Summary
Utilizzando un dispositivo progettato in precedenza per applicare la deformazione meccanica alle celle aderenti, questo documento descrive una geometria del substrato ridisegnata e un apparato personalizzato per l'imaging a cella singola ad alta risoluzione delle cellule tese con un obiettivo di immersione in olio 100x.
Abstract
Ceppo meccanico extracellulare è noto per suscitare risposte fenotipiche cellulari e ha rilevanza fisiologica in diversi sistemi tissutali. Per catturare l'effetto dello sforzo di trazione extracellulare applicato sulle popolazioni cellulari in vitro attraverso saggi biochimici, un dispositivo è stato precedentemente progettato che può essere fabbricato semplicemente ed è abbastanza piccolo da adattarsi all'interno di incubatori di coltura tissutale, così come sopra fasi del microscopio. Tuttavia, il precedente disegno del substrato di polidimetilsilossano non ha consentito l'imaging subcellulare ad alta risoluzione attraverso obiettivi di immersione in olio. Questo lavoro descrive una geometria ridisegnata del substrato di polidimetilsilossano e una configurazione di imaging personalizzata che insieme può facilitare l'imaging subcellulare ad alta risoluzione delle cellule vive mentre è sotto sforzo applicato. Questo substrato può essere utilizzato con lo stesso dispositivo progettato in precedenza e, quindi, ha gli stessi vantaggi di cui sopra, oltre a consentire l'imaging ottico ad alta risoluzione. Il design del substrato di polidimetilsilossano può essere migliorato incorporando una griglia che faciliterà il tracciamento della stessa cellula prima e dopo l'applicazione della deformazione. I risultati rappresentativi dimostrano l'imaging time-lapse ad alta risoluzione di nuclei con etichetta fluorescente all'interno di cellule tese catturate utilizzando il metodo descritto qui. Questi dati di dinamica nucleare forniscono approfondimenti sul meccanismo mediante il quale la deformazione a trazione applicata favorisce la differenziazione delle cellule progenitrici dell'oligodendrocyte.
Introduction
Cellule e tessuti nel corpo sono sottoposti a vari spunti meccanici, compresi i ceppi di trazione. Tuttavia, gli effetti di questi spunti sulla biologia delle cellule neurali non sono ancora stati studiati ampiamente e compresi completamente. Nel sistema nervoso centrale, le fonti di ceppo meccanico includono la crescita dello sviluppo1,2,3,4, processi fisiologici come piegatura del midollo spinale, sangue e liquido cerebrospinale pulsazioni e condizioni patologiche come trauma, gonfiore assone, cicatrici gliali o crescita tumorale5,6,7,8. Vale la pena di indagare su come la tensione di trazione influisce sulla differenziazione degli oligodendrociti e sulla successiva mielinazione degli assoni, che è un processo critico nel sistema nervoso centrale dei vertebrati. Utilizzando un dispositivo di deformazione personalizzato e piastre multipozzetto elastomeriche, i lavori precedenti9,10 hanno dimostrato che la deformazione uniassiale statica può aumentare la differenziazione dell'oligodendrocyte attraverso cambiamenti globali nell'espressione genica 10. per ottenere un'ulteriore comprensione dei meccanismi di meccanotrasduzione della deformazione in queste cellule, il precedente apparato sperimentale deve essere ridisegnato come descritto qui, per consentire l'imaging a fluorescenza ad alta risoluzione delle dinamiche nucleari in vita cellule sotto sforzo. In particolare, viene sviluppata una piastra di polidimetilsilossano monopozzetto e la configurazione di imaging è ridisegnata per consentire l'imaging time-lapse di cellule vive sotto sforzo utilizzando una lente di immersione a olio 100x. Per eliminare gli effetti ottici negativi del polidimetilsilossano nel percorso della luce, le cellule vengono immagine non attraverso la piastra di polidimetilsilossano, ma nella posizione invertita, attraverso il vetro di copertura che copre il compartimento cellulare. Utilizzando questo nuovo design di imaging, vengono registrate centinaia di filmati time-lapse ad alta risoluzione, di singoli nuclei di cellule all'interno di cellule aderenti integre, dove la cromatina è etichettata mediante l'etichettatura dell'istone H2B in proteine fluorescenti verdi. Questi film dimostrano che la tensione di trazione induce cambiamenti nella struttura della cromatina e nelle dinamiche che sono coerenti con la progressione della differenziazione dell'oligodendrocyte.
