Summary
Использование ранее разработанных устройств для применения механических деформаций для приверженец клеток, этот документ описывает переработанную геометрию субстрата и индивидуальные аппарата для высокого разрешения одноклеточных изображений напряженных клеток с целью 100 x погружения масла.
Abstract
Внеклеточного механического штамма, как известно, вызывают фенотипические реакции клеток и имеет физиологическую значимость в нескольких системах ткани. Чтобы захватить эффект прикладной внеклеточного растяжения деформации на популяции клеток в пробирке с помощью биохимических анализов, устройство ранее был разработан, который может быть изготовлен просто и достаточно мал, чтобы поместиться внутри ткани инкубаторы культуры, а также на вершине стадии микроскопа. Однако Предыдущая конструкция субслоя полидиметилсилксисана не позволила обеспечить субсотовую визуализацию высокого разрешения с помощью целей нефтяного погружения. Эта работа описывает переработанную геометрию полидиметилсилослоя субстрата и настроенную настройку изображений, которая вместе может облегчить субсотовую визуализацию с высоким разрешением живых клеток в то время как под примененное напряжение. Этот субстратом может быть использован с тем же самым, ранее спроектированный прибор и, следовательно, имеет те же преимущества, что и перечисленные выше, в дополнение к позволяя высокого разрешения оптических изображений. Конструкция субслоя полидиметилсилксиана может быть улучшена путем включения сетки, которая облегчит отслеживание той же ячейки до и после применения штамма. Репрезентативные результаты демонстрируют с высоким разрешением промежуток времени изображения с флуоресцентно маркированные ядра в напряженных клетках, захваченных с помощью метода, описанного здесь. Эти данные ядерной динамики дают представление о механизме, с помощью которого прикладная деформация растяжения способствует дифференциации клеток прародителя олигодендроцитов.
Introduction
Клетки и ткани в организме подвергаются воздействию различных механических сигналов, включая растяжение. Однако влияние этих сигналов на биологию нервных клеток еще не изучено экстенсивно и полностью понято. В центральной нервной системе, источники механического штамма включают рост развития1,2,3,4, физиологические процессы, такие как изгиб спинного мозга, крови и спинномозговой жидкости пульсация, и патологических состояний, таких как травма, аксон отек, глиальных рубцов, или рост опухоли5,6,7,8. Стоит исследовать, как растяжение растяжение влияет на дифференциацию олигодендроцитов и последующего миелелинизации аксонов, который является критическим процессом в центральной нервной системе позвоночных. Использование специально разработанных штамм устройства и эластомерные пластины MultiWell, предыдущие работы9,10 показали, что статический uniаксиальный штамм может увеличить олигодендроцитов дифференциации с помощью глобальных изменений в экспрессии генов 10. для получения дальнейшего понимания механизмов деформации механикообработки в этих клетках, предыдущий экспериментальный аппарат должен быть изменен, как описано здесь, чтобы обеспечить высокое разрешение флуоресцентной визуализации ядерной динамики в жизни клетки под напряжением. В частности, один-хорошо полидиметилсилоксиан плита разработана, и конфигурация изображений переработан, чтобы позволить покадровой визуализации живых клеток под напряжением с использованием 100X масло погружения объектива. Чтобы устранить негативные оптические эффекты полидиметилсилисансана в световой путь, клетки, отображаемого не через полидиметилсилопксана пластины, но в перевернутом положении, через крышку стекла покрытие клеточного отсека. С помощью этого нового дизайна изображений, сотни с высоким разрешением покадровой фильмы записываются, отдельных клеточных ядер в нетронутыми адепт клеток, где хроматина маркируются путем пометки гистон H2B для зеленого флуоресцентного белка. Эти фильмы демонстрируют, что растяжение деформации индуцирует изменения в структуре хроматина и динамики, которые согласуются с прогрессированием олигодендроцитов дифференциации.
