Summary
एक पहले से डिजाइन किए गए उपकरण का उपयोग करने वाले कोशिकाओं का पालन करने के लिए यांत्रिक तनाव लागू करने के लिए, इस कागज एक बदल दिया बुनियाद ज्यामिति और उच्च संकल्प एक 100x तेल विसर्जन उद्देश्य के साथ तनावपूर्ण कोशिकाओं के एकल कोशिका इमेजिंग के लिए एक अनुकूलित उपकरण का वर्णन ।
Abstract
कोशिकामय यांत्रिक विकृति कोशिका फीनोटाइपिक प्रतिक्रियाओं को प्रकाश में लाने के लिए जानी जाती है और कई ऊतक प्रणालियों में शरीरक्रियात्मक प्रासंगिकता होती है । सेल आबादी पर एप्लाइड extracellular तन्य खिंचाव के प्रभाव पर कब्जा करने के लिए के माध्यम से जैव रासायनिक assays हैं, एक डिवाइस पहले से डिजाइन किया गया है जो बस निर्मित किया जा सकता है और काफी छोटा करने के लिए ऊतक संस्कृति इंक्यूबेटरों के अंदर फिट है, साथ ही के शीर्ष पर माइक्रोस्कोप चरणों । हालांकि, polydimethylsiloxane उपस्तर के पिछले डिजाइन तेल विसर्जन उद्देश्यों के माध्यम से उच्च संकल्प subसेलुलर इमेजिंग की अनुमति नहीं थी. इस काम का वर्णन एक बदल दिया ज्यामिति polydimethylsiloxane उपस्तर और एक स्वनिर्धारित इमेजिंग सेटअप है कि एक साथ उच्च संकल्प की सुविधा कर सकते हैं लाइव कोशिकाओं के सबसेलुलर इमेजिंग जबकि लागू तनाव के तहत. इस बुनियाद एक ही है, पहले से डिजाइन उपकरण के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है और इसलिए, उच्च संकल्प ऑप्टिकल इमेजिंग की अनुमति के अलावा, ऊपर सूचीबद्ध के रूप में एक ही लाभ है. पॉलीडाइमेथिलसिलॉक्सेन अधोतल के डिजाइन में एक ग्रिड को शामिल करके सुधार किया जा सकता है जो तनाव के आवेदन से पहले और बाद में एक ही कोशिका को ट्रैक करने की सुविधा प्रदान करेगा । प्रतिनिधि परिणाम उच्च संकल्प का प्रदर्शन समय-चूक इमेजिंग fluorescently के साथ तनावपूर्ण कोशिकाओं के भीतर पर कब्जा कर लिया विधि का उपयोग कर यहां वर्णित है । ये नाभिकीय गतिकी डेटा उस क्रियाविधि में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं जिसके द्वारा अनुप्रयुक्त तनन विकृति ओलिगॉडएन्ड्रोसाइट प्रजनक कोशिकाओं के विभेदन को बढ़ावा देती है ।
Introduction
शरीर में कोशिकाओं और ऊतकों को विभिन्न यांत्रिक संकेतों के अधीन किया जाता है, जिसमें तन्य उपभेदों शामिल हैं । हालांकि, तंत्रिका कोशिकाओं के जीव विज्ञान पर इन संकेतों का प्रभाव अभी तक बड़े पैमाने पर अध्ययन नहीं किया गया है और पूरी तरह से समझा । केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में, यांत्रिक तनाव के स्रोतों विकासात्मक विकास1,2,3,4, रीढ़ की हड्डी झुकने, रक्त और मस्तिष्कमेरु द्रव के रूप में इस तरह के शारीरिक प्रक्रियाओं में शामिल धड़कन, और इस तरह के आघात के रूप में रोग की स्थिति, एक्सोन सूजन, ग्लाइकल scarring, या ट्यूमर विकास5,6,7,8. यह कैसे तन्य तनाव oligodendrocytes और axons, जो कशेरुकी केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है के बाद myelination के भेदभाव को प्रभावित करता है की जांच के लायक है । एक कस्टम डिजाइन तनाव डिवाइस और इलॉस्टोमेरिक मल्टीवेल प्लेट्स का उपयोग करना, पिछले काम करता है9,10 से पता चला है कि स्थिर एकाक्षी तनाव जीन अभिव्यक्ति में वैश्विक परिवर्तन के माध्यम से oligodendroणु विभेदन बढ़ा सकते है 10. इन कोशिकाओं में विकृति यंत्रावर्तन की क्रियाविधि की और समझ प्राप्त करने के लिए, पिछले प्रायोगिक उपकरण को पुनः डिज़ाइन किया जाना चाहिए, जैसा कि यहां वर्णित है, कि जीवन में नाभिकीय गतिशीलता के उच्च-विभेदन प्रतिदीप्ति इमेजिंग को सक्षम करने के लिए तनाव के तहत कोशिकाओं । विशेष रूप से, एक अच्छी तरह से polydimethylsiloxane थाली विकसित की है, और इमेजिंग विन्यास एक 100x तेल विसर्जन लेंस का उपयोग कर तनाव के तहत जीवित कोशिकाओं के समय-चूक इमेजिंग के लिए अनुमति देने के लिए बदल दिया है. प्रकाश पथ में polydimethylsiloxane के नकारात्मक ऑप्टिकल प्रभाव को खत्म करने के लिए, कोशिकाओं को polydimethylsiloxane थाली के माध्यम से नहीं imaged कर रहे हैं, लेकिन उल्टे स्थिति में, सेल डिब्बे को कवर ग्लास कवर के माध्यम से. इस नए इमेजिंग डिजाइन का प्रयोग, उच्च संकल्प समय चूक फिल्मों के सैकड़ों दर्ज कर रहे हैं, अक्षुण्ण आसंन कोशिकाओं के भीतर व्यक्तिगत सेल नाभिक की, जहां क्रोमेटिन ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए H2B हिस्टोन टैगिंग द्वारा लेबल है । ये फिल्में प्रदर्शित करता है कि तंय तनाव क्रोमेटिन संरचना और गतिशीलता है कि oligodendrocyte विभेदन की प्रगति के साथ संगत कर रहे है में परिवर्तन लाती ।