L'imaging a cellule vive sotto sforzo applicato è tecnicamente impegnativo e richiede un design del dispositivo compatibile con il sistema del microscopio. Il design personalizzato qui descritto presenta un'alternativa economica alle soluzioni commerciali. Le sue dimensioni consentono l'installazione su stadi del microscopio e l'imaging delle cellule vive ad alta risoluzione spaziale durante la deformazione applicata. La configurazione dell'imaging è progettata per facilitare l'imaging delle cellule in tempo reale utilizzando una lente di immersione a olio 100x con la massima chiarezza, attraverso il vetro di copertura, non attraverso lo strato di piastra in polidimetilsilossano che altrimenti diminuisce la qualità dell'immagine ed è comune nella maggior parte configurazioni di imaging sotto sforzo. Il dispositivo, con una piastra montata contenente celle, può anche essere conservato facilmente nell'incubatrice. Questo dispositivo è progettato per applicare la deformazione uniassiale a substrati che facilitano la coltura delle cellule aderenti e mantengono una deformazione stabile e uniforme in più giorni. La configurazione descritta qui può essere utilizzata per l'imaging ad alta risoluzione di vari tipi di cellule aderenti sotto sforzo, rendendolo applicabile agli studi di meccanotrasduzione in molti campi della meccanobiologia cellulare.
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Protocol
1. progettazione dello stampo a singolo pozzetto in polidimetilsilossano per immagini ad alta risoluzione
Nota: lo stampo per la produzione di lastre di polidimetilsilossano è stato progettato con le seguenti caratteristiche per consentire l'imaging con una lente di immersione a olio 100x e una corretta misura nel dispositivo di deformazione personalizzato-Build (Figura 1a, B).
- Mantenere le dimensioni complessive della piastra in modo che si adatti ai morsetti del dispositivo di deformazione.
Nota: sono 60 mm x 73 mm. - Fare un compartimento di celle o bene che è significativamente più piccolo delle dimensioni laterali della piastra intera, per evitare archi (curvatura fuori piano) effetti che si verificano ai bordi sbloccati della piastra polidimetilsilossano durante la deformazione applicata.
Nota: il comparto è stato progettato come quadrato da 23 mm x 23 mm. - Mantenere la profondità del comparto cellulare il più minimale possibile (non più di 80 μm), per consentire la messa a fuoco con l'obiettivo di immersione dell'olio 100x attraverso il vetro di copertura posto sopra il compartimento, ma renderlo sufficiente a contenere i supporti ed evitare di contattare o spremendo le cellule.
- Sollevare il compartimento cellulare su un quadrato con un'altezza di 3 mm, per avvicinare le cellule alla lente nella configurazione del microscopio invertito per consentire una facile messa a fuoco.
Nota: gli stampi con le caratteristiche di cui sopra possono essere fabbricati da molte tecniche tra cui, ad esempio, alluminio fresato. In alternativa, gli stampi master possono anche essere assemblati utilizzando fogli acrilici tagliati con un cutter laser, coperchio di vetro #0 per il vano cellulare, e super colla. Questo stampo principale è usato per fare una impronta di polidimetilsilossano, che viene poi utilizzato per fare stampi di lavoro utilizzando una resina di colata.
2. fabbricazione di lastre di polidimetilsilossano monopozzetto e compartimenti quadrati
- Miscelare la base di polidimetilsilossano e l'agente polimerizzante in un rapporto di 20:1 (in peso) in una tazza monouso. Pesare un totale di 20 g di polidimetilsilossano per stampo (per la fabbricazione di una piastra di polidimetilsilossano) e 150 g di polidimetilsilossano per 150 mm di diametro in plastica (per realizzare un lotto di scomparti quadrati).
- Lasciare il mix di polidimetilsilossano in un degasaggio vuoto a-0,8 bar per 30 minuti (o fino a quando tutte le bolle vengono rimosse).
- Versare il mix di polidimetilsilossano negli stampi (per le piastre) o in piatti di plastica 150 mm (per i compartimenti quadrati).
- Rimuovere eventuali bolle aggiuntive in questa fase, sia soffiando aria (per bocca) o Degassando gli stampi/piatti riempiti di polydimethylsiloxane di nuovo a-0,8 bar vuoto per 30 min.
- Lasciare gli stampi/piatti in un forno a 80 ° c su un tavolo di livellamento per 2 h.
- Rimuovere accuratamente gli stampi/i piatti dal forno e farli raffreddare a temperatura ambiente. Staccare delicatamente il polidimetilsilossano polimerizzato dopo aver tagliato accuratamente i bordi con una lama (Figura 1C).
- Sul polidimetilsilossano di diametro 150 mm, disegna una griglia di 2 cm x 2 cm con un pennarello. All'interno di ogni quadrato, disegna un quadrato di 1 cm x 1 cm, lasciando un margine di 0,5 cm su tutti i lati. Utilizzando una lama, tagliare accuratamente lungo le linee per ottenere compartimenti quadrati (Figura 2a).
- Pulire le piastre di polidimetilsilossano/compartimenti quadrati incubandole in 100% acetone per 4 h, seguita da 100% etanolo per 4 h, seguita da acqua in autoclave per 4 h.
