Summary
באמצעות התקן שתוכנן בעבר כדי להחיל זן מכני לתאים חסיד, נייר זה מתאר גיאומטריה תת שכבה מחדש מכשיר מותאם אישית עבור ברזולוציה גבוהה תא יחיד הדמיה של תאים מתוחים עם המטרה טבילה 100x שמן.
Abstract
זן מכני מכניים ידוע לעורר תגובות פנוטיות תאים והוא בעל רלוונטיות פיזיולוגית במספר מערכות רקמה. כדי ללכוד את ההשפעה של מאמץ מתיחה שימושית הלחץ על אוכלוסיות תאים בתוך מבחנה באמצעות ביוכימיים הביוכימי, המכשיר תוכנן בעבר אשר יכול להיות מפוברק פשוט הוא קטן מספיק כדי להתאים בתוך מחממות התרבות רקמות, כמו גם על גבי שלבי המיקרוסקופ. עם זאת, העיצוב הקודם של שכבת המשנה polydiמתיל siloxane לא אפשרו הדמיה משנית ברזולוציה גבוהה באמצעות מטרות טבילה בשמן. עבודה זו מתארת את הגיאומטריה המחודש של שכבת המשנה polydiמתיל siloxane ואת הגדרת הדמיה מותאמת אישית כי ביחד יכול להקל על הדמיה משנית ברזולוציה גבוהה של תאים חיים בעוד תחת לחץ מוחל. ניתן להשתמש ברובד משנה זה עם אותו התקן מעוצב מוקדם יותר, ומכאן, יש יתרונות זהים לאלה המפורטים לעיל, בנוסף להתרת הדמיה אופטית ברזולוציה גבוהה. העיצוב של שכבת המשנה polydiמתיל siloxane ניתן לשפר על ידי שילוב של רשת אשר להקל על מעקב אחר אותו תא לפני ואחרי היישום של זן. תוצאות הנציג להפגין ברזולוציה גבוהה לפקיעה זמן הדמיה של גרעיני בעלי תווית בתוך תאים מתוחים שנתפסו באמצעות השיטה המתוארת כאן. נתונים אלה הדינמיקה הגרעינית לתת תובנות לתוך המנגנון שבו לחץ מתיחה להחיל מקדם הבידול של תאים אוליגודנדרוציטים קדמון.
Introduction
תאים ורקמות בגוף חשופים רמזים מכניים שונים, כולל זנים מתיחה. עם זאת, ההשפעות של רמזים אלה על ביולוגיה של תאים עצביים עדיין לא נחקרו בהרחבה והבינו באופן מלא. במערכת העצבים המרכזית, מקורות זן מכני כוללים צמיחה התפתחותית1,2,3,4, תהליכים פיזיולוגיים כגון כיפוף חוט השדרה, דם ונוזל שדרתי ומצבים פתולוגיים כגון טראומה, הנפיחות אקסון, הצטלקות גליה, או צמיחה הגידול5,6,7,8. כדאי לחקור כיצד זן מתיחה משפיע על הבידול של oligodendrocytes הפוך ואת מיאלואידית הבאים של אקסונים, שהוא תהליך קריטי במערכת העצבים המרכזית של בעלי החוליות. באמצעות מותאם אישית מעוצב המכשיר מאמץ ולוחיות אלסטומרים multiwell, העבודות הקודמות9,10 הראו כי זן סטטי של היחידה יכול להגדיל בידול באמצעות שינויים גלובליים ביטוי גנטי 10. כדי להשיג הבנה נוספת של המנגנונים של מנגנון הלחץ בתאים אלה, המנגנון הנסיוני הקודם חייב להיות מחדש כמתואר כאן, כדי לאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה של קרינה פלואורסצנטית של דינמיקה גרעינית בחיים תאים תחת לחץ. באופן ספציפי, צלחת בודדת polydiמתיל siloxane מפותחת, ואת התצורה הדמיה מחדש כדי לאפשר את הדמיה בזמן לפקיעה של תאים חיים תחת זן באמצעות עדשת השמן 100x טבילה. כדי לחסל את ההשפעות האופטיות השליליות של polydiמתיל siloxane במסלול האור, התאים הם התמונה לא דרך הצלחת polydiמתיל siloxane, אבל בתנוחה הפוכה, דרך הזכוכית לכסות כיסוי תא התא. באמצעות עיצוב זה הדמיה חדשה, מאות ברזולוציה גבוהה הזמן לפקיעה סרטים נרשמות, של גרעיני תא בודדים בתוך תאים חסיד שלמים, שם כרומטין מתויג על ידי תיוג היסטון H2B לחלבון פלורסנט ירוק. סרטים אלה מדגימים כי זן מתיחה גורם שינויים מבנה כרומטין ודינמיקה כי הם עקביים עם ההתקדמות של אוליגודנדרוציטים בידול.