एप्लाइड स्ट्रेन के तहत लाइव सेल इमेजिंग तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है और माइक्रोस्कोप प्रणाली के साथ संगत है कि एक युक्ति डिजाइन की आवश्यकता है । कस्टम डिजाइन यहां वर्णित वाणिज्यिक समाधान के लिए एक सस्ता विकल्प प्रस्तुत करता है । इसके आयाम माइक्रोस्कोप चरणों पर अपनी स्थापना को सक्षम और लागू तनाव के दौरान उच्च स्थानिक संकल्प पर जीना सेल इमेजिंग । इमेजिंग सेटअप जीना सेल इमेजिंग उच्चतम स्पष्टता के साथ एक 100x तेल विसर्जन लेंस का उपयोग करने की सुविधा के लिए डिज़ाइन किया गया है, कवर ग्लास के माध्यम से नहीं, polydimethylsiloxane प्लेट की परत के माध्यम से जो अंयथा छवि गुणवत्ता कम हो जाती है और सबसे में आम है तनाव के तहत इमेजिंग setups । डिवाइस, एक घुड़सवार प्लेट युक्त कोशिकाओं के साथ, भी इनक्यूबेटर में आसानी से संग्रहीत किया जा सकता है । इस उपकरण को substrata के लिए एक अक्षीय तनाव लागू करने के लिए डिज़ाइन किया गया है कि आसंन कोशिका संस्कृति को सुविधाजनक बनाने और कई दिनों में एक स्थिर और एक समान तनाव को बनाए रखने । यहां वर्णित सेटअप का उपयोग स्ट्रेन के अंतर्गत विभिन्न आसंन कोशिका प्रकारों के उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के लिए किया जा सकता है, जिससे यह कोशिका यंत्रजीव विज्ञान के कई क्षेत्रों में यंत्ररूपांतरण अध्ययनों के लिए लागू होता है ।
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Protocol
1. उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए एक अच्छी तरह से polydimethylsiloxane मोल्ड के डिजाइन
नोट: polydimethylsiloxane प्लेटों के निर्माण के लिए मोल्ड निम्नलिखित सुविधाओं के साथ एक 100x तेल विसर्जन लेंस के साथ इमेजिंग सक्षम करने के लिए और कस्टम निर्माण तनाव डिवाइस में एक सही फिट के साथ बनाया गया है (चित्रा 1a, बी).
- समग्र थाली आयाम इस तरह रखें कि यह तनाव डिवाइस के clamps में फिट बैठता है ।
नोट: यहां, वे ६० mm x ७३ mm हैं । - एक सेल डिब्बे या अच्छी तरह से है कि पूरी थाली के पार्श्व आयामों से काफी छोटा है, आर्कन (बाहर के विमान झुकने) प्रभाव है कि लागू तनाव के दौरान polydimethylsiloxane थाली के unclamped किनारों पर होने से बचने के लिए ।
नोट: यहां, डिब्बे एक 23 मिमी x 23 मिमी वर्ग के रूप में डिजाइन किया गया था । - सेल डिब्बे की गहराई के रूप में संभव ंयूनतम के रूप में रखें (नहीं से अधिक ८० μm), को कवर गिलास के माध्यम से 100x तेल विसर्जन लेंस के साथ ध्यान केंद्रित कर सक्षम करने के लिए डिब्बे के शीर्ष पर रखा है, लेकिन यह पर्याप्त पर्याप्त मीडिया को शामिल करने के लिए और संपर्क से बचने या कोशिकाओं फैलाएंगे ।
- 3 मिमी की ऊंचाई के साथ एक वर्ग पर सेल कंपार्टमेंट उठाएं, कोशिकाओं को औंधा माइक्रोस्कोप सेटअप में लेंस के करीब लाने के लिए आसान ध्यान केंद्रित करने के लिए सक्षम करें ।
नोट: ऊपर सुविधाओं के साथ Molds सहित कई तकनीकों द्वारा निर्मित किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, milled एल्यूमीनियम । वैकल्पिक रूप से, मास्टर molds भी एक लेज़र कटर के साथ एक्रिलिक शीट्स कट का उपयोग करके इकट्ठा किया जा सकता है, सेल डिब्बे के लिए गिलास #0 को कवर, और सुपर गोंद । यह मास्टर मोल्ड एक polydimethylsiloxane छाप, जो तब एक कास्टिंग राल का उपयोग कर काम molds बनाने के लिए प्रयोग किया जाता है बनाने के लिए प्रयोग किया जाता है ।
2. एकल-कूप polydimethylsiloxane प्लेटों और वर्ग डिब्बों के निर्माण
- एक डिस्पोजेबल कप में 20:1 (वजन द्वारा) के अनुपात में polydimethylsiloxane आधार और इलाज एजेंट मिक्स. कुल 20 ग्राम polydimethylsiloxane प्रति मोल्ड का वजन (एक polydimethylsiloxane प्लेट बनाने के लिए) और १५० ग्राम polydimethylsiloxane प्रति १५० मिमी-व्यास प्लास्टिक डिश (वर्ग डिब्बों का एक बैच बनाने के लिए).
- 30 मिनट के लिए एक वैक्यूम डिगैसर में-०.८ बार polydimethylsiloxane मिश्रण छोड़ दो (या जब तक सभी बुलबुले हटा रहे हैं) ।
- Polydimethylsiloxane मिश्रण molds (प्लेटों के लिए) में या १५० मिमी प्लास्टिक के व्यंजनों में (वर्ग डिब्बों के लिए) डालो ।
- इस स्तर पर किसी भी अतिरिक्त बुलबुले निकालें, या तो हवा उड़ाने के द्वारा (मुंह से) या polydimethylsiloxane से भरा molds degassing-०.८ बार वैक्यूम में 30 मिनट के लिए ।
- Molds के एक ८० डिग्री सेल्सियस में छोड़ दो घंटे के लिए एक leveling मेज पर ओवन/
- ध्यान से molds के बाहर निकालने के लिए या ओवन से बर्तन और उंहें कमरे के तापमान के लिए शांत हो जाओ । धीरे से ठीक polydimethylsiloxane बाहर छील के बाद ध्यान से एक ब्लेड के साथ किनारों को काटने (चित्रा 1 सी).
