Summary
À l’aide d’un dispositif conçu antérieurement pour appliquer une déformation mécanique aux cellules adhérentes, cet article décrit une géométrie de substrat redessinée et un appareil personnalisé pour l’imagerie à une seule cellule à haute résolution de cellules tendues avec un objectif d’immersion en huile de 100 x.
Abstract
La souche mécanique extracellulaire est connue pour susciter des réponses phénotypiques cellulaires et a une pertinence physiologique dans plusieurs systèmes tissulaires. Pour capter l’effet de la déformation extracellulaire appliquée sur les populations cellulaires in vitro via des dosages biochimiques, un dispositif a déjà été conçu qui peut être fabriqué simplement et est assez petit pour s’adapter à l’intérieur des incubateurs de culture tissulaire, ainsi que sur le dessus de étapes du microscope. Cependant, la conception antérieure du substrat de polydiméthylsiloxane n’autorisait pas l’imagerie subcellulaire à haute résolution par des objectifs d’immersion en huile. Ce travail décrit une géométrie redessinée du substrat de polydiméthylsiloxane et une configuration d’imagerie personnalisée qui, ensemble, peut faciliter l’imagerie sous-cellulaire à haute résolution des cellules vivantes pendant la déformation appliquée. Ce substrat peut être utilisé avec le même appareil conçu précédemment et, par conséquent, a les mêmes avantages que énumérés ci-dessus, en plus d’autoriser l’imagerie optique haute résolution. La conception du substrat de polydiméthylsiloxane peut être améliorée en incorporant une grille qui facilitera le suivi de la même cellule avant et après l’application de la souche. Les résultats représentatifs démontrent une imagerie en accéléré à haute résolution des noyaux marqués fluorescemment dans les cellules tendues capturées à l’aide de la méthode décrite ici. Ces données sur la dynamique nucléaire donnent un aperçu du mécanisme par lequel la souche de traction appliquée favorise la différenciation des cellules progénitrices des oligodendrocytes.
Introduction
Les cellules et les tissus dans le corps sont soumis à divers indices mécaniques, y compris les souches de traction. Cependant, les effets de ces indices sur la biologie des cellules neuronales n’ont pas encore été étudiés de manière exhaustive et pleinement compris. Dans le système nerveux central, les sources de déformation mécanique comprennent la croissance du développement1,2,3,4, les processus physiologiques tels que la flexion de la moelle épinière, le sang et le liquide céphalo-rachidien pulsations, et pathologies telles que traumatisme, gonflement Axon, cicatrices gliales, ou croissance tumorale5,6,7,8. Il est intéressant d’étudier comment la déformation de la traction affecte la différenciation des oligodendrocytes et la myélination subséquente des axones, qui est un processus critique dans le système nerveux central des vertébrés. À l’aide d’un dispositif de déformation conçu sur mesure et de plaques multipuits en élastomère, les travaux antérieurs9,10 ont montré que la souche uniaxiale statique peut augmenter la différenciation des oligodendrocytes par des changements globaux dans l’expression des gènes 10. pour mieux comprendre les mécanismes de la mécanotransduction de la souche dans ces cellules, l’appareil expérimental précédent doit être redessiné comme décrit ici, pour permettre l’imagerie par fluorescence à haute résolution de la dynamique nucléaire dans les conditions de vie cellules sous tension. Plus précisément, une plaque de polydiméthylsiloxane à un seul puits est développée et la configuration d’imagerie est redessinée pour permettre l’imagerie en accéléré des cellules vivantes sous contrainte à l’aide d’une lentille d’immersion à l’huile de 100 x. Pour éliminer les effets optiques négatifs du polydiméthylsiloxane dans la voie de la lumière, les cellules sont imagées non pas par la plaque de polydiméthylsiloxane, mais dans la position inversée, à travers le verre de couverture couvrant le compartiment cellulaire. Grâce à cette nouvelle conception d’imagerie, des centaines de films en accéléré à haute résolution sont enregistrés, de noyaux cellulaires individuels dans des cellules adhérentes intactes, où la chromatine est étiquetée par le marquage de l’histone H2B à la protéine fluorescente verte. Ces films démontrent que la déformation par traction induit des changements dans la structure et la dynamique de la chromatine qui sont compatibles avec la progression de la différenciation des oligodendrocytes.