הדמיה של תאים חיים תחת זן שימושית היא מאתגרת טכנית ודורש עיצוב המכשיר תואם את מערכת המיקרוסקופ. העיצוב המותאם אישית המתואר כאן מציג חלופה זולה לפתרונות מסחריים. מימדים שלה לאפשר ההתקנה שלה על שלבי מיקרוסקופ לחיות הדמיה של התא ברזולוציה מרחבית גבוהה במהלך מאמץ להחיל. ההתקנה הדמיה נועד להקל על הדמיית תאים חיים באמצעות עדשת השמן 100x טבילה עם הבהירות הגבוהה ביותר, דרך זכוכית העטיפה, לא דרך השכבה של צלחת polydiמתיל siloxane אשר אחרת מקטין את איכות התמונה נפוצה ביותר כיוונוני הדמיה תחת לחץ. המכשיר, עם צלחת רכוב המכיל תאים, ניתן גם לאחסן בקלות בחממה. התקן זה נועד להחיל זן uniaxial כדי שכבות להקל על תרבות התא מחסיד ולשמור על מאמץ יציב ואחיד על פני ימים מרובים. ההתקנה המתוארת כאן יכולה לשמש עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה של סוגי תאים שונים החסיד מתחת ללחץ, מה שהופך אותו לרלוונטי ללימודי מכניזציה בתחומים רבים של תא מכניאוביולוגיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. עיצוב התבנית היחידה להדמיה ברזולוציה גבוהה
הערה: התבנית לייצור לוחות polydiמתיל siloxane מתוכנן עם התכונות הבאות כדי לאפשר דימות עם עדשת השמן 100x טבילה והתאמה נכונה התקן מותאם אישית לבנות המכשיר (איור 1A, B).
- לשמור על מידות לוחית הכולל כגון זה מתאים את התפסים של המכשיר מאמץ.
הערה: כאן, הם 60 mm x 73 mm. - להפוך תא תא או גם כי הוא קטן באופן משמעותי מאשר הממדים לרוחב של הצלחת כולו, כדי למנוע (מחוץ המטוס כיפוף) אפקטים שקורים בקצוות מהודק של הצלחת polydiמתיל siloxane במהלך הוחל זן.
הערה: כאן, התא תוכנן כריבוע 23 מ"מ x 23 מ"מ. - לשמור על עומק תא התא מינימלי ככל האפשר (לא יותר מ 80 μm), כדי לאפשר התמקדות עם עדשת השמן 100x טבילה דרך הזכוכית לכסות ממוקם על גבי התא, אבל לעשות את זה די מספיק כדי להכיל מדיה כדי להימנע מיצירת קשר או לסחוט את התאים.
- הרימו את תא התא על ריבוע עם גובה של 3 מ מ"מ, כדי להביא את התאים קרוב יותר לעדשה בכיוונון המיקרוסקופ הפוך כדי לאפשר התמקדות קלה.
הערה: תבניות בתכונות הנ ל יכולות להיות מיוצרות על ידי טכניקות רבות, למשל, אלומיניום והומה. לחילופין, תבניות מאסטר ניתן גם להרכיב באמצעות יריעות אקריליק לחתוך עם חותך לייזר, זכוכית לכסות0 תא התא, דבק סופר. זה עובש מאסטר משמש כדי להפוך הטבעה polydiמתיל siloxane, אשר משמש אז לעשות תבניות עבודה באמצעות שרף הליהוק.
2. הייצור של לוחיות בודדות ותאי מרובע
- מערבבים polydiמתיל siloxane בסיס וריפוי הסוכן ביחס של 20:1 (לפי משקל) בספל חד פעמי. שוקלים סך של 20 גרם של polydiמתיל siloxane לעובש (להכנת צלחת אחת פולידימתיל) ו 150 גרם של polydiמתיל siloxane לכל 150 מ"מ בקוטר צלחת פלסטיק (להכנת אצווה אחת של תאים מרובעים).
- השאירו את התערובת polydiמתיל siloxane ב-0.8 לשואב אבק בר במשך 30 דקות (או עד שכל הבועות יוסרו).
- יוצקים את התערובת polydiמתיל siloxane לתוך תבניות (עבור צלחות) או לתוך 150 מ"מ מנות פלסטיק (עבור תאים רבועים).
- להסיר בועות נוספות בשלב זה, אם על ידי פיצוץ אוויר (לפי מתחת) או מבטל את התבניות של פולידימתיל ממולא בצורות/מנות שוב ב-0.8 בר ואקום עבור 30 דקות.
- השאירו את התבניות/מנות בתנור של 80 ° c על שולחן החלקה ב-2 שעות.
- הסירו בזהירות את התבניות/הכלים מהתנור ותנו להם להתקרר לטמפרטורת החדר. בעדינות לקלף את polydiמתיל siloxane נרפא לאחר חיתוך בזהירות את הקצוות עם להב (איור 1C).
- על 150 מ"מ בקוטר polydiמתיל siloxane, לצייר רשת 2 ס"מ x 2 ס מ עם סמן. בתוך כל ריבוע, לצייר כיכר 1 ס מ x 1 ס מ, השארת שוליים של 0.5 ס מ מכל הכיוונים. באמצעות להב, חותכים בזהירות לאורך הקווים כדי להשיג תאים רבועים (איור 2A).
- נקו את הצלחות polydiמתיל siloxane/תאי מרובע על ידי דגירה אותם 100% אצטון עבור 4 h, ואחריו 100% אתנול עבור 4 שעות, ואחריו מים אוטוקלע עבור 4 h.
- מניחים את לוחיות/תאי מרובע על נייר הסרט לגיבוי הפרפין (לא סרט פרפין אבל הנייר) בתוך צלחת פלסטיק בקוטר 150 מ"מ (איור 2C).
- השאירו את הצלחת polydiמתיל siloxane בתנור 80 ° c כדי להתייבש עבור 4 h.