- १५० mm-व्यास polydimethylsiloxane पर, एक मार्कर के साथ एक 2 सेमी x 2 सेमी ग्रिड ड्रा । प्रत्येक वर्ग के भीतर, एक 1 सेमी x 1 सेमी स्क्वायर ड्रा, सभी पक्षों पर ०.५ सेमी की एक मार्जिन छोड़ । एक ब्लेड का उपयोग करते हुए, सावधानीपूर्वक चौकोर डिब्बों को प्राप्त करने के लिए रेखाओं के साथ काट लें (चित्र 2a) ।
- Polydimethylsiloxane प्लेटों को साफ करने के लिए उन्हें १००% एसीटोन में 4 एच के लिए, और उसके बाद 4 घंटे के लिए १००
- पट्टियां/पैराफिन फिल्म समर्थन कागज पर (नहीं पैराफिन फिल्म कागज पर) एक १५० mm व्यास प्लास्टिक डिश के अंदर (चित्र2 सी) प्लेस ।
- ८० ° c ओवन में polydimethylsiloxane थाली छोड़ 4 ज के लिए सूखी ।
- सील १५० मिमी व्यास व्यंजनों polydimethylsiloxane प्लेट और पैराफिन फिल्म के साथ कंटेनर चौकों युक्त, और एक ठंडे कमरे में उन्हें आगे उपयोग तक की दुकान.
3. polydimethylsiloxane प्लेटों के functionalization
- पैराफिन फिल्म निकालें, प्लास्टिक डिश के कवर को हटा दें, और 30 मिनट के लिए अल्ट्रावायलेट लाइट के तहत पॉलीडाइमेथिलसिलॉक्सेन प्लेट और चौकोर डिब्बों को रखें ।
- प्लाज्मा-इलाज (5 मिनट के लिए १५० W पर) polydimethylsiloxane प्लेट (ऊपर का सामना करना पड़ सेल डिब्बे के साथ) वर्ग डिब्बों के बिना, संस्कृति सतह हाइड्रोफिलिक बनाने के लिए.
- तुरंत प्लाज्मा के इलाज की सतह पर वर्ग डिब्बों जगह (चित्रा 2b) और मैन्युअल रूप से प्रेस करने के लिए अस्थायी रूप से दोनों को एक साथ छड़ी.
नोट: नहीं प्लाज्मा-वर्ग डिब्बों का इलाज, या फिर वे polydimethylsiloxane थाली करने के लिए दृढ़ता से रहना होगा और वे इमेजिंग के दौरान बंद हो जाना चाहिए जब आसानी से बंद नहीं आ जाएगा. - Polydimethylsiloxane सतह के लिए-NH2 समूहों को लागू करने के लिए 2 ज के लिए अच्छी तरह से करने के लिए १०० मिमी (3-aminopropyl) triethoxysilane की २०० μl जोड़ें । एक १०० mM समाधान बनाने के लिए, 10 मिलीलीटर पानी में शुद्ध (3-aminopropyl) triethoxysilane के २३४ μL भंग । एक 2 एच ऊष्मायन के बाद, विआयनीकृत पानी के साथ 3x वेल्स धोने ।
- आणविक crosslinker bissulfosuccinimidyl suberate के 2 मिलीग्राम वजन और यह 1 मीटर (4-(2-hydroxyethyl) के ७०० μL में भंग -1-piperazineethane सल्फॉनिक एसिड बफर (पीएच ८.०) और २.८ मिलीलीटर पानी ।
नोट: यह २०० मिमी (4-(2-हाइड्रोक्सियेथिल)-1-piperazineethane सल्फॉनिक एसिड बफर में एक मिमी bissulfosuccinimidyl suberate समाधान दे देंगे । ध्यान दें कि ५० mM एकाग्रता बफ़र भी अच्छी तरह से काम करता है ।- इस घोल में से १३५ μL और 1 मिलीग्राम/एमएल फाइब्रोक्टिन की 15 μL जोड़ें 4 घंटे के लिए प्रत्येक polydimethylsiloxane थाली में अच्छी तरह से कमरे के तापमान पर ।
- फॉस्फेट-buffered खारा समाधान के साथ 3x धो लो । अच्छी तरह से करने के लिए फॉस्फेट-buffered खारा समाधान के ५०० μL जोड़ें । कवर १५० mm-व्यास पैराफिन फिल्म के साथ polydimethylsiloxane युक्त पकवान और यह एक ठंडे कमरे में स्टोर, आगे उपयोग तक ।
4. प्लास्टिक व्यंजन और फ्लैक्स के functionalization
- 1 ज के लिए पॉली-डी-लाइसिन (पीडीएल, बाँझ पानी में) के 5 μg/mL सॉल्यूशन के साथ प्लास्टिक व्यंजन और फ्लास्क को सेक्यूबेट करें । इस समाधान के १.५ मिलीलीटर (ligand) प्रति ३५ मिमी व्यास पकवान, यह 3 मिलीलीटर प्रति ७५ ६०
- बर्तन धोने और बाँझ पानी के साथ 2x फ्लैक्स है ।
- उंहें छोड़ के लिए जैव सुरक्षा मंत्रिमंडल में सूखी 1 एच (या सूखी जब तक) और उंहें ठंडे कमरे में 4 डिग्री सेल्सियस में स्टोर और अधिक उपयोग तक ।
5. murine oligodendrocyte जनक कोशिकाओं के लिए प्रसार और विभेदन माध्यम
- प्रसार और विभेदन माध्यम के 100x समाधान के ५० मिलीलीटर तैयार, २.५ मिलीलीटर की aliquots बनाने के लिए, और उंहें-८० डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
नोट: प्रसार माध्यम की संरचना ०.१ मिलीग्राम/एमएल गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन, ६२ एनजी/एमएल प्रोजेस्टेरोन, 16 μg/एमएल putrescine, 5 μg/mL इंसुलिन, ५० μg/एमएल holo-transferrin, 5 एनजी/एमएल सोडियम selenite, 1x पेंसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन, 10 एनजी/एमएल प्लेटलेट-व्युत्पन्न वृद्धि फैक्टर, और 10 एनजी/उच्च ग्लूकोज और पाइरूवेट के साथ Dulbecco संशोधित ईगल के माध्यम (DMEM) में वृद्धि कारक है । जबकि गोजातीय सीरम albumin, प्रोजेस्टेरोन, putrescine, और सोडियम सेलिनाइट का गठन किया जा सकता है और 100x, इंसुलिन, holo-transferrin, और penicillin में संग्रहीत-streptomycin 1x समाधान की तैयारी करते समय ताजा जोड़ा जाना चाहिए । वृद्धि कारक 10 μg/mL पर गठित किया जाना चाहिए और हर दिन कोशिकाओं को ताजा जोड़ा जाना चाहिए (1 μL/ विभेदन माध्यम की संरचना ०.