Summary
Utilizando un dispositivo previamente diseñado para aplicar la cepa mecánica a las células adherentes, este papel describe una geometría de sustrato rediseñado y un aparato personalizado para la imagen de célula única de alta resolución de células tensas con un objetivo de inmersión de aceite 100x.
Abstract
Se sabe que la cepa mecánica extracelular provoca respuestas fenotísicas celulares y tiene relevancia fisiológica en varios sistemas tisulares. Para capturar el efecto de la tensión de tracción extracelular aplicada en las poblaciones celulares in vitro a través de Ensayos bioquímicos, un dispositivo ha sido previamente diseñado que puede ser fabricado simplemente y es lo suficientemente pequeño para caber dentro de incubadoras de cultivo de tejido, así como en la parte superior de etapas del microscopio. Sin embargo, el diseño anterior del sustrato de polidimetilsiloxano no permitía la creación de imágenes subcelulares de alta resolución a través de objetivos de inmersión en aceite. Este trabajo describe una geometría rediseñada del sustrato de polidimetilsiloxano y una configuración de imágenes personalizada que, en conjunto, puede facilitar la toma de imágenes subcelulares de alta resolución de las células vivas bajo tensión aplicada. Este sustrato se puede utilizar con el mismo dispositivo diseñado anteriormente y, por lo tanto, tiene las mismas ventajas que se enumeran anteriormente, además de permitir la imagen óptica de alta resolución. El diseño del sustrato de polidimetilsiloxano se puede mejorar mediante la incorporación de una rejilla que facilitará el seguimiento de la misma célula antes y después de la aplicación de la cepa. Los resultados representativos demuestran la creación de imágenes en tiempo de lapso de alta resolución de núcleos etiquetados con fluorescencia dentro de las células tensas capturadas utilizando el método descrito aquí. Estos datos de dinámicas nucleares proporcionan información sobre el mecanismo mediante el cual la cepa de tracción aplicada promueve la diferenciación de las células progenitoras de oligodendrocitos.
Introduction
Las células y los tejidos en el cuerpo están sometidos a diversas señales mecánicas, incluyendo las cepas de tracción. Sin embargo, los efectos de estas señales en la biología de las células neuronales aún no se han estudiado extensamente y entendido completamente. En el sistema nervioso central, las fuentes de la cepa mecánica incluyen crecimiento del desarrollo1,2,3,4, procesos fisiológicos tales como flexión de la médula espinal, sangre y líquido cefalorraquídeo palpitaciones y afecciones patológicas como trauma, hinchazón de Axon, cicatrices gliales o crecimiento tumoral5,6,7,8. Vale la pena investigar cómo la tensión de tracción afecta a la diferenciación de oligodendrocitos y la posterior mielinización de los axones, que es un proceso crítico en el sistema nervioso central del vertebrado. Utilizando un dispositivo de deformación de diseño personalizado y placas de multipozo elastoméricos, las obras anteriores9,10 han demostrado que la cepa uniaxial estática puede aumentar la diferenciación de oligodendrocitos a través de cambios globales en la expresión génica 10. para comprender mejor los mecanismos de la mecanotransducción de cepas en estas células, se debe rediseñar el anterior aparato experimental como se describe aquí, para permitir la imagen de fluorescencia de alta resolución de la dinámica nuclear en la vida células bajo tensión. Específicamente, se desarrolla una placa de polidimetilsiloxano de un solo pozo, y se rediseña la configuración de imágenes para permitir la toma de imágenes de lapso de tiempo de las células vivas bajo tensión utilizando una lente de inmersión de aceite 100x. Para eliminar los efectos ópticos negativos de polidimetilsiloxano en la vía de la luz, las células se muestran no a través de la placa de polidimetilsiloxano, pero en la posición invertida, a través del vidrio de la cubierta que cubre el compartimiento de la célula. Utilizando este nuevo diseño de imágenes, se registran cientos de películas de lapso de tiempo de alta resolución, de núcleos celulares individuales dentro de las células adherentes intactas, donde la cromatina se etiqueta etiquetando la histona H2B a la proteína fluorescente verde. Estas películas demuestran que la tensión de tracción induce cambios en la estructura de la cromatina y la dinámica que son consistentes con la progresión de la diferenciación de oligodendrocitos.