- חותם את מנות 150 מ"מ בקוטר המכיל צלחות פולידימתיל וריבועים מכולה עם סרט פרפין, ולאחסן אותם בחדר קר עד לשימוש נוסף.
3. הפונקציונליזציה של צלחות פולידימתילקסיאן
- הסר את הסרט פרפין, להסיר את העטיפה של צלחת פלסטיק, ולמקם את הצלחות polydiמתיל siloxane בתאי מרובע תחת אור אולטרה סגול עבור 30 דקות.
- פלזמה לטפל (ב 150 W עבור 5 דקות) את הצלחות polydiמתיל siloxane (עם תא התא פונה כלפי מעלה) ללא התאים הרבועים, כדי להפוך את פני השטח התרבותי הידרופילי.
- מיד למקם את התאים הרבועים על פני השטח מטופל פלזמה (איור 2B) ולחץ באופן ידני כדי לתקוע באופן זמני את שניהם יחד.
הערה: לא פלזמה לטפל בתאי הכיכר, או אחרת הם לדבוק בחוזקה על צלחת polydiמתיל siloxane לא ירד בקלות כאשר הם חייבים להיות מקולף במהלך הדמיה. - הוסף 200 μL של 100 מ"מ (3-aminopropyl) triethoxysilane לבאר עבור 2 h כדי להציג – NH2 קבוצות למשטח של פולידימתיל סילאוקאן. כדי ליצור פתרון 100 מ"מ, לפזר 234 μL של טהור (3-aminopropyl) triethoxysilane ב 10 מ ל של מים. לאחר הדגירה 2 h, לשטוף את הבארות 3x עם מים מוכי.
- שוקלים 2 מ ג של החוצה מולקולרית מקשר מולקולרי ביסולפומיאמידיהמייפיהמאוורר ו לפזר אותו ב 700 μL של 1 M (4-(2-הידרוקסיל) -1-piperazהחומצה sulfonic מאגר חומצות (pH 8.0) ו 2.8 mL של מים.
הערה: זה ייתן פתרון משנה 1 מ"מ ביותר ביסולפויומידיהעדשה ב 200 מ"מ (4-(2-הידרוקסיל) -1-piperazineethane חומצה sulfonic מאגר. שים לב כי מאגר ריכוז 50 מ"מ גם עובד היטב.- הוסף 135 μL של פתרון זה ו 15 μL של 1 מ"ג/mL fibronectin לבאר בכל לוח פולידימתיל 4 h בטמפרטורת החדר.
- רוחצים את 3x עם תמיסת מלח מוזרמת פוספט. הוסף 500 μL של תמיסה מלוחים באגירה של פוספט לבאר. מכסים את המנה 150 מ"מ קוטר המכיל polydiמתיל siloxane עם סרט פרפין ולאחסן אותו בחדר קר, עד שימוש נוסף.
4. הפונקציונליזציה של מנות פלסטיק וצלוחיות
- דגירה מנות פלסטיק ו צלוחיות עם 5 μg/mL פתרון של פולי-D-ליזין (PDL, במים סטריליים) עבור 1 h. הוסף 1.5 mL של פתרון זה (ligand) לכל 35 מ"מ צלחת קוטר, 3 מ ל זה לכל 60 מ"מ בקוטר התבשיל, ו 10 מ"ל לכל 75 ס"מ2 התרבות הבקבוקון.
- לשטוף את הכלים ומבחנות 2x עם מים סטריליים.
- השאירו אותם יבשים בארונית הביובטיל 1 h (או עד יבש) ואחסנו אותם בחדר הקר ב -4 ° c עד לשימוש נוסף.
5. התפשטות ובידול בינונית לתאים אוליגודנדרוציטים מורנין
- הכינו 50 mL של פתרונות 100x של התפשטות ובידול בינוני, לעשות ali, ts של 2.5 mL, ולאחסן אותם ב-80 ° c.
הערה: ההרכב של בינוני התפשטות הוא 0.1 mg/mL סרום אלבומין, 62 ng/mL הפרוגסטרון, 16 μg/mL ריקבון, 5 μg/ml אינסולין, 50 μg/mL-העברת, 5 ng/mL הסלנייט, 1 x פניצילין-סטרפטומיצין, 10 ng/ml טסיות-הצמיחה נגזר פקטור, ו 10 ng/mL פיברוהפיצוץ גורם הצמיחה ב בינונית שונה של הנשר של דולבקה (DMEM) עם גלוקוז גבוה ופירובט. בעוד סרום בשור האלבומין, פרוגסטרון, ריקבון, ו הסלניט נתרן יכול להיות היוו ומאוחסן 100x, אינסולין, holo-הועבר, ו פניצילין-סטרפטומיצין יש להוסיף טרי תוך הכנת פתרון 1x. גורמי הצמיחה חייב להיות היוו 10 μg/mL ויש להוסיף טרי לתאים כל יום (1 μL/mL של בינוני). ההרכב של בינוני בידול הוא 0.1 mg/mL סרום הפרה אלבומין, 62 ng/mL הפרוגסטרון, 16 μg/mL ריקבון, 5 μg/ml אינסולין, 50 μg/mL-העברת, 5 ng/ml הסלנייט, 1x פניצילין-סטרפטומיצין, 400 ng/mL, 400 ng/ml L-תירוקסין, ו 0.5% סרום העובר העוברי DMEM עם גלוקוז גבוה ופירובט. Triiodothyronine ו-L-תירוקסין יכול להיות היוו עם ריאגנטים אחרים מאוחסן 100x. אינסולין, הולקו-מועבר, ו פניצילין-סטרפטומיצין יש להוסיף טרי תוך הכנת פתרון 1x. - עבור הכנת 50 mL של 100x התפשטות בינונית, התמוססות 510 mg של סרום הפרה אלבומין ב -17 מ ל של בינוני של דולבקו, 310 μg של פרוגסטרון ב 31 μL של אתנול, 80 mg של ריקבון ב 500 μL של בינונית של דולבקה, 25 μg של נתרן סלנייט ב 10 μL של בינונית של דולבקו , ו-DMEM מלא עד 50 mL
- עבור הכנת 50 mL של הפתרון 100x של בידול בינוני, בנוסף לפזר 2 מ"ג תריודוטירונין ב 40 μl של הידרוקסיד נתרן 2 מ ג של L-תירוקסין ב 40 μl של נתרן הידרוקסיד, לאחר מכן למלא את הפתרון כדי 50 mL עם בינונית של dulbecco. לסנן את הפתרון דרך יחידה סטרילית מסנן חד פעמי, ולאחסן את הליגטים ב-80 ° c.