Живая клеточная визуализация под применной нагрузкой является технически сложной задачей и требует разработки устройства, совместимого с системой микроскопа. Пользовательский дизайн описано здесь представляет недорогую альтернативу коммерческим решениям. Его размеры позволяют его установку на стадии микроскопа и живой визуализации ячейки при высоком пространственном разрешении во время прикладной деформации. Настройка изображений предназначена для облегчения живого изображения клеток с помощью 100X масло погружения объектив с высокой ясностью, через крышку стекла, а не через слой полидиметилсилоксиан пластины, которые в противном случае уменьшает качество изображения и является общим в большинстве установок визуализации под напряжением. Устройство, с установленной пластиной, содержащей ячейки, также может легко храниться в инкубаторе. Этот прибор конструирован для того чтобы приложить uniосевое напряжение к субстратам которые облегчают приверженец культуру клетки и поддерживает стабилизированный и равномерный напряжение над множественными днями. Описанная здесь настройка может быть использована для визуализации различных типов клеток в высоком разрешении под напряжением, что делает ее применимой к механопреобразованым исследованиям во многих отраслях механикобиологии клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Проектирование однохорошо-полидиметилсилизовидной плесени для визуализации с высоким разрешением
Примечание: Прессформа для изготавливания плит полидиметилсилоксиана конструированы с следующими характеристиками для того чтобы включить воображение с объективом масла погружения 100X и правильно приспосабливать в приспособлении таможн-сборки (Диаграмма 1A, B).
- Держите общие размеры пластины таким образом, чтобы он поместится в зажимы устройства деформации.
Примечание: здесь, они 60 mm x 73 mm. - Сделать ячейку отсека или хорошо, что значительно меньше, чем боковых размеров всей пластины, чтобы избежать дуги (вне плоскости изгиба) эффекты, которые происходят на незажатых краях пластины полидиметилсиласана во время применения штамма.
Примечание: здесь отсек был спроектирован как 23 мм х 23 мм квадрат. - Держите глубину клеточного отсека как можно меньше (не более 80 мкм), чтобы включить фокусирование с маслом 100-х погружной линзы через стекло крышки, помещено в верхней части отсека, но сделать его достаточным, чтобы содержать средства массовой информации и избегать контакта или сжимая клетки.
- Поднимите ячейку отсека на квадрат с высотой 3 мм, чтобы привести клетки ближе к объективу в перевернутом микроскопе установки для обеспечения легкого фокусировки.
Примечание: прессформы с вышеприведними функциями могут быть изготовлены многими методами, включая, например, измельченный алюминий. Кроме того, мастер формы также могут быть собраны с помощью акриловых листов вырезать с лазерной резак, крышка стекла #0 для клеточного отсека, и супер клей. Этот мастер плесень используется, чтобы сделать отпечаток полидиметилсиликсана, который затем используется, чтобы сделать рабочие формы с использованием смолы литья.
2. Изготовление одноходных, полидиметилсиллоксана пластин и квадратных отсеков
- Смешайте полидиметилсилилизан и отверждения агента в соотношении 20:1 (по весу) в одноразовой чашке. Весить в общей сложности 20 г полидиметилсиликсана в форме (для изготовления одной пластины полидиметилсиликсана) и 150 г полидиметилсиликсана на 150 мм в диаметре пластикового блюда (для изготовления одной партии квадратных отсеков).
- Оставьте в вакуумной смеси полидиметилсилосан в вакууме дегассера в-0,8 в течение 30 мин (или до тех пор, пока все пузырьки не будут удалены).
- Полейте смесь полидиметилсиликсана в формы (для плит) или в пластиковое блюдо 150 мм (для квадратных отсеков).
- Удалите все дополнительные пузыри на данном этапе, либо путем выдувания воздуха (в рот) или дегазации полидиметилсилосанэ заполненные формы/блюда снова на-0,8 бар вакуум в течение 30 мин.
- Оставьте формы/блюда в духовке 80 ° c на выравнивание таблицы для 2 ч.
- Аккуратно удалите формы/блюда из духовки и дайте им остыть до комнатной температуры. Осторожно очистите отвержденных полидиметилсиликсана после тщательного резки краев лезвие (рис.1C).
- На 150 мм диаметр полидиметилсилоксиан, нарисуйте 2 см х 2 см сетки с маркером. В каждом квадратном, нарисуйте 1 см х 1 см квадрат, оставляя запас 0,5 см со всех сторон. Используя лезвие, аккуратно разрезать вдоль линий, чтобы получить квадратные отсеки (рисунок 2A).
- Чистота полидиметилсиласана пластин/квадратных отсеков путем инкубации их в 100% ацетон для 4 ч, а затем 100% этанола для 4 ч, а затем автоклапаном воды для 4 ч.
- Поместите тарелки/квадратные отсеки на бумагу из парафина (не парафин, но бумагу) внутри пластикового блюда диаметром 150 мм (Рисунок 2C).
- Оставьте пластинку полидиметилсиликсана в духовке 80 ° с для просушки на 4 ч.
- Печать диаметром 150 мм блюд, содержащих полидиметилсилоксиан пластин и контейнерных квадратов с парафиновые пленки, и хранить их в холодном помещении до дальнейшего использования.