- Posizionare le piastre/scomparti quadrati su carta di supporto pellicola di paraffina (non la pellicola di paraffina ma la carta) all'interno di un piatto di plastica diametro 150 mm (Figura 2C).
- Lasciare la piastra di polidimetilsilossano nel forno 80 ° c per asciugare per 4 h.
- Sigillare i piatti di 150 mm di diametro contenenti lastre di polidimetilsilossano e quadrati di contenitori con pellicola di paraffina, e conservarli in una stanza fredda fino a nuovo uso.
3. funzionalizzazione delle piastre di polidimetilsilossano
- Rimuovere la pellicola di paraffina, rimuovere il coperchio della piastra di plastica e posizionare le piastre di polidimetilsilossano e i compartimenti quadrati sotto la luce ultravioletta per 30 minuti.
- Trattamento al plasma (a 150 W per 5 min) le piastre di polidimetilsilossano (con il compartimento cellulare rivolto verso l'alto) senza i compartimenti quadrati, per rendere la superficie della coltura idrofila.
- Posizionare immediatamente i compartimenti quadrati sulla superficie trattata al plasma (Figura 2B) e premere manualmente per attaccare temporaneamente i due.
Nota: non plasma-trattare i compartimenti quadrati, altrimenti si attaccano fortemente alla piastra polidimetilsilossano e non si staccano facilmente quando devono essere staccati durante l'imaging. - Aggiungere 200 μL di 100 mM (3-amminopropil) trietossisilano al pozzo per 2 h per introdurre – NH2 gruppi alla superficie del polidimetilsilossano. Per effettuare una soluzione di 100 mM, sciogliere 234 μL di trietossisilano puro (3-amminopropil) in 10 mL di acqua. Dopo un'incubazione di 2 ore, lavare i pozzetti 3x con acqua deionizzata.
- Pesare 2 mg del CROSSLINKER molecolare bissulfosuccinimidyl suberato e dissolverlo in 700 μl di 1 M (4-(2-idrossietil) -1-piperazineetano solfonico acid buffer (pH 8,0) e 2,8 ml di acqua.
Nota: questo darà una soluzione di 1 mM di bissulfosuccinimidil suberato in 200 mM (4-(2-idrossietil) -1-piperazineethane acido sulfonico tampone. Si noti che un buffer di concentrazione di 50 mM funziona anche bene.- Aggiungere 135 μL di questa soluzione e 15 μL di fibronectina 1 mg/mL al pozzo in ogni piastra di polidimetilsilossano per 4 ore a temperatura ambiente.
- Lavare 3x con soluzione salina tamponata con fosfato. Aggiungere 500 μL di soluzione salina tamponata con fosfato al pozzo. Coprire il piatto di diametro 150 mm contenente il polidimetilsilossano con pellicola di paraffina e conservarlo in una stanza fredda, fino a ulteriore utilizzo.
4. funzionalizzazione di piatti di plastica e palloni
- Incubare piatti di plastica e flaconi con una soluzione di 5 μg/mL di poli-D-lisina (PDL, in acqua sterile) per 1 h. aggiungere 1,5 mL di questa soluzione (ligand) per piatto di diametro 35 mm, 3 mL di esso per piatto di diametro 60 mm e 10 mL per flacone di coltura da 75 cm2 .
- Lavare i piatti e i flaconi 2x con acqua sterile.
- Lasciare asciugare nel mobile di biosicurezza per 1 h (o fino a secco) e conservarli nella stanza fredda a 4 ° c fino a nuovo uso.
5. il mezzo di proliferazione e differenziazione per le cellule progenitrici dell'oligodendrocyte murina
- Preparare 50 mL di soluzioni 100x del mezzo di proliferazione e differenziazione, fare aliquote di 2,5 mL e conservarli a-80 ° c.
