Summary
وباستخدام جهاز مصمم مسبقا لتطبيق السلالة الميكانيكية علي الخلايا الملتصقة ، تصف هذه الورقة هندسه الطبقة الفرعية المعاد تصميمها وجهازا مخصصا للتصوير عالي الاستبانة للخلايا المتوترة بهدف غمر الزيت بنسبه 100x.
Abstract
ومن المعروف ان السلالة الميكانيكية خارج الخلية للحصول علي الاستجابات الظاهرية الخلوية ولها صله فسيولوجية في العديد من أنظمه الانسجه. للتقاط تاثير ضغط الشد خارج الخلية التطبيقية علي الخلايا السكانية في المختبر عن طريق الاختبارات البيوكيميائية ، وقد تم تصميم جهاز سابقا التي يمكن ان تكون ملفقه ببساطه وصغيره بما يكفي لتناسب داخل حاضنات ثقافة الانسجه ، وكذلك علي راس مراحل المجهر. ومع ذلك ، فان التصميم السابق للطبقة الفرعية polydimethylsiloxane لا يسمح بالتصوير الخلوي العالي الاستبانة عن طريق أهداف غمر الزيت. يصف هذا العمل هندسه أعيد تصميمها للطبقة الفرعية polydimethylsiloxane واعداد التصوير المخصصة التي يمكن ان تسهل معا التصوير الخلوي العالي الاستبانة للخلايا الحية اثناء الضغط المطبق. يمكن استخدام هذه الطبقة الفرعية مع نفس الجهاز المصمم سابقا ، التالي ، لديه نفس المزايا المذكورة أعلاه ، بالاضافه إلى السماح بالتصوير البصري عالي الدقة. ويمكن تحسين تصميم الطبقة الفرعية polydimethylsiloxane بدمج شبكه من شانها ان تسهل تتبع نفس الخلية قبل وبعد تطبيق السلالة. تظهر النتائج التمثيلية تصويرا بفواصل زمنيه عاليه الدقة لفلوريسسينتلي المسمية نواه داخل الخلايا المجهدة الملتقطة باستخدام الطريقة الموصوفة هنا. هذه البيانات ديناميات النووية تعطي رؤى في اليه التي الشد المطبقة يعزز التمايز من الخلايا الجذعية اوليجوديندروسيتي.
Introduction
تخضع الخلايا والانسجه في الجسم لمختلف العظات الميكانيكية ، بما في ذلك سلالات الشد. ومع ذلك ، فان اثار هذه العظة علي بيولوجيا الخلايا العصبية لم تدرس بعد علي نطاق واسع وفهم تماما. في الجهاز العصبي المركزي ، وتشمل مصادر السلالة الميكانيكية النمو التنموي1،2،3،4، العمليات الفسيولوجية مثل الانحناء الحبل الشوكي والدم والسائل النخاعي نبض ، والحالات المرضية مثل الصدمة ، وتورم عصبي ، تندب جليال ، أو نمو الورم5،6،7،8. ومن الجدير بالبحث كيف تؤثر سلاله الشد علي التمايز من oligodendrocytes والنخاع اللاحقة من axons ، وهي عمليه حرجه في الجهاز العصبي المركزي فقاري. باستخدام جهاز سلاله مصممه خصيصا وصفائح المطاط المرن ، وقد أظهرت الاعمال السابقة9،10 ان سلاله أحاديه المحوري ثابته يمكن ان تزيد من التمايز اوليجوديندروسيتي عن طريق التغيرات العالمية في التعبير الجيني 10-ولاكتساب مزيد من الفهم لليات الضغط الألى في هذه الخلايا ، يجب أعاده تصميم الجهاز التجريبي السابق علي النحو الموصوف هنا ، لتمكين التصوير الفلوري العالي الاستبانة لديناميات الاسلحه النووية في العيش خلايا تحت الضغط. علي وجه التحديد ، يتم تطوير لوحه أحاديه البئر بوليميثيلسيلاوكسان ، ويتم أعاده تصميم تكوين التصوير للسماح للتصوير الفاصل الزمني للخلايا الحية تحت الضغط باستخدام عدسه الغمر النفط 100x. للقضاء علي الآثار البصرية السلبية polydimethylsiloxane في المسار الخفيف ، والخلايا التي لا يتم من خلال لوحه polydiميثيل siloxane ، ولكن في الموقف المقلوب ، من خلال غطاء الزجاج تغطي مقصوره الخلية. باستخدام هذا التصميم التصويري الجديد ، يتم تسجيل المئات من الأفلام ذات الفواصل الزمنيه عاليه الدقة ، من نوى الخلايا الفردية داخل الخلايا الملتصقة السليمة ، حيث يتم تسميه الكروماتين بوضع علامات هيستون H2B علي البروتين الفلوري الأخضر. هذه الأفلام تثبت ان سلاله الشد يدفع التغييرات في بنيه الكروماتين والديناميكيات التي تتسق مع تطور التمايز اوليجوديندروسيتي.