- עבור הכנת 250 mL של 1x התפשטות/בידול בינוני, לערבב 2.5 mL של פתרון 100x של התפשטות/בידול בינוני עם 12.5 mg של holo-העברת, 125 μL של 10 מ"ג/mL אינסולין, ו 2.5 mL של 100 x פניצילין-סטרפטומיצין. למלא את הפתרון כדי 250 mL עם מדיום של Dulbecco ולסנן אותו דרך יחידת סטרילי מסנן חד פעמי.
הערה: יש להוסיף את גורמי הגדילה באופן טרי וישיר לתרבות התאים, ולא למכלול כולו של המדיום החדש.
6. תרבית תאים
- התחל עם תאים אוליגודנדרוציטים קדמון מושעה בינוני התפשטות. זרע תאים אלה בצפיפות של 35,000 תאים/ס"מ2 על משטחי פלסטיק מצופים PDL (מנות או צלוחיות, ראה סעיף 4). כוונן את עוצמת הנפח של היקף ההפצה ל-3 מ ל ל-10 ס מ2 של שטח שטח של שכבת משנה של פלסטיק; כמות נמוכה יותר של בינונית עלולה להוביל לתא מתיחה הנובע מכוחות מתח פני השטח, בעוד שנפח מדיום גבוה יותר במנות עלול לגרום לניקוז.
- הוסף גורמי גדילה (מקדם הגדילה הנגזר הנגזרת וגורם גדילה fibronectin) כל יום, שמירה על הריכוז שלהם 10 ng/mL ולשנות מחצית המדיום התפשטות בימים חלופיים.
- ביום השלישי, לנתק את התאים ממשטח הפלסטיק באמצעות פתרון עדין לניתוק התא (למשל, המאטאז): להסיר את המדיום, לשטוף 1 x עם תמיסת מלח באגירה מלוחים, להוסיף 1 מ ל של פתרון ניתוק לכל 20 ס מ2 שטח, להשאיר את התבשיל/בקבוקון בחממה ב 37 ° c עבור 10 דקות, ולהקיש אותו בעדינות עד שכל התאים התנתק (להסתכל תחת מיקרוסקופ).
- פיפטה באמצעות קצה 200 μL כדי לשבור את הגושים לתוך תאים בודדים, להעביר אותם בצינור 50 mL, לדלל אותם התפשטות בינונית, ספין ב 0.2 x g עבור 10 דקות, להיפטר supernatant, ולהשעות את הגלולה הפצת בינונית כדי להפוך נפח כולל של 1 mL. ספור את התאים באמצעות ציטומטר.
- שוטפים את הלוחות הפסיבוניים בשני הצלחות, 15 דקות לכביסה, עם מדיום הפצה.
- זרע 35,000 תאים לצלחת polydiמתיל siloxane ב 700 μL של התפשטות בינונית.
- הוסף בניית פלבאמצע של H2B-gfp עבור תיוג היסטון H2B עם חלבון פלורסנט ירוק.
הערה: כאן, 1.4 μL של CellLight H2B-GFP BacMam2 שילוב ערבוב התווסף לכל צלחת (2 μL לכל 50,000 תאים). - לאחר 24 שעות, הר את הדגימות polydiמתיל siloxane עם תאים להיות נמתח על המכשיר מאמץ uniaxial (כפי שמוצג באיור 2D). לשנות את המדיום בכל הדגימות לבידול בינוני.
- כדי לאמץ את הדגימות, למדוד את האורך תא בתא מתוח (איור 3A) ולהפוך את הבורג מיקרומטר שלב כדי להגדיל את אורך תא התא לפי הסכום הרצוי (למשל, 10%, ראה איור 3a). השאירו את דגימות פולידימתיל הנמתח והבלתי מתוחות בחממה ב-37 ° צ' עד הדמיה.
7. הדמיה
- . תדליק את המיקרוסקופ הגדר את טמפרטורת אינקובטור המיקרוסקופ ל-37 ° c.
- להביא את המטרה לשמש (100x טבילה שמן) למיקום המרכזי כמו צריח היעד לא יהיו נגישים מאוחר יותר. להתיר את המטרה ולהרוס אותו בחזרה עם טבעת אובייקטיבית (איור 4A), כך שהמטרה ניתן להביא קרוב יותר לתאים. אם מטרת הנפט משמשת כאן, יש להוסיף טיפת שמן בשלב זה.