Nota: la composizione del mezzo di proliferazione è 0,1 mg/mL di albumina sierica bovina, 62 ng/mL di progesterone, 16 μg/mL di putrescina, 5 μg/mL di insulina, 50 μg/mL Holo-transferrina, 5 ng/mL di selenito di sodio, 1x penicillina-streptomicina, 10 ng/mL fattore di crescita del fibroblasto 10 ng/mL nel mezzo di Dulbecco modificato di Eagle (DMEM) con alto glucosio e piruvato. Mentre l'albumina sierica bovina, il progesterone, la putrescina e il selenito di sodio possono essere costituiti e conservati a 100x, l'insulina, l'Holo-transferrina e la penicillina-streptomicina devono essere aggiunte fresche durante la preparazione della soluzione 1x. I fattori di crescita devono essere costituiti a 10 μg/mL e devono essere aggiunti freschi alle cellule ogni giorno (1 μL/mL di mezzo). La composizione del mezzo di differenziazione è 0,1 mg/mL di albumina sierica bovina, 62 ng/mL progesterone, 16 μg/mL di putrescina, 5 μg/mL di insulina, 50 μg/mL di Holo-transferrina, 5 ng/mL di selenito di sodio, 1x penicillina-streptomicina, 400 ng/mL triiodotironina, 400 ng/mL L-tiroxina, e 0,5% di siero bovino fetale in DMEM con alto glucosio e piruvato. Triiodotironina e L-tiroxina possono essere costituiti con altri reagenti e conservati a 100x. L'insulina, l'Holo-transferrina e la penicillina-streptomicina devono essere aggiunte fresche durante la preparazione della soluzione 1x. - Per la preparazione di 50 mL di mezzo di proliferazione 100x, sciogliere 510 mg di albumina sierica bovina in 17 mL di medium di Dulbecco, 310 μg di progesterone in 31 μL di etanolo, 80 mg di putrescina in 500 μL di medium di Dulbecco, 25 μg di selenito di sodio in 10 μL di medium di Dulbecco e DMEM completo fino a 50 mL
- Per la preparazione di 50 mL di soluzione 100x di mezzo di differenziazione, sciogliere inoltre 2 mg di triiodotironina in 40 μL di idrossido di sodio e 2 mg di L-tiroxina in 40 μL di idrossido di sodio, quindi riempire la soluzione a 50 mL con il mezzo di Dulbecco. Filtrare la soluzione attraverso un'unità filtrante sterile monouso, aliquota e conservare le aliquote a-80 ° c.
- Per la preparazione di 250 mL di 1x mezzo di proliferazione/differenziazione, mescolare 2,5 mL di soluzione 100x di mezzo di proliferazione/differenziazione con 12,5 mg di Holo-transferrina, 125 μL di 10 mg/mL di insulina e 2,5 mL di 100x penicillina-streptomicina. Riempire la soluzione a 250 mL con il mezzo di Dulbecco e filtrarla attraverso un'unità filtrante sterile monouso.
Nota: i fattori di crescita devono essere aggiunti freschi e direttamente alla coltura cellulare, non all'intero lotto di mezzo ricostituito.
6. coltura cellulare
- Iniziare con cellule progenitrici oligodendrocyte sospese in mezzo di proliferazione. Semina queste cellule ad una densità di 35.000 cellule/cm2 su superfici plastiche rivestite in PDL (piatti o flaconi, vedere paragrafo 4). Regolare il volume del mezzo di proliferazione a 3 mL per 10 cm2 di superficie di substrato plastico; un volume più basso di mezzo può portare a aggregazione cellulare derivante da forze di tensione superficiale, mentre un volume più elevato di mezzo nei piatti può causare fuoriuscita.
- Aggiungere i fattori di crescita (fattore di crescita derivato dalle piastrine e fattore di crescita della fibronectina) ogni giorno, mantenendo la loro concentrazione a 10 ng/mL e cambiare la metà del mezzo di proliferazione nei giorni alternati.
- Il terzo giorno, staccare le cellule dalla superficie plastica utilizzando una soluzione di distacco delle cellule delicato (ad esempio, accutase): rimuovere il mezzo, lavare 1x con soluzione salina tamponata con fosfato, aggiungere 1 mL di soluzione di distacco per 20 cm2 area, lasciare il piatto/pallone in un incubatore a 37 ° c per 10 minuti, e toccare delicatamente fino a quando tutte le cellule si sono staccate (guardare sotto un microscopio).
- Pipettare con una punta da 200 μL per rompere i grumi in cellule singole, trasferirli in un tubo da 50 mL, diluirli in un mezzo di proliferazione, girare a 0,2 x g per 10 min, scartare il surnatante e risospendere il pellet nel mezzo di proliferazione per fare un volume totale di 1 ml. Conta le cellule usando un citometro.
- Lavare le piastre in polidimetilsilossano funzionalizzate con fibronectina 2x, 15 min per lavaggio, con mezzo di proliferazione.
- Seme 35.000 cellule per piastra di polidimetilsilossano in 700 μL di mezzo di proliferazione.
- Aggiungere un costrutto plasmide di H2B-GFP per l'etichettatura istone H2B con proteina verde fluorescente.
Nota: qui sono stati aggiunti 1,4 μL di miscela di transfezione CellLight H2B-GFP BacMam2 per ogni lastra (2 μL per 50.000 cellule). - Dopo 24 h, montare i campioni di polidimetilsilossano con le cellule da allungare sul dispositivo di deformazione uniassiale (come mostrato nella Figura 2D). Cambiare il mezzo in tutti i campioni al mezzo di differenziazione.
