Summary
Mit Hilfe eines zuvor entwickelten Geräts zur mechanischen Belastung von Anbauzellen beschreibt dieser Beitrag eine neu gestaltete Substratum-Geometrie und ein maßgeschneidertes Gerät zur hochauflösenden Einzeller-Abbildung von angespannten Zellen mit einem 100x Öl-Immersionsziel.
Abstract
Es ist bekannt, dass eine technische Belastung für zellphälenförmige Reaktionen eine physiologische Relevanz in mehreren Gewebesystemen hervorruft. Um die Wirkung der aufgetragenen extrazellulären Zugbelastung auf die Zellpopulationen in vitro durch biochemische Assays zu erfassen, wurde zuvor ein Gerät entwickelt, das einfach hergestellt werden kann und klein genug ist, um Inkubatoren der Gewebekultur zu integrieren, sowie darüber hinaus Mikroskop-Stufen. Die bisherige Gestaltung des Polydimethylsiloxan-Substratums erlaubte jedoch keine hochauflösende subzelluläre Bildgebung über Öl-Immersionsziele. Diese Arbeit beschreibt eine neu gestaltete Geometrie des polydimethylsiloxanen Substrats und eine maßgeschneiderte Bildgebung, die zusammen eine hochauflösende subzelluläre Bildgebung lebender Zellen unter Auftragen der Last ermöglichen kann. Dieses Substrat kann mit dem gleichen, früher entworfenen Gerät verwendet werden und hat somit die gleichen Vorteile wie oben aufgelistet, zusätzlich zu einer hochauflösenden optischen Bildgebung. Das Design des Polydimethylsiloxan-Substratums kann durch die Einbettung eines Gitters verbessert werden, das die Verfolgung der gleichen Zelle vor und nach der Anwendung der Belastung erleichtert. Repräsentative Ergebnisse zeigen eine hochauflösende Zeitraffer-Abbildung von fluoreszierend beschrifteten Kernen in angespannten Zellen, die mit der hier beschriebenen Methode erfasst werden. Diese Daten der nuklearen Dynamik geben Einblicke in den Mechanismus, durch den die angewandte Zugbelastung die Differenzierung von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen fördert.
Introduction
Zellen und Gewebe im Körper werden verschiedenen mechanischen Ketten ausgesetzt, darunter auch Zugstämme. Die Auswirkungen dieser Hinweise auf die Biologie neuronaler Zellen sind jedoch noch nicht umfassend untersucht und vollständig verstanden worden. Im zentralen Nervensystem sind die Quellen der mechanischen Belastung das Entwicklungswachstumvon 1,2,3,4, physiologische Prozesse wie Rückenmarksbiegung, Blut und Hirnspinalflüssigkeit. Pulsierung und pathologische Zustände wie Trauma, Axonschwellung, Gliollennarbung oder Tumorwachstum5,6,7,8. Es lohnt sich zu untersuchen, wie sich Zugbelastung auf die Differenzierung von Oligodendrozyten und die anschließende Myelination von Axonen auswirkt, was ein kritischer Prozess im Wirbelsäulenmittelnervensystem ist. Mit Hilfe eines maßgeschneiderten Dehnungsgerätes und einer elastomeren Multiwell-Platte haben frühere Arbeiten9,10gezeigt , dass statische Einblutungsstrapazen die Oligodendrozytendifferenzierung durch globale Veränderungen der Genexpression erhöhen können. 10. Um ein weiteres Verständnis der Mechanismen der Dehnungsmechanotransduktion in diesen Zellen zu gewinnen, muss der bisherige Experimentalapparat so umgestaltet werden, wie er hier beschrieben wird, um eine hochauflösende Fluoreszenz-Abbildung der nuklearen Dynamik im Leben zu ermöglichen. Zellen unter Belastung. Konkret wird eine einfallsbringende Polydimethylsiloxan-Platte entwickelt, und die Bildkonfiguration wird neu gestaltet, um die Zeitraffer-Abbildung lebender Zellen unter Belastung durch eine 100x Öl-Tauchlinse zu ermöglichen. Um die negativen optischen Effekte von Polydimethylsiloxan im Lichtweg zu eliminieren, werden Zellen nicht durch die Polydimethylsiloxan-Platte, sondern in der umgekehrten Position durch das Deckglas abgebildet, das das Zellfach bedeckt. Mit diesem neuen bildgebenden Design werden hunderte von hochauflösenden Zeitraffer-Filmen aufgenommen, von einzelnen Zellkernen innerhalb intakter, anhaftierter Zellen, in denen Chromatin durch die Markierung von Histon H2B auf grünes fluoreszierendes Protein gekennzeichnet wird. Diese Filme zeigen, dass Zugstrapazen Veränderungen in der Chromatin-Struktur und-Dynamik induzieren, die mit dem Fortschreiten der Oligodendrozyten-Differenzierung im Einklang stehen.