التصوير الخلوي الحي تحت السلالة التطبيقية صعب من الناحية الفنية ويتطلب تصميم جهاز متوافق مع نظام المجهر. ويقدم التصميم المخصص الموصوف هنا بديلا غير مكلف للحلول التجارية. وتمكن ابعاده من تركيبها علي مراحل المجهر وتصوير الخلايا الحية باستبانة مكانيه عاليه اثناء الضغط المطبق. تم تصميم اعداد التصوير لتسهيل تصوير الخلايا الحية باستخدام عدسه الغمر النفط 100x مع اعلي درجه وضوح ، من خلال غطاء الزجاج ، وليس من خلال طبقه من لوحه polydimethylsiloxane الذي يقلل من جوده الصورة ، وهو أمر شائع في معظم أجهزه التصوير تحت الضغط. يمكن أيضا تخزين الجهاز ، مع لوحه مثبته تحتوي علي خلايا ، بسهوله في الحاضنة. تم تصميم هذا الجهاز لتطبيق سلاله أحاديه المحور لأسطح التي تسهل ثقافة الخلايا الملتصقة والحفاظ علي سلاله مستقره وموحده علي مدي عده أيام. يمكن استخدام الاعداد الموصوف هنا للتصوير عالي الدقة لأنواع الخلايا الملتصقة المختلفة تحت الضغط ، مما يجعله قابلا للتطبيق علي الدراسات الميكانيكية في العديد من مجالات البيولوجيا الميكانيكية للخلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تصميم العفن polydimethylsiloxane واحد جيدا للتصوير عاليه الدقة
ملاحظه: تم تصميم قالب لتصنيع لوحات polydimethylsiloxane مع الميزات التالية لتمكين التصوير مع عدسه الغمر النفط 100x ويصلح الصحيح في جهاز سلاله مخصصه بناء (الشكل 1A، B).
- الحفاظ علي ابعاد لوحه العامة بحيث تناسبها في المشابك من جهاز سلاله.
ملاحظه: هنا ، فهي 60 مم × 73 مم. - جعل حجره الخلية أو جيدا ان أصغر بكثير من الابعاد الجانبية للوحه بأكملها ، لتجنب الانحناء (خارج الطائرة) الآثار التي تحدث في حواف غير مثبته من لوحه polydimethylsiloxane خلال السلالة التطبيقية.
ملاحظه: هنا ، تم تصميم المقصورة كمربع 23 مم × 23 مم. - الحفاظ علي عمق مقصوره الخلية كحد ادني ممكن (وليس أكثر من 80 μm) ، لتمكين التركيز مع 100x النفط الغمر عدسه من خلال غطاء الزجاج وضعت علي راس المقصورة ، ولكن جعلها كافيه بما يكفي لاحتواء وسائل الاعلام وتجنب الاتصال أو الضغط علي الخلايا.
- رفع مقصوره الخلية علي مربع مع ارتفاع 3 ملم ، لجعل الخلايا أقرب إلى العدسة في الاعداد المجهر المقلوب لتمكين التركيز السهل.
ملاحظه: قوالب مع الميزات المذكورة أعلاه يمكن تصنيعها من قبل العديد من التقنيات بما في ذلك ، علي سبيل المثال ، المضروب ألومنيوم. بدلا من ذلك ، يمكن أيضا تجميع القوالب الرئيسية باستخدام صفائح الأكريليك مع قطع الليزر ، وتغطيه الزجاج #0 لحجره الخلية ، والغراء السوبر. ويستخدم هذا القالب الرئيسي لجعل بصمه polydimethylsiloxane ، والذي يستخدم بعد ذلك لجعل قوالب العمل باستخدام الراتنج الصب.
2. تصنيع لوحات بوليميثيلسيلاوكسان أحاديه البئر ومقصورات مربعه
- مزيج polydiميثيل siloxane قاعده وعامل علاج في نسبه 20:1 (بالوزن) في كوب المتاح. تزن ما مجموعه 20 غراما من polydimethylsiloxane في العفن (لصنع واحده polydimethylsiloxane لوحه) و 150 غرام من polydimethylsiloxane لكل 150 مم في قطر طبق من البلاستيك (لجعل دفعه واحده من المقصورات مربع).
- ترك مزيج polydiميثيل siloxane في فراغ دغسر في-0.8 بار لمده 30 دقيقه (أو حتى يتم أزاله جميع الفقاعات).
- صب polydimethylsiloxane مزيج في قوالب (لوحات) أو في 150 الاطباق البلاستيكية مم (لمقصورات مربع).
- أزاله اي فقاعات اضافيه في هذه المرحلة ، اما عن طريق نفخ الهواء (عن طريق الفم) أو التخلص من قوالب polydimethylsiloxane مملوءة/الاطباق مره أخرى في-0.8 شريط فراغ لمده 30 دقيقه.
- اترك القوالب/الاطباق في فرن 80 درجه مئوية علي طاوله التسوية لمده 2 ساعة.
- أزاله بعناية قوالب/اطباق من الفرن والسماح لهم تهدئه إلى درجه حرارة الغرفة. قشر بلطف خارج polydimethylsiloxane الشفاء بعد قطع بعناية حواف مع شفره (الشكل 1C).
- علي 150 mm-القطر polydimethylsiloxane ، رسم 2 سم × 2 سم الشبكة مع علامة. داخل كل مربع ، رسم 1 سم × 1 سم مربع ، وترك هامش 0.5 سم من جميع الجوانب. باستخدام شفره ، قطع بعناية علي طول خطوط للحصول علي مقصورات مربعه (الشكل 2A).
- تنظيف لوحات polydimethylsiloxane/المقصورات مربع من خلال احتضان لهم في 100 ٪ الأسيتون ل 4 h ، تليها 100 ٪ الايثانول ل 4 h ، تليها المياه المعقمة ل 4 h.
- وضع لوحات/المقصورات مربع علي ورق البارافين دعم الفيلم (وليس الفيلم البارافين ولكن الورق) داخل 150 ملم قطرها طبق من البلاستيك (الشكل 2C).
- اتركي صفيحه بوليميثيلسيلاوكسان في الفرن 80 درجه مئوية لتجف لمده 4 ساعات.
- قم بختم الاطباق ذات القطر ال150 ملم التي تحتوي علي لوحات بوليميثيلسيلاوكسان ومربعات الحاوية مع فيلم البارافين ، وخزنها في غرفه بارده حتى يتم استخدامها بشكل أكبر.