१ मिलीग्राम/एमएल गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन, ६२ एनजी/एमएल progesterone, 16 μg/एमएल putrescine, 5 μg/एमएल इंसुलिन, ५० μg/एमएल holo-transferrin, 5 एनजी/एमएल सोडियम selenite, 1x पेंसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन, ४०० एनजी/एमएल triiodothyronine, ४०० एनजी/एमएल L-thyroxine, और उच्च ग्लूकोज और पाइरूवेट के साथ DMEM में ०.५% भ्रूण गोजातीय सीरम. Triiodothyronine और एल thyroxine अन्य अभिकर्मकों के साथ गठित किया जा सकता है और 100x पर संग्रहीत. इंसुलिन, holo transferrin, और पेनिसिलिन-streptomycin 1x समाधान तैयार करते समय ताजा जोड़ा जाना चाहिए । - 100 x प्रसार मध्यम के ५० मिलीलीटर की तैयारी के लिए, ५१० मिलीग्राम गोजातीय सीरम एल्बुमिन के 17 मिलीलीटर में dulbecco के माध्यम से, ३१० माइक्रोग्राम प्रोजेस्टेरोन की 31 μl में इथेनॉल, ८० के लिए ५०० μl में putrescine की , और पूर्ण DMEM अप करने के लिए ५० मिलीलीटर
- विभेदन माध्यम के 100x समाधान के ५० मिलीलीटर की तैयारी के लिए, इसके अतिरिक्त 2 मिलीग्राम ट्राईआयोडोथायरोनिन के ४० μl में सोडियम हाइड्रॉक्साइड के और 2 मिलीग्राम एल-thyroxine के ४० μl सोडियम हाइड्रॉक्साइड में, तो समाधान को भरने के लिए ५० एमएल dulbecco माध्यम से । एक बाँझ डिस्पोजेबल फिल्टर इकाई, aliquot के माध्यम से समाधान फ़िल्टर, और aliquot की दुकान पर-८० डिग्री सेल्सियस ।
- 1x प्रसार के २५० मिलीलीटर की तैयारी के लिए/विभेदन माध्यम, मिश्रण के 100x समाधान के २.५ मिलीलीटर और holo-transferrin के १२.५ मिलीग्राम, 10 मिलीग्राम/एमएल इंसुलिन के १२५ μL, और 100x पेनिसिलिन के २.५ मिलीलीटर-स्ट्रेप्टोमाइसिन । Dulbecco के माध्यम से २५० मिलीलीटर के लिए समाधान भरें और एक बाँझ डिस्पोजेबल फिल्टर इकाई के माध्यम से यह फिल्टर ।
नोट: विकास कारकों को नए सिरे से जोड़ा जाना चाहिए और सेल संस्कृति के लिए सीधे, नहीं पुनर्गठित माध्यम के पूरे बैच के लिए ।
6. सेल संस्कृति
- Oligodendrocyte जनक कोशिकाओं के साथ शुरू प्रसार मध्यम में निलंबित कर दिया । बीज ३५,००० कोशिकाओं के घनत्व पर इन कोशिकाओं/सेमी2 pdl-लेपित प्लास्टिक सतहों पर (बर्तन या flasks है, अनुभाग 4 देखें) । प्रसार मध्यम प्लास्टिक की सतह क्षेत्र के 10 सेमी2 प्रति 3 मिलीलीटर की मात्रा को समायोजित; मध्यम की एक कम मात्रा सतह तनाव बलों से उत्पन्न सेल clumping के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, जबकि व्यंजन में मध्यम की एक उच्च मात्रा बिखराव का कारण हो सकता है ।
- वृद्धि कारक (प्लेटलेट-व्युत्पन्न वृद्धि कारक और fibronectin वृद्धि कारक) हर दिन, 10 एनजी/एमएल पर उनकी एकाग्रता को बनाए रखने और वैकल्पिक दिनों पर प्रसार माध्यम के आधे परिवर्तन जोड़ें ।
- तीसरे दिन, एक सौंय कोशिका टुकड़ी समाधान का उपयोग प्लास्टिक की सतह से कोशिकाओं को अलग (जैसे, accutase): माध्यम निकालें, 1 एक्स फॉस्फेट-buffered खारा समाधान के साथ धो लें, 20 सेमी2 क्षेत्र प्रति अलगाव समाधान की एक मिलीलीटर जोड़ने, पकवान छोड़/ 10 मिनट के लिए ३७ ° c पर एक इनक्यूबेटर में, और धीरे से सभी कोशिकाओं को अलग कर दिया है जब तक यह नल (एक खुर्दबीन के नीचे देखो) ।
- पिपेट एक २०० μL टिप का उपयोग कर एक सेल में clumps तोड़ने के लिए, उंहें एक ५० मिलीलीटर ट्यूब के लिए स्थानांतरण, उंहें प्रसार माध्यम में पतला, 10 मिनट के लिए ०.२ x g पर स्पिन, supernatant त्यागने, और प्रसार के माध्यम में गोली resuspend करने के लिए 1 मिलीलीटर की कुल मात्रा बनाने । किसी साइटोमीटर का उपयोग करके कक्षों की गणना करना ।
- फिब्रोरेक्टिन-फंक्श्नाइज्ड polydimethylsiloxane प्लेट्स 2x, प्रसार मध्यम के साथ 15 मिनट प्रति धोने धोने ।
- बीज ३५,००० प्रसार मध्यम के ७०० μL में polydimethylsiloxane थाली प्रति सेल ।
- ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ H2B हिस्टोन लेबल के लिए H2B-gfp के एक प्लाज्मिड निर्माण जोड़ें ।
नोट: यहां, १.४ μl celllight H2B-जीएफपी BacMam2 अभिकर्मक मिक्स प्रत्येक थाली (2 μl प्रति ५०,००० कोशिकाओं) के लिए जोड़ा गया था । - 24 घंटे के बाद, polydimethylsiloxane नमूने माउंट करने के लिए कोशिकाओं के साथ एक अक्षीय तनाव डिवाइस पर बढ़ाया जा करने के लिए (के रूप में चित्र 2dमें दिखाया गया है). सभी नमूनों में माध्यम को विभेदन माध्यम में बदलें ।
- नमूनों को छानकर, अतनावपूर्ण सेल कम्पार्टमेंट की लम्बाई को मापें (चित्र3ए) और स्टेज माइक्रोमीटर स्क्रू को चालू करें जिससे सेल कंपार्टमेंट की लंबाई वांछित राशि (उदा., 10%, चित्र 3bदेखें) तक बढ़ सके । जब तक इमेजिंग ३७ ° c पर इनक्यूबेटर में फैला और फैलाया हुआ polydimethylsiloxane नमूनों को छोड़ दें ।