Die Live-Zell-Bildgebung unter aufgesetzter Belastung ist technisch anspruchsvoll und erfordert ein mit dem Mikroskop-System kompatibles Gerätedesign. Das hier beschriebene individuelle Design stellt eine kostengünstige Alternative zu kommerziellen Lösungen dar. Seine Abmessungen ermöglichen den Einbau auf Mikroskop-Stufen und Live-Zell-Bildgebung mit hoher räumlicher Auflösung während der aufgetragenen Belastung. Das bildgebende Setup soll die Bildgebung von lebenden Zellen mit einer 100-fach-Öltauchlinse mit höchster Klarheit durch das Deckglas erleichtern, nicht durch die Schicht der Polydimethylsiloxan-Platte, die sonst die Bildqualität verringert und in den meisten Fällen üblich ist. Bildgebende Setups unter Belastung. Das Gerät, mit einer montierten Platte, die Zellen enthält, lässt sich auch einfach im Inkubator lagern. Dieses Gerät ist so konzipiert, dass es Substraten, die die anhaftende Zellkultur erleichtern und eine stabile und gleichmäßige Belastung über mehrere Tage hinweg erhalten, uniaxiale Belastung aufträgt. Das hier beschriebene Setup kann für die hochauflösende Abbildung verschiedener anhaftender Zelltypen unter Belastung genutzt werden, was es für Mechanotransduktionsstudien in vielen Bereichen der Zellmechanobiologie geeignet macht.
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Protocol
1. Design der Einbrunnen-Polydimethylsiloxan-Form für hochauflösende Bildgebung
Hinweis: Die Form zur Herstellung von Polydimethylsiloxan-Platten ist mit folgenden Eigenschaften ausgestattet, um eine Bildgebung mit einer 100x Öltauchlinse und einer korrekten Passform in die maßgeschneiderte Dehnungsvorrichtung (Abbildung 1A, B) zu ermöglichen.
- Halten Sie die gesamten Plattenmaße so, dass sie in die Klemmen der Dehnungsvorrichtung passen.
Achtung: Hier sind sie 60 mm x 73 mm. - Machen Sie ein Zellfach oder einen Brunnen, der deutlich kleiner ist als die seitlichen Abmessungen der ganzen Platte, um zu vermeiden, dass sich die Wirkung (außerhalb des Flugzeugs), die an den ungeklemmten Kanten der Polydimethylsiloxan-Platte während der aufgetragenen Belastung passieren, abspielt.
Hinweis: Hier wurde das Fach als 23 mm x 23 mm Quadrat konzipiert. - Halten Sie die Tiefe des Zellfaches so minimal wie möglich (nicht mehr als 80 μm), damit die Fokussierung mit der 100x Öltauchlinse durch das Deckglas auf dem Oberfach des Faches platziert wird, aber ausreichend genug, um Medien zu enthalten und zu vermeiden, dass Kontakt oder Die Zellen quetschen.
- Heben Sie das Zellfach auf ein Quadrat mit einer Höhe von 3 mm, um die Zellen näher an die Linse im umgekehrten Mikroskop-Setup zu bringen, um eine einfache Fokussierung zu ermöglichen.
Hinweis: Formen mit den oben genannten Eigenschaften können mit vielen Techniken hergestellt werden, wie zum Beispiel gefrästes Aluminium. Alternativ können auch Meisterformen mit Acrylplatten mit einem Laserschneider, Deckglas #0 für das Zellfach und Superkleber zusammengesetzt werden. Diese Meisterform wird zur Herstellung eines Polydimethylsiloxan-Aufdrucks verwendet, der dann mit einem Gießharz für die Herstellung von Arbeitsformen verwendet wird.
2. Herstellung von Einbrunnen Polydimethylsiloxan-Platten und quadratischen Fächern
- Polydimethylsiloxan-Basis und Härtungsmittel im Verhältnis von 20:1 (nach Gewicht) in einem Einwegbecher mischen. Wiegen insgesamt 20 g Polydimethylsiloxan pro Form (für die Herstellung einer Polydimethylsiloxan-Platte) und 150 g Polydimethylsiloxan pro 150 mm-in-durchmessende Kunststoffschale (für die Herstellung einer Charge quadratischer Fächer).
- Lassen Sie die Polydimethylsiloxan-Mischung in einem Vakuum-Degasser bei-0,8 bar für 30 min (oder bis alle Blasen entfernt sind).
- Die Polydimethylsiloxan-Mischung in die Formen (für Teller) oder in 150 mm Plastikschalen (für quadratische Fächer) geben.
- Entfernen Sie in dieser Phase zusätzliche Blasen, entweder durch Blasluft (durch den Mund) oder durch Entgasung der polydimethylsiloxan gefüllten Formen/Gerichte wieder bei-0,8 bar Vakuum für 30 min.
- Lassen Sie die geschmolzenen/Gerichte in einem 80 ° C-Ofen auf einem Nivelliertisch für 2 Stunden.
- Die Molds/Schalen vorsichtig aus dem Ofen nehmen und auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Das ausgehärtete Polydimethylsiloxan nach sorgfältigem Schneiden der Kanten mit einer Klinge vorsichtig ausziehen (Abbildung 1C).
- Auf dem 150 mm großen Polydimethylsiloxan zeichnen Sie ein 2 cm x 2 cm Gitter mit einem Marker. Ziehen Sie innerhalb jedes Quadrats ein 1 cm x 1 cm Quadrat, so dass ein Rand von 0,5 cm auf allen Seiten. Mit einer Klinge, sorgfältig entlang der Linien geschnitten, um quadratische Fächer zu erhalten (Abbildung 2A).
- Reinigen Sie die polydimethylsiloxanen Platinen/.