La toma de imágenes de células vivas bajo tensión aplicada es técnicamente desafiante y requiere un diseño de dispositivo compatible con el sistema del microscopio. El diseño personalizado descrito aquí presenta una alternativa barata a las soluciones comerciales. Sus dimensiones permiten su instalación en etapas de microscopio e imágenes de células vivas a alta resolución espacial durante la deformación aplicada. La configuración de imágenes está diseñada para facilitar la toma de imágenes de células vivas utilizando una lente de inmersión de aceite de 100x con la mayor claridad, a través del vidrio de la cubierta, no a través de la capa de placa de polidimetilsiloxano que de otra manera disminuye la calidad de imagen y es común en la mayoría configuraciones de imágenes bajo tensión. El dispositivo, con una placa montada que contiene las células, también se puede almacenar fácilmente en la incubadora. Este dispositivo está diseñado para aplicar la cepa uniaxial a substratos que facilitan el cultivo de células adherentes y mantienen una tensión estable y uniforme durante varios días. La configuración descrita aquí se puede utilizar para la imagen de alta resolución de varios tipos de células adherentes bajo tensión, por lo que es aplicable a los estudios de mecanotransducción en muchos campos de la mecanobiología celular.
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Protocol
1. diseño del molde de polidimetilsiloxano de un solo pozo para imágenes de alta resolución
Nota: el molde para fabricar placas de polidimetilsiloxano está diseñado con las siguientes características para permitir la creación de imágenes con una lente de inmersión de aceite de 100x y un ajuste correcto en el dispositivo de deformación unitaria de construcción personalizada (figura 1A, B).
- Mantenga las dimensiones generales de la placa de tal manera que encaje en las abrazaderas del dispositivo de deformación unitaria.
Nota: aquí, son 60 mm x 73 mm. - Hacer un compartimento de células o bien que sea significativamente más pequeño que las dimensiones laterales de toda la placa, para evitar los efectos de arco (flexión fuera del plano) que ocurren en los bordes no sujetados de la placa de polidimetilsiloxano durante la cepa aplicada.
Nota: aquí, el compartimento fue diseñado como un cuadrado de 23 mm x 23 mm. - Mantenga la profundidad del compartimento de la célula tan mínima como sea posible (no más de 80 μm), para permitir enfocar con la lente de inmersión de aceite 100x a través del vidrio de la cubierta colocado en la parte superior del compartimiento, pero que sea lo suficientemente suficiente para contener medios y evitar el contacto o apretando las células.
- Levante el compartimento de la célula en un cuadrado con una altura de 3 mm, para acercar las celdas a la lente en la configuración del microscopio invertido para permitir un enfoque fácil.
Nota: los moldes con las características anteriores pueden ser fabricados por muchas técnicas, incluyendo, por ejemplo, aluminio molido. Alternativamente, los moldes maestros también se pueden ensamblar usando láminas de acrílico cortadas con un cortador láser, vidrio de la cubierta #0 para el compartimiento de la célula, y pegamento súper. Este molde maestro se utiliza para hacer una impresión de polidimetilsiloxano, que luego se utiliza para hacer moldes de trabajo utilizando una resina de fundición.
2. fabricación de placas de polidimetilsiloxano de un solo pozo y compartimentos cuadrados
- Mezclar la base de polidimetilsiloxano y el agente de curado en una proporción de 20:1 (en peso) en una taza desechable. Pesar un total de 20 g de polidimetilsiloxano por molde (para fabricar una placa de polidimetilsiloxano) y 150 g de polidimetilsiloxano por plato de plástico de diámetro 150 mm (para hacer un lote de compartimentos cuadrados).