L’imagerie cellulaire en direct sous contrainte appliquée est techniquement difficile et nécessite une conception d’appareil compatible avec le système de microscope. La conception personnalisée décrite ici présente une alternative peu coûteuse aux solutions commerciales. Ses dimensions permettent son installation sur les stades du microscope et l’imagerie cellulaire en direct à haute résolution spatiale pendant la déformation appliquée. La configuration d’imagerie est conçue pour faciliter l’imagerie cellulaire en direct à l’aide d’une lentille d’immersion à l’huile de 100 x avec la plus grande clarté, à travers le verre de couverture, pas par la couche de la plaque de polydiméthylsiloxane qui, autrement, diminue la qualité de l’image et est commune dans la plupart configurations d’imagerie sous tension. L’appareil, avec une plaque montée contenant des cellules, peut également être stocké facilement dans l’incubateur. Cet appareil est conçu pour appliquer une souche uniaxiale à des substrats qui facilitent la culture de cellules adhérentes et maintiennent une souche stable et uniforme sur plusieurs jours. La configuration décrite ici peut être utilisée pour l’imagerie haute résolution de divers types de cellules adhérentes sous contrainte, ce qui le rend applicable aux études de mécanotransduction dans de nombreux domaines de la mécanobiologie cellulaire.
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Protocol
1. conception du moule de polydiméthylsiloxane à un seul puits pour l’imagerie haute résolution
Remarque: le moule pour la fabrication de plaques de polydiméthylsiloxane est conçu avec les caractéristiques suivantes pour permettre l’imagerie avec une lentille d’immersion de l’huile 100X et un ajustement correct dans le dispositif de contrainte de construction sur mesure (figure 1a, B).
- Conservez les dimensions globales de la plaque de façon à ce qu’elle s’insère dans les pinces du dispositif de déformation.
NOTE: ici, ils sont 60 mm x 73 mm. - Faire un compartiment cellulaire ou bien qui est significativement plus petit que les dimensions latérales de la plaque entière, pour éviter les effets d’arc (flexion hors plan) qui se produisent aux bords non serrés de la plaque de polydiméthylsiloxane pendant la souche appliquée.
Remarque: ici, le compartiment a été conçu comme un carré de 23 mm x 23 mm. - Garder la profondeur du compartiment cellulaire aussi minime que possible (pas plus de 80 μm), pour permettre la mise au point avec la lentille d’immersion de l’huile 100X à travers le couvercle en verre placé sur le dessus du compartiment, mais le rendre suffisamment suffisant pour contenir les médias et pour éviter de contacter ou serrant les cellules.
- Soulever le compartiment à cellules sur un carré d’une hauteur de 3 mm, pour rapprocher les cellules de la lentille dans la configuration du microscope inversé pour permettre une mise au point facile.
Remarque: les moules avec les caractéristiques ci-dessus peuvent être fabriqués par de nombreuses techniques, y compris, par exemple, l’aluminium fraisé. Alternativement, les moules maîtres peuvent également être assemblés en utilisant des feuilles acryliques coupées avec un cutter laser, couvercle en verre #0 pour le compartiment de la cellule, et super colle. Ce moule maître est utilisé pour faire une empreinte de polydiméthylsiloxane, qui est ensuite utilisé pour faire des moules de travail à l’aide d’une résine de coulée.
2. fabrication de plaques de polydiméthylsiloxane à puits unique et de compartiments carrés
- Mélanger la base de polydiméthylsiloxane et l’agent de durcissement dans un rapport de 20:1 (en poids) dans une tasse jetable. Peser un total de 20 g de polydiméthylsiloxane par moule (pour la fabrication d’une plaque de polydiméthylsiloxane) et 150 g de polydiméthylsiloxane par 150 mm de diamètre dans un plat en plastique (pour faire un lot de compartiments carrés).
- Laisser le mélange de polydiméthylsiloxane dans un dégazeur à vide à-0,8 bar pendant 30 min (ou jusqu’à ce que toutes les bulles soient enlevées).
- Versez le mélange de polydiméthylsiloxane dans les moules (pour les assiettes) ou dans des plats en plastique de 150 mm (pour les compartiments carrés).
- Enlevez les bulles additionnelles à ce stade, soit en soufflant de l’air (par la bouche) ou en dégazant les moules/plats remplis de polydiméthylsiloxane à nouveau à-0,8 bar vide pendant 30 min.
- Laisser les moules/plats dans un four à 80 ° c sur une table de nivellement pendant 2 h.
- Retirez délicatement les moules/plats du four et laissez-les refroidir à température ambiante. Peler délicatement le polydiméthylsiloxane durci après avoir soigneusement coupé les bords avec une lame (figure 1c).
- Sur le polydiméthylsiloxane de diamètre 150 mm, dessinez une grille de 2 cm x 2 cm avec un marqueur. Dans chaque carré, dessinez un carré de 1 cm x 1 cm, laissant une marge de 0,5 cm de chaque côté. À l’aide d’une lame, coupez soigneusement le long des lignes pour obtenir des compartiments carrés (figure 2a).