- Legen Sie die Platinen auf Paraffin-Folien-Backpapier (nicht die Paraffin-Folie, sondern das Papier) in eine Plastikschüssel mit einem Durchmesser von 150 mm (Abbildung 2C).
- Die Polydimethylsiloxan-Platte im 80 ° C-Ofen 4 Stunden trocknen lassen.
- Die 150 mm großen Geschirr mit Polydimethylsiloxan-Platten und Containerquadraten mit Paraffinfolie versiegelt und bis auf Weiteres in einem kalten Raum lagern.
3. Funktionalisierung von Polydimethylsiloxan-Platten
- Die Paraffinfolie entfernen, die Abdeckung der Kunststoffschale entfernen und die Polydimethylsiloxan-Platten und quadratischen Fächer 30 min unter UV-Licht stellen.
- Plasma-treat (bei 150 W für 5 min) die Polydimethylsiloxan-Platten (mit dem Zellfach nach oben) ohne die quadratischen Fächer, um die Kulturfläche hydrophil zu machen.
- Die quadratischen Fächer sofort auf die Plasma-behandelte Fläche legen (Abbildung 2B) und manuell drücken, um die beiden vorübergehend zu kleben.
Hinweis: Behandeln Sie die quadratischen Fächer nicht Plasa, sonst haften sie stark an der Polydimethylsiloxan-Platte und werden nicht leicht abfallen, wenn sie während der Bildgebung abgeschält werden müssen. - 200 μL von 100 mM (3-Aminopropyl) Triethoxysilane für 2 h in den Brunnen geben, um – NH2 Gruppen auf die Polydimethylsiloxan-Oberfläche einzuführen. Um eine 100-MM-Lösung zu machen, lösen Sie 234 μL reines (3-Aminopropyl) Ethoxysilane in 10 ml Wasser auf. Nach einer 2-h-Inkubation die Brunnen 3x mit deionisiertem Wasser waschen.
- Wiegen Sie 2 mg des molekularen Crosslinkers Bissulfosuvinimidyl suberate und lösen Sie es in 700 μL von 1 M (4-(2-Hydroxyethyl) -1-Piperazineethan-Säure-Puffer (pH 8,0) und 2,8 ml Wasser auf.
NOTE: Dies wird eine 1 mM Bissulfosuccinimidyl-Suberat-Lösung in 200 mM (4-(2-Hydroxyethyl) -1-Piperazineethan-Sulfonsäure-Puffer. Beachten Sie, dass auch ein 50-MM-Konzentrationspuffer gut funktioniert.- 135 μL dieser Lösung und 15 μL von 1 mg/mL Fibronectin in jeder Polydimethylsiloxan-Platte für 4 h bei Raumtemperatur in den Brunnen geben.
- 3x mit phosphatgepufferten Salzlösung waschen. Dem Brunnen werden 500 μL Phosphat-gepufferte Salzlösung zugegeben. Die 150 mm große Schale, die das Polydimethylsiloxan enthält, mit Paraffinfolie bedecken und bis auf weiteres in einem kalten Raum lagern.
4. Funktionalisierung von Kunststoffschalen und-Flasken
- Inkubate Plastikschalen und-Flappen mit einer 5 μg/mL-Lösung aus Poly-D-Lysin (PDL, In sterilem Wasser) für 1 Stunde. 1,5 ml dieser Lösung (Ligand) pro 35 mm Durchmesser Schüssel, 3 ml davon pro 60 mm-Durchmesser Schüssel und 10 ml pro 75 cm 2 Kulturflasche.
- Waschen Sie die Geschirr und Flaschen 2x mit sterilem Wasser.
- 1 Stunde (oder bis trocken) im Kiosschutzschrank trocknen lassen und bis zur Weiterverwendung im kalten Raum bei 4 ° C aufbewahren.
5. Proliferation und Differenzierungsmedium für Murin-Oligodendrozyten-Vorläuferzellen
- Bereiten Sie 50 mL von 100x Lösungen des Vermehrungs-und Differenzierungsmediums vor, machen Sie Aliquote von 2,5 mL und lagern Sie sie bei-80 ° C.