3. функционализация полидиметилсиллоксана пластин
- Снимите парафиновую пленку, снимите крышку пластикового блюда и поместите на 30 мин в ультрафиолетовом свете пластины полидиметилсиликсана и квадратные отсеки.
- Плазма-лечить (на 150 W в течение 5 мин) полидиметилсилограксана пластины (с клеточного отсека вверх) без квадратных отсеков, чтобы сделать культуру поверхности гидрофильной.
- Сразу же поместите квадратные отсеки на плазменную поверхность (рис. 2B) и нажмите вручную, чтобы временно вставить два вместе.
Примечание: не плазма-лечить квадратных отсеков, или же они будут придерживаться сильно полидиметилсиллоксана пластины и не будет оторваться легко, когда они должны быть снимают во время визуализации. - Добавьте 200 мкл 100 мм (3-аминопропилль) триэтоксисилайн в колодец на 2 ч, чтобы ввести-2 группы в поверхность полидиметилсилоксана. Чтобы сделать раствор 100 mM, Растворите 234 мкл чистого (3-амиопропиля) триметоксисайна в 10 мл воды. После инкубации 2 ч, вымойте скважины 3x с обожелионизированной водой.
- Взвесьте 2 мг молекулярного скрещивание биссульфоцантинидил и растворите его в 700 мкл от 1 м (4-(2-гидрокeyll)-2-1-пипиазинэтан сульфоническая кислота буфер (pH 8,0) и 2,8 мл воды.
Примечание: это даст 1 мм биссульфосукинидил подрационическое раствор в 200 мм (4-(2-гидрокезиол)-1-пипиазинэтан сульфонический кислотный буфер. Обратите внимание, что буфер концентрации 50 mM также работает хорошо.- Добавить 135 мкл этого раствора и 15 мкл 1 мг/мл фиброннектина в колодец в каждой полидиметилсилофильной пластине для 4 ч при комнатной температуре.
- Промыть 3x с фосфат-буфером физиологического раствора. Добавьте 500 Мкl фосфатно-буферного раствора для колодца. Накройте блюдо диаметром 150 мм, содержащее полидиметилсилосан с парафинным пленкой и храните его в холодном помещении до дальнейшего использования.
4. функционализация пластиковых блюд и фляги
- Инкубировать пластиковые тарелки и фляги с 5 мкг/мл раствора поли-D-Лизин (СНО, в стерильной воде) на 1 ч. Добавить 1,5 мл этого раствора (лигонд) на 35 мм в диаметре блюдо, 3 мл его на 60 мм в диаметре блюдо, и 10 мл на 75 см2 культура фляги.
- Вымойте посуду и фляги 2x стерильной водой.
- Оставьте их высохнуть в шкафу биобезопасности для 1 ч (или до сухого) и хранить их в холодном помещении при температуре 4 ° c до дальнейшего использования.
5. распространение и дифференциация среды для Мурина олигодендроцитов клеток-предшественников
- Подготовка 50 ml из 100X решения распространения и дифференциации среды, сделать аликвотов 2,5 ml, и хранить их на-80 ° c.
Примечание: состав среды распространения составляет 0,1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина, 62 нг/мл прогестерона, 16 мкг/мл путрисина, 5 мкг/мл инсулина, 50 мкг/мл голо-трансферрина, 5 нг/мл селенита натрия, 1x пенициллин-стрептомицин, 10 нг/мл, рост тромбоцитов фактор, и 10 нг/мл фиброз фактор роста в модифицированный игл Дульбекко (ДМЭМ) с высоким уровнем глюкозы и pyruvate. В то время как бычий сыворотки альбумина, прогестерона, Putrescine, и селенита натрия может быть сформирован и хранится на 100X, инсулин, голо-трансферрин, и пенициллин-стрептомицин должны быть добавлены свежие при подготовке 1x решение. Факторы роста должны быть на уровне 10 мкг/мл и должны добавляться к клеткам каждый день (1 мкл/мл среднего). В состав дифференцированного носителя 0,1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина, 62 нг/мл прогестерона, 16 мкг/мл путрексина, 5 мкг/мл инсулина, 50 мкг/мл голо-передачи, 5 нг/мл селенита натрия, 1x пенициллин-стрептомицин, 400 нг/мл трийодтиронина, 400 нг L-тироксин и 0,5% фетальной бычьей сыворотки в дм с высоким уровнем глюкозы и пируватом. Трийодтиронин и L-сироксин можно образовать с другими реагентами и хранить в 100X. Инсулин, голо-трансферрин, и пенициллин-стрептомицин должны быть добавлены свежие при подготовке 1x решение. - Для подготовки 50 мл средней пролиферации 100 х, растворить 510 мг коровьего альбумина в 17 мл средней Дульбекко, 310 мкг прогестерона в 31 мкл этанола, 80 мг путрексина в 500 мкл среднего Дульбекко, 25 мкг селенита натрия в 10 мкл средней Дульбекко и полный ДМ до 50 мл
- Для подготовки 50 mL из 100X раствор дифференцированного среднего, дополнительно растворить 2 мг трийодтиронина в 40 мкл гидроксида натрия и 2 мг L-роксина в 40 мкл гидроксида натрия, затем заполнить решение до 50 мл с средой Дульбекко. Фильтр раствор через стерильный одноразовый фильтр, aliquot, и хранить аликвотс при-80 ° c.