3-إضفاء الطابع الوظيفي علي لوحات بوليديميثيلسيلاوكساني
- أزاله الفيلم البارافين ، وأزاله غطاء من طبق من البلاستيك ، ووضع لوحات polydimethylsiloxane والمقصورات مربع تحت الضوء فوق البنفسجي لمده 30 دقيقه.
- البلازما-علاج (في 150 W لمده 5 دقائق) لوحات polydimethylsiloxane (مع المقصورة الخلية التي تواجه) دون مقصورات مربعه ، لجعل الثقافة سطح هيدروفيلييك.
- وضع علي الفور المقصورات مربع علي سطح البلازما المعالجة (الشكل 2B) واضغط يدويا لعصا مؤقتا اثنين معا.
ملاحظه: لا البلازما-علاج مقصورات مربع ، والا فانها سوف تلتصق بقوة إلى لوحه polydimethylsiloxane ولن تاتي بسهوله عندما يجب ان تكون مقشر اثناء التصوير. - أضافه 200 μL من 100 mM (3-امينوبروبيل) triethoxysilane إلى البئر لمده 2 ساعة لإدخال-NH2 مجموعات إلى سطح بوليميثيلسيلاوكسان. لجعل 100 mM حل ، تذوب 234 μL من النقي (3-امينوبروبيل) triethoxysilane في 10 مل من الماء. بعد الحضانة 2 ح ، وغسل الآبار 3x مع الماء منزوع الأيونات.
- تزن 2 ملغ من الخلايا المتداخلة الجزيئية بيسولفوسكانيديديل وتذوب في 700 μL من 1 م (4-(2-هيدروكسي ايثيل) -1-بيبروازيايثان العازلة حمض السلفونيك (pH 8.0) و 2.8 mL من الماء.
ملاحظه: هذا سيعطي 1 مم بيسسولفوسكانيديديل الحل سويرات في 200 mM (4-(2-هيدروكسي ايثيل) -1-بيبروازيايثان العازلة حمض السلفونيك. لاحظ ان المخزن المؤقت للتركيز 50 mM يعمل أيضا بشكل جيد.- أضافه 135 μl من هذا الحل و 15 μl من 1 ملغ/مل الفيبرونكتين جنيني إلى بئر في كل لوحه polydimethylsiloxane ل 4 ح في درجه حرارة الغرفة.
- غسل 3x مع محلول ملحي الفوسفات مخزنه. أضافه 500 μL من الفوسفات-مخزن محلول ملحي إلى البئر. تغطيه 150 مم--قطرها الطبق الذي يحتوي علي polydimethylsiloxane مع الفيلم البارافين وتخزينها في غرفه بارده ، حتى مزيد من الاستخدام.
4. إضفاء الطابع الوظيفي علي الاطباق البلاستيكية وقوارير
- احتضان الاطباق البلاستيكية وقوارير مع محلول 5 ميكروغرام/مل من بولي-D-يسين (PDL ، في المياه المعقمة) ل 1 ح. أضافه 1.5 mL من هذا الحل (ligand) لكل 35 مم-قطر الطبق ، 3 مل منه في 60 مم-قطر الطبق ، و 10 مل لكل 75 سم2 ثقافة قارورة.
- يغسل الاطباق وقوارير 2x مع الماء المعقم.
- اتركها لتجف في خزانه السلامة الاحيائيه لمده 1 ساعة (أو حتى تجف) وتخزينها في الغرفة الباردة في 4 درجه مئوية حتى استخدامها.
5-الانتشار والتمايز المتوسط للخلايا الجذعية المولدة
- اعداد 50 ml من حلول 100x من الانتشار والتمايز المتوسطة ، وجعل قسامات من 2.5 mL ، وتخزينها في-80 درجه مئوية.
ملاحظه: تكوين المتوسطة الانتشار هو 0.1 ملغ/مل الأبقار المصل البقري ، 62 نانوغرام/مل البروجسترون ، 16 ميكروغرام/مل بوتريسين ، 5 ميكروغرام/مل الانسولين ، 50 ميكروغرام/مل هولو-ترانسفيرين ، 5 نانوغرام/مل سيليريت الصوديوم ، 1x البنسلين-ستربتوميسين ، 10 نانوغرام/مل الصفائح الدموية النمو المشتقة عامل ، و 10 نانوغرام/مل عامل نمو الخلايا الليفية في المتوسط النسر دولبيكو المعدلة (DMEM) مع ارتفاع الجلوكوز و pyruvate. بينما الزلال المصل البقري ، البروجسترون ، الوضع ، والصوديوم سيليريت يمكن تشكيلها وتخزينها في 100x ، الانسولين ، هولو ترانسفيرين ، والبنسلين-ستربتوميسين يجب ان تضاف جديده اثناء اعداد الحل 1x. يجب ان تكون عوامل النمو في 10 ميكروغرام/مل ويجب ان تضاف طازجه إلى الخلايا كل يوم (1 μL/مل من المتوسطة). تكوين المتوسطة التمايز هو 0.1 ملغ/مل البقري مصل الدم الزلال ، 62 نانوغرام/مل البروجسترون ، 16 ميكروغرام/مل بوتريسين ، 5 ميكروغرام/مل الانسولين ، 50 ميكروغرام/مل هولو-ترانسفيرين ، 5 نانوغرام/مل سيليريت الصوديوم ، 1x البنسلين-ستربتوميسين ، 400 ng/mL ثلاثي يودوثيرونين ، 400 ng/mL L-هرمون الغدة الدرقية ، و 0.5 ٪ الجنين البقري المصل في DMEM مع ارتفاع الجلوكوز و pyruvate. Triiodothyronine و L-هرمون الغدة الدرقية يمكن ان تشكل مع الكواشف الأخرى وتخزينها في 100x. يجب أضافه الانسولين ، والبنسلين-الترانسفيرين ، والبنستربتومايسين الطازجة اثناء اعداد الحل 1x. - لاعداد 50 مل من متوسط الانتشار 100x ، تذوب 510 ملغ من الزلال المصل البقري في 17 مل من المتوسطة دولبيكو ، 310 ميكروغرام من البروجسترون في 31 μL من الايثانول ، 80 ملغ من بوتريسين في 500 μL المتوسطة دولبيكو ، 25 ميكروغرام من سيليريت الصوديوم في 10 μL المتوسطة دولبيكو ، وكامل DMEM تصل إلى 50 mL
- لاعداد 50 مل من محلول 100x من التمايز المتوسطة ، بالاضافه إلى حل 2 ملغ من ثلاثي يودوثيرونين في 40 μL من هيدروكسيد الصوديوم و 2 ملغ من L-هرمون الغدة الدرقية في 40 μL من هيدروكسيد الصوديوم ، ثم تملا الحل إلى 50 mL مع المتوسطة دولبيكو. تصفيه الحل من خلال وحده فلتر معقم المتاح ، aliquot ، وتخزين aliquot في-80 درجه مئوية.