- לסנתז מראש (באמצעות הדפסה תלת-ממדית או עיבוד שבבי) מחזיק פלסטיק או מתכת בעל שתי תכונות חשובות — חלון זוויתי וצעד (איור 4B).
הערה: החלון תומך עובי0 שמיכות זכוכית שיחזיק את המדיום בזמן המכשיר המתח נמצא במצב הפוך. חתך זוויתי בקצוות חלון (איור 4D) מאפשר למטרה להתקרב שמיכות זכוכית. הצעד במחזיק מאפשר לנו להביא את polydiמתיל siloxane יותר למטה, קרוב יותר למטרה. - מניחים שמיכות זכוכית (עובי0, עם ממדים של 25 מ"מ x 25 מ"מ או 35 מ"מ בקוטר) על המשטח העליון של המחזיק על ידי הפצת שומן ואקום בפריפריה של החלון (איור 4C), ולהקליט את חלון פלסטיק על הבמה המיקרוסקופ ( איור 4D ואיור 5a).
- לעזאזל בשלב z-תרגום על הבמה למיקרוסקופ ולהעביר אותו לתנוחת zהעליונה (איור 5a).
- הסר 500 μL של המדיום מן הלוח polydiמתיל siloxane להיות התמונה ולהוסיף זה בינוני על שמיכות זכוכית בחלון פלסטיק לבן.
- נתק בזהירות את התא המרובע מלוחית הפולידימתילקסיאן עם פינצטה סטרילית.
- להחזיק את המכשיר מאמץ בתנוחה זקופה (תאים הפונים למעלה) מעל חלון פלסטיק לבן ובזהירות להפוך את המכשיר מאמץ כדי לאפשר כל טיפה בינונית נוספת ישירות באמצע שמיכות זכוכית (איור 5B) (תאים הפונים למטה).
- הצב את החלק התחתון של התקן הנבג אל שלב ה- z-תרגום עם הקלטת הדו (איור 5c, D).
- בזמן שהוא מסתכל דרך עינית תחת ברייטפילד, לאט להביא את המכשיר זן למטה (איור 5e) (על ידי הפחתת השלב z-תרגום) ולהעביר את המטרה עד כדי להתמקד על התאים.
- בצע שלב זה באיטיות מאוד, צעד אחר צעד. אם המכשיר המתח לוחץ יותר מדי על הכיסויים, התאים יכולים לקבל דחוס (גורם להם למות) ואם המטרה לוחץ יותר מדי על הכיסויים, coverslip יכול לשבור (גורם בינוני לדלוף לשפוך על המטרה).
- סרוק את הצלחת polydiמתיל siloxane ב- xו- yכיוונים כדי למצוא תא בעל גרעין פלורסנט (תחת epiפלואורסצנט עם 488 nm של עירור גל) והמבנה התא המתאים (תחת ברייטפילד).
- אם העקירה לרוחב של שלב המיקרוסקופ אינו משפיע על ההתמקדות האנכית יותר מדי, בחר אזורים מרובים של תחומי עניין באמצעות תכונה נקודתי על התוכנה. לעיתים, המיקוד רגיש מאוד לכל תזוזה לרוחב של הבמה. במקרים כאלה, התמונה תא אחד בכל פעם. סמן את מיקומי ה- x, yו- zעבור כל תא מעניין.
- שיא הרשומה (או פתוח-pinhole) תמונות של הגרעין עם 488 nm של עירור הגל ואת התא עם עירור ברייטפילד במרווחים של 30 s לכל מסגרת עבור משך כולל של לפחות 30 דקות.
8. ניתוח נתונים
-
תנודות גרעיניות
- פתח את רצף התמונות של הגרעין (איור 6A) בתוכנת ניתוח תמונה ומסף הגרעין של תמונות הזמן (לדוגמה, השתמש בפקודה הסף בתוך Imagej או בפקודה גרייטרש בתוכנה MATLAB).
- קבל את אזור הגרעין (בפיקסלים) כפונקציה של זמן, להתוות אותו בתוכנת התוויית נתונים (איור 6B), ולהתאים פולינום הזמנה שלישית לנתונים (איור 6b) (למשל, להשתמש בניתוח | התאמה | הפקודה התאמה פולינומיאלית במקור או בפקודה פוליfit בתוכנה MATLAB).
- הפחת את ערך הפולינום המצויד מהאזור הממשי (בפיקסלים) עבור כל נקודת זמן. אזור מתוקן זה ידוע כאזור השאריות.
הערה: תהליך זה מסיר את כל המגמה הגדלה או יורדת בנתונים המגיעים משגיאות אינסטרומנטלית ונקראת הסרת מגמות.- חישוב אחוזי השאריות של האזור על-ידי חלוקת האזור השיורי בכל נקודה עם ערך הפולינום המצויד בנקודת זמן זו (איור 6D).
- חשב את סטיית התקן של סדרת הזמן שיורית באזור. סטיית התקן הזאת מציינת. את משרעת התנודות הגרעיניות
-
התוויית נתונים וניתוח סטטיסטי
- חישוב משרעת של תנודות גרעיניות כממוצע של 20 גרעיני לפחות לכל תנאי.