NOTE: Die Zusammensetzung des Proliferationsmediums ist 0,1 mg/mL Rinder-Serum Albumin, 62 ng/mL Progesteron, 16 μg/mL putrescine, 5 μg/mL Insulin, 50 μg/mL holo-transferrin, 5 ng/mL Natriumselenite, 1x Penicillin-Streptomycin, 10 ng/mL platelet-derived growth Faktor, und 10 ng/mL Fibroblast-Wachstumsfaktor in Dulbecco es modifiziertem Eagle es Medium (DMEM) mit hoher Glukose und Pyruvat. Während Rinder-Serum Albumin, Progesteron, Putreszin und Natriumselenit bei 100x konstituiert und gelagert werden können, müssen bei der Zubereitung der 1x-Lösung frische hinzugefügt werden. Die Wachstumsfaktoren müssen bei 10 μg/mL gebildet werden und täglich frisch in die Zellen (1 μL/mL des Mediums) eingefügt werden. Die Zusammensetzung des Differenzierungsmediums beträgt 0,1 mg/mL Rinder-Serum albumin, 62 ng/mL Progesteron, 16 μg/mL putrescine, 5 μg/mL Insulin, 50 μg/mL holo-transferrin, 5 ng/mL Natriumselenite, 1x Penicillin-Streptomycin, 400 ng/mL triiodothyronine, 400 ng/mL L-Schilddrüse, und 0,5% fetales Rinderserum in DMEM mit hoher Glukose und Pyruvat. Triiodothyronin und L-Schilddrüse können mit anderen Reagenzien gebildet und bei 100x gelagert werden. Insulin, Holo-transferrin und Penicillin-Streptomycin müssen bei der Vorbereitung der 1x-Lösung frisch hinzugefügt werden. - Für die Zubereitung von 50 ml 100x Proliferationsmedium, lösen Sie 510 mg Rinder-Serum Albumin in 17 mL Dulbecco Medium, 310 μg Progesteron in 31 μL Ethanol, 80 mg Putreszin in 500 μL Dulbecco-Medium, 25 μg Natriumselenit in 10 μL Dulbecco es Medium , und volle DMEM bis zu 50 mL
- Für die Zubereitung von 50 mL 100x Lösung des Differenzierungsmediums zusätzlich 2 mg Triiodothyronin in 40 μL Natriumhydroxid und 2 mg L-thyroxin in 40 μL Natriumhydroxid auflösen, dann die Lösung mit Dulbecco-Medium auf 50 mL auffüllen. Filtern Sie die Lösung durch eine sterile Einwegfiltereinheit, Aliquot, und speichern Sie die Aliquots bei-80 ° C.
- Für die Zubereitung von 250 mL 1x Proliferation/Differenzierungsmedium, mischen Sie 2,5 mL von 100x Lösung von Proliferation/Differenzierungsmedium mit 12,5 mg Holo-transferrin, 125 μL von 10 mg/mL Insulin und 2,5 mL von 100x Penicillin-Streptomycin. Füllen Sie die Lösung auf 250 mL mit dem Dulbecco-Medium auf und filtern Sie sie durch eine sterile Einwegfiltereinheit.
NOTE: Die Wachstumsfaktoren müssen frisch und direkt in die Zellkultur aufgenommen werden, nicht in die ganze Gruppe des rekonstituierten Mediums.
6. Zellkultur
- Beginnen Sie mit Oligodendrozyten-Vorläuferzellen, die im Proliferationsmedium aufgehängt sind. Saatgut diese Zellen mit einer Dichte von 35.000 Cells/2 auf PDL-beschichtete Kunststoffoberflächen (Geschirr oder Flaschen, siehe Abschnitt 4). Das Volumen des Proliferationsmediums auf 3 ml pro 10 cm 2 der Oberfläche des Kunststoffsubstrats anpassen; Ein geringeres Medium kann zu einer Zellklemme führen, die durch Oberflächenspannungskräfte entsteht, während ein höheres Medium im Geschirr zu Verschmutzungen führen kann.
- Fügen Sie jeden Tag Wachstumsfaktoren (platelet-abgeleiteter Wachstumsfaktor und Fibronektin Wachstumsfaktor) hinzu, halten Sie ihre Konzentration bei 10 ng/mL aufrecht und verändern Sie die Hälfte des Proliferationsmediums an wechselnden Tagen.
- Am dritten Tag die Zellen mit einer sanften Zellablösungslösung (z.B. Akkutase) von der Kunststoffoberfläche abtrennen: Das Medium entfernen, 1x mit phosphatgepufferter Salzlösung waschen, 1 mL Loslösung pro 20 cm 2-Bereich hinzufügen, die Unehre verlassen In einem Inkubator bei 37 ° C für 10 min, und sanft tippen Sie es, bis alle Zellen sich gelöst haben (siehe unter einem Mikroskop).
- Pipette mit einer 200 μL-Spitze, um Klumpen in einzelne Zellen zu zerlegen, sie auf ein 50 mL-Rohr zu übertragen, sie im Proliferationsmedium zu verdünnen, bei 0,2 x g für 10 Minuten zu drehen, das Supernatant abzulegen und das Pellet-Medium im Proliferationsmedium wieder zu verlegen, um ein Gesamtvolumen von 1 mL zu erzeugen. Zählen Sie die Zellen mit einem Zytometer.
- Die Fibronektin-Funktionalisierten Polydimethylsiloxan-Platten 2x, 15 min pro Wäsche, mit Proliferationsmedium waschen.
- Saatgut 35.000 Zellen pro Polydimethylsiloxan-Platte in 700 μL Proliferationsmedium.
- Fügen Sie ein Plasmid-Konstrukt von H2B-GFP zur Kennzeichnung von Histon H2B mit grünem Leuchtstoffprotein hinzu.
Hinweis: Hier wurde jeder Platte 1,4 μL CellLight H2B-GFP BacMam2 Transfektionsmix zugesetzt (2 μL pro 50.000 Zellen). - Nach 24 Stunden die Polydimethylsiloxan-Proben mit Zellen montieren, die auf der uniaxialen Dehnungsvorrichtung gestreckt werden sollen (wie in Abbildung 2Dgezeigt). Ändern Sie das Medium in allen Proben in Differenzierungsmedium.