- لاعداد 250 مل من 1x الانتشار/التمايز المتوسطة ، مزيج 2.5 mL من محلول 100x من الانتشار/التمايز المتوسطة مع 12.5 ملغ من هولو-ترانسفيرين ، 125 μL من 10 ملغ/مل الانسولين ، و 2.5 مل من 100x البنسلين-ستربتوميسين. أملا المحلول ب 250 مل مع متوسط دولبيكو وقم بتصفيته من خلال وحده فلتر معقمه يمكن التخلص منها.
ملاحظه: يجب أضافه عوامل النمو الطازجة ومباشره إلى ثقافة الخلية ، وليس إلى دفعه كامله من المتوسطة المعاد تشكيلها.
6-ثقافة الخلية
- تبدا مع اوليجوديندروسيتي الخلايا سلف معلقه في المتوسطة الانتشار. بذور هذه الخلايا في كثافة 35,000 الخلايا/سم2 علي الأسطح البلاستيكية المغلفة pdl (اطباق أو قوارير ، انظر القسم 4). ضبط حجم متوسط الانتشار إلى 3 مل لكل 10 سم2 من المساحة السطحية من الطبقة التحتية البلاستيكية. قد يؤدي انخفاض حجم المتوسطة إلى تكتل الخلايا الناشئة عن قوي التوتر السطحي ، في حين ان حجما اعلي من المتوسطة في الاطباق قد يسبب انسكاب.
- أضافه عوامل النمو (عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية وعامل نمو الفيبروكتين) كل يوم ، والحفاظ علي تركيزها في 10 نانوغرام/مل وتغيير نصف متوسط الانتشار في الأيام البديلة.
- في اليوم الثالث ، فصل الخلايا من سطح البلاستيك باستخدام حل مفرزه الخلية لطيف (علي سبيل المثال ، accutase): أزاله المتوسطة ، وغسل 1x مع محلول ملحي الفوسفات مخزنه ، أضافه 1 مل من محلول انفصال لكل 20 سم2 المنطقة ، وترك الطبق/قارورة في حاضنه في 37 درجه مئوية لمده 10 دقيقه ، والاستفادة منه بلطف حتى فصل جميع الخلايا (انظر تحت المجهر).
- ماصه باستخدام تلميح 200 μL لكسر كتل في خلايا واحده, نقلها إلى أنبوب 50 mL, تمييع لهم في الانتشار المتوسطة, تدور في 0.2 x ز لمده 10 دقيقه, تجاهل supernatant, وأعاده تعليق بيليه في المتوسطة الانتشار لجعل حجم الكلي 1 مل. احسب الخلايا باستخدام مقياس مضخم للخلايا.
- غسل فيبرونكتين-الدالة polydimethylsiloxane لوحات 2x ، 15 دقيقه لكل غسل ، مع الانتشار المتوسطة.
- بذره 35,000 خليه لكل [بولديميثيلسلوكين] لوحه في 700 μL من انتشار متوسطه.
- أضافه بناء البلازميد من H2B لوضع العلامات هيستون H2B مع البروتين الفلوري الأخضر.
ملاحظه: هنا ، تم أضافه 1.4 μL من CellLight H2B-GFP BacMam2 مزيج ترانسفيكشن إلى كل لوحه (2 μL لكل 50,000 الخلايا). - بعد 24 ساعة ، جبل عينات بوليميثيلسيلاوكسان مع الخلايا التي امتدت علي جهاز سلاله أحاديه المحور (كما هو مبين في الشكل 2D). تغيير المتوسطة في جميع العينات إلى متوسط التمايز.
- لسلاله العينات ، وقياس طول حجره الخلية غير المتوترة (الشكل 3a) وتحويل المسمار ميكرومتر المرحلة لزيادة طول حجره الخلية بالمبلغ المطلوب (علي سبيل المثال ، 10 ٪ ، انظر الشكل 3a). اترك عينات بوليميثيلسيلاوكسان الممدودة وغير المتمددة في الحاضنة عند 37 درجه مئوية حتى التصوير.
7-التصوير
- قم بتشغيل المجهر. تعيين درجه حرارة حاضنه المجهر إلى 37 درجه مئوية.
- جلب الهدف لاستخدامها (100x الغمر النفط) إلى المركز المركزي كما برج الهدف لن يمكن الوصول اليها في وقت لاحق. فك الهدف والمسمار مره أخرى مع حلقه موضوعيه (الشكل4A) بحيث يمكن ان يكون الهدف أقرب إلى الخلايا. إذا تم استخدام هدف النفط هنا ، أضافه قطره من النفط في هذه الخطوة.