- ניהול מבחן סטטיסטי חד כיוון אחד עם תיקון Bonferroni כדי לקבוע אם יש הבדל משמעותי בשרעת התנודות כפונקציה של תנאי הריבית (לדוגמה, עם ובלי מאמץ מיושם).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
העבודה האחרונה שמטרתה לחקור את ההשפעה של זן מתיחה על oligodendrocytes הפוך10 הראה כי 10% זן מתיחה uniaxial מקדם את הבידול של תאים אוליגודנדרוציטים קדמון על ידי שינויים גלובליים ביטוי הגנים. המנגנון מאחורי שינויים אלה ביטוי הגנים ניתן לנחקר באמצעות הדמיה של פרמטרים subcellular, כגון מבנה השלד, לוקליזציה גורם שעתוק, דינמיקה גרעינית, וארגון כרומטין. עם זאת, הגיאומטריה הקודמת של שכבת המשנה של פולימתיל סילאוקאן לא איפשרה הדמיה של תא יחיד ברזולוציה גבוהה. כפי שמתואר בעבודה זו, הגיאומטריה המחודש של שכבת המשנה של polydiמתיל siloxane והגדרת הדמיה ממוזערת את המרחק בין התאים והמטרה. דבר זה מאפשר לכידת הזמן תמונות לפקיעה של הגרעין המסומן באמצעות מטרה לטבילה בשמן 100x (איור 6A).
תנודות באזור הגרעיני הצפוי תלויות במצב הבידול של התאים11,12. השוואה בין התנודות הגרעיניות של תאים אוליגודנדרוציטים, וכי של oligodendrocytes הפוך הבדיל סופני הראה כי האחרון יש תנודות נמוכות באופן משמעותי (איור 6E). לאחר מכן, תנודות גרעיניות של תאים אוליגודנדרוציטים בשעה 1 h, 24 שעות, ו 48 h פוסט כימי אינדוקציה של בידול עם ובלי 10% מתח מתיחה הושוו. עם אינדוקציה כימית לבד, משרעת של תנודות גרעיניות הראו ירידה משמעותית ב 48 h אבל לא ב 24 שעות (איור 6F). מצד שני, אינדוקציה כימית יחד עם זן 10% מתיחה הראה ירידה משמעותית ב 24 שעות, אשר נשאר קבוע, ללא הפחתה נוספת ב 48 h (איור 6G).
הגיאומטריה הסאב-שכבה ותצורת ההדמיה המתוארת במסמך זה אפשרו הקלטה של סרטים ברזולוציה גבוהה של תאים מתוחים. הניתוח הבא של סרטים אלה הראה כי המתח ממהר את הלחות של תנודות גרעיניות, אשר הוא סמן של בידול. תוצאות אלה מעניקים תובנה למנגנון שבו המתח מקדם אוליגודנדרוציטים בידול. דיון נוסף על הפרשנות של תוצאות אלו וניסויים עתידיים מתוארים במאקג'ה ואח '13.
איור 1: עיצוב וגיאומטריה של ה פולימתיתיל סילאוקאן . עובש שכמוך (א) סקיצה של העובש המראה את כל הממדים במילימטרים (סקיצה זו נוצרה על ידי Whits טכנולוגיות, סינגפור). (ב) תצוגה תלת ממדית של העובש (מותאם מכהיג ואח '11). שיבוץ מראה תמונה של העובש. (ג) תצוגה תלת ממדית של הצלחת polydiמתיל siloxane המציא באמצעות העובש (מותאם מאקהיג'ה ואח '11). שיבוץ מראה תמונה של צלחת פולידימתיל סילאוקאן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הכנה לדוגמה. (A) תמונה של צלחת פולידימתיל סילאוקאן ומרובע. (ב) תא מרובע ממוקם על הכיכר המוגבהת על צלחת polydiמתיל siloxane. מטרתו היא להכיל בינונית עבור התאים. (ג) צלחות פולידימתיל סילאוקאנה מאוחסנות במנות פלסטיק בקוטר 150 מ"מ באמצעות נייר parafilm כדי למנוע מהפולידימתיל לדבוק בפלסטיק. (ד) בעוד לעלות את הצלחת על המכשיר להתאמץ, לתמוך בו מלמטה באמצעות שתי אצבעות כדי למנוע את הנפול של הצלחת. אם הצלחת עדיין ממשיך קצת לאחר להעלות, להגדיל את המרחק בין זרועות המכשיר להתאמץ ידי הפיכת שלב התרגום. בשלב זה, התרגום של הבמה לא צריך לגרום למתח בצלחת polydiמתיל siloxane. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: מתיחה התא. (א) למדוד את האורך הראשוני של הצלחת בין התפסים, באמצעות סרגל. (ב) למתוח את הצלחת על ידי הפיכת הבורג על שלב התרגום כדי להגדיל את אורך הצלחת הראשונית לפי האחוזים הרצויים. הגדלת x% באורך מקבילה ל-X% מהמאמץ. שים לב, כדי ליצור את הנבג הרצוי (X%) בתא של תרבות התא המוגבהת, הצלחת הראשית חייבת להיות מתוחה בכמות גבוהה יותר (כ-2X%) בשל ההבדל בעובי שלהם בגיאומטריית הלוחית המתוארת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: הכנה להדמיה. (א) להביא את המטרה 100x למיקום המרכזי בצריח, להוציא את המטרה, ולהרוס אותו בחזרה עם הטבעת האובייקטיבית. (ב) סקיצה של המחזיק מראה את כל הממדים במילימטרים. (ג) לפזר ואקום משחה בפריפריה של החלון במחזיק, באמצעות טיפ פיפטה, ומניחים שמיכות זכוכית על גבי. השתמש זכוכית כיסוי עם עובי0 או1, כדי לאפשר התמקדות עם עדשת השמן 100x טבילה. (ד) מניחים את המחזיק (1) על במת המיקרוסקופ (2). הביאו את השמן (6) מטרה (3) קרוב יותר לcoverslip (5) כי הוא נדבק למחזיק, באמצעות שומן ואקום (4). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: הגדרת הדמיה במיקרוסקופ. (א) להרכיב את השלב z-תרגום (החץ הצהוב) ואת המחזיק (החץ האדום) על במת המיקרוסקופ. (ב) להטות את המכשיר מאמץ על הבמה מיקרוסקופ כדי לתת כל ירידה בינונית על שמיכות זכוכית של המחזיק. לתקוע קלטת דו צדדית (חץ כחול) על המכשיר מאמץ כי יהיה לדבוק על הבמה z-תרגום. (ג) מניחים את המכשיר מאמץ בעמדה הפוכה, תמיכה בו על z-תרגום שלב. התאים חייבים להיות מיושרים עם שמיכות הזכוכית של מחזיק הפלסטיק. (ד) גאומטריה הפוכה של מכשיר הנבג ממזערת את המרחק בין התאים והמטרה, ובכך מקלה על הדמיה ברזולוציה גבוהה (המותאמת מתוך מכהיג ואח '11). (ה) השקפה צדדית לפני הבאת המכשיר מאמץ למטה (1); תצוגה צדדית לאחר הבאת המכשיר המאמץ למטה (2); תצוגה מלמעלה לאחר להביא את המכשיר זן למטה (3). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: התמונות הנציגה ואת השטח תנודות נתונים של הגרעין. דמות זו מותאמת מתוך מסכת ואח '11. (א) דמות אופיינית של גרעין המסומן עם היסטון H2B מתויג חלבון פלורסנט ירוק, ו תא הבחנה אוליגודנדרוציטים מחולל. הגרעין נמצא בפוקוס, בעוד שתהליכי התאים מחוץ לפוקוס. (ב) סדרת זמן אופיינית של אזור גרעיני (בפיקסלים). (ג) פולינום הסדר השלישי הותאם לנתונים. (ד) האחוז מסדרת הזמן השיורית של התנודות באזור. (E) מהקצה הגרעיני תנודות של תאים אוליגודנדרוציטים קדמון מתרבים ו oligodendrocytes הפוך הבדיל סופני. (ו) התנועה הגרעינית תנודות ב 1 h, 24 h, ו 48 h postintion של בידול כימי ללא מתח. (G) האזור הגרעיני תנודות ב 1 h, 24 h, ו 48 h postinduction של בידול כימי עם מתח מתיחה 10%. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המכשיר בעבר1 תוכנן עבור היישום של מתיחה לחילוץ מאמץ על תאים חסיד. העיצוב של שכבת המשנה polydiמתיל siloxane בעבודה הזאת היה מספיק עבור ביוכימיים, כמו גם הדמיה ברזולוציה נמוכה של תאים נמתח. בעבודה זו, עוצב מחדש שכבת המשנה, ותצורה של הדמיה מקורית המסייעת להדמיית תאים משנית ברזולוציה גבוהה. היתרונות של מערכת זו הם רבים: זה יכול להיבנות במעבדה באמצעות רכיבים פשוטים, זה זול לעומת התקנים מסחריים מסחרי (500 USD לכל תא התקן מאמץ), והוא קטן מספיק כדי להתאים בתוך מחממות התרבות רקמות, כמו גם על מיקרוסקופים. יתר על כן, למרות מערכת הדמיה תוארה כאן עם ההתקנה הפוכה המיקרוסקופ, זה יכול להיות מותאם בקלות עבור תצורת מיקרוסקופ זקוף.
ישנם מספר צעדים קריטיים המעורבים בהכנה לדוגמה והדמיה. ראשית, הצלחות polydiמתיל siloxane ותאי מרובע יש לנקות ביסודיות לפני זריעת התאים (פרוטוקול שלב 2.8) כדי להבטיח הישרדות התא (כמו polydiמתיל siloxane רעיל לתאים). שנית, מאז נפח של בינוני נוזלי שיכול להתאים בתוך תא מרובע הוא פחות מ 1 mL, זה עלול להתאדות אם המדגם הוא בחממה במשך כמה ימים. מכאן, המדיום חייב להיבדק כל יום מתחדש בעת הצורך. בנוסף, את השטח המועלה על צלחת פולידיתיל siloxane יכול להיות מכוסה עם הפוכה 60 מ"מ בקוטר צלחת פלסטיק כדי למזער את האידוי. שלישית, זהירות קיצונית חייב להיות מופעל תוך הזזת המכשיר מאמץ על המיקרוסקופ דרך בשלב z-תרגום להביא את התאים קרוב שמיכות זכוכית. דחיסת התאים (אפילו לרגע) בין שכבת המשנה של פולידימתילקסיאן ושמיכות הזכוכית עלולות לגרום למוות תאים. הרביעי, תאים מתים ופסולת התא עשוי להישאר תקוע שמיכות זכוכית לאחר המדגם פולידימתיל siloxane הוסר. מכאן, לאחר הדמיה, שמיכות זכוכית חייב להיות משכו מן שומן ואקום שמיכות טרי צריך להיות מצורף לפני הרכבה מדגם חדש.