7. इमेजिंग
- माइक्रोस्कोप को चालू करें । ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए माइक्रोस्कोप इनक्यूबेटर तापमान सेट करें ।
- उद्देश्य लाने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा (100x तेल विसर्जन) केंद्रीय स्थिति के रूप में उद्देश्य बुर्ज बाद में सुलभ नहीं होगा । इस उद्देश्य को खोलना और इसे वापस एक साथ एक उद्देश्य अंगूठी के साथ पेंच (चित्रा 4a) ताकि उद्देश्य कोशिकाओं के करीब लाया जा सकता है । अगर एक तेल उद्देश्य यहां इस्तेमाल किया जा रहा है, इस कदम पर तेल की एक बूंद जोड़ें ।
- (3 डी मुद्रण या मशीनिंग के माध्यम से) पहले से synthesize एक प्लास्टिक या धातु धारक है कि दो महत्वपूर्ण विशेषताएं है-एक angled खिड़की और एक कदम (चित्र 4B) ।
नोट: खिड़की एक मोटाई #0 ग्लास coverslip है कि माध्यम पकड़ होगा समर्थन करता है, जबकि तनाव डिवाइस एक औंधा राज्य में है । खिड़की के किनारों पर angled कट (चित्रा 4d) उद्देश्य के लिए ग्लास coverslip के करीब आने की अनुमति देता है । धारक में कदम हमें बढ़ाया polydimethylsiloxane आगे नीचे लाने के लिए, उद्देश्य के करीब की अनुमति देता है । - एक ग्लास coverslip प्लेस (मोटाई #0, आयामों के साथ 25 मिमी x 25 मिमी या व्यास में ३५ मिमी) खिड़की की परिधि पर वैक्यूम चर्बी फैल द्वारा धारक के शीर्ष सतह पर (चित्रा 4C), और माइक्रोस्कोप मंच पर प्लास्टिक की खिड़की टेप ( चित्रा 4D और चित्रा 5a) ।
- एक z-माइक्रोस्कोप मंच पर अनुवाद चरण पेंच और यह सर्वोच्च z-स्थिति (चित्रा 5a) के लिए कदम ।
- फैला polydimethylsiloxane थाली से माध्यम के ५०० μL निकालें और imaged करने के लिए सफेद प्लास्टिक की खिड़की में ग्लास coverslip पर इस माध्यम जोड़ें ।
- सावधानीपूर्वक चौकोर डिब्बे को पालीडिमिथाइलसिलॉक्सेन प्लेट से बाँझ चिमटी से अलग करें ।
- एक ईमानदार स्थिति (ऊपर का सामना करना पड़ कोशिकाओं) सफेद प्लास्टिक खिड़की के ऊपर में तनाव डिवाइस पकड़ो और ध्यान से तनाव युक्ति पलटी इतनी के रूप में कांच coverslip के बीच में किसी भी अतिरिक्त मध्यम छोड़ सीधे (चित्रा 5B) (कोशिकाओं नीचे का सामना करना पड़) ।
- तनाव युक्ति के नीचे के भाग को दो तरफा टेप के साथ z-अनुवाद चरण पर रखें (चित्र 5c, D) ।
- जबकि brightfield के तहत नेत्रिका के माध्यम से देख, धीरे से तनाव डिवाइस नीचे लाने के (चित्रा 5e) ( z-अनुवाद चरण कम करके) और उद्देश्य चाल को कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित ।
- इस चरण को बहुत धीरे से, चरण दर चरण निष्पादित करें । यदि तनाव युक्ति coverslip पर बहुत ज्यादा प्रेस, कोशिकाओं को संकुचित (उंहें मरने के कारण) और यदि उद्देश्य प्रेस coverslip पर बहुत ज्यादा है, coverslip तोड़ (माध्यम के कारण रिसाव और उद्देश्य पर फैल सकता है) कर सकते हैं ।
- एक्सऔर वाईमें polydimethylsiloxane थाली स्कैन एक फ्लोरोसेंट नाभिक है कि एक सेल खोजने के लिए (के तहत ४८८ एनएम तरंगदैर्ध्य उत्तेजना के साथ epifluorescence) और उपयुक्त कोशिका आकारिकी (brightfield के तहत) ।
- यदि सूक्ष्मदर्शी स्तर के पार्श्व विस्थापन ऊर्ध्वाधर बहुत अधिक ध्यान केंद्रित नहीं प्रभावित करता है, सॉफ्टवेयर पर एक बहुबिंदु सुविधा का उपयोग कर हितों के कई क्षेत्रों का चयन करें । कई बार, ध्यान केंद्रित मंच के किसी भी पार्श्व विस्थापन के लिए बहुत संवेदनशील है । ऐसे मामलों में, एक समय में छवि एक सेल । ब्याज के प्रत्येक सेल के लिए एक्स, वाई-, और जेडपदों को चिह्नित करें ।
- न्यूक्लियस की तरंगदैर्घ्य उत्तेजन के साथ ४८८ के साथ नाभिक की चित्र (या ओपन-पिनहोल) रिकॉर्ड करें जिसमें 30 े प्रति फ्रेम के अंतराल पर न्यूनतम 30 मिनट की कुल अवधि के लिए ब्राइटफील्ड उत्तेजन हो ।
8. डेटा विश्लेषण
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नाभिकीय उतार-चढ़ाव
- नाभिक छवियों के अनुक्रम को खोलें (चित्र 6a) एक छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में, और नाभिक समय-चूक छवियों की सीमा (उदाहरण के लिए, ImageJ में थ्रेशोल्ड आदेश या सॉफ़्टवेयर Matlab में ग्रेथ्रेश आदेश का उपयोग करें) ।
- नाभिक क्षेत्र प्राप्त (पिक्सेल में) समय के एक समारोह के रूप में, यह एक सॉफ्टवेयर की साजिश रचने डेटा में प्लॉट (चित्रा 6B), और डेटा के लिए एक तिहाई क्रम बहुपद फिट (चित्रा 6b) (उदाहरण के लिए, विश्लेषण का उपयोग करें । फिटिंग । बहुपद या सॉफ्टवेयर मैटलैब में पॉलीफिट कमांड के मूल में फ़िट आदेश ।