- توليف مسبقا (عن طريق الطباعة ثلاثية الابعاد أو بالقطع) حامل من البلاستيك أو المعدن الذي يحتوي علي اثنين من الميزات الهامه-نافذه الزاوية وخطوه (الشكل 4B).
ملاحظه: الإطار يدعم سماكه #0 الزجاج كوفيرسليب التي من شانها ان تعقد المتوسطة في حين ان جهاز سلاله في حاله مقلوبه. القطع الزاوية في حواف النافذة (الشكل 4D) يسمح للهدف ان يقترب من الزجاج المشبك. الخطوة في حامل يسمح لنا لجلب polydiميثيل siloxane امتدت أكثر إلى أسفل ، أقرب إلى الهدف. - وضع الزجاج كوفيرسليب (سمك #0 ، مع ابعاد 25 مم × 25 ملم أو 35 مم في القطر) علي السطح العلوي للحامل عن طريق نشر الشحوم فراغ في محيط النافذة (الشكل 4c) ، والشريط نافذه من البلاستيك علي مرحله المجهر ( الشكل 4D والشكل 5 ا).
- المسمار مرحله z-الترجمة علي مرحله المجهر ونقله إلى اعلي z-الموقف (الشكل 5a).
- أزاله 500 μl من المتوسطة من لوحه polydimethylsiloxane امتدت إلى ان تكون الناقصة وأضافه هذه الوسيلة علي الزجاج كوفيرسليب في نافذه من البلاستيك الأبيض.
- افصل الحجرة المربعة بعناية من لوحه بوليميثيلسيلاوكسان مع ملاقط معقمه.
- عقد جهاز سلاله في وضع تستقيم (الخلايا التي تواجه حتى) فوق النافذة البلاستيكية البيضاء وعكس بعناية جهاز سلاله وذلك للسماح لأي قطره المتوسطة الاضافيه مباشره في منتصف الزجاج كوفيرسليب (الشكل 5b) (الخلايا التي تواجه أسفل).
- وضع الجزء السفلي من جهاز سلاله علي مرحله z-الترجمة مع الشريط علي الوجهين (الشكل 5c، D).
- اثناء النظر من خلال العدسة تحت برايت فيلد ، ببطء جلب جهاز السلالة إلى أسفل (الشكل 5E) (عن طريق خفض المرحلة z-الترجمة) وتحريك الهدف حتى التركيز علي الخلايا.
- تنفيذ هذه الخطوة ببطء شديد ، خطوه بخطوه. إذا كان جهاز سلاله يضغط كثيرا علي كوفيرسليب ، يمكن الحصول علي ضغط الخلايا (مما تسبب لهم بالموت) وإذا كان الهدف يضغط كثيرا علي كوفيرسليب ، يمكن كسر كوفيرسليب (تسبب المتوسطة لتسرب وانسكاب علي الهدف).
- مسح لوحه polydimethylsiloxane في x-و y-الاتجاات للعثور علي خليه التي لديها نواه الفلورسنت (تحت العدسة مع 488 nm من الاثاره الطول الموجي) والمورفولوجية الخلية المناسبة (تحت برايت فيلد).
- إذا كان الازاحه الجانبية للمرحلة المجهر لا يؤثر علي التركيز الراسي كثيرا ، حدد مناطق متعددة من المصالح باستخدام ميزه متعددة علي البرنامج. في بعض الأحيان ، يكون التركيز حساسا جدا لأي أزاحه جانبيه للمرحلة. في مثل هذه الحالات ، صوره خليه واحده في كل مره. حدد المواضع xو yو zلكل خليه من الاهتمامات.
- سجلت [ويد-فيلد] (أو [هوت-بيهول]) صور من النواة مع 488 [نم] من طول موجه أثاره ومن الخلية مع [برايت فيلد] أثاره علي فترات من 30 [س] لكل اطار لمده إجماليه من علي الأقل 30 [مين.].
8-تحليل البيانات
-
التقلبات النووية
- افتح تسلسل الصور النواة (الشكل 6A) في برنامج تحليل الصور وعتبه الصور الفاصلة الزمنيه النواة ( علي سبيل المثال ، استخدم الأمر العتبة في Imagej أو الأمر جريثريح في matlab البرنامج).
- الحصول علي منطقه النواة (بالبكسل) كداله للوقت ، ورسمها في البرمجيات بالتامر البيانات (الشكل 6B) ، وتناسب متعدد الحدود النظام الثالث إلى البيانات (الشكل6b) (علي سبيل المثال ، استخدام التحليل | تركيب | الأمر صالح متعدد الحدود في الأصل أو الأمر بوليفيت في matlab البرنامج).
- اطرح قيمه متعددة الحدود المجهزة من المنطقة الفعلية (بالبكسل) لكل نقطه زمنيه. وتعرف هذه المنطقة المصححة باسم المنطقة المتبقية.
ملاحظه: هذه العملية أزاله اي اتجاه زيادة أو نقصان في البيانات القادمة من أخطاء الاداات ويسمي detrending.- حساب النسبة المئوية للمنطقة المتبقية عن طريق تقسيم المنطقة المتبقية في كل نقطه زمنيه مع قيمه متعددة الحدود المجهزة في تلك النقطة الزمنيه (الشكل 6D).
- حساب الانحراف المعياري لسلسله وقت المنطقة المتبقية. ويدل هذا الانحراف المعياري علي اتساع التقلبات النووية.
-
تخطيط البيانات والتحليل الإحصائي
- حساب سعة التقلبات النووية كمتوسط لما لا يقل عن 20 نواه لكل حاله.