- Um die Proben zu belasten, messen Sie die unbelastete Zellfresslänge (Abbildung 3A) und drehen Sie die Bühnenmikrometerschraube, um die Länge des Zellgedecks um die gewünschte Menge zu erhöhen (z.B. 10%, siehe Abbildung 3B). Lassen Sie die gestreckten und ungestreckte Polydimethylsiloxan-Proben im Inkubator bei 37 ° C bis zur Bildgebung.
7. Bildgebung
- Schalten Sie das Mikroskop ein. Stellen Sie die Mikroskop-Inkubator-Temperatur auf 37 ° C.
- Bringen Sie das zu verwendenden Objektiv (100x Öleintauchen) in die zentrale Position, da der objektive Turm später nicht mehr zugänglich ist. Das Objektiv abschrauben und mit einem Objektring (Abbildung 4A) zurückschrauben, damit das Objektiv näher an die Zellen herangeführt werden kann. Wenn hier ein Ölziel verwendet wird, fügen Sie bei diesem Schritt einen Tropfen Öl hinzu.
- Synthesize vorher (durch 3D-Druck oder Bearbeitung) einen Kunststoff-oder Metallhalter, der zwei wichtige Merkmale — ein abgewinkeltes Fenster undeinen Schritt (Abbildung 4B) hat.
Hinweis: Das Fenster unterstützt eine Dicke #0 Glaskappe, die das Medium hält, während sich das Dehnungsgerät in einem umgekehrten Zustand befindet. Der abgewinkelte Schnitt an den Fensterkanten (Abbildung 4D) ermöglicht es, das Objektiv näher an die Glasverkitzung heranzuführen. Der Schritt in den Halter ermöglicht es uns, das gestreckte Polydimethylsiloxan weiter unten, näher an das Ziel zu bringen. - Legen Sie eine Glaskitzel (Dicke #0, mit Abmessungen von 25 mm x 25 mm oder 35 mm Durchmesser) auf die Oberseite des Halters, indem Sie Vakuumfettander Peripherie des Fensters verteilen (Abbildung 4C), und binden Sie das Kunststofffenster auf die Mikroskop-Ebene ( Abbildung 4D und Abbildung 5A).
- Eine z-Übersetzungsstufe auf die Mikroskop-Stufe schrauben und auf die oberste z-Position ( Abbildung 5A) verschieben.
- Entfernen Sie 500 μL des Mediums aus der gestreckten Polydimethylsiloxan-Platte, um abgebildet zu werden, und fügen Sie dieses Medium auf die Glaskappe im weißen Kunststofffenster.
- Mit sterilen Pinzetten wird das quadratische Fach von der Polydimethylsiloxan-Platte sorgfältig abgetrennt.
- Halten Sie das Dehnungsgerät in einer aufrechten Position (Zellen nach oben) über dem weißen Kunststofffenster und drehen Sie die Dehnungsvorrichtung sorgfältig um, so dass ein zusätzliches Medium direkt in der Mitte des Glaskitzel abfallen kann (Abbildung 5B) (Zellennach unten).
- Legen Sie den unteren Teil des Dehnungsgerätes mit dem doppelseitigen Band auf die z-Übersetzungsstufe (Abbildung 5C, D).
- Beim Blick durch das Okular unter Brightfield langsam das Dehnungsgerät nach unten bringen (Abbildung 5E) (durch Absenkung der z-Übersetzungsstufe) und das Objektiv nach oben zu verschieben, um sich auf die Zellen zu konzentrieren.
- Führen Sie diesen Schritt äußerst langsam, Schritt für Schritt. Wenn das Dehnungsgerät zu sehr auf den Kenterlip drückt, können die Zellen komprimiert werden (wodurch sie absterben), und wenn das Objektiv zu sehr auf den Kenterlip drückt, kann der Kenterlip brechen (wodurch das Medium austreten und auf das Objektiv ablaufen).
- Scannen Sie die Polydimethylsiloxan-Platte in x-und y-Richtungen, um eine Zelle zu finden, die einen fluoreszierenden Kern (unter Epifluoreszenz mit 488 nm Wellenlängen-Anregung) und die entsprechende Zellmorphologie (unter Brightfield) hat.
- Wenn die seitliche Verschiebung des Mikroskop-Stadions die vertikale Fokussierung nicht zu sehr beeinflusst, wählen Sie mehrere Interessensregionen mit einer Multipoint-Funktion auf der Software aus. Manchmal ist die Fokussierung sehr empfindlich auf jede seitliche Verschiebung der Bühne. In solchen Fällen eine Zelle nach der anderen. Markieren Sie die Positionen x-, y-und z-Positionenfür jede Zelle des Interesses.
- Zeichnen Sie Weiterflächen-Bilder (oder Freiblöcken) des Kerns mit 488 nm Wellenlängen-Anregung und der Zelle mit Brightfield-Anregung in Abständen von 30 s pro Rahmen für eine Gesamtdauer von mindestens 30 min auf.
8. Datenanalyse
-
Nukleare Schwankungen
- Öffnen Sie die Reihenfolge der Kernbilder (Abbildung 6A) in einer Bildanalyse-Software und schwellen Sie die Kernzeit-Lapse-Bilder ab (verwenden Sie zum Beispiel den Threshold-Befehl in ImageJ oder den Graythresh-Befehl in der Software MATLAB).