- Nettoyer les plaques de polydiméthylsiloxane/compartiments carrés en les incubant en 100% d’acétone pendant 4 h, suivie de 100% d’éthanol pendant 4 h, puis d’eau autoclavée pendant 4 h.
- Placer les plaques/compartiments carrés sur du papier de support de film de paraffine (pas le film de paraffine mais le papier) à l’intérieur d’un plat en plastique de diamètre 150 mm (Figure 2c).
- Laisser sécher la plaque de polydiméthylsiloxane dans le four 80 ° c pendant 4 h.
- Sceller les plats de 150 mm de diamètre contenant des plaques de polydiméthylsiloxane et des carrés contenant du film de paraffine, et les ranger dans une chambre froide jusqu’à utilisation ultérieure.
3. fonctionnalisation des plaques de polydiméthylsiloxane
- Enlevez le film de paraffine, enlevez le couvercle du plat en plastique, et placez les plaques de polydiméthylsiloxane et les compartiments carrés sous la lumière ultraviolette pendant 30 min.
- Traiter le plasma (à 150 W pendant 5 min) les plaques de polydiméthylsiloxane (avec le compartiment de cellules vers le haut) sans les compartiments carrés, pour rendre la surface de culture hydrophile.
- Placez immédiatement les compartiments carrés sur la surface traitée au plasma (figure 2b) et appuyez manuellement pour coller temporairement les deux ensemble.
Remarque: ne traitez pas le plasma des compartiments carrés, sinon ils colleront fortement à la plaque de polydiméthylsiloxane et ne se décolleront pas facilement lorsqu’ils doivent être décollés pendant l’imagerie. - Ajouter 200 μL de 100 mM (3-Aminopropyl) triéthoxysilane au puits pendant 2 h pour introduire – NH2 groupes à la surface du polydiméthylsiloxane. Pour faire une solution de 100 mM, dissoudre 234 μL de triéthoxysilane pur (3-aminopropyle) dans 10 mL d’eau. Après une incubation de 2 h, lavez les puits 3x avec de l’eau désionisée.
- Peser 2 mg du réticulation moléculaire bissulfosuccinimidyl subberate et le dissoudre dans 700 μL de 1 M (4-(2-hydroxyethyl) -1-pipérazineéthane sulfonique tampon d’acide (pH 8,0) et 2,8 mL d’eau.
NOTE: Ceci donnera une solution de 1 mM de bissulfosuccinimidyl subérate dans un tampon d’acide sulfonique de 200 mM (4-(2-hydroxyethyl) -1-pipérazineethane. Notez qu’un tampon de concentration de 50 mM fonctionne également bien.- Ajouter 135 μL de cette solution et 15 μL de fibronectine à 1 mg/mL au puits dans chaque plaque de polydiméthylsiloxane pendant 4 h à température ambiante.
- Laver 3x avec une solution saline tamponnée au phosphate. Ajouter 500 μL de solution saline tamponnée au phosphate au puits. Recouvrir le plat de 150 mm de diamètre contenant le polydiméthylsiloxane avec du film de paraffine et le ranger dans une chambre froide, jusqu’à utilisation ultérieure.
4. fonctionnalisation des plats et flacons en plastique
- Incuber les plats et flacons en plastique avec une solution de 5 μg/mL de poly-D-lysine (PDL, dans l’eau stérile) pendant 1 h. Ajouter 1,5 mL de cette solution (ligand) par 35 mm de diamètre, 3 mL par plat de 60 mm de diamètre et 10 mL par 75 cm2 flacon de culture.
- Lavez la vaisselle et les flacons 2x avec de l’eau stérile.
- Laissez-les sécher dans l’armoire de biosécurité pendant 1 h (ou jusqu’à ce qu’ils soient secs) et rangez-les dans la chambre froide à 4 ° c jusqu’à utilisation ultérieure.
5. prolifération et milieu de différenciation des cellules progénitrices des oligodendrocytes murins
- Préparer 50 mL de solutions 100X du milieu de prolifération et de différenciation, faire des aliquotes de 2,5 mL et les entreposer à-80 ° c.