- اجراء اختبار إحصائي لتحليل الفروق في اتجاه واحد مع تصحيح Bonferroni لتحديد ما إذا كان هناك اختلاف كبير في اتساع التذبذبات كداله لشروط الفائدة (علي سبيل المثال ، مع وبدون الضغط المطبق).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وأظهرت الاعمال الاخيره التي تهدف إلى التحقيق في تاثير إجهاد الشد علي oligodendrocytes10 ان سلاله الشد أحاديه المحور 10 ٪ يعزز التمايز من الخلايا السلف oligodendrocytes من التغيرات العالمية في التعبير الجيني. ويمكن سبر اليه الكامنة وراء هذه التغييرات في التعبير الجيني عن طريق تصوير المعلمات دون الخلوية ، مثل هيكل خلوي ، وتوطين عامل النسخ ، والديناميكيات النووية ، ومنظمه الكروماتين. ومع ذلك ، فان الهندسة السابقة للطبقة الفرعية بوليميثيلسيلاوكسان لم تسمح بالتصوير بخليه واحده عاليه الاستبانة. وكما هو موصوف في هذا العمل ، فان الهندسة المعاد تصميمها للطبقة الفرعية polydimethylsiloxane واعداد التصوير تقلل من المسافة بين الخلايا والهدف. وهذا يسمح التقاط الصور الفاصلة الزمنيه من نوى الخلية فلوريسسينتلي المسمي باستخدام 100x النفط الغمر الهدف (الشكل 6A).
يعتمد تقلبات في النووية يسلط منطقه علي التمييز دوله من الخلايا11,12. وأظهرت المقارنة بين التقلبات النووية للخلايا البروجينتور اوليغوندرونسيتي والتي عضال المتمايزة اوليجوديندروسيتي ان هذا الأخير لديها تقلبات اقل بكثير (الشكل 6e). بعد ذلك ، تمت مقارنه التقلبات النووية للخلايا البروجينتور اوليجوديندروسيتي في 1 ح ، 24 ساعة ، و 48 h التعريفي بعد الكيميائية من التمايز مع وبدون سلاله الشد 10 ٪. ومع الحث الكيميائي وحده ، أظهرت سعة التقلبات النووية انخفاضا كبيرا في 48 ساعة ولكن ليس في 24 ساعة (الشكل 6F). من ناحية أخرى ، وأظهرت التعريفي الكيميائية مع سلاله الشد 10 ٪ انخفاضا كبيرا في 24 ساعة ، والتي ظلت ثابته ، دون مزيد من الانخفاض في 48 h (الشكل 6G).
مكنت هندسه الطبقة الفرعية وتكوين التصوير الموصوف في هذه الورقة من تسجيل الأفلام عاليه الدقة من الخلايا المتوترة. وقد اثبت التحليل اللاحق لهذه الأفلام ان السلالة تعجل بالتقلبات النووية المثبطة ، وهي علامة تمييز. هذه النتائج تعطي نظره ثاقبه إلى اليه التي سلاله يعزز التمايز اوليجوديندروسيتي. ويرد وصف لمزيد من المناقشات بشان تفسير هذه النتائج والتجارب المستقبلية في Makhija وآخرون13.
الشكل 1: تصميم وهندسه بوليديميثيلسيلاوكسان العفن. (ا) رسم تخطيطي للقالب الذي يظهر جميع الابعاد في ملليمتر (تم توليد هذا الرسم التخطيطي من قبل تقنيات Whits ، سنغافورة). (ب) رؤية ثلاثية الابعاد للقالب (مقتبسه من Makhija et al.11). أقحم يظهر صوره من العفن. (ج) الرؤية ثلاثية الابعاد لصفيحه بوليديميثيلسيلاوكسان الملفقة باستخدام العفن (مقتبسه من Makhija et al.11). الملحق يظهر صوره لصفيحه بوليديميثيلسيلاوكسان. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: اعداد العينة. (ا) صوره لوحه بوليديميثيلسيلاوكسان وحجره مربعه. (ب) توضع الحجرة المربعة علي المربع المرفوع علي صفيحه بوليميثيلسيلاوكسان. الغرض منه هو احتواء المتوسطة للخلايا. (ج) يتم تخزين لوحات Polydimethylsiloxane في 150 مم-قطر الاطباق البلاستيكية باستخدام ورقه بارافيلم لمنع Polydimethylsiloxane من التصاق علي البلاستيك. (D) في حين تصاعد لوحه علي جهاز السلالة ، ودعمها من الجزء السفلي باستخدام اصبعين لمنع اي ترهل من لوحه. إذا كانت لوحه لا تزال يتدلى قليلا بعد المتصاعدة ، وزيادة المسافة بين الاسلحه جهاز سلاله من خلال تحويل مرحله الترجمة. في هذه الخطوة ، ينبغي ان ترجمه المرحلة لا تحفز علي الضغط في لوحه polydimethylsiloxane. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تمدد الخلية. (ا) قياس الطول الاولي للوحه بين المشابك ، وذلك باستخدام مسطره. (ب) تمتد اللوحة عن طريق تحويل المسمار في مرحله الترجمة لزيادة طول اللوحة الاوليه بالنسبة المئوية المطلوبة. X% زيادة في الطول يقابل X% من السلالة. لاحظ انه ، لتوليد السلالة المطلوبة (X ٪) في حجره ثقافة الخلية المرفوعة ، يجب ان تكون الصفيحة الرئيسية متوترة بمقدار اعلي (تقريبا 2X%) بسبب الفرق في سمكها في الهندسة لوحه وصفها. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: التحضير للتصوير. (ا) جلب الهدف 100x إلى الموقع المركزي في البرج ، وفك الهدف ، والمسمار مره أخرى مع حلقه الهدف. (ب) رسم تخطيطي لحامل يبين جميع الابعاد بالملليمتر. (ج) نشر الشحوم فراغ في محيط النافذة في حامل ، وذلك باستخدام طرف ماصه ، ووضع الزجاج المشبك علي القمه. استخدام غطاء الزجاج مع سمك #0 أو #1 ، لتمكين التركيز مع 100x النفط الغمر العدسة. (د) وضع الحامل (1) في مرحله المجهر (2). جلب النفط (6) الهدف (3) أقرب إلى كوفيرسليب (5) التي تمسك حامل ، وذلك باستخدام الشحوم فراغ (4). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: اعداد التصوير علي المجهر. (ا) تجميع مرحله z-الترجمة (السهم الأصفر) وحامل (السهم الأحمر) علي مرحله المجهر. (B) أماله الجهاز سلاله علي مرحله المجهر وذلك للسماح اي قطره متوسطه علي الزجاج كوفيرسليب للحامل. ألصق شريطا علي الوجهين (السهم الأزرق) علي جهاز السلالة الذي سيلتصق بمرحله الترجمة z. (ج) وضع جهاز السلالة في موضع مقلوب ، ودعمه في مرحله الترجمة z. يجب محاذاة الخلايا مع كوفيرسليب الزجاج من حامل البلاستيك. (د) الهندسة المقلوبة للجهاز السلالة تقلل من المسافة بين الخلايا والهدف ، التالي تسهل التصوير عالي الاستبانة (المقتبس من Makhija وآخرون11). (ه) منظر جانبي قبل رفع جهاز السلالة (1) ؛ عرض جانبي بعد جلب جهاز سلاله أسفل (2); العرض العلوي بعد جلب جهاز السلالة إلى أسفل (3). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: الصور التمثيلية وبيانات تقلبات المنطقة للنواة. وقد تم تكييف هذا الرقم من Makhija وآخرون11. (ا) الصورة النموذجية لنواه مسماه بH2B هيستون الموسومة بالبروتين الفلوري الأخضر ، والتمييز بين الخلايا الجذعية. النواة هي في التركيز ، في حين ان العمليات الخلية هي خارج التركيز. (ب) السلسلة الزمنيه النموذجية للمنطقة النووية (بالبكسل). (ج) الترتيب الثالث متعدد الحدود المزود بالبيانات. (د) النسبة المئوية للسلسلة الزمنيه لتقلبات المناطق المتبقية. (ه) تقلبات الحافة النووية لتكاثر الخلايا المتقدمة للخلايا الجذعية والعضال المتمايزة. (و) التقلبات النووية الحافة في 1 ح ، 24 ح ، و 48 h التعريفي من التمايز الكيميائي دون سلاله. (ز) تقلبات المنطقة النووية في 1 ح ، 24 ح ، و 48 h التعريفي من التمايز الكيميائي مع 10 ٪ إجهاد الشد. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد تم تصميم جهاز سابقا1 لتطبيق سلاله الشد خارج الخلية علي الخلايا الملتصقة. وكان تصميم الطبقة الفرعية بوليميثيلسيلاوكسان في ذلك العمل كافيا لاختبارات الكيمياء الحيوية ، فضلا عن التصوير المنخفض الاستبانة للخلايا المتمددة. وفي هذا العمل ، أعيد تصميم الطبقة الفرعية ، واستحدثت تشكيله تصويريه جديده تسهل تصوير الخلايا الخلوية الحية عاليه الاستبانة. مزايا هذا النظام عديده: فانه يمكن بناؤها في المختبر باستخدام مكونات بسيطه ، فمن غير مكلفه بالمقارنة مع أجهزه السلالة التجارية (500 دولار أمريكي للجهاز سلاله خليه) ، وانها صغيره بما يكفي لتناسب داخل حاضنات ثقافة الانسجه ، وكذلك علي المجاهر. وعلاوة علي ذلك ، علي الرغم من انه قد تم وصف نظام التصوير هنا مع الاعداد المجهر المقلوب ، فانه يمكن تعديلها بسهوله لتكوين المجهر تستقيم.
وهناك عدد قليل من الخطوات الحاسمة التي ينطوي عليها اعداد العينات والتصوير. أولا ، لوحات polydimethylsiloxane والمقصورات المربعة يجب تنظيفها بدقه قبل بذر الخلية (بروتوكول الخطوة 2.8) لضمان بقاء الخلية (كما polydimethylsiloxane غير الشفاء هو سام للخلايا). ثانيا ، حيث ان حجم السائل المتوسطة التي يمكن احتواؤها داخل المقصورة مربع اقل من 1 مل ، فانه قد تتبخر إذا كانت العينة في الحاضنة لبضعة أيام. التالي ، يجب فحص الوسيط كل يوم وتجديده عند الحاجة. بالاضافه إلى ذلك ، يمكن تغطيه المنطقة المرتفعة علي صفيحه بوليديميثيلسيلاوكسان بطبق بلاستيكي مقلوب بقطر 60 مم لتقليل التبخر. ثالثا ، يجب توخي الحذر الشديد اثناء تحريك جهاز الضغط علي المجهر إلى أسفل عبر مرحله z-الترجمة لجعل الخلايا أقرب إلى الزجاج المشبك. ضغط الخلايا (حتى للحظة) بين الطبقة الفرعية بوليميثيلسيلاوكسان والشفة الزجاجية قد يسبب موت الخلايا. رابعا ، قد تظل الخلايا الميتة والحطام الخلوي عالقه في الزجاج الزجاجي بعد أزاله عينه بوليميثيلسيلاوكسان. التالي ، بعد التصوير ، يجب ان يتم سحبها من الزجاج كوفيرسليب قباله من الشحوم فراغ وينبغي ان تعلق كوفيرسليب الطازجة قبل تركيب عينه جديده.
