanée de plusieurs marqueurs de surface, leur nombre est limité à 12 par échantillon en raison du chevauchement des spectres d’émission. Pour corriger le chevauchement spectral, il faut une compensation de fluorescence à temps intensif. Pour tenir compte de cela, le développement d’un panel stratégique ou l’utilisation de techniques de cytométrie en masse est nécessaire. En outre, des difficultés pourraient survenir dans le logement des souris dans des conditions non-SPF en ce qui concerne les lignes directrices spécifiques du logement des animaux, mais le petit nombre actuel d’études sur les rongeurs non-SPF montre que de telles études sont possibles12,21 . Par exemple, des installations animales séparées pour les souris SPF et non-SPF pourraient être évaluées. Le développement d’un système immunitaire humain de genre adulte est compromis chez les souris SPF12,21, ce qui entraîne des limitations pour traduire les stratégies de traitement des expériences animales aux études cliniques.
En conclusion, nous fournissons un protocole détaillé pour la caractérisation phénotypique des adipeux murin et des cellules immunitaires hépatiques en utilisant la cytométrie en flux dans un modèle animal induit par le régime de la Nash et de la résistance à l’insuline. Compte tenu de la fonction complexe et de la régulation des cellules innées et adaptatives dans le contexte de l’obésité et de la dysrégulation métabolique, nos méthodes proposées devraient contribuer à approfondir notre compréhension des mécanismes immunologiques pour équilibrer l’homéostasie métabolique et, ainsi, aider à développer des thérapies humaines qui peuvent rétablir les réponses immunitaires anti-inflammatoires. Dans l’ensemble, le modèle animal fourni sert de modèle rapide et robuste pour évaluer les complications métaboliques associées à l’obésité et peut être appliqué à d’autres modèles de maladies.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions Anke Jurisch, Diana Woellner, Dr. Kathrin Witte et Cornelia Heckmann pour leur aide aux procédures expérimentales et Benjamin tiburzy de biolegend pour des commentaires utiles sur la stratégie de blocage. J.S. a été soutenue par la bourse Helmholtz (ICEMED). Cette étude a été soutenue par des subventions de l’unité de recherche clinique de l’Institut de santé de Berlin (BIH), le «BCRT-Grant» par le ministère fédéral allemand de l’éducation et de la recherche et la Fondation Einstein. KS-B. et H.-D.V. sont financés par FOR2165.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 µm cell strainers | Falcon | 352340 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 26 G x 5/8 needles | BD | 305115 | |
| 35 mm Petri Dishes | Falcon | 353001 | |
| 40 µm cell strainers | Falcon | 352340 | |
| ACK lysis buffer | GIBCO | A1049201 | |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45 | Biolegend | 103127 | AB_493714 (BioLegend Cat. No. 103127) |
| Analysis software | FlowJo 10.0.8 software | ||
| APC anti-mouse CD11c Antibody | Biolegend | 117309 | AB_313778 (BioLegend Cat. No. 117309) |
| APC anti-mouse KLRG1 (MAFA) Antibody | Biolegend | 138411 | AB_10645509 (BioLegend Cat. No. 138411) |
| BV421 anti-mouse CD127 Antibody | Biolegend | 135023 | AB_10897948 (BioLegend Cat. No. 135023) |
| BV421 anti-mouse F4/80 Antibody | Biolegend | 123131 | AB_10901171 (BioLegend Cat. No. 123131) |
| BV605 anti-mouse CD279 (PD-1) Antibody | Biolegend | 135219 | AB_11125371 (BioLegend Cat. No. 135219) |
| BV605 anti-mouse NK-1.1 Antibody | Biolegend | 108739 | AB_2562273 (BioLegend Cat. No. 108739) |
| BV650 anti-mouse/human CD11b Antibody | Biolegend | 101239 | AB_11125575 (BioLegend Cat. No. 101239) |
| BV711 anti-mouse/human B220 Antibody | Biolegend | 103255 | AB_2563491 (BioLegend Cat. No. 103255) |
| BV785 anti-mouse CD8a Antibody | Biolegend | 100749 | AB_11218801 (BioLegend Cat. No. 100749) |
| C57Bl/6J mice, male, 5 weeks old | Forschungseinrichtungen für experimentelle Medizin (FEM) | ||
| CaCl2 | Charité - Universitätsmedizin Berlin | A119.1 | |
| Collagenase NB 4G Proved Grade | SERVA | 11427513 | |
| Collagenase Typ I | Worthington | LS004197 | |
| Conical centrifuge tube 15mL | Falcon | 352096 | |
| Conical centrifuge tube 50 mL | Falcon | 352070 | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | 4716728001 | |
| Fetal bovine serum | Biochrom | S0115 | |
| Filter 30µm | Celltrics | 400422316 | |
| FITC anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100203 | AB_312660 (BioLegend Cat. No. 100203) |
| Flow cytometry | BD-LSR Fortessa | ||
| Forceps | Sigma-Aldrich | F4142-1EA | |
| HBSS | Bioanalytic GmBH | 085021-0500 | |
| High-fat diet | SSNIF | E15741–34 | 60 kJ% from fat, 19 kJ% from proteins, and 21 kJ% from carbohydrates |
| micro dissecting scissors | Sigma-Aldrich | S3146 | used for dissection purposes |
| PE anti-mouse CD25 Antibody | Biolegend | 101903 | AB_312846 (BioLegend Cat. No. 101903) |
| PE/Cy7 anti-mouse CD62L Antibody | Biolegend | 104417 | AB_313102 (BioLegend Cat. No. 104417) |
| PE/Cy7 anti-mouse I-A/I-E (MHCII) Antibody | Biolegend | 107629 | AB_2290801 (BioLegend Cat. No. 107629) |
| PE/Dazzle 594 anti-mouse CD4 Antibody | Biolegend | 100565 | AB_2563684 (BioLegend Cat. No. 100565) |
| Percoll solution | Biochrom | L6115 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD44 Antibody | Biolegend | 103031 | AB_2076206 (BioLegend Cat. No. 103031) |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse Gr-1 Antibody | Biolegend | 108427 | AB_893561 (BioLegend Cat. No. 108427) |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 12559069 | |
| Round-Bottom Tubes with cell strainer cap | STEMCELL Technologies | 38030 | |
| TruStain fcX anti-mouse CD16/32 | Biolegend | 101301 | AB_312800 (BioLegend Cat. No. 101301) |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T6146 | |
| Zombie NIR Fixable Viability Kit | Biolegend | 423105 | viablity stain |
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