- प्रत्येक समय बिंदु के लिए वास्तविक क्षेत्र (पिक्सेल में) से फिट बहुपद के मूल्य घटाना । इस संशोधित क्षेत्र को अवशिष्ट क्षेत्र के रूप में जाना जाता है ।
नोट: यह प्रक्रिया वाद्य त्रुटियों से आने वाले डेटा में किसी भी बढ़ती या घटती प्रवृत्ति को निकालता है और detrending कहलाता है ।- अवशिष्ट क्षेत्र के प्रत्येक समय बिंदु पर फिट बहुपद के मूल्य के साथ विभाजन द्वारा अवशिष्ट क्षेत्र के प्रतिशत की गणना (चित्रा 6D) ।
- अवशिष्ट क्षेत्र समय श्रृंखला के मानक विचलन की गणना । यह मानक विचलन नाभिकीय उतार-चढ़ाव के आयाम को दर्शाता है ।
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डेटा प्लॉटिंग और सांख्यिकीय विश्लेषण
- प्रत्येक अवस्था में न्यूक्लिम के न्यूनतम 20 नाभिक के माध्य के रूप में नाभिकीय उतार-चढ़ाव के आयाम की गणना कीजिए ।
- एक-तरफ़ा विश्लेषण-के-प्रसरण सांख्यिकीय परीक्षण Bonferroni सुधार के साथ आचरण कि क्या वहां ब्याज की शर्तों के एक समारोह के रूप में fluctuations के आयाम में एक महत्वपूर्ण अंतर है (उदाहरण के लिए, के साथ और लागू तनाव के बिना) ।
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Representative Results
हाल ही में oligodendrocytes पर तन्य तनाव के प्रभाव की जांच करने के उद्देश्य से काम10 से पता चला कि एक 10% एकाक्षी तन्य तनाव जीन अभिव्यक्ति में वैश्विक परिवर्तन द्वारा oligodendrocytes जनक कोशिकाओं की भिंनता को बढ़ावा देता है । जीन की अभिव्यक्ति में इन परिवर्तनों के पीछे तंत्र के द्वारा जांच की जा सकती है subcellular मापदंडों के इमेजिंग, जैसे साइटोस्केलेटन संरचना, ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर स्थानीयकरण, परमाणु गतिशीलता, और क्रोमेटिन संगठन. हालांकि, polydimethylsiloxane उपस्तर के पिछले ज्यामिति उच्च संकल्प एकल कोशिका इमेजिंग की अनुमति नहीं दी. इस काम में वर्णित के रूप में, polydimethylsiloxane उपस्तर और इमेजिंग सेटअप की बदल दिया ज्यामिति कोशिकाओं और उद्देश्य के बीच की दूरी को कम किया । यह एक 100x तेल विसर्जन उद्देश्य (चित्रा 6a) का उपयोग कर fluorescently लेबल कोशिका नाभिक के समय चूक छवियों पर कब्जा करने की अनुमति देता है.
नाभिकीय प्रक्षेपित क्षेत्र में उतार-चढ़ाव, कोशिकाओं की विभेदन स्थिति,11,12पर निर्भर करता है । Oligodendrocyte जनक कोशिकाओं के परमाणु fluctuations की तुलना में और है कि अंत में विभेदित oligodendrocyte का पता चला है कि बाद काफी कम fluctuations (आंकड़ा 6E) है । अगले, oligodendrocyte प्रजनक कोशिकाओं के परमाणु fluctuations पर 1 ज, 24 ज, और ४८ एच के बाद-भेदभाव के रासायनिक प्रेरण के साथ और एक 10% तंय तनाव के बिना तुलना की गई । अकेले रासायनिक प्रेरण के साथ, परमाणु fluctuations के आयाम पर ४८ घंटे में एक महत्वपूर्ण कमी दिखाई लेकिन नहीं 24 एच (चित्रा 6F) । दूसरी ओर, रासायनिक प्रेरण एक साथ एक 10% तन्य खिंचाव के साथ 24 घंटे में एक महत्वपूर्ण कमी दिखाई दिया, जो स्थिर रहे, ४८ घंटे में और अधिक कमी के बिना (चित्रा 6G) ।
बुनियाद ज्यामिति और इस कागज में वर्णित इमेजिंग विंयास तनावपूर्ण कोशिकाओं के उच्च संकल्प फिल्मों की रिकॉर्डिंग सक्षम होना चाहिए । इन फिल्मों के बाद के विश्लेषण से यह प्रदशत होता है कि तनाव नाभिकीय उतार-चढ़ाव को तेजी से घटा रहा है, जो विभेदन का सूचक है । इन परिणामों के द्वारा तंत्र में अंतर्दृष्टि दे जो तनाव oligodendrocyte विभेदन को बढ़ावा देता है । इन परिणामों की व्याख्या और भविष्य के प्रयोगों पर आगे की चर्चा माखीजा एट अल.13में वर्णित है ।
चित्रा 1: डिजाइन और ज्यामिति के पॉलीडाइमेथिलसिलेक्सेन मोल्ड । (क) सभी आयामों को मिलीमीटर में दर्शाते हुए आचारण का रेखाचित्र (यह रेखाचित्र Whits प्रौद्योगिकियों, सिंगापुर द्वारा उत्पन्न किया गया था) । (ख) मोल्ड के त्रि-आयामी दृश्य (माखीजा एट अल11से अनुकूलित) । इनसेट ढाक की फोटो दिखाती है । (ग) मोल्ड (माखीजा एट अल.11से अनुकूलित) के उपयोग से निर्मित पॉलीडाइमेथिलसिलॉक्सेन प्लेट का त्रि-आयामी दृश्य । इनसेट पॉलीडिमेथिलसिलेक्टेन प्लेट की फोटो दिखाता है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: नमूना तैयारी । (क) पॉलीडाइमेथिलसिलेक्टेन प्लेट और एक चौकोर डिब्बे का फोटो । (ख) वर्गाकार डिब्बा पॉलीडाइमेथिलसिलेक्सेन प्लेट पर उभरे हुए वर्ग पर रखा गया है । इसका उद्देश्य कोशिकाओं के लिए माध्यम को नियंत्रित करना है । (ग) पॉलीडाइमेथिलसिलॉक्सेन प्लेटों को प्लास्टिक पर चिपकाकर पॉलीडाइमेथिलिसिलॉक्सन को रोकने के लिए पैराफ्ilm पेपर का उपयोग करके १५० मिमी व्यास वाले प्लास्टिक व्यंजन में भंडारित किया जाता है । (घ) स्ट्रेन डिवाइस पर प्लेट को बढ़ते समय, प्लेट के किसी भी sagging को रोकने के लिए दो उंगलियों का उपयोग करते हुए नीचे से इसका समर्थन करें । यदि प्लेट अभी भी बढ़ते के बाद थोड़ा sags, अनुवाद चरण बदल कर तनाव युक्ति हथियारों के बीच की दूरी में वृद्धि हुई है । इस कदम पर, मंच के अनुवाद polydimethylsiloxane थाली में तनाव पैदा नहीं करना चाहिए । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3: खींच सेल । (ं) एक मापनी का उपयोग करते हुए, क्लैम्प्स के बीच प्लेट की आरंभिक लंबाई को मापें । (इ) आरंभिक प्लेट की लंबाई को वांछित प्रतिशत तक बढ़ाने के लिए अनुवाद चरण पर पेंच को मोड़कर प्लेट को स्ट्रेच करें । लंबाई में एक्स% वृद्धि तनाव के एक्स% से मेल खाती है । ध्यान दें कि, वांछित तनाव उत्पंन करने के लिए (X%) उठाया सेल संस्कृति डिब्बे में, मुख्य थाली एक उच्च राशि से तनावपूर्ण होना चाहिए (लगभग 2X%) क्योंकि वर्णित प्लेट ज्यामिति में उनकी मोटाई में अंतर है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4: इमेजिंग के लिए तैयारी । (क) बुर्ज में केंद्रीय स्थिति के लिए 100x उद्देश्य लाओ, उद्देश्य खोलना, और इसे वापस उद्देश्य अंगूठी के साथ एक साथ पेंच । (ख) सभी आयामों को मिलीमीटर में दर्शाते हुए धारक का रेखाचित्र । (ग) एक पिपेट टिप का उपयोग कर, धारक में खिड़की की परिधि पर वैक्यूम चर्बी फैला है, और शीर्ष पर एक गिलास coverslip जगह है । मोटाई #0 या #1 के साथ एक कवर गिलास का प्रयोग करें, 100x तेल विसर्जन लेंस के साथ ध्यान केंद्रित कर सकें । (घ) होल्डर (1) को माइक्रोस्कोप स्टेज (2) पर रखें । तेल लाओ (6) उद्देश्य (3) coverslip के करीब (5) है कि धारक को अटक गया है, वैक्यूम चर्बी (4) का उपयोग कर । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
चित्रा 5: माइक्रोस्कोप पर इमेजिंग सेटअप । (क) z-अनुवाद चरण (पीला तीर) और धारक (लाल तीर) को माइक्रोस्कोप अवस्था पर एकत्रित करें । (इ) विकृति युक्ति को सूक्ष्मदर्शी अवस्था में झुकाएं जिससे कि किसी भी माध्यम को धारक के काँच के सहवर्णी पर छोड़ दें । एक डबल तरफा टेप (नीले तीर) तनाव डिवाइस पर छड़ी कि z-अनुवाद चरण पर छड़ी जाएगा । (ग) विकृति युक्ति को विपरीत स्थिति में रखें, जो इसे ्र-अनुवाद अवस्था में सहायक हो । कोशिकाओं को प्लास्टिक धारक के कांच के coverslip के साथ गठबंधन किया जाना चाहिए । (घ) विकृति युक्ति की व्युत्क्रमित ज्यामिति, कोशिकाओं और उद्देश्य के बीच की दूरी को न्यूनतम करती है, जिससे उच्च-विभेदन इमेजिंग (माखीजा एट अल.11से रूपांतरित) की सुविधा होती है । (ङ) स्ट्रेन डिवाइस को नीचे लाने से पहले साइड व्यू (1); तनाव डिवाइस नीचे लाने के बाद साइड व्यू (2); शीर्ष दृश्य तनाव डिवाइस नीचे लाने के बाद (3) । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
चित्रा 6: प्रतिनिधि छवियों और क्षेत्र के नाभिक के आंकड़े fluctuations । यह आंकड़ा मखीजा एट अल11से अनुकूलित है । (क) एक नाभिक के विशिष्ट छवि हिस्टोन H2B के साथ लेबल को हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए टैग की गईं, और एक विभेदीकारी oligodendrocyte जनक कोशिका । नाभिक फोकस में होता है, जबकि कोशिका प्रक्रियाएं फोकस से बाहर होती हैं । (ख) किसी नाभिकीय क्षेत्र की विशिष्ट काल श्रृंखला (पिक्सेल्स में) । (ग) आँकड़ों में लगाया गया तीसरा कोटि बहुपद । (घ) अवशिष्ट क्षेत्र उतार-चढ़ाव समय श्रृंखला का प्रतिशत । (ङ) oligodendrocyte प्रजनक कोशिकाओं और मरणासन्न विभेदक ओलिगोन्ड्रोसाइट्स के प्रसार के नाभिकीय धार उतार-चढ़ाव । (च) नाभिकीय धार में उतार-चढ़ाव 1 ज, 24 ज तथा ४८ ज पर रासायनिक विभेदन के पश्चात (छ) नाभिकीय क्षेत्र में 1 ज, 24 ज पर उतार-चढ़ाव तथा 10% तनन विकृति के साथ रासायनिक विभेदन के पश्चात ४८ । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
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Discussion
एक युक्ति पहले से1 आसंन कोशिकाओं पर extracellular तन्यता तनाव के आवेदन के लिए डिजाइन किया गया है । उस काम में polydimethylsiloxane बुनियाद के डिजाइन जैव रासायनिक assays हैं, साथ ही फैला कोशिकाओं के कम संकल्प इमेजिंग के लिए पर्याप्त था । इस काम में, बुनियाद बदल दिया गया था, और उच्च संकल्प subसेलुलर लाइव सेल इमेजिंग की सुविधा है कि एक उपन्यास इमेजिंग विन्यास शुरू किया गया था. इस प्रणाली के लाभ कई हैं: यह में निर्मित किया जा सकता है प्रयोगशाला सरल घटकों का उपयोग कर, यह सस्ती है वाणिज्यिक तनाव उपकरणों की तुलना में (प्रति सेल तनाव डिवाइस ५०० अमरीकी डालर), और यह काफी छोटा है ऊतक संस्कृति इंक्यूबेटर के अंदर फिट, साथ ही पर सूक्ष्मदर्शी. इसके अलावा, हालांकि इमेजिंग प्रणाली औंधा माइक्रोस्कोप सेटअप के साथ यहां वर्णित किया गया है, यह आसानी से ईमानदार माइक्रोस्कोप विंयास के लिए समायोजित किया जा सकता है ।