- Per filtrare i campioni, misurare la lunghezza del compartimento della cella non tesa (Figura 3A) e ruotare la vite micrometrica dello stage per aumentare la lunghezza del compartimento cellulare per la quantità desiderata (ad esempio, 10%, vedere Figura 3B). Lasciare i campioni di polidimetilsilossano allungato e non allungato nell'incubatore a 37 ° c fino all'imaging.
7. l'imaging
- Accendi il microscopio. Impostare la temperatura dell'incubatore del microscopio a 37 ° c.
- Portare l'obiettivo da utilizzare (100x immersione in olio) alla posizione centrale come la torretta obiettivo non sarà accessibile in seguito. Svitare l'obiettivo e avvitarlo di nuovo insieme ad un anello obiettivo (Figura 4a) in modo che l'obiettivo può essere avvicinato alle cellule. Se si utilizza un obiettivo petrolifero, aggiungere una goccia di olio in questo passaggio.
- Sintetizzare in anticipo (attraverso la stampa 3D o la lavorazione) un supporto in plastica o metallo che ha due caratteristiche importanti-una finestra angolata e un passo (Figura 4B).
Nota: la finestra supporta uno spessore #0 vetrino coprioggetti in vetro che terrà il supporto mentre il dispositivo di deformazione è in uno stato invertito. Il taglio angolato ai bordi della finestra (Figura 4D) consente all'obiettivo di avvicinarsi al vetrino coprioggetti in vetro. Il passo nel supporto ci permette di portare il polidimetilsilossano allungato più in basso, più vicino all'obiettivo. - Collocare un vetrino coprioggetti in vetro (spessore #0, con dimensioni di 25 mm x 25 mm o 35 mm di diametro) sulla superficie superiore del supporto, diffondendo il grasso sotto vuoto alla periferia della finestra (Figura 4c) e incollando la finestra di plastica sulla fase del microscopio ( Figura 4D e Figura 5a).
- Avvitare una fase di traslazione zsulla fase del microscopio e spostarla nella posizione zpiù in alto (Figura 5a).
- Rimuovere 500 μL di mezzo dalla lastra di polidimetilsilossano allungata da imbiancare e aggiungere questo mezzo sul vetrino coprioggetti in vetro nella finestra di plastica bianca.
- Staccare con cautela il compartimento quadrato dalla piastra di polidimetilsilossano con pinzette sterili.
- Tenere il dispositivo di deformazione in posizione eretta (celle rivolte verso l'alto) sopra la finestra di plastica bianca e invertire con cautela il dispositivo di deformazione in modo da lasciare qualsiasi goccia media in più direttamente al centro del vetrino coprioggetti (Figura 5b) (celle rivolte verso il basso).
- Posizionare la parte inferiore del dispositivo di deformazione sullo stadio di traslazione zcon il nastro biadesivo (Figura 5C, D).
- Mentre si guarda attraverso l'oculare sotto il campo chiaro, lentamente portare il dispositivo di deformazione verso il basso (Figura 5E) (abbassando la fase di traslazione z) e spostare l'obiettivo fino a concentrarsi sulle cellule.
- Eseguire questo passaggio molto lentamente, passo dopo passo. Se il dispositivo di deformazione preme troppo sul vetrino coprioggetti, le cellule possono ottenere compresso (causando loro di morire) e se l'obiettivo preme troppo sul vetrino coprioggetti, il vetrino coprioggetti può rompere (causando medio a perdita e versare sull'obiettivo).
- Scansionare la piastra di polidimetilsilossano in direzioni xe yper trovare una cellula che ha un nucleo fluorescente (sotto epifluorescenza con 488 nm di eccitazione della lunghezza d'onda) e una morfologia cellulare appropriata (sotto campo chiaro).
- Se lo spostamento laterale della fase del microscopio non influisce eccessivamente sulla messa a fuoco verticale, selezionare più aree di interesse utilizzando una funzione multipunto sul software. A volte, la messa a fuoco è molto sensibile a qualsiasi spostamento laterale del palco. In questi casi, immagine una cella alla volta. Contrassegnare le posizioni x, ye zper ogni cella di interesse.
- Registrare immagini di ampio campo (o a foro aperto) del nucleo con 488 nm di eccitazione della lunghezza d'onda e della cella con eccitazione campo chiaro ad intervalli di 30 s per fotogramma per una durata complessiva di almeno 30 minuti.
8. analisi dei dati
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Fluttuazioni nucleari
- Aprire la sequenza delle immagini del nucleo (Figura 6a) in un software di analisi delle immagini e la soglia delle immagini di time-lapse nucleo (ad esempio, utilizzare il comando Threshold in ImageJ o il comando GRAYTHRESH nel software Matlab).
- Ottenere l'area del nucleo (in pixel) in funzione del tempo, tracciarla in un software di stampa dati (Figura 6b) e adattare un terzo ordine polinomiale ai dati (Figura 6C) (ad esempio, utilizzare l' analisi | Fitting | Comando di adattamento polinomiale in Origin o il comando Polyfit nel software Matlab).