- Holen Sie sich den Kernbereich (in Pixel) als eine Funktion der Zeit, zeichnen Sie ihn in einer Datenplanungssoftware(Abbildung 6B), und passen Sie einen dritten Auftrag polynomial zu den Daten (Abbildung 6C) (zum Beispiel verwenden Sie die Analyse | Passend | Polynomiale Fit-Befehl in Origin oder der Polyfit-Befehl in der Software MATLAB).
- Subtrahieren Sie den Wert des eingebauten Polynomiums für jeden Zeitpunkt aus dem eigentlichen Bereich (in Pixel). Dieser korrigierte Bereich wird als Restfläche bezeichnet.
Hinweis: Dieser Prozess entfernt jeden zunehmenden oder abnehmenden Trend in den Daten, die von instrumentalen Fehlern ausgehen und wird als Entgleiung bezeichnet.- Berechnen Sie den Prozentsatz der Restfläche, indem Sie den Restbereich an jedem Zeitpunkt mit dem Wert des zu diesem Zeitpunkt eingebauten Polynomiums teilen (Abbildung 6D).
- Berechnen Sie die Standardabweichung der Restflächen-Zeitreihe. Diese Standardabweichung bezeichnet die Amplitude von nuklearen Schwankungen.
-
Datenplündern und statistische Analysen
- Berechnen Sie die Amplitude der nuklearen Schwankungen als Mittel von mindestens 20 Kernen pro Zustand.
- Führen Sie einen einseitigen Varianzstatistiktest mit Bonferroni-Korrektur durch, um festzustellen, ob es einen signifikanten Unterschied in der Amplitude der Schwankungen gibt, wenn es um die Bedingungen geht (zum Beispiel mit und ohne aufgetragene Belastung).
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Representative Results
Jüngste Arbeiten, die darauf abzielten, die Wirkung von Zugbelastung auf Oligodendrozyten10 zu untersuchen, zeigten, dass eine 10% uniaxiale Zugbelastung die Differenzierung von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen durch globale Veränderungen der Genexpression fördert. Der Mechanismus hinter diesen Veränderungen der Genexpression kann durch die Abbildung subzellulärer Parameter, wie der Zytoskelettstruktur, der Transkriptionsfaktor-Lokalisierung, der nuklearen Dynamik und der Chromatin-Organisation, untersucht werden. Die bisherige Geometrie des Polydimethylsiloxan-Substratums erlaubte jedoch keine hochauflösende Einzeller-Bildgebung. Wie in dieser Arbeit beschrieben, minimierte die neu gestaltete Geometrie des Polydimethylsiloxan-Substrats und die bildgebende Einrichtung den Abstand zwischen den Zellen und dem Objektiv. Dies ermöglicht die Erfassung von Zeitraffer-Bildern von fluoreszierenden Zellkernen mit einem 100x Öl-Immersionsziel (Abbildung 6A).
Schwankungen im atomaren projizierten Bereich hängen vom Differenzierungszustand der Zellen11,12ab. Ein Vergleich der nuklearen Schwankungen der Oligodendrozyten-Vorläuferzellen und der terminell differenzierten Oligodendrozyten ergab, dass letztere deutlich geringere Schwankungen aufweisen (Abbildung 6E). Als nächstes wurden die nuklearen Schwankungen der Oligodendrozyten-Vorläuferzellen bei 1 h, 24 h und 48 h postchemischer Induktion der Differenzierung mit und ohne 10% Zugbelastung verglichen. Allein mit der chemischen Induktion zeigte die Amplitude der nuklearen Schwankungen einen deutlichen Rückgang bei 48 Stunden, nicht aber bei 24 Stunden (Abbildung 6F). Auf der anderen Seite zeigte die chemische Induktion zusammen mit einer Zugbelastung von 10% einen deutlichen Rückgang bei 24 h, der konstant blieb, ohne weitere Reduktion bei 48 Stunden (Abbildung 6G).
Die Substratum-Geometrie und die in diesem Beitrag beschriebene Bildkonfiguration ermöglichten die Aufnahme hochauflösender Filme von strapazierten Zellen. Die anschließende Analyse dieser Filme hat gezeigt, dass die Belastung der nuklearen Schwankungen, die ein Zeichen der Differenzierung ist, beschleunigt. Diese Ergebnisse geben Einblick in den Mechanismus, durch den die Belastung die Oligodendrozyten-Differenzierung fördert. Weitere Diskussionen über die Interpretation dieser Ergebnisse und zukünftige Experimente werden in Makhija et al. 13 beschrieben.