- Deje la mezcla de polidimetilsiloxano en un desgasificador al vacío a-0,8 bar durante 30 min (o hasta que se eliminen todas las burbujas).
- Vierta la mezcla de polidimetilsiloxano en los moldes (para platos) o en platos plásticos de 150 mm (para compartimentos cuadrados).
- Quite cualquier burbuja adicional en esta etapa, ya sea soplando aire (por la boca) o desgasificar los moldes/platos rellenos de polidimetilsiloxano de nuevo a-0,8 bar de vacío durante 30 min.
- Deje los moldes/platos en un horno de 80 ° c en una mesa de nivelación durante 2 h.
- Retire con cuidado los moldes/platos del horno y déjelos enfriar a temperatura ambiente. Pelar suavemente el polidimetilsiloxano curado después de cortar cuidadosamente los bordes con una cuchilla (figura 1C).
- En el polidimetilsiloxano de 150 mm de diámetro, dibuje una rejilla de 2 cm x 2 cm con un marcador. Dentro de cada cuadrado, dibuja un cuadrado de 1 cm x 1 cm, dejando un margen de 0,5 cm en todos los lados. Utilizando una cuchilla, cortar cuidadosamente a lo largo de las líneas para obtener compartimentos cuadrados (figura 2A).
- Limpie las placas de polidimetilsiloxano/compartimentos cuadrados incubándolas en un 100% de acetona durante 4 h, seguida de un 100% de etanol durante 4 h, seguida de agua esterilizada en autoclave durante 4 h.
- Coloque las placas/compartimentos cuadrados en papel de respaldo de película de parafina (no en la película de parafina, sino en el papel) dentro de un plato de plástico de 150 mm de diámetro (figura 2C).
- Dejar secar la placa de polidimetilsiloxano en el horno de 80 ° c durante 4 h.
- Sellar los platos de 150 mm de diámetro que contengan placas de polidimetilsiloxano y cuadrados de contenedores con película de parafina, y almacenarlos en una sala fría hasta su uso posterior.
3. funcionalización de placas de polidimetilsiloxano
- Retire la película de parafina, retire la cubierta de la placa de plástico, y coloque las placas de polidimetilsiloxano y compartimentos cuadrados bajo luz ultravioleta durante 30 min.
- Plasma-tratar (a 150 W durante 5 min) las placas de polidimetilsiloxano (con el compartimento de la célula hacia arriba) sin los compartimentos cuadrados, para hacer la superficie de cultivo hidrófila.
- Coloque inmediatamente los compartimentos cuadrados sobre la superficie tratada con plasma (figura 2B) y presione manualmente para pegar los dos de forma temporal.
Nota: no tratar el plasma de los compartimentos cuadrados, o de lo contrario se adhieren fuertemente a la placa de polidimetilsiloxano y no se desprender fácilmente cuando se deben pelar durante la toma de imágenes. - Añadir 200 μL de 100 mM (3-aminopropil) Triethoxysilane al pozo durante 2 h para introducir – NH2 grupos a la superficie de polidimetilsiloxano. Para hacer una solución de 100 mM, disolver 234 μL de Triethoxysilane puro (3-aminopropil) en 10 mL de agua. Después de una incubación de 2 h, lavar los pozos 3x con agua desionizada.
- Pesar 2 mg de la reticulación molecular bissulfosuccinimidyl suberato y disolverlo en 700 μL de 1 M (4-(2-hidroxietil) -1-Tampón de piperazineetano de ácido sulfónico (pH 8,0) y 2,8 mL de agua.
Nota: Esto dará una solución de suberato de bissulfosuccinimidyl de 1 mM en 200 mM (4-(2-hidroxietil) -1-Tampón de ácido sulfónico piperazineetano. Tenga en cuenta que un búfer de concentración de 50 mM también funciona bien.- Añadir 135 μL de esta solución y 15 μL de 1 mg/mL de fibronectina al pozo en cada placa de polidimetilsiloxano durante 4 h a temperatura ambiente.