- Sottrarre il valore del polinomio montato dall'area effettiva (in pixel) per ogni punto temporale. Questa area corretta è nota come area residua.
Nota: questo processo rimuove qualsiasi tendenza crescente o decrescente nei dati provenienti da errori strumentali e viene chiamato detrending.- Calcolare la percentuale di area residua dividendo l'area residua ad ogni punto temporale con il valore del polinomio montato in quel punto temporale (Figura 6D).
- Calcolare la deviazione standard della serie temporale residua dell'area. Questa deviazione standard denota l'ampiezza delle fluttuazioni nucleari.
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Tracciatura dati e analisi statistica
- Calcolare l'ampiezza delle fluttuazioni nucleari come media di almeno 20 nuclei per condizione.
- Condurre un test statistico di analisi di varianza unidirezionale con correzione Bonferroni per determinare se vi sia una differenza significativa nell'ampiezza delle fluttuazioni in funzione delle condizioni di interesse (ad esempio, con e senza deformazione applicata).
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Representative Results
I recenti lavori volti a indagare l'effetto della deformazione a trazione sugli oligodendrociti10 hanno mostrato che un ceppo di trazione uniassiale del 10% promuove la differenziazione delle cellule progenitrici dell'oligodendrocyte mediante cambiamenti globali nell'espressione genica. Il meccanismo dietro questi cambiamenti nell'espressione genica può essere sondato attraverso l'imaging dei parametri subcellulari, come la struttura del citoscheletro, la localizzazione del fattore di trascrizione, la dinamica nucleare e l'organizzazione della cromatina. Tuttavia, la precedente geometria del substrato di polidimetilsilossano non ha consentito l'imaging a cella singola ad alta risoluzione. Come descritto in questo lavoro, la geometria ridisegnata del substrato di polidimetilsilossano e la configurazione dell'imaging minimizzò la distanza tra le cellule e l'obiettivo. Ciò consente di catturare immagini time-lapse di nuclei cellulari con etichetta fluorescente utilizzando un obiettivo di immersione in olio 100x (Figura 6a).
Le fluttuazioni nell'area proiettata nucleare dipendono dallo stato di differenziazione delle cellule11,12. Un confronto tra le fluttuazioni nucleari delle cellule progenitrici dell'oligodendrocyte e quello degli oligodendrociti terminalmente differenziati hanno mostrato che questi ultimi hanno fluttuazioni significativamente inferiori (Figura 6E). Successivamente, sono state confrontate le fluttuazioni nucleari delle cellule progenitrici dell'oligodendrocyte a 1 h, 24 h e 48 h di induzione post-chimica di differenziazione con e senza una tensione di trazione del 10%. Con l'induzione chimica da sola, l'ampiezza delle fluttuazioni nucleari ha mostrato una diminuzione significativa a 48 h ma non a 24 h (Figura 6F). Dall'altro lato, l'induzione chimica insieme a una tensione di trazione del 10% ha mostrato una diminuzione significativa a 24 ore, che è rimasta costante, senza ulteriore riduzione a 48 h (Figura 6g).
La geometria del substrato e la configurazione di imaging descritta in questo documento consentiva la registrazione di filmati ad alta risoluzione di celle tese. L'analisi successiva di questi film ha dimostrato che la deformazione accelera lo smorzamento delle fluttuazioni nucleari, che è un marcatore di differenziazione. Questi risultati forniscono informazioni sul meccanismo mediante il quale la deformazione promuove la differenziazione dell'oligodendrocyte. Ulteriori discussioni sull'interpretazione di questi risultati e sugli esperimenti futuri sono descritte in Makhija et al.13.