NOTE: la composition du milieu de prolifération est de 0,1 mg/mL de sérum albumine bovine, 62 ng/mL de progestérone, 16 μg/mL de putrescine, 5 μg/mL d’insuline, 50 μg/mL de Holo-transferrine, 5 ng/mL de sélénite de sodium, 1x pénicilline-streptomycine, 10 ng/mL de croissance facteur de croissance des fibroblastes de 10 ng/mL dans le milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM) avec un taux élevé de glucose et de pyruvate. Alors que l’albumine sérique bovine, la progestérone, la putrescine et la sélénite de sodium peuvent être constituées et entreposées à 100X, l’insuline, l’Holo-transferrine et la pénicilline-streptomycine doivent être ajoutées fraîches tout en préparant la solution 1x. Les facteurs de croissance doivent être constitués à 10 μg/mL et doivent être ajoutés chaque jour aux cellules (1 μL/mL de milieu). La composition du milieu de différenciation est de 0,1 mg/mL d’albumine sérique bovine, 62 ng/mL de progestérone, 16 μg/mL de putrescine, 5 μg/mL d’insuline, 50 μg/mL de Holo-transferrine, 5 ng/mL de sélénite de sodium, 1x pénicilline-streptomycine, 400 ng/mL de triiodothyronine, 400 ng/mL L-thyroxine, et 0,5% de sérum bovin fœtal dans le DMEM avec un taux élevé de glucose et de pyruvate. La triiodothyronine et la L-thyroxine peuvent être constituées avec d’autres réactifs et stockées à 100X. L’insuline, la Holo-transférrine et la pénicilline-streptomycine doivent être ajoutées fraîches tout en préparant la solution 1x. - Pour préparer 50 mL de milieu de prolifération 100X, dissoudre 510 mg d’albumine sérique bovine dans 17 mL du milieu de Dulbecco, 310 μg de progestérone dans 31 μL d’éthanol, 80 mg de putrescine dans 500 μL de milieu de Dulbecco, 25 μg de sélénite de sodium dans 10 μL de milieu de Dulbecco et DMEM complet jusqu’à 50 mL
- Pour préparer 50 mL de solution 100X de milieu de différenciation, dissoudre également 2 mg de triiodothyronine dans 40 μL d’hydroxyde de sodium et 2 mg de L-thyroxine dans 40 μL d’hydroxyde de sodium, puis remplir la solution à 50 mL avec le milieu de Dulbecco. Filtrer la solution à l’aide d’une unité de filtration jetable stérile, aliquote, et stocker les aliquotes à-80 ° c.
- Pour préparer 250 mL de 1x milieu de prolifération/différenciation, mélanger 2,5 mL de solution 100X de milieu de prolifération/différenciation avec 12,5 mg de Holo-transferrine, 125 μL de 10 mg/mL d’insuline et 2,5 mL de 100X de pénicilline-streptomycine. Remplissez la solution à 250 mL avec le support de Dulbecco et filtrez-la à l’aide d’une unité de filtration jetable stérile.
NOTE: les facteurs de croissance doivent être ajoutés frais et directement à la culture cellulaire, pas à l’ensemble du lot de milieu reconstitué.
6. culture cellulaire
- Commencer par des cellules progénitrices d’oligodendrocytes suspendues dans le milieu de prolifération. Ensemencer ces cellules à une densité de 35 000 cellules/cm2 sur des surfaces plastiques revêtues de PDL (plats ou flacons, voir rubrique 4). Ajuster le volume du milieu de prolifération à 3 mL par 10 cm2 de la surface du substrat en plastique; un volume inférieur de milieu peut entraîner une agglutination cellulaire résultant de forces de tension superficielle, tandis qu’un volume plus élevé de milieu dans les plats peut provoquer des déversements.
- Ajouter tous les jours des facteurs de croissance (facteur de croissance dérivé des plaquettes et facteur de croissance de la fibronectine), en maintenant leur concentration à 10 ng/mL et en changeant la moitié du milieu de prolifération sur des jours alternatifs.
- Le troisième jour, détachez les cellules de la surface en plastique à l’aide d’une solution de détachement cellulaire douce (p. ex., accutase): retirer le milieu, laver 1x avec une solution saline tamponnée au phosphate, ajouter 1 mL de solution de détachement par zone de 20 cm2 , laisser le plat/flacon dans un incubateur à 37 ° c pendant 10 min, et Tapotez doucement jusqu’à ce que toutes les cellules se soient détachées (Regardez sous un microscope).
- Pipetter à l’aide d’une pointe de 200 μL pour briser les touffes dans des cellules individuelles, les transférer dans un tube de 50 mL, les diluer dans un milieu de prolifération, tourner à 0,2 x g pendant 10 min, jeter le surnageant, et Resuspendre le culot en milieu de prolifération pour obtenir un volume total de 1 ml. Comptez les cellules à l’aide d’un cytomètre.
- Laver les plaques de polydiméthylsiloxane fonctionnalisées par la fibronectine 2x, 15 min par lavage, avec un milieu de prolifération.
- Semences 35 000 cellules par plaque de polydiméthylsiloxane dans 700 μL de milieu de prolifération.
- Ajouter une construction de plasmide de H2B-GFP pour étiqueter l’histone H2B avec la protéine fluorescente verte.