- Для подготовки 250 мл 1x распространения/дифференцировки средних, смешайте 2,5 mL из 100X решение распространения/дифференцировки среды с 12,5 mg Холо-трансферрин, 125 мкл 10 мг/мл инсулина, и 2,5 мл 100X пенициллин-стрептомицин. Заполните раствор до 250 mL с средой Дульбекко и фильтровать его через стерильный Блок одноразового фильтра.
Примечание: факторы роста должны быть добавлены свежими и непосредственно к культуре клетки, не к всей партии восстановленного средства.
6. Культура клетки
- Начните с олигодендроцитов клеток-предшественников, взвешенных в среде распространения. Семян этих клеток при плотности 35 000 клеток/см2 на СНО-покрытием пластиковых поверхностей (посуда или фляги, см. раздел 4). Отрегулируйте объем среды распространения до 3 мл на 10 см2 поверхности пластикового субстрата; более низкий объем среды может привести к слияний клеток, возникающих из сил поверхностного натяжения, в то время как больший объем среды в блюдах может вызвать утечку.
- Добавить факторы роста (тромбоцитов, полученных фактор роста и фибронектина фактор роста) каждый день, сохраняя их концентрацию на 10 нг/мл и изменить половину распространения среды на альтернативные дни.
- На третий день, отделить клетки от пластиковой поверхности с помощью мягкого раствора отряда ячейки (например, accutase): удалить носитель, вымыть 1x с фосфат-буфером физиологического раствора, добавить 1 мл раствора отряда на 20 см2 области, оставьте блюдо/колбу в инкубаторе при температуре 37 ° c в течение 10 мин, и осторожно коснитесь его, пока все клетки не отделились (посмотрите под микроскопом).
- Пипетка использованием 200 мкл наконечник разорвать сгустки в одиночные клетки, перевести их на 50 mL трубки, разбавить их в распространении среды, спина на 0,2 x g в течение 10 мин, отказаться от supernatant, и ресуспензируем гранулы в распространении среды, чтобы сделать общий объем 1 мл. Считайте клетки, используя cytometer.
- Мыть фиброннектин-функционализированных полидиметилсилоксиан пластин 2x, 15 мин на стирка, с распространением среды.
- Семян 35 000 клеток на полидиметилсиллоксана пластины в 700 мкл распространения среды.
- Добавьте плазмид конструкт H2B-GFP для маркировки гистон H2B с зеленым флуоресцентным белком.
Примечание: здесь, 1,4 МКН CellLight H2B-GFP смесь BacMam2 была добавлена к каждой пластине (2 мкл на 50 000 ячеек). - После 24 ч, смонтировать полидиметилсилоксиан образцы с клетками, которые будут растянуты на одноосевое устройство деформации (как показано на рисунке 2D). Изменение среды во всех образцах на дифференцировку среды.
- Чтобы напрягать образцы, Измерьте длину ненатянутого клеточного отсека (Рисунок 3A) и поверните винт на этапе микрометра, чтобы увеличить длину клеточного отсека на нужную сумму (например, 10%, см. диаграмму 3a). Оставьте растянутые и незатянутых образцов полидиметилсиликсана в инкубаторе при температуре 37 ° c до визуализации.
7. Визуализация
- Включите Микроскоп. Установите температуру инкубатора микроскопа до 37 ° c.
- Принесите цель, которая будет использоваться (100X погружение масла) в центральное положение, так как цель башни не будет доступна позже. Отвинтить цель и винт его обратно вместе с объективным кольцом (Рисунок 4A), так что цель может быть ближе к клеткам. Если цель нефти используется здесь, добавьте каплю масла на этом шаге.
- Синтезировать заранее (с помощью 3D-печати или обработки) пластиковый или металлический держатель, имеющий две важные функции — угловые окна и шаг (Рисунок 4B).