- Lave 3x con solución salina amortiguada con fosfato. Añadir 500 μL de solución salina tampón de fosfato al pozo. Cubra el plato de 150 mm de diámetro que contiene el polidimetilsiloxano con película de parafina y guárdelo en una sala fría, hasta su uso posterior.
4. la funcionalización de los platos y matraces plásticos
- Incubar los platos y frascos de plástico con una solución de 5 μg/mL de Poly-D-lisina (PDL, en agua estéril) durante 1 h. Añadir 1,5 mL de esta solución (ligand) por plato de 35 mm de diámetro, 3 mL de ella por plato de 60 mm de diámetro y 10 mL por frasco 75 cm2 cultivo.
- Lavar los platos y matraces 2x con agua estéril.
- Déjelos secar en el gabinete de bioseguridad durante 1 h (o hasta que estén secos) y guárdela en la sala fría a 4 ° c hasta su uso posterior.
5. medio de proliferación y diferenciación para las células progenitoras de oligodendrocitos murinos
- Preparar 50 mL de soluciones 100x del medio de proliferación y diferenciación, hacer alícuts de 2,5 mL, y almacenarlos a-80 ° c.
Nota: la composición del medio de proliferación es 0,1 mg/mL de albúmina sérica bovina, 62 ng/mL de progesterona, 16 μg/mL de putrescina, 5 μg/mL de insulina, 50 μg/mL de holo-Transferrin, 5 ng/mL de Selenite sódico, 1x penicilina-estreptomicina, 10 ng/mL factor, y 10 ng/mL de factor de crecimiento de fibroblastos en el medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con alta glucosa y piruvato. Mientras que la albúmina sérica bovina, la progesterona, la putrescina y la selenita sódica se pueden constituir y almacenar a 100x, la insulina, la holo-transferrina y la penicilina-estreptomicina deben añadirse frescas mientras se prepara la solución 1x. Los factores de crecimiento deben estar constituidos a 10 μg/mL y deben añadirse frescos a las células cada día (1 μL/mL de medio). La composición del medio de diferenciación es de 0,1 mg/mL de albúmina sérica bovina, 62 ng/mL de progesterona, 16 μg/mL de putrescina, 5 μg/mL de insulina, 50 μg/mL de holo-Transferrin, 5 ng/mL de Selenite sódica, 1x penicilina-estreptomicina, 400 ng/mL de triyodotironina, 400 ng/mL L-tiroxina, y 0,5% suero bovino fetal en DMEM con alta glucosa y piruvato. La triyodotironina y la L-tiroxina pueden constituirse con otros reactivos y almacenarse a 100x. La insulina, la holo-transferrina y la penicilina-estreptomicina se deben añadir frescas mientras se prepara la solución 1x. - Para la preparación de 50 mL de medio de proliferación 100x, disolver 510 mg de albúmina sérica bovina en 17 mL de medio de Dulbecco, 310 μg de progesterona en 31 μL de etanol, 80 mg de putrescina en 500 μL del medio de Dulbecco, 25 μg de selenita sódica en 10 μL de medio de Dulbecco , y el completo DMEM hasta 50 mL
- Para preparar 50 mL de solución 100x de medio de diferenciación, disuelva adicionalmente 2 mg de triyodotironina en 40 μL de hidróxido de sodio y 2 mg de L-tiroxina en 40 μL de hidróxido de sodio, luego llene la solución a 50 mL con el medio de Dulbecco. Filtre la solución a través de una unidad de filtro desechable estéril, alícuota y almacene las alícuotas a-80 ° c.