NOTE: ici, 1,4 μL de mélange de transfection de CellLight H2B-GFP BacMam2 a été ajouté à chaque plaque (2 μL par 50 000 cellules). - Après 24 h, montez les échantillons de polydiméthylsiloxane avec des cellules à étirer sur le dispositif de déformation uniaxiale (comme illustré à la figure 2D). Changez le milieu dans tous les échantillons en milieu de différenciation.
- Pour filtrer les échantillons, mesurez la longueur du compartiment cellulaire non tendu (figure 3A) et tournez la vis du micromètre de scène pour augmenter la longueur du compartiment cellulaire de la quantité désirée (p. ex., 10%, voir la figure 3b). Laisser les échantillons de polydiméthylsiloxane étirés et non étirés dans l’incubateur à 37 ° c jusqu’à l’imagerie.
7. l’imagerie
- Allumez le microscope. Réglez la température de l’incubateur de microscope à 37 ° c.
- Amenez l’objectif à utiliser (immersion de l’huile 100X) à la position centrale car la tourelle objective ne sera pas accessible ultérieurement. Dévissez l’objectif et revissez-le ensemble avec un anneau objectif (figure 4a) afin que l’objectif puisse être rapproché des cellules. Si un objectif d’huile est utilisé ici, ajoutez une goutte d’huile à cette étape.
- Synthétiser à l’avance (via l’impression 3D ou l’usinage) un support en plastique ou en métal qui a deux caractéristiques importantes — une fenêtre inclinée et une étape (figure 4b).
Remarque: la fenêtre prend en charge une épaisseur #0 un rebord en verre qui tiendra le support tandis que le dispositif de déformation est dans un État inversé. La coupe angulaire aux bords de la fenêtre (figure 4D) permet à l’objectif de se rapprocher du rebord en verre. L’étape dans le support nous permet d’amener le polydiméthylsiloxane étiré plus bas, plus près de l’objectif. - Placer une bavette en verre (épaisseur #0, avec des dimensions de 25 mm x 25 mm ou 35 mm de diamètre) sur la surface supérieure du support en étalant la graisse sous vide à la périphérie de la fenêtre (figure 4C), et collez la fenêtre en plastique sur l’étape du microscope ( Figure 4D et figure 5A).
- Visser une étape de translation zsur l’étape du microscope et la déplacer vers la position zla plus haute (figure 5A).
- Retirer 500 μL du milieu de la plaque de polydiméthylsiloxane étirée à imagé et ajouter ce milieu sur le rebord en verre dans la fenêtre en plastique blanc.
- Détachez délicatement le compartiment carré de la plaque de polydiméthylsiloxane avec des pinces stériles.
- Tenez le dispositif de déformation en position verticale (cellules orientées vers le haut) au-dessus de la fenêtre en plastique blanc et inversez prudemment le dispositif de déformation de façon à laisser tomber tout support supplémentaire directement au milieu de la bavette en verre (figure 5B) (les cellules orientées vers le bas).
- Placez la partie inférieure du dispositif de déformation sur la phase z-translation avec le ruban adhésif double face (Figure 5C, D).
- Tout en regardant à travers l’oculaire sous fond clair, amenez lentement le dispositif de déformation vers le bas (figure 5e) (en abaissant la phase de traduction z) et déplacez l’objectif jusqu’à se concentrer sur les cellules.
- Effectuez cette étape très lentement, étape par étape. Si le dispositif de déformation presse trop sur la bavette, les cellules peuvent être compressées (provoquant leur mort) et si l’objectif presse trop sur la bavette, la lamelle peut se briser (causant le moyen de fuite et de déversement sur l’objectif).
- Scannez la plaque de polydiméthylsiloxane dans les directions xet ypour trouver une cellule qui a un noyau fluorescent (sous épifluorescence avec 488 nm d’excitation de longueur d’onde) et une morphologie cellulaire appropriée (sous fond clair).
- Si le déplacement latéral de l’étape du microscope n’affecte pas trop la focalisation verticale, sélectionnez plusieurs régions d’intérêts en utilisant une fonction multipoint sur le logiciel. Parfois, la focalisation est très sensible à tout déplacement latéral de la scène. Dans de tels cas, l’image d’une cellule à la fois. Marquez les positions x, yet zpour chaque cellule d’intérêt.
- Enregistrer des images à champ large (ou à trou ouvert) du noyau avec 488 nm d’excitation de longueur d’onde et de la cellule avec excitation de champ clair à des intervalles de 30 s par trame pour une durée totale d’au moins 30 min.
8. analyse des données
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Fluctuations nucléaires
- Ouvrez la séquence des images de noyau (figure 6A) dans un logiciel d’analyse d’image et le seuil des images de temps-lapse de noyau (par exemple, employez la commande de seuil dans ImageJ ou la commande de GRAYTHRESH dans le logiciel Matlab).