Bild 1: Design und Geometrie der Polydimethylsiloxan Schimmel. (A) Skizze der Form, die alle Abmessungen in Millimetern zeigt (diese Skizze wurde von Whits Technologies, Singapur). (B) Dreidimensionale Ansicht der Form (von Makhija et al. 11). Inset zeigt ein Foto der Form. (C) dreidimensionale Ansicht der Polydimethylsiloxan-Platte, die mit der Form hergestellt wurde (von Makhija et al. 11). Inset zeigt ein Foto der Polydimethylsiloxan-Platte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Bild 2: Probenvorbereitung. (A) Foto einer Polydimethylsiloxan-Platte und eines quadratischen Faches. (B) Das quadratische Fach wird auf dem erhöhten Quadrat auf der Polydimethylsiloxan-Platte platziert. Sein Zweck ist es, Medium für die Zellen zu enthalten. (C) Polydimethylsiloxan-Platten werden in Plastikschalen mit einem Durchmesser von 150 mm mit Parafilm-Papier gelagert, um zu verhindern, dass das Polydimethylsiloxan auf den Kunststoff klebt. D) Während der Montage der Platte auf die Dehnungsvorrichtung, stützen Sie sie von unten mit zwei Fingern, um ein Absinken der Platte zu verhindern. Wenn die Platte nach dem Einbau noch ein wenig absinkt, vergrößern Sie den Abstand zwischen den Dehnungsgeräten, indem Sie die Übersetzungsstufe drehen. Bei diesem Schritt sollte die Übersetzung der Bühne keine Belastung in der Polydimethylsiloxan-Platte verursachen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Zelldehnung. A) Messen Sie die Anfangslänge der Platte zwischen den Klemmen mit einem Lineal. B) die Platte durch Drehen der Schraube auf der Übersetzungsstufe zu strecken, um die anfängliche Plattenlänge um den gewünschten Prozentsatz zu erhöhen. Die Längensteigerung von X% entspricht X% der Belastung. Beachten Sie, dass, um die gewünschte Belastung zu erzeugen (X%) Im Hochzellenkulturraum muss die Hauptplatte um einen höheren Betrag (ca. 2X%) belastet werden. Wegen der Differenz in ihrer Dicke in der beschriebenen Plattengeometrie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Bild 4: Vorbereitung auf die Bildgebung. (A) Das 100x-Objektiv in die zentrale Position im Turm bringen, das Objektiv abschrauben und zusammen mit dem Objektring zurückschrauben. (B) Skizze des Halters, die alle Abmessungen in Millimetern zeigt. (C) Vakuumfett an der Peripherie des Fensters in den Halter mit einer Pipette-Spitze verteilen und einen Glaskupp darauf legen. Verwenden Sie ein Deckglas mit Dicke #0 oder #1, um die Fokussierung mit der 100x Öltauchlinse zu ermöglichen. D) den Halter (1) auf die Mikroskop-Stufe (2) legen. Bringen Sie das Öl (6) Objektiv (3) näher an den Kessellip (5), der mit Vakuumfett (4) am Halter befestigt ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Bild 5: Bildgebungsaufbau am Mikroskop. (A) Die z-Übersetzungsstufe(gelber Pfeil) und den Halter (roter Pfeil) auf die Mikroskop-Stufe montieren. (B) Das Dehnungsgerät auf die Mikroskop-Stufe ansteigen, um jedes Medium auf die Glaskappe des Halters fallen zu lassen. Kleben Sie ein doppelseitiges Klebeband (blauer Pfeil) auf das Dehnungsgerät, das auf die z-Übersetzungsstufe klebt. C) das Dehnungsgerät in eine umgekehrte Position zu bringen und es auf der z-Übersetzungsstufe zu unterstützen. Die Zellen müssen mit dem Glaskappe des Kunststoffhalters ausgerichtet sein. D) Die umgekehrte Geometrie des Dehnungsgerätes minimiert den Abstand zwischen den Zellen und dem Objektiv und erleichtert so eine hochauflösende Bildgebung (angepasst vonMakhija et al. 11). (E) Seitenansicht vor dem Absenken des Dehnungsgerätes (1); Seitenansicht nach dem Absenken des Dehnungsgerätes (2); Top-Ansicht nach dem Absenken des Dehnungsgerätes (3). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Bild 6: Repräsentative Bilder und Flächenschwankungen Daten des Kerns. Diese Figur ist von Makhija et al. 11angepasst. (A) Typisches Bild eines Kerns, der mit Histon H2B beschriftet ist, der auf grünes fluoreszierendes Protein markiert ist, und eine differenzierende oligodendrocyte Vorläuferzelle. Der Kern steht im Fokus, während die Zellprozesse nicht im Fokus stehen. (B) Typische Zeitreihen eines Kernbereichs (in Pixel). (C) Polynomial der dritten Ordnung, das an die Daten angepasst ist. D) Anteil der Restflächenfluktuationszeit. E) nukleare Kantenschwankungen von sich vermehrenden Oligodendrozyten-Vorläuferzellen und terminell differenzierten Oligodendrozyten. F) nukleare Kantenschwankungen bei 1 h, 24 h und 48 Stunden Nachinduktion chemischer Differenzierung ohne Belastung. G) Schwankungen im Bereich des Kernbereichs bei 1 h, 24 Stunden und 48 Stunden Nachinduktion chemischer Differenzierung mit 10% Zugbelastung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Ein Gerät wurde zuvor1 für den Einsatz von extrazellulärer Zugbelastung der anhaftenden Zellen entwickelt. Das Design des Polydimethylsiloxan-Substrats, das für biochemische Untersuchungen geeignet war, sowie die niedrig auflösende Abbildung von gestreckten Zellen. In dieser Arbeit wurde das Substrat neu gestaltet und eine neuartige bildgebende Konfiguration eingeführt, die hochauflösende subzelluläre Live-Zell-Bildgebung ermöglicht. Die Vorteile dieses Systems sind vielfältig: Es kann im Labor mit einfachen Komponenten gebaut werden, es ist preiswert im Vergleich zu kommerziellen Dehnungsgeräten (500 USD pro Zellstraftgerät), und es ist klein genug, um Inkubatoren in der Gewebekultur sowie auf Mikroskope. Darüber hinaus kann das Bildgebungssystem hier mit dem umgekehrten Mikroskop-Setup beschrieben, aber es lässt sich leicht an die aufrechte Mikroskop-Konfiguration anpassen.