والقيود المفروضة علي جهاز السلالة هي ان تطبيق الازاحه الجانبية للمرحلة لا يمكن برمجته لأداء السلالة الدورية أو المتوترة وانه لا يمكن الا ان يطبق السلالة أحاديه المحور. الحد من الطبقة التحتية polydimethylsiloxane في الهندسة الموصوفة هو ان سلاله اعلي من 25% قد يسبب كسر polydimethylsiloxane.
ويمكن ان يكون التعديل المستقبلي لتحسين تصميم الطبقة الفرعية polydimethylsiloxane هو دمج شبكه علي سطح ثقافة الخلية. وهذا من شانه ان يسمح لتتبع نفس الخلية قبل وبعد تطبيق سلاله الشد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
ويعرب جميع المؤلفين عن امتنانهم للدعم التمويلي المقدم من مؤسسه البحوث الوطنية في سنغافورة من خلال مجموعه البحوث المتعددة التخصصات التابعة للتحالف بين سنغافورة ومعهد ماساتشوستس للتكنولوجيا والبحوث والتكنولوجيا (SMART) والميكروميكانيكس (BioSyM). وأعرب المؤلفان الدكتور جاغيليسكا والدكتور فان فليت أيضا عن امتنانهما للتمويل والدعم المقدمين من مؤسسه Saks-كافانوغ. ويشكر المؤلفان وليام اونغ والدكتور سينغ يان تشيو من جامعه نانيانغ التكنولوجية ، سنغافورة ، لتوفير خلايا الفئران التي تقدم السلف لبعض التجارب الموصوفة في هذا العمل ، ويشكر المؤلفون الدكتور غ. ف. شيفاشانكار من معهد البيولوجيا الميكانيكية ، جامعه سنغافورة الوطنية ، سنغافورة ، لاجراء مناقشات بشان تقلبات المناطق النووية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary cells | Primary Oligodendrocyte Progenitor Cells isolated from Neonatal Rats were provided by Dr. S. Y. Chew's lab at Nanyang Technological University |
||
| Media | |||
| DMEM high glucose | Gibco | 11996-065-500ml | |
| Pen/Strep | Gibco | 15070-063-100ml | |
| FGF | Prospec | CYT-608-50ug | |
| PDGF | Prospec | CYT-776-10ug | |
| Media Stock components | |||
| BSA | Sigma | A9418-10G | |
| Progesterone | Sigma | P8783-1G | |
| Putrescine | Sigma | P5780-5G | |
| Sodium Selenite | Sigma | S5261-10G | |
| Tri-iodothyronine | Sigma | T6397-100MG | |
| Thyroxine | Sigma | T1775-100MG | |
| Holo-Transferrin | Sigma | T0665-500MG | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Mold and PDMS plate | |||
| PDMS - Dow Corning Sylgard 184 | Ellsworth | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Mold - Liquid Plastic | Smooth-On | Smooth Cast 310 - Trail Size | |
| Substrate Coatings | |||
| poly-D-lysine | Sigma | P6407-5MG | |
| Fibronectin | Sigma | F1141-2MG | |
| Histone staining | |||
| CellLigt H2B-GFP BacMam | Molecular Probes | C10594 | |
| Surface functionalization | |||
| APTES | Sigma | A3648-100ml | |
| BS3 | Covachem | 13306-100mg | |
| HEPES buffer pH 8.0 | Alfa Aesar | J63578-AK-250ml | |
| Cell detachment | |||
| Accutase | Invitrogen | A1110501-100ml |
References
- Bray, D. Mechanical tension produced by nerve cells in tissue culture. Journal of Cell Science. 410, 391-410 (1979).
- Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension. Developmental Biology. 389, (1983).
- Van Essen, D. C. A tension-based theory of morphogenesis and compact wiring in the central nervous system. Nature. , (1997).
- Smith, D. H. Stretch growth of integrated axon tracts: Extremes and exploitations. Progress in Neurobiology. 89, 231-239 (2011).
- Cullen, D. K., Simon, C. M., LaPlaca, C. M. Strain rate-dependent induction of reactive astrogliosis and cell death in three-dimensional neuronal-astrocytic co-cultures. Brain Research. , 103-115 (2011).
- Fisher, E., et al. Imaging correlates of axonal swelling in chronic multiple sclerosis brains. Annals of Neurology. 2, 219-228 (2007).
- Nikić, I., et al. A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Nature Medicine. 17, 495-500 (2011).
- Payne, S. C., Bartlett, C. A., Harvey, A. R., Dunlop, S. A., Fitzgerald, M. Functional loss during chronic secondary degeneration in rat optic nerve. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53, (2018).
- Zeiger, A. S., et al. Static mechanical strain induces capillary endothelial cell cycle re-entry and sprouting. Physical Biology. 13, 1-16 (2017).
- Jagielska, A., et al. Mechanical strain promotes oligodendrocyte differentiation by global changes of gene expression. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 93 (2017).
- Pajerowski, J. D., Dahl, K. N., Zhong, F. L., Sammak, P. J., Discher, D. E. Physical plasticity of the nucleus in stem cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1, 0-5 (2007).
- Talwar, S., Kumar, A., Rao, M., Menon, G. I., Shivashankar, G. V. Correlated spatio-temporal fluctuations in chromatin compaction states characterize stem cells. Biophysical Journal. 104, 553-564 (2013).
- Makhija, E., et al. Mechanical strain alters cellular and nuclear dynamics at early stages of oligodendrocyte differentiation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 59 (2018).