- Para preparar 250 mL de 1x proliferación/diferenciación medio, mezclar 2,5 mL de solución 100x de medio de proliferación/diferenciación con 12,5 mg de holo-Transferrin, 125 μL de 10 mg/mL de insulina, y 2,5 mL de 100x penicilina-streptomicina. Llene la solución a 250 mL con el medio de Dulbecco y filtre a través de una unidad de filtro desechable estéril.
Nota: los factores de crecimiento deben añadirse frescos y directamente al cultivo celular, no a todo el lote de medio reconstituido.
6. cultivo celular
- Comience con células progenitoras de oligodendrocitos suspendidas en medio de proliferación. Sembrar estas células a una densidad de 35.000 células/cm2 sobre superficies de plástico recubiertas por PDL (platos o matraces, ver sección 4). Ajustar el volumen del medio de proliferación a 3 mL por 10 cm2 de superficie de sustrato plástico; un volumen menor de medio puede conducir a la aglomeración celular derivada de las fuerzas de tensión superficial, mientras que un mayor volumen de medio en los platos puede causar derrames.
- Añadir factores de crecimiento (factor de crecimiento derivado de plaquetas y factor de crecimiento de la fibronectina) todos los días, manteniendo su concentración a 10 ng/mL y cambiar la mitad del medio de proliferación en días alternos.
- Al tercer día, separe las células de la superficie plástica utilizando una solución de desprendimiento de células suave (p. ej., accutasa): Extraiga el medio, lave 1X con solución salina amortiguada con fosfato, añada 1 mL de solución de desprendimiento por área de 20 cm2 , deje el plato/matraz en una incubadora a 37 ° c durante 10 min, y Tócala suavemente hasta que todas las células se hayan desprendido (mirar bajo un microscopio).
- Pipetear con una punta de 200 μL para romper grumos en células individuales, transferirlos a un tubo de 50 mL, diluir en medio de proliferación, girar a 0,2 x g durante 10 min, desechar el sobrenadante, y resuspendar el pellet en medio de proliferación para hacer un volumen total de 1 ml. Cuente las células usando un CITOMETRO.
- Lavar las placas de polidimetilsiloxano de fibronectina-funcionalizada 2x, 15 min por lavado, con medio de proliferación.
- Semilla 35.000 células por placa de polidimetilsiloxano en 700 μL de medio de proliferación.
- Añadir una construcción plásmido de H2B-GFP para el etiquetado de histona H2B con proteína fluorescente verde.
Nota: aquí, 1,4 μL de CellLight H2B-GFP BacMam2 se añadió una mezcla de transfección a cada placa (2 μL por 50.000 células). - Después de las 24 h, Monte las muestras de polidimetilsiloxano con células que se deben estirar en el dispositivo de deformación unitaria uniaxial (como se muestra en la Figura 2D). Cambiar el medio en todas las muestras a medio de diferenciación.
- Para colar las muestras, mida la longitud del compartimento de celdas sin tensión (figura 3a) y gire el tornillo del micrómetro de la etapa para aumentar la longitud del compartimento de la célula por la cantidad deseada (por ejemplo, 10%, ver figura 3B). Dejar las muestras de polidimetilsiloxano estiradas y sin estirar en la incubadora a 37 ° c hasta la toma de imágenes.
7. imágenes
- Encienda el microscopio. Ajuste la temperatura de la incubadora de microscopio a 37 ° c.
- Llevar el objetivo a ser utilizado (100x inmersión de aceite) a la posición central como la torreta objetiva no será accesible más adelante. Desenroscar el objetivo y atornillar de nuevo junto con un anillo objetivo (figura 4a) para que el objetivo puede ser acercado a las células. Si se utiliza un objetivo de aceite aquí, agregue una gota de aceite en este paso.
- Sintetizar de antemano (a través de la impresión 3D o mecanizado) un soporte de plástico o metal que tiene dos características importantes-una ventana en ángulo y un paso (Figura 4B).