Figura 1: Progettazione e geometria del polidimetilsilossano muffa. (A) schizzo dello stampo che Mostra tutte le dimensioni in millimetri (questo schizzo è stato generato da Whits Technologies, Singapore). (B) vista tridimensionale dello stampo (adattato da Makhija et al.11). Inset Mostra una foto dello stampo. (C) vista tridimensionale della lastra di polidimetilsilossano fabbricata utilizzando lo stampo (adattato da Makhija et al.11). Inset Mostra una foto della lastra di polidimetilsilossano. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 2: Preparazione del campione. A) foto di una lastra di polidimetilsilossano e di un compartimento quadrato. B) il compartimento quadrato è collocato sul quadrato rialzato sulla lastra di polidimetilsilossano. Il suo scopo è quello di contenere il mezzo per le cellule. C) le piastre di polidimetilsilossano sono conservate in piatti di plastica di diametro 150 mm utilizzando carta parafilm per evitare che il polidimetilsilossano si attacchi sulla plastica. (D) durante il montaggio della piastra sul dispositivo di deformazione, sostenerlo dal basso utilizzando due dita per evitare qualsiasi cedimento della piastra. Se la piastra si ferma un po' dopo il montaggio, aumentare la distanza tra i bracci del dispositivo di deformazione girando la fase di traduzione. A questo punto, la traduzione dello stadio non deve indurre ceppo nella piastra di polidimetilsilossano. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 3: allungamento della cella. (A) misurare la lunghezza iniziale della piastra tra i morsetti, utilizzando un righello. (B) allungare la piastra ruotando la vite sulla fase di traslazione per aumentare la lunghezza della piastra iniziale per la percentuale desiderata. L'aumento della lunghezza x% corrisponde all'X% della deformazione. Si noti che, per generare la deformazione desiderata (X%) nel compartimento della coltura cellulare sollevato, la piastra principale deve essere tesa da una quantità superiore (circa 2X%) a causa della differenza di spessore nella geometria della piastra descritta. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 4: Preparazione per l'imaging. (A) portare l'obiettivo 100x alla posizione centrale nella torretta, svitare l'obiettivo e avvitarlo di nuovo insieme all'anello obiettivo. (B) schizzo del supporto che Mostra tutte le dimensioni in millimetri. (C) stendere il grasso sottovuoto alla periferia della finestra del supporto, utilizzando una punta di pipetta, e posizionare un vetrino coprioggetti in vetro sulla parte superiore. Utilizzare un vetro di copertura con spessore #0 o #1, per consentire la messa a fuoco con l'obiettivo di immersione dell'olio 100x. (D) Posizionare il supporto (1) sullo stadio del microscopio (2). Portare l'olio (6) obiettivo (3) più vicino al vetrino coprioggetti (5) che è attaccato al supporto, utilizzando grasso sottovuoto (4). Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 5: impostazione dell'imaging al microscopio. (A) assemblare lo stadio di traslazione z(freccia gialla) e il supporto (freccia rossa) sullo stadio del microscopio. (B) inclinare il dispositivo di deformazione sullo stadio del microscopio in modo da lasciare qualsiasi goccia media sul vetrino coprioggetti di vetro del supporto. Attaccare un nastro biadesivo (freccia blu) sul dispositivo di deformazione che si attacca alla fase di conversione z. (C) Collocare il dispositivo di deformazione in posizione invertita, supportandolo sulla fase di traslazione z. Le celle devono essere allineate con il coprioggetto in vetro del supporto in plastica. D) la geometria invertita del dispositivo di deformazione riduce al minimo la distanza tra le celle e l'obiettivo, facilitando così l'imaging ad alta risoluzione (adattato da Makhija et al.11). E) vista laterale prima di abbassare il dispositivo di deformazione (1); vista laterale dopo aver portato il dispositivo di deformazione verso il basso (2); vista dall'alto dopo aver portato il dispositivo di deformazione verso il basso (3). Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 6: Immagini rappresentative e le fluttuazioni di area dati del nucleo. Questa cifra è adattata da Makhija et al.11. (A) immagine tipica di un nucleo etichettato con istone H2B contrassegnato con proteina verde fluorescente, e una cellula progenitrice di oligodendrocyte differenziante. Il nucleo è a fuoco, mentre i processi cellulari sono fuori fuoco. B) serie temporale tipica di un'area nucleare (in pixel). C) polinomio terzo ordine adattato ai dati. (D) percentuale delle serie temporali di fluttuazione dell'area residua. E) fluttuazioni dei margini nucleari delle cellule progenitrici dell'oligodendrocyte proliferanti e degli oligodendrociti terminalmente differenziati. F) fluttuazioni del bordo nucleare a 1 h, 24 h e 48 h post-induzione della differenziazione chimica senza sforzo. G) fluttuazioni dell'area nucleare a 1 h, 24 h e 48 h post induzione della differenziazione chimica con il 10% di tensione di trazione. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
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Discussion
Un dispositivo ha precedentemente1 stato progettato per l'applicazione di sforzo di trazione extracellulare su cellule aderenti. Il disegno del substrato di polidimetilsilossano in quel lavoro era sufficiente per i saggi biochimici, così come l'imaging a bassa risoluzione delle cellule allungate. In questo lavoro, il substrato è stato ridisegnato e è stata introdotta una nuova configurazione di imaging che facilita l'imaging cellulare subcellulare ad alta risoluzione. I vantaggi di questo sistema sono numerosi: può essere costruito in laboratorio utilizzando componenti semplici, è poco costoso rispetto ai dispositivi di deformazione commerciali (500 USD per dispositivo di deformazione cellulare), ed è abbastanza piccolo per adattarsi all'interno incubatori di coltura dei tessuti, così come su Microscopi. Inoltre, anche se il sistema di imaging è stato descritto qui con la configurazione del microscopio invertito, può essere facilmente regolato per la configurazione del microscopio verticale.