Примечание: окно поддерживает толщину #0 стеклянный комбинезон, который будет удерживать носитель, в то время как устройство деформации находится в перевернутом состоянии. Угловой разрез на оконных краях (рис. 4D) позволяет приблизиться к покрытому стеклу. Шаг в держателе позволяет нам вывести растянутую полидиметилсиллокан вниз, ближе к цели. - Поместите стеклянный комбинезон (толщина #0, с размерами 25 мм х 25 мм или 35 мм в диаметре) на верхнюю поверхность держателя, распространяя вакуумные смазки на периферии окна (Рисунок 4c), и лента пластиковые окна на стадии микроскопа ( Рисунок 4D и фигура 5A).
- Винт этап z-перевода на стадии микроскопа и переместить его в верхний z-позиции (Рисунок 5a).
- Удалите 500 мкл среды от растянутой полидиметилсилоксиановой пластины для изображения и добавьте эту среду на стеклянный комбинезон в белом пластиковом окне.
- Аккуратно отделим квадратный отсек от полидиметилсилизансана пластину стерильными щипчиками.
- Держите напряжение устройства в вертикальном положении (клетки вверх) над белым пластиковым окном и тщательно инвертировать деформации устройства, чтобы позволить любой дополнительной средней капли непосредственно в середине стеклянный комбинезон (Рисунок 5B) (клетки, стоящие вниз).
- Поместите нижнюю часть устройства деформации на стадию z-перевода с двусторонней лентой (Рисунок 5C, D).
- При взгляде через окуляр под яркое поле, медленно довести штамм устройства вниз (рис. 5E) (за счет снижения z-перевод этап) и переместить цель до сосредоточиться на клетках.
- Выполните этот шаг очень медленно, шаг за шагом. Если устройство деформации давит слишком много на покрывало, клетки могут быть сжаты (заставляя их умирать), и если цель давит слишком много на покрывало, покрывало может сломаться (вызывая среду утечки и разлива на цель).
- Сканирование пластины полидиметилсилорксана в х-и y-направлениях, чтобы найти ячейку, которая имеет флуоресцентное ядро (под эпифлуоресценции с 488 нм возбуждения длины волны) и соответствующие морфологии клеток (под брайтфилд).
- Если боковое смещение стадии микроскопа не влияет на вертикальное фокусирование слишком много, выберите несколько областей интересов с помощью многоточечной функции на программном обеспечении. Иногда, фокусировка очень чувствительна к любому боковому перемещению сцены. В таких случаях изображение одной ячейки за один раз. Отметьте x-, y-и z-позиции для каждой ячейки интереса.
- Запись широкополых (или открытых Пинхол) изображений ядра с 488 нм возбуждения длины волны и ячейки с возбуждениями Брайта с интервалом 30 s за кадр для общей продолжительности не менее 30 мин.
8. анализ данных
-
Ядерные колебания
- Откройте последовательность изображений ядра (Рисунок 6A) в программном обеспечении для анализа изображений и пороговое значение временных изображений ядра (например, используйте порог команды в Imiej или грейтреш команды в программном обеспечении MATLAB).
- Получите область ядра (в пикселях) как функцию времени, прокладываем ее в программном обеспечении для построения данных (Рисунок 6B), и приспосабливали третий заказ Полиномиальный к данным (Диаграмма 6B) (например, используйте анализ | Фитинг | Команда по происхождению полиномиальная Fit или команда polyfit в программном обеспечении MATLAB).
- Вычесть значение приталенный Полиномиальный из фактической области (в пикселях) для каждой точки времени. Эта исправленная область известна как остаточная область.
Примечание: этот процесс удаляет любые растущие или уменьшающиеся тенденции в данных, поступающих от инструментальных ошибок, и называется детрендовым.- Рассчитать процент остаточного участка путем деления остаточного участка на каждый момент времени с значением приспособленный Полиномиальный на той временной точке (Рисунок 6D).
- Расчет стандартного отклонения остаточных временных рядов области. Это стандартное отклонение обозначает амплитуду ядерных колебаний.
-
Построение данных и статистический анализ
- Рассчитать амплитуду ядерных колебаний как среднее, по крайней мере, 20 ядер в расчете на условие.