- Obtenez la zone du noyau (en pixels) en fonction du temps, tracez-la dans un logiciel de traçage de données (figure 6B) et adaptez un polynôme de troisième ordre aux données (figure 6C) (par exemple, utilisez l' analyse | Raccord | Polynomial fit dans Origin ou la commande polyfit dans le logiciel Matlab).
- Soustrayez la valeur du polynôme ajusté de la zone réelle (en pixels) pour chaque point de temps. Cette zone corrigée est connue sous le nom de zone résiduelle.
Remarque: ce processus élimine toute tendance croissante ou décroissante dans les données provenant des erreurs instrumentales et est appelée detendance.- Calculez le pourcentage de la zone résiduelle en divisant la zone résiduelle à chaque point de temps avec la valeur du polynôme ajusté à ce point de temps (Figure 6d).
- Calculez l’écart type de la série temporelle de la zone résiduelle. Cet écart-type indique l’amplitude des fluctuations nucléaires.
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Traçage de données et analyse statistique
- Calculer l’amplitude des fluctuations nucléaires comme une moyenne d’au moins 20 noyaux par condition.
- Effectuer un test statistique d’analyse de variance à sens unique avec la correction Bonferroni pour déterminer s’il existe une différence significative dans l’amplitude des fluctuations en fonction des conditions d’intérêt (par exemple, avec et sans souche appliquée).
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Representative Results
Des travaux récents visant à étudier l’effet de la contrainte de traction sur les oligodendrocytes10 ont montré qu’une souche de traction uniaxiale de 10% favorise la différenciation des cellules progénitrices d’oligodendrocytes par des changements globaux dans l’expression des gènes. Le mécanisme derrière ces changements dans l’expression génique peut être sondé par l’imagerie des paramètres subcellulaires, tels que la structure du cytosquelette, la localisation du facteur de transcription, la dynamique nucléaire et l’organisation de la chromatine. Cependant, la géométrie antérieure du substrat du polydiméthylsiloxane n’autorisait pas l’imagerie à une seule cellule à haute résolution. Comme décrit dans ce travail, la géométrie redessinée du substrat de polydiméthylsiloxane et la configuration d’imagerie minimisent la distance entre les cellules et l’objectif. Cela permet de capturer des images Time-lapse de noyaux cellulaires marqués fluorescemment à l’aide d’un objectif d’immersion à l’huile de 100 x (figure 6A).
Les fluctuations de la zone projetée nucléaire dépendent de l’état de différenciation des cellules11,12. Une comparaison des fluctuations nucléaires des cellules progénitrices d’oligodendrocytes et des oligodendrocytes différenciés en phase terminale a montré que ces dernières présentaient des fluctuations significativement plus faibles (figure 6e). Ensuite, on a comparé les fluctuations nucléaires des cellules progénitrices d’oligodendrocytes à 1 h, 24 h et 48 h après l’induction post-chimique de la différenciation avec et sans une souche de traction de 10%. Avec l’induction chimique seule, l’amplitude des fluctuations nucléaires a montré une diminution significative à 48 h, mais pas à 24 h (figure 6F). D’autre part, l’induction chimique avec une souche de traction de 10% a montré une diminution significative à 24 h, qui est restée constante, sans réduction supplémentaire à 48 h (figure 6G).
La géométrie du substrat et la configuration d’imagerie décrite dans ce document ont permis l’enregistrement de films haute résolution de cellules tendues. L’analyse subséquente de ces films démontre que la souche accélère l’amortissement des fluctuations nucléaires, qui est un marqueur de différenciation. Ces résultats donnent un aperçu du mécanisme par lequel la souche favorise la différenciation des oligodendrocytes. Des discussions ultérieures sur l’interprétation de ces résultats et des expériences futures sont décrites dans Makhija etal.