Es gibt einige kritische Schritte, die bei der Probenvorbereitung und-bildgebung durchgeführt werden. Zunächst müssen die Polydimethylsiloxan-Platten und quadratischen Fächer vor der Zellentsaat gründlich gereinigt werden (Protokollschritt 2.8), um das Überleben der Zelle zu sichern (da ungehärtetes Polydimethylsiloxan für die Zellen giftig ist). Zweitens, da das Volumen des flüssigen Mediums, das in das quadratische Fach passen kann, weniger als 1 ml beträgt, kann es verdunsten, wenn die Probe im Inkubator für ein paar Tage ist. Daher muss das Medium täglich überprüft und bei Bedarf wieder aufgefüllt werden. Zusätzlich kann die erhöhte Fläche auf der Polydimethylsiloxan-Platte mit einer umgekehrten Plastikschüssel mit 60 mm-Durchmesser abgedeckt werden, um die Verdunstung zu minimieren. Drittens ist extreme Vorsicht geboten, wenn man das Dehnungsgerät auf dem Mikroskop über die z-Übersetzungsstufe nach unten bewegt, um die Zellen näher an den Glaskappenlip zu bringen. Die Komprimierung der Zellen (auch für einen Moment) zwischen dem Polydimethylsiloxan-Substrat und der Glaskofenlippe kann zum Zelltod führen. Viertens können die abgestorbenen Zellen und Zellschutt nach dem Entfernen der Polydimethylsiloxan-Probe an der Glaskappe stecken bleiben. Daher muss nach der Bildgebung der Glaskesselriss aus dem Vakuumfett gezogen werden und vor der Montage einer neuen Probe sollte ein frischer Kopfkkosle angebracht werden.
Die Einschränkungen des Dehnungsgerätes sind, dass die Anwendung der studenseitlichen Verschiebung nicht auf zyklische oder ramponierte Belastung programmiert werden kann und nur eine uniaxiale Belastung auftragen kann. Die Einschränkung des Polydimethylsiloxan-Substrats in der beschriebenen Geometrie besteht darin, dass eine Belastung von mehr als 25% eine Fraktur des Polydimethylsiloxans verursachen kann.
Eine zukünftige Modifikation zur Verbesserung des Designs des Polydimethylsiloxan-Substratums könnte die Einbindung eines Gitters auf der Zeltkulturoberfläche sein. Dies würde es ermöglichen, die gleiche Zelle vor und nach dem Auftragen von Zugbelastungen zu verfolgen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Alle Autoren danken der Unterstützung durch die National Research Foundation of Singapore durch die interdisziplinäre Forschungsgruppe Singapure-MIT Alliance for Research and Technology (SMART) BioSystems und Mikromechanik (BioSyM). Die Autoren Dr. Jagielska und Dr. Van Vliet danken auch der Finanzierung und Unterstützung der Saks-Kavanaugh Stiftung. Die Autoren danken William Ong und Dr. Sing Yian Chew von der Nanyang Technological University, Singapur, für die Bereitstellung von Rattenoligodendrocyte-Vorläuferzellen für einige Experimente, die in diesem Werk beschrieben werden, und die Autoren danken Dr. G. V. Shivashankar von Mechanobiologie Institut, National University of Singapore, Singapur, für Diskussionen über nukleare Flächenschwankungen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary cells | Primary Oligodendrocyte Progenitor Cells isolated from Neonatal Rats were provided by Dr. S. Y. Chew's lab at Nanyang Technological University |
||
| Media | |||
| DMEM high glucose | Gibco | 11996-065-500ml | |
| Pen/Strep | Gibco | 15070-063-100ml | |
| FGF | Prospec | CYT-608-50ug | |
| PDGF | Prospec | CYT-776-10ug | |
| Media Stock components | |||
| BSA | Sigma | A9418-10G | |
| Progesterone | Sigma | P8783-1G | |
| Putrescine | Sigma | P5780-5G | |
| Sodium Selenite | Sigma | S5261-10G | |
| Tri-iodothyronine | Sigma | T6397-100MG | |
| Thyroxine | Sigma | T1775-100MG | |
| Holo-Transferrin | Sigma | T0665-500MG | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Mold and PDMS plate | |||
| PDMS - Dow Corning Sylgard 184 | Ellsworth | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Mold - Liquid Plastic | Smooth-On | Smooth Cast 310 - Trail Size | |
| Substrate Coatings | |||
| poly-D-lysine | Sigma | P6407-5MG | |
| Fibronectin | Sigma | F1141-2MG | |
| Histone staining | |||
| CellLigt H2B-GFP BacMam | Molecular Probes | C10594 | |
| Surface functionalization | |||
| APTES | Sigma | A3648-100ml | |
| BS3 | Covachem | 13306-100mg | |
| HEPES buffer pH 8.0 | Alfa Aesar | J63578-AK-250ml | |
| Cell detachment | |||
| Accutase | Invitrogen | A1110501-100ml |
References
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