המגבלות של המכשיר מאמץ הם כי היישום של הזחה לרוחב בשלב לא ניתן לתכנת לבצע זן מחזורי או מתוח וכי הוא יכול להחיל רק זן uniaxial. הגבלת שכבות המשנה של פולימתיל סילאוקאן בגיאומטריה המתוארת היא שמתח גבוה מ -25% עלול לגרום לשבר של הפולימתיל סילאוקאן.
שינוי עתידי כדי לשפר את העיצוב של שכבת המשנה polydiמתיל siloxane יכול להיות שילוב של רשת על פני השטח של תרבות התא. זה יאפשר לעקוב אחר אותו תא לפני ואחרי היישום של זן מתיחה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
כל המחברים בהכרת תודה מימון תמיכה מתוך קרן המחקר הלאומי של סינגפור דרך הברית סינגפור-MIT למחקר וטכנולוגיה (SMART) BioSystems ו Micromechanics (BioSyM) קבוצת מחקר רב-תחומי. המחברים ד ר ג'יאלאסקה וד ר ואן ולליט גם מממנים בהכרת תודה ותמיכה מקרן סאקס-קאבוונוב. המחברים מודים לוויליאם אונג וד ר סינג יאנאן ללעוס מהאוניברסיטה הטכנולוגית של נניאנג, סינגפור, למתן תאים אוליגודנדרוציטים בחולדות לניסויים מסוימים המתוארים בעבודה זו, והמחברים מודים לד ר ג. ושואשאני מ מכון מכונאי, האוניברסיטה הלאומית של סינגפור, סינגפור, לדיונים על תנודות באזור הגרעיני.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary cells | Primary Oligodendrocyte Progenitor Cells isolated from Neonatal Rats were provided by Dr. S. Y. Chew's lab at Nanyang Technological University |
||
| Media | |||
| DMEM high glucose | Gibco | 11996-065-500ml | |
| Pen/Strep | Gibco | 15070-063-100ml | |
| FGF | Prospec | CYT-608-50ug | |
| PDGF | Prospec | CYT-776-10ug | |
| Media Stock components | |||
| BSA | Sigma | A9418-10G | |
| Progesterone | Sigma | P8783-1G | |
| Putrescine | Sigma | P5780-5G | |
| Sodium Selenite | Sigma | S5261-10G | |
| Tri-iodothyronine | Sigma | T6397-100MG | |
| Thyroxine | Sigma | T1775-100MG | |
| Holo-Transferrin | Sigma | T0665-500MG | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Mold and PDMS plate | |||
| PDMS - Dow Corning Sylgard 184 | Ellsworth | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Mold - Liquid Plastic | Smooth-On | Smooth Cast 310 - Trail Size | |
| Substrate Coatings | |||
| poly-D-lysine | Sigma | P6407-5MG | |
| Fibronectin | Sigma | F1141-2MG | |
| Histone staining | |||
| CellLigt H2B-GFP BacMam | Molecular Probes | C10594 | |
| Surface functionalization | |||
| APTES | Sigma | A3648-100ml | |
| BS3 | Covachem | 13306-100mg | |
| HEPES buffer pH 8.0 | Alfa Aesar | J63578-AK-250ml | |
| Cell detachment | |||
| Accutase | Invitrogen | A1110501-100ml |
References
- Bray, D. Mechanical tension produced by nerve cells in tissue culture. Journal of Cell Science. 410, 391-410 (1979).
- Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension. Developmental Biology. 389, (1983).
- Van Essen, D. C. A tension-based theory of morphogenesis and compact wiring in the central nervous system. Nature. , (1997).
- Smith, D. H. Stretch growth of integrated axon tracts: Extremes and exploitations. Progress in Neurobiology. 89, 231-239 (2011).
- Cullen, D. K., Simon, C. M., LaPlaca, C. M. Strain rate-dependent induction of reactive astrogliosis and cell death in three-dimensional neuronal-astrocytic co-cultures. Brain Research. , 103-115 (2011).
- Fisher, E., et al. Imaging correlates of axonal swelling in chronic multiple sclerosis brains. Annals of Neurology. 2, 219-228 (2007).
- Nikić, I., et al. A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Nature Medicine. 17, 495-500 (2011).
- Payne, S. C., Bartlett, C. A., Harvey, A. R., Dunlop, S. A., Fitzgerald, M. Functional loss during chronic secondary degeneration in rat optic nerve. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53, (2018).
- Zeiger, A. S., et al. Static mechanical strain induces capillary endothelial cell cycle re-entry and sprouting. Physical Biology. 13, 1-16 (2017).
- Jagielska, A., et al. Mechanical strain promotes oligodendrocyte differentiation by global changes of gene expression. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 93 (2017).
- Pajerowski, J. D., Dahl, K. N., Zhong, F. L., Sammak, P. J., Discher, D. E. Physical plasticity of the nucleus in stem cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1, 0-5 (2007).
- Talwar, S., Kumar, A., Rao, M., Menon, G. I., Shivashankar, G. V. Correlated spatio-temporal fluctuations in chromatin compaction states characterize stem cells. Biophysical Journal. 104, 553-564 (2013).
- Makhija, E., et al. Mechanical strain alters cellular and nuclear dynamics at early stages of oligodendrocyte differentiation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 59 (2018).