Figure 1: Conception et géométrie du polydiméthylsiloxane moule. (A) croquis du moule montrant toutes les dimensions en millimètres (cette esquisse a été générée par les technologies de Whits, Singapour). B) vue tridimensionnelle du moule (adapté de Makhija et al.11). L’encart montre une photo du moule. C) vue tridimensionnelle de la plaque de polydiméthylsiloxane fabriquée à l’aide du moule (adaptée de Makhija et al.11). L’encart montre une photo de la plaque de polydiméthylsiloxane. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: Préparation de l’échantillon. A) photo d’une plaque de polydiméthylsiloxane et d’un compartiment carré. Ble compartiment carré est placé sur le carré surélevé de la plaque de polydiméthylsiloxane. Son but est de contenir le milieu pour les cellules. (C) les plaques de polydiméthylsiloxane sont entreposées dans des plats en plastique de 150 mm de diamètre à l’aide de papier Parafilm pour empêcher le polydiméthylsiloxane de coller sur le plastique. (D) lorsque vous montez la plaque sur le dispositif de déformation, soutenez-la du fond en utilisant deux doigts pour éviter toute affaissement de la plaque. Si la plaque s’affasse encore un peu après le montage, augmentez la distance entre les bras du dispositif de déformation en tournant la phase de translation. À cette étape, la traduction de la scène ne doit pas induire de déformation dans la plaque de polydiméthylsiloxane. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: étirement de la cellule. (A) Mesurez la longueur initiale de la plaque entre les pinces, à l’aide d’une règle. (B) étirer la plaque en tournant la vis sur le stade de translation pour augmenter la longueur initiale de la plaque par le pourcentage désiré. X% d’augmentation de la longueur correspond à X% de la souche. Notez que, pour générer la souche souhaitée (X%) dans le compartiment de culture de cellules surélevées, la plaque principale doit être tendue par une quantité plus élevée (environ 2X%) en raison de la différence de leur épaisseur dans la géométrie de la plaque décrite. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4: Préparation à l’imagerie. (A) Amenez l’objectif 100X à la position centrale de la tourelle, dévissez l’objectif et vissez-le en même temps que l’anneau objectif. (B) croquis du support montrant toutes les dimensions en millimètres. (C) répartir la graisse à vide à la périphérie de la fenêtre du support, à l’aide d’une pointe de pipette, et placer un rebord en verre sur le dessus. Utilisez un verre de couverture avec une épaisseur #0 ou #1, pour permettre la mise au point avec l’objectif d’immersion de l’huile 100X. (D) Placer le support (1) au niveau du microscope (2). Rapprocher l’objectif (6) de l’huile (3) de la lèvre (5) collée au support, en utilisant de la graisse à vide (4). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5: configuration de l’imagerie au microscope. (A) Assemblez le stade de translation z(flèche jaune) et le support (flèche rouge) sur l’étage du microscope. (B) incliner le dispositif de déformation sur la platine du microscope de manière à laisser tomber tout support sur la vitre du support. Collez un ruban adhésif double face (flèche bleue) sur le dispositif de déformation qui s’accroche à la phase z-translation. (C) Placez le dispositif de déformation en position inversée, en le soutenant sur la platine z-translation. Les cellules doivent être alignées avec le rebord en verre du support en plastique. (D) la géométrie inversée du dispositif de déformation minimise la distance entre les cellules et l’objectif, facilitant ainsi l’imagerie à haute résolution (adaptée de Makhija et al.11). (E) vue latérale avant d’amener le dispositif de traction vers le bas (1); vue latérale après avoir amené le dispositif de traction vers le bas (2); vue de dessus après avoir ramené le dispositif de déformation (3). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6: Des images représentatives et des fluctuations de zone des données du noyau. Ce chiffre est adapté de Makhija et coll.11. (A) image typique d’un noyau étiqueté avec l’histone H2B étiqueté à la protéine fluorescente verte, et une cellule progénitrice différenciante d’oligodendrocytes. Le noyau est mis au point, tandis que les processus cellulaires sont hors de focus. B) séries chronologiques typiques d’une zone nucléaire (en pixels). (C) polynôme de troisième ordre adapté aux données. D) pourcentage de la série temporelle de fluctuation de la zone résiduelle. E) fluctuations de l’arête nucléaire des cellules progénitrices proliférantes d’oligodendrocytes et des oligodendrocytes à différenciation terminale. Ffluctuations de l’arête nucléaire à 1 h, 24 h et 48 h après la différenciation chimique sans déformation. (G) fluctuations de la zone nucléaire à 1 h, 24 h, et 48 h après la différenciation chimique avec une souche de traction de 10%. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Un dispositif a déjà été conçu pour l’application de souches de traction extracellulaires sur les cellules adhérentes. La conception du substrat du polydiméthylsiloxane dans ce travail était suffisante pour les dosages biochimiques, ainsi que pour l’imagerie à basse résolution des cellules étirées. Dans ce travail, le substrat a été remanié, et une nouvelle configuration d’imagerie qui facilite l’imagerie cellulaire sous-cellulaire à haute résolution a été introduite. Les avantages de ce système sont nombreux: il peut être construit en laboratoire en utilisant des composants simples, il est peu coûteux par rapport aux dispositifs de déformation commerciale (500 USD par dispositif de déformation cellulaire), et il est assez petit pour s’adapter à l’intérieur des incubateurs de culture tissulaire, ainsi que sur Microscopes. De plus, bien que le système d’imagerie ait été décrit ici avec la configuration du microscope inversé, il peut être facilement ajusté pour la configuration du microscope vertical.