नमूना तैयार करने और इमेजिंग में कुछ महत्वपूर्ण कदम शामिल हैं । सबसे पहले, polydimethylsiloxane प्लेटों और वर्ग के डिब्बों को अच्छी तरह से सेल सीडिंग (प्रोटोकॉल कदम २.८) से पहले साफ करने के लिए सेल अस्तित्व सुनिश्चित करने के लिए है (के रूप में ठीक नहीं होने polydimethylsiloxane कोशिकाओं के लिए विषाक्त है). दूसरा, क्योंकि वर्ग डिब्बे के अंदर फिट कर सकते है कि तरल पदार्थ की मात्रा 1 मिलीलीटर से भी कम है, यह अगर नमूना कुछ दिनों के लिए इनक्यूबेटर में है भाप बन सकता है । इसलिए, माध्यम हर दिन की जांच की जानी चाहिए और जब आवश्यक भरपाई । इसके अतिरिक्त, polydimethylsiloxane थाली पर उठाया क्षेत्र वाष्पीकरण को कम करने के लिए एक औंधा ६० mm-व्यास प्लास्टिक डिश के साथ कवर किया जा सकता है । तीसरा, अत्यधिक सावधानी का प्रयोग किया जाना चाहिए, जबकि माइक्रोस्कोप पर तनाव उपकरण नीचे z-अनुवाद चरण के माध्यम से ले जाने के लिए कोशिकाओं को गिलास coverslip के करीब लाने के लिए । Polydimethylsiloxane उपस्तर और कांच coverslip के बीच कोशिकाओं (यहां तक कि एक पल के लिए) compressing कोशिका मौत का कारण हो सकता है. चौथा, मृत कोशिकाओं और सेल मलबे polydimethylsiloxane नमूना हटा दिया गया है के बाद कांच coverslip के लिए अटक रह सकते हैं. इसलिए, इमेजिंग के बाद, ग्लास coverslip वैक्यूम तेल से दूर खींच लिया जाना चाहिए और एक ताजा coverslip एक नया नमूना बढ़ते से पहले संलग्न किया जाना चाहिए ।
स्ट्रेन डिवाइस की सीमाएं हैं कि चरण पार्श्व विस्थापन के अनुप्रयोग को चक्रीय या रैप्ड स्ट्रेन करने के लिए क्रमादेशित नहीं किया जा सकता है और यह केवल एकाक्षी विकृति लागू कर सकता है । Polydimethylsiloxane उपस्तर की सीमा वर्णित ज्यामिति में यह है कि 25% से अधिक तनाव polydimethylsiloxane के फ्रैक्चर का कारण हो सकता है ।
एक भविष्य संशोधन polydimethylsiloxane बुनियाद के डिजाइन में सुधार करने के लिए कोशिका संस्कृति की सतह पर एक ग्रिड का समावेश हो सकता है । इससे पहले और तन्य तनाव के आवेदन के बाद एक ही सेल पर नज़र रखने के लिए अनुमति होगी ।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
सभी लेखकों को आभार सिंगापुर के नेशनल रिसर्च फाउंडेशन से अनुसंधान और प्रौद्योगिकी (स्मार्ट) BioSystems और Micromechanics (BioSyM) अंतःविषय अनुसंधान समूह लेखक डॉ. जगलिस्का और डॉ वान वनीत भी Saks-Kavanaugh फाउंडेशन से धन और समर्थन की कृतज्ञता स्वीकार करते हैं । लेखकों विलियम Ong और डॉ गाओ Yian धंयवाद इस काम में वर्णित कुछ प्रयोगों के लिए चूहे oligodendrocyte जनक कोशिकाओं को उपलब्ध कराने के लिए Nanyang प्रौद्योगिकी विश्वविद्यालय, सिंगापुर से चबाना, और लेखकों डॉ जी वी शिवशंकर से धंयवाद परमाणु क्षेत्र में उतार-चढ़ाव के बारे में विचार-विमर्श के लिए राष् ट्रीय सिंगापुर विश् वविद्यालय, सिंगापुर के यांत्रिक जीव विज्ञान संस् थान ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary cells | Primary Oligodendrocyte Progenitor Cells isolated from Neonatal Rats were provided by Dr. S. Y. Chew's lab at Nanyang Technological University |
||
| Media | |||
| DMEM high glucose | Gibco | 11996-065-500ml | |
| Pen/Strep | Gibco | 15070-063-100ml | |
| FGF | Prospec | CYT-608-50ug | |
| PDGF | Prospec | CYT-776-10ug | |
| Media Stock components | |||
| BSA | Sigma | A9418-10G | |
| Progesterone | Sigma | P8783-1G | |
| Putrescine | Sigma | P5780-5G | |
| Sodium Selenite | Sigma | S5261-10G | |
| Tri-iodothyronine | Sigma | T6397-100MG | |
| Thyroxine | Sigma | T1775-100MG | |
| Holo-Transferrin | Sigma | T0665-500MG | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Mold and PDMS plate | |||
| PDMS - Dow Corning Sylgard 184 | Ellsworth | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Mold - Liquid Plastic | Smooth-On | Smooth Cast 310 - Trail Size | |
| Substrate Coatings | |||
| poly-D-lysine | Sigma | P6407-5MG | |
| Fibronectin | Sigma | F1141-2MG | |
| Histone staining | |||
| CellLigt H2B-GFP BacMam | Molecular Probes | C10594 | |
| Surface functionalization | |||
| APTES | Sigma | A3648-100ml | |
| BS3 | Covachem | 13306-100mg | |
| HEPES buffer pH 8.0 | Alfa Aesar | J63578-AK-250ml | |
| Cell detachment | |||
| Accutase | Invitrogen | A1110501-100ml |
References
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