Nota: la ventana soporta un espesor #0 cubierta de vidrio que sostenia el medio mientras el dispositivo de deformación está en estado invertido. El corte angular en los bordes de la ventana (Figura 4D) permite que el objetivo se acerque más a la cobertura de vidrio. El paso en el soporte nos permite acercar el polidimetilsiloxano estirado, más cerca del objetivo. - Colocar una tapa de vidrio (espesor #0, con dimensiones de 25 mm x 25 mm o 35 mm de diámetro) en la superficie superior del soporte extendiendo la grasa de vacío en la periferia de la ventana (figura 4C), y tape la ventana de plástico en la etapa del microscopio ( Figura 4D y figura 5A).
- Atornille una etapa de traslación zen la etapa del microscopio y muévase a la posición zsuperior (figura 5A).
- Retire 500 μL del medio de la placa de polidimetilsiloxano estirada para ser fotografiado y agregue este medio sobre el revestimiento de vidrio en la ventana de plástico blanco.
- Separe con cuidado el compartimento cuadrado de la placa de polidimetilsiloxano con pinzas estériles.
- Sujete el dispositivo de deformación unitaria en posición vertical (celdas hacia arriba) por encima de la ventana de plástico blanca e invierta con cuidado el dispositivo de deformación unitaria para permitir que cualquier gota de medio extra se caiga directamente en el centro del cobertor de vidrio (figura 5b) (células hacia abajo).
- Coloque la parte inferior del dispositivo de deformación unitaria en la etapa de traducción zcon la cinta de doble cara (figura 5C, D).
- Mientras mira a través del ocular bajo campo claro, baje lentamente el dispositivo de deformación unitaria (figura 5e) (bajando la etapa de traducción z) y mueva el objetivo hacia arriba para centrarse en las células.
- Realice este paso muy despacio, paso a paso. Si el dispositivo de deformación presiona demasiado en el cupo, las células pueden comprimirse (causando que mueran) y si el objetivo presiona demasiado sobre el cobertor, el cupo puede romperse (causando que el medio se filtre y derrame sobre el objetivo).
- Escanee la placa de polidimetilsiloxano en las direcciones xe y para encontrar una célula que tenga un núcleo fluorescente (bajo epifluorescencia con 488 nm de excitación de la longitud de onda) y una morfología celular apropiada (bajo campo claro).
- Si el desplazamiento lateral de la etapa del microscopio no afecta demasiado al enfoque vertical, seleccione varias regiones de intereses utilizando una entidad multipunto en el software. A veces, el enfoque es muy sensible a cualquier desplazamiento lateral de la etapa. En tales casos, la imagen de una celda a la vez. Marque las posiciones x, y y zpara cada celda de interés.
- Registre imágenes de campo amplio (o de orificio abierto) del núcleo con 488 nm de excitación de longitud de onda y de la célula con excitación de campo claro a intervalos de 30 s por fotograma para una duración total de al menos 30 min.
8. Análisis de datos
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Las fluctuaciones nucleares
- Abra la secuencia de imágenes del núcleo (figura 6A) en un software de análisis de imagen y umbral de las imágenes de lapso de tiempo del núcleo (por ejemplo, utilice el comando Threshold en ImageJ o el comando graythresh en el software MATLAB).
- Obtenga el área del núcleo (en píxeles) como una función del tiempo, compáplo en un software de trazado de datos (Figura 6B) y ajuste un polinomio de tercer orden a los datos (Figura 6C) (por ejemplo, utilice el análisis | Fitting | Comando Polynomial Fit en Origin o el comando polyfit en el software MATLAB).
- Reste el valor del polinomio ajustado del área real (en píxeles) para cada punto de tiempo. Esta área corregida se conoce como área residual.
Nota: este proceso elimina cualquier tendencia creciente o decreciente en los datos provenientes de errores instrumentales y se llama detrending.- Calcule el porcentaje de área residual dividiendo el área residual en cada punto de tiempo con el valor del polinomio ajustado en ese punto de tiempo (figura 6D).