Il y a quelques étapes critiques impliquées dans la préparation de l’échantillon et l’imagerie. Premièrement, les plaques de polydiméthylsiloxane et les compartiments carrés doivent être soigneusement nettoyés avant l’ensemencement des cellules (protocole étape 2,8) pour assurer la survie des cellules (comme le polydiméthylsiloxane non polymérisé est toxique pour les cellules). Deuxièmement, puisque le volume de fluide qui peut s’adapter à l’intérieur du compartiment carré est inférieur à 1 mL, il peut s’évaciner si l’échantillon est dans l’incubateur pendant quelques jours. Par conséquent, le milieu doit être vérifié tous les jours et réapprovisionné au besoin. En outre, la surface surélevée de la plaque de polydiméthylsiloxane peut être recouverte d’un plat en plastique de 60 mm de diamètre inversé pour minimiser l’évaporation. Troisièmement, il faut faire preuve d’une extrême prudence tout en déplaçant le dispositif de déformation sur le microscope vers le bas par l’intermédiaire de la phase z-translation pour rapprocher les cellules de la bavette en verre. Comprimer les cellules (même pendant un moment) entre le substrat de polydiméthylsiloxane et la lamelle de verre peut causer la mort cellulaire. Quatrièmement, les cellules mortes et les débris cellulaires peuvent rester collés à la lamelle de verre après que l’échantillon de polydiméthylsiloxane a été enlevé. Par conséquent, après l’imagerie, la bavette en verre doit être retirée de la graisse à vide et une lèvre fraîche doit être fixée avant de monter un nouvel échantillon.
Les limitations du dispositif de déformation sont que l’application du déplacement latéral de la scène ne peut pas être programmée pour effectuer une déformation cyclique ou rampée et qu’elle ne peut appliquer que des déformations uniaxiales. La limitation du substrat du polydiméthylsiloxane dans la géométrie décrite est qu’une souche supérieure à 25% peut provoquer une fracture du polydiméthylsiloxane.
Une modification future pour améliorer la conception du substrat du polydiméthylsiloxane pourrait être l’incorporation d’une grille sur la surface de la culture cellulaire. Cela permettrait de suivre la même cellule avant et après l’application de la souche de traction.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Tous les auteurs reconnaissent avec gratitude le soutien financier de la Fondation nationale de la recherche de Singapour par l’entremise du groupe de recherche interdisciplinaire de l’Alliance pour la recherche et la technologie (SMART) BioSystems et micromécanique (BioSyM) de Singapour-MIT. Les auteurs Dr. Jagielska et van Vliet reconnaissent également avec gratitude le financement et le soutien de la Fondation Saks-Kavanrire. Les auteurs remercient William ONG et le Dr Sing Yian Chew de l’Université technologique de Nanyang, à Singapour, pour avoir fourni des cellules progénitrices d’oligodendrocytes de rat pour certaines expériences décrites dans ce travail, et les auteurs remercient le Dr G. V. Shivashankar de Institut de mécanobiologie, Université nationale de Singapour, Singapour, pour les discussions sur les fluctuations des zones nucléaires.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary cells | Primary Oligodendrocyte Progenitor Cells isolated from Neonatal Rats were provided by Dr. S. Y. Chew's lab at Nanyang Technological University |
||
| Media | |||
| DMEM high glucose | Gibco | 11996-065-500ml | |
| Pen/Strep | Gibco | 15070-063-100ml | |
| FGF | Prospec | CYT-608-50ug | |
| PDGF | Prospec | CYT-776-10ug | |
| Media Stock components | |||
| BSA | Sigma | A9418-10G | |
| Progesterone | Sigma | P8783-1G | |
| Putrescine | Sigma | P5780-5G | |
| Sodium Selenite | Sigma | S5261-10G | |
| Tri-iodothyronine | Sigma | T6397-100MG | |
| Thyroxine | Sigma | T1775-100MG | |
| Holo-Transferrin | Sigma | T0665-500MG | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Mold and PDMS plate | |||
| PDMS - Dow Corning Sylgard 184 | Ellsworth | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Mold - Liquid Plastic | Smooth-On | Smooth Cast 310 - Trail Size | |
| Substrate Coatings | |||
| poly-D-lysine | Sigma | P6407-5MG | |
| Fibronectin | Sigma | F1141-2MG | |
| Histone staining | |||
| CellLigt H2B-GFP BacMam | Molecular Probes | C10594 | |
| Surface functionalization | |||
| APTES | Sigma | A3648-100ml | |
| BS3 | Covachem | 13306-100mg | |
| HEPES buffer pH 8.0 | Alfa Aesar | J63578-AK-250ml | |
| Cell detachment | |||
| Accutase | Invitrogen | A1110501-100ml |
References
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