- Проведите один способ анализа в дисперсию статистического теста с коррекцией Бонферрони, чтобы определить, есть ли существенная разница в амплитуде колебаний как функция условий интереса (например, с и без применного напряжения).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Недавняя работа, направленная на исследование влияния растяжения на Олигодендроциты10 , показала, что 10%-ое напряжение одноосевого натяжения способствует дифференциации клеток-прародителя олигодендроцитов в результате глобальных изменений экспрессии генов. Механизм, который следует за этими изменениями экспрессии генов, можно зондировать с помощью изображений субклеточных параметров, таких как структура цитоскелета, локализация транскрипционного фактора, ядерная динамика и организация хроматина. Однако Предыдущая геометрия субслоя полидиметилсилксисана не позволила одноклеточной визуализации с высоким разрешением. Как описано в этой работе, переработанная геометрия субслоя полидиметилсилксиана и Настройка изображений минимизированы расстояние между клетками и целью. Это позволяет захватывать покадровой изображений флуоресцентно помечены ядер клеток с помощью 100X цель погружения масла (Рисунок 6A).
Колебания в зоне проецируемого ядерного оружия зависят от состояния дифференцировки ячеек11,12. Сравнение ядерных колебаний олигодендроцитов клеток-предшественников и, что неизлечимо дифференцированной Олигодендроциты показали, что последние имеют значительно более низкие колебания (рис. 6E). Затем были сравнены ядерные флуктуации олигодендроцитов клеток-предшественников на уровне 1 ч, 24 ч, и 48 h после химической индукции дифференциации и без напряжения 10% на растяжение. С химическим индукцией самостоятельно, амплитуда ядерных флуктуаций показала существенное уменьшение на 48 h но не на 24 h (Диаграмма 6F). С другой стороны, химическая индукция вместе с 10% штамм растяжение показал значительное снижение на 24 ч, который оставался неизменным, без дальнейшего сокращения на 48 h (Рисунок 6G).
Геометрия субстрата и конфигурация изображений, описанные в этом документе, позволили записывать фильмы с высоким разрешением на напряженные клетки. Последующий анализ этих фильмов продемонстрировал, что напряжение ускоряет смягчение ядерных колебаний, что является маркером дифференциации. Эти результаты дают представление о механизме, с помощью которого штамм способствует дифференциации олигодендроцитов. Дальнейшее обсуждение толкования этих результатов и будущих экспериментов описано в Makhija et al.13.
Рисунок 1: Проектирование и геометрия полидиметилсиликсан плесени. A) эскиз формы, показывающая все размеры в миллиметрах (этот эскиз был сгенерированный технологиями, Сингапур). (B) трехмерное представление формы (адаптировано из Makhija et al.11). На врезке изображена фотография плесени. C) трехмерное представление пластины полидиметилсилорксана, изготовленной с использованием плесени (адаптировано из Makhija et al.11). На врезке показана фотография плиты полидиметилсилаксана. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Рисунок 2: Подготовки образца. A) Фото полидиметилсилаксана пластины и квадратного отсека. B) квадратное отделение размещается на приподнятом квадратном квадрате на плите полидиметилсиликсана. Его цель состоит в том, чтобы содержать среду для клеток. (C) полидиметилсилимоксана пластины хранятся в 150 мм в диаметре пластиковыми блюдами с использованием парапленки бумаги, чтобы предотвратить полидиметилсилимоксана от прилипания на пластик. (D) при монтаже пластины на устройство деформации, поддерживать его снизу с помощью двух пальцев для предотвращения любого провисания пластины. Если пластина по-прежнему немного побита после монтажа, увеличение расстояния между оружием деформации устройства, поворачивая этап перевода. На этом этапе перевод сцены не должен вызывать напряжение в полидиметилсилыксана пластины. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Рисунок 3: клетка растяжка. A) измерить начальную длину пластины между зажимами, используя линейку. (B) растянуть пластины, поворачивая винт на этапе перевода увеличить начальную длину пластины на желаемый процент. X% увеличение длины соответствует X% от деформации. Обратите внимание, что для получения желаемого штамма (X%) в салоне повышенной клеточной культуры, основная пластина должна быть напряжена более высокой суммой (приблизительно 2X%) из-за разницы в их толщине в описанной геометрии плиты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Рисунок 4: Подготовка к визуализации. (A) довести цель 100X до центрального положения в башне, открутить цель, и винт его обратно вместе с объективным кольцом. (B) эскиз держателя, показывающий все размеры в миллиметрах. (C) распространение вакуумной смазки на периферии окна в держателе, с помощью пипетки наконечник, и поместить стеклянный комбинезон на вершине. Используйте крышку стекла с толщиной #0 или #1, для включения фокусировки с 100X масло погружения объектива. (D) Поместите держатель (1) на стадии микроскопа (2). Принесите масло (6) цель (3) ближе к маскикрои (5), которая прилипла к держателю, используя вакуумные смазки (4). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Рисунок 5: Установка изображения на Микроскоп. (A) Соберите этап z-перевода (желтая стрелка) и держатель (красная стрелка) на стадии микроскопа. (B) наклон устройства деформации на стадии микроскопа, чтобы позволить любой средней капли на стеклянный комбинезон держателя. Stick двустороннюю ленту (синяя стрелка) на штамм устройства, которые будут придерживаться на z-трансляции этапе. (C) Поместите устройство деформации в перевернутое положение, поддерживая его на стадии z-перевода. Клетки должны быть приведены в соответствие со стеклянным покрытелем пластикового держателя. (D) перевернутая геометрия устройства деформации сводит к минимуму расстояние между клетками и целью, тем самым способствуя визуализации с высоким разрешением (адаптировано из Makhija et al.11). (E) вид сбоку до приведения устройства деформации вниз (1); вид сбоку после чего устройство деформации вниз (2); вид сверху, после чего устройство деформации вниз (3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Рисунок 6: Репрезентативные изображения и колебания области данных ядра. Эта цифра адаптирована из Makhija et al.11. (A) типичный образ ядра помечены гистон H2B помечены Зеленый флуоресцентный белок, и дифференцируя олигодендроцитов ячейки предшественников. Ядро находится в фокусе, в то время как клеточные процессы находятся вне фокуса. B) типичные временные ряды ядерной зоны (в пикселях). (C) третьего порядка Полиномиальные установлены на данные. (D) процентное соотношение остаточного времени колебания зоны. E) колебания ядерных краев пролиферирующих клеток-предшественников и неизлечимо дифференцированных олигодендроцитов. (F) ядерные колебания края на 1 ч, 24 ч, и 48 h постиндукции химического дифференцирования без напряжения. G) колебания ядерной зоны на уровне 1 ч, 24 ч и 48 ч постиндукции химической дифференциации с 10%-ным напряжением. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Устройство имеет ранее1 был разработан для нанесения внеклеточного напряжения растяжения на адепт клеток. Конструкция субслоя полидиметилсилксиана в этой работе была достаточна для биохимических анализов, а также с низкоразрешающей визуализацию растянутых клеток. В этой работе, субстрата был переработан, и Новая конфигурация изображений, что облегчает с высоким разрешением субклеточных изображений живых клеток был введен. Преимущества этой системы многочисленны: она может быть построена в лабораторных условиях с использованием простых компонентов, она недорогая по сравнению с коммерческими устройствами деформации (500 USD на ячейку штамма устройства), и она достаточно мала, чтобы поместиться внутри ткани инкубаторы культуры, а также на Микроскопы. Кроме того, хотя система визуализации была описана здесь с инвертированной установкой микроскопа, она может быть легко скорректирована для вертикальной конфигурации микроскопа.
Есть несколько критических шагов, участвующих в подготовке образца и визуализации. Во-первых, полидиметилсиллоксана пластины и квадратные отсеки должны быть тщательно очищены до посева клеток (протокол шаг 2,8), чтобы обеспечить выживание клеток (как невылеченных полидиметилсилксиан является токсичным для клеток). Во-вторых, поскольку объем жидкости среды, которая может поместиться внутри квадратного отсека меньше 1 мл, он может испаряться, если образец находится в инкубаторе в течение нескольких дней. Следовательно, среда должна проверяться каждый день и пополняться при необходимости. Кроме того, поднятая область на полидиметилсилансиановой пластине может быть покрыта перевернутым пластиковым блюдом диаметром 60 мм, чтобы минимизировать испарение. В-третьих, крайняя осторожность должна быть осуществлена при перемещении устройства деформации на Микроскоп вниз через z-перевод этапе довести клетки ближе к стеклянной маскирование. Сжатие клеток (даже на мгновение) между полслоем полидиметилсилксиана и покрывающие стекла может привести к гибели клеток. В-четвертых, мертвые клетки и клеточный мусор могут оставаться прилипли к покрытому стеклом после удаления полидиметилсиллоксана образца. Таким образом, после визуализации, стеклянный комбинезон должен быть снимается с вакуумной смазки и свежий комбинезон должен быть прикреплен до монтажа нового образца.
Ограничения устройства деформации заключаются в том, что применение стадии бокового смещения не может быть запрограммированным для выполнения циклических или перенапряжения и что оно может только применить одноосевое напряжение. Ограничение субслоя полидиметилсилксана в описанной геометрии состоит в том, что штамм, более 25%, может вызвать перелом полидиметилсиликсана.