Ci sono alcuni passaggi critici coinvolti nella preparazione dei campioni e nell'imaging. In primo luogo, le piastre di polidimetilsilossano e i compartimenti quadrati devono essere accuratamente puliti prima della semina cellulare (protocollo passo 2,8) per garantire la sopravvivenza delle cellule (come polidimetilsilossano non polimerizzato è tossico per le cellule). In secondo luogo, dal momento che il volume di fluido che può adattarsi all'interno del compartimento quadrato è inferiore a 1 mL, può evaporare se il campione è nell'incubatore per alcuni giorni. Pertanto, il mezzo deve essere controllato ogni giorno e rifornito quando necessario. Inoltre, l'area sollevata sulla piastra polidimetilsilossano può essere coperta con un piatto di plastica invertito di diametro di 60 mm per minimizzare l'evaporazione. In terzo luogo, è necessario prestare estrema cautela mentre si sposta il dispositivo di deformazione al microscopio verso il basso tramite la fase di traslazione zper avvicinare le celle al vetrino coprioggetti in vetro. Comprimendo le cellule (anche per un attimo) tra il substrato del polidimetilsilossano e il vetrino vetrato può causare la morte delle cellule. In quarto luogo, le cellule morte e i detriti cellulari possono rimanere attaccati al vetrino coprioggetti dopo che il campione di polidimetilsilossano è stato rimosso. Quindi, dopo l'imaging, il vetrino coprioggetti in vetro deve essere tirato fuori dal grasso sottovuoto e un coprioggetto fresco deve essere attaccato prima di montare un nuovo campione.
I limiti del dispositivo di deformazione sono che l'applicazione dello spostamento laterale della fase non può essere programmata per eseguire la deformazione ciclica o dilata e che può applicare solo ceppo uniassiale. La limitazione del substrato di polidimetilsilossano nella geometria descritta è che un ceppo superiore al 25% può causare una frattura del polidimetilsilossano.
Una futura modifica per migliorare la progettazione del substrato del polidimetilsilossano potrebbe essere l'incorporazione di una griglia sulla superficie della coltura cellulare. Ciò consentirebbe di tracciare la stessa cellula prima e dopo l'applicazione della tensione di trazione.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Tutti gli autori riconoscono con gratitudine il sostegno al finanziamento della National Research Foundation di Singapore attraverso il gruppo di ricerca interdisciplinare di Singapore-MIT Alliance for Research e Technology (SMART) BioSystems e Micromechanics (BioSyM). Gli autori Dr. Jagielska e Dr. van Vliet riconoscono con gratitudine anche il finanziamento e il sostegno della Fondazione Saks-Kavanaugh. Gli autori ringraziano William ONG e Dr. Sing Yian Chew della Nanyang Technological University, Singapore, per aver fornito cellule progenitrici del ratto oligodendrocyte per alcuni esperimenti descritti in questo lavoro, e gli autori ringraziano il dottor G. V. Shivashankar da Istituto di meccanobiologia, Università nazionale di Singapore, Singapore, per le discussioni sulle fluttuazioni dell'area nucleare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary cells | Primary Oligodendrocyte Progenitor Cells isolated from Neonatal Rats were provided by Dr. S. Y. Chew's lab at Nanyang Technological University |
||
| Media | |||
| DMEM high glucose | Gibco | 11996-065-500ml | |
| Pen/Strep | Gibco | 15070-063-100ml | |
| FGF | Prospec | CYT-608-50ug | |
| PDGF | Prospec | CYT-776-10ug | |
| Media Stock components | |||
| BSA | Sigma | A9418-10G | |
| Progesterone | Sigma | P8783-1G | |
| Putrescine | Sigma | P5780-5G | |
| Sodium Selenite | Sigma | S5261-10G | |
| Tri-iodothyronine | Sigma | T6397-100MG | |
| Thyroxine | Sigma | T1775-100MG | |
| Holo-Transferrin | Sigma | T0665-500MG | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Mold and PDMS plate | |||
| PDMS - Dow Corning Sylgard 184 | Ellsworth | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Mold - Liquid Plastic | Smooth-On | Smooth Cast 310 - Trail Size | |
| Substrate Coatings | |||
| poly-D-lysine | Sigma | P6407-5MG | |
| Fibronectin | Sigma | F1141-2MG | |
| Histone staining | |||
| CellLigt H2B-GFP BacMam | Molecular Probes | C10594 | |
| Surface functionalization | |||
| APTES | Sigma | A3648-100ml | |
| BS3 | Covachem | 13306-100mg | |
| HEPES buffer pH 8.0 | Alfa Aesar | J63578-AK-250ml | |
| Cell detachment | |||
| Accutase | Invitrogen | A1110501-100ml |
References
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