- Calcule la desviación estándar de la serie temporal de área residual. Esta desviación estándar denota la amplitud de las fluctuaciones nucleares.
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El trazado de datos y el análisis estadístico
- Calcule la amplitud de las fluctuaciones nucleares como una media de al menos 20 núcleos por condición.
- Realizar una prueba estadística de análisis de varianza unidireccional con corrección de Bonferroni para determinar si hay una diferencia significativa en la amplitud de las fluctuaciones como una función de las condiciones de interés (por ejemplo, con y sin deformación aplicada).
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Representative Results
Los trabajos recientes dirigidos a investigar el efecto de la tensión de tracción en los oligodendrocitos10 mostraron que una cepa de tracción uniaxial al 10% promueve la diferenciación de las células progenitoras de oligodendrocitas por los cambios globales en la expresión génica. El mecanismo detrás de estos cambios en la expresión génica se puede sondeado a través de la imagen de los parámetros subcelulares, como la estructura del citoesqueleto, la localización del factor de transcripción, la dinámica nuclear y la organización de la cromatina. Sin embargo, la geometría anterior del sustrato de polidimetilsiloxano no permitía la toma de imágenes de una sola célula de alta resolución. Como se describe en este trabajo, la geometría rediseñada del sustrato de polidimetilsiloxano y la configuración de imágenes minimizaron la distancia entre las células y el objetivo. Esto permite capturar imágenes Time-lapse de núcleos celulares etiquetados con fluorescencia usando un objetivo de inmersión de aceite 100x (figura 6A).
Las fluctuaciones en el área proyectada nuclear dependen del estado de diferenciación de las células11,12. Una comparación de las fluctuaciones nucleares de las células progenitoras de oligodendrocitos y la de los oligodendroocitos de diferenciación terminal mostraron que estos últimos tienen fluctuaciones significativamente menores (figura 6E). A continuación, se compararon las fluctuaciones nucleares de las células progenitoras de oligodendrocitos a 1 h, 24 h y 48 h de inducción post-química de diferenciación con y sin una tensión de tracción del 10%. Con la inducción química por sí sola, la amplitud de las fluctuaciones nucleares mostró una disminución significativa a 48 h, pero no a las 24 h (figura 6F). Por otro lado, la inducción química junto con una cepa de tracción al 10% mostraron una disminución significativa a las 24 h, que permaneció constante, sin más reducción a las 48 h (figura 6G).
La geometría del substrato y la configuración de imagen descrita en este documento permitieron la grabación de películas de alta resolución de células tensas. El análisis posterior de estas películas demostró que la cepa acelera la amortiguación de las fluctuaciones nucleares, que es un marcador de diferenciación. Estos resultados dan una idea del mecanismo por el cual la cepa promueve la diferenciación de oligodendrocitos. En Makhija et al.13se describen más los debates sobre la interpretación de estos resultados y los experimentos futuros.
Figura 1: Diseño y geometría de la polidimetilsiloxano molde. (A) boceto del molde que muestra todas las cotas en milímetros (este boceto fue generado por las tecnologías whits, Singapur). (B) vista tridimensional del molde (adaptado de Makhija et al.11). Recuadro muestra una foto del molde. (C) vista tridimensional de la placa de polidimetilsiloxano fabricada con el molde (adaptado de Makhija et al.11). El recuadro muestra una foto de la placa de polidimetilsiloxano. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Preparación de muestras. (A) foto de una placa de polidimetilsiloxano y un compartimento cuadrado. (B) el compartimento cuadrado se coloca sobre el cuadrado levantado en la placa de polidimetilsiloxano. Su propósito es contener el medio para las células. (C) las placas de polidimetilsiloxano se almacenan en platos plásticos de 150 mm de diámetro que utilizan papel de parafilm para evitar que el polidimetilsiloxano se pegue en el plástico. (D) durante el montaje de la placa en el dispositivo de deformación unitaria, apoyarlo desde la parte inferior con