Будущая модификация для улучшения конструкции субслоя полидиметилсилксиана может быть включение сетки на поверхности культуры клеток. Это позволит отслеживать одну и ту же ячейку до и после применения напряжения на растяжение.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Все авторы благодарно признают финансовую поддержку от национального исследовательского фонда Сингапура через Сингапур-MIT Альянс научно-исследовательских и технологических (SMART) биосистем и Micromechanics (биосистема) междисциплинарной исследовательской группы. Авторы д-р Ягелска и д-р ван Влиет также с благодарностью признают финансирование и поддержку со стороны Фонда Сакс-Кавано. Авторы благодарят Уильяма Онг и д-ра Синг Йяна Чу из Наньянского технологического университета, Сингапур, за то, что они обеспечивают клетки-предшественники олигодендроцитов для некоторых экспериментов, описанных в этой работе, и Авторы благодарят доктора г. в. Шивашанкара от Институт механобиологии, Национальный университет Сингапура, Сингапур, для дискуссий о колебаниях ядерной зоны.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary cells | Primary Oligodendrocyte Progenitor Cells isolated from Neonatal Rats were provided by Dr. S. Y. Chew's lab at Nanyang Technological University |
||
| Media | |||
| DMEM high glucose | Gibco | 11996-065-500ml | |
| Pen/Strep | Gibco | 15070-063-100ml | |
| FGF | Prospec | CYT-608-50ug | |
| PDGF | Prospec | CYT-776-10ug | |
| Media Stock components | |||
| BSA | Sigma | A9418-10G | |
| Progesterone | Sigma | P8783-1G | |
| Putrescine | Sigma | P5780-5G | |
| Sodium Selenite | Sigma | S5261-10G | |
| Tri-iodothyronine | Sigma | T6397-100MG | |
| Thyroxine | Sigma | T1775-100MG | |
| Holo-Transferrin | Sigma | T0665-500MG | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Mold and PDMS plate | |||
| PDMS - Dow Corning Sylgard 184 | Ellsworth | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Mold - Liquid Plastic | Smooth-On | Smooth Cast 310 - Trail Size | |
| Substrate Coatings | |||
| poly-D-lysine | Sigma | P6407-5MG | |
| Fibronectin | Sigma | F1141-2MG | |
| Histone staining | |||
| CellLigt H2B-GFP BacMam | Molecular Probes | C10594 | |
| Surface functionalization | |||
| APTES | Sigma | A3648-100ml | |
| BS3 | Covachem | 13306-100mg | |
| HEPES buffer pH 8.0 | Alfa Aesar | J63578-AK-250ml | |
| Cell detachment | |||
| Accutase | Invitrogen | A1110501-100ml |
References
- Bray, D. Mechanical tension produced by nerve cells in tissue culture. Journal of Cell Science. 410, 391-410 (1979).
- Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension. Developmental Biology. 389, (1983).
- Van Essen, D. C. A tension-based theory of morphogenesis and compact wiring in the central nervous system. Nature. , (1997).
- Smith, D. H. Stretch growth of integrated axon tracts: Extremes and exploitations. Progress in Neurobiology. 89, 231-239 (2011).
- Cullen, D. K., Simon, C. M., LaPlaca, C. M. Strain rate-dependent induction of reactive astrogliosis and cell death in three-dimensional neuronal-astrocytic co-cultures. Brain Research. , 103-115 (2011).
- Fisher, E., et al. Imaging correlates of axonal swelling in chronic multiple sclerosis brains. Annals of Neurology. 2, 219-228 (2007).
- Nikić, I., et al. A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Nature Medicine. 17, 495-500 (2011).
- Payne, S. C., Bartlett, C. A., Harvey, A. R., Dunlop, S. A., Fitzgerald, M. Functional loss during chronic secondary degeneration in rat optic nerve. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53, (2018).
- Zeiger, A. S., et al. Static mechanical strain induces capillary endothelial cell cycle re-entry and sprouting. Physical Biology. 13, 1-16 (2017).
- Jagielska, A., et al. Mechanical strain promotes oligodendrocyte differentiation by global changes of gene expression. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 93 (2017).
- Pajerowski, J. D., Dahl, K. N., Zhong, F. L., Sammak, P. J., Discher, D. E. Physical plasticity of the nucleus in stem cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1, 0-5 (2007).
- Talwar, S., Kumar, A., Rao, M., Menon, G. I., Shivashankar, G. V. Correlated spatio-temporal fluctuations in chromatin compaction states characterize stem cells. Biophysical Journal. 104, 553-564 (2013).
- Makhija, E., et al. Mechanical strain alters cellular and nuclear dynamics at early stages of oligodendrocyte differentiation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 59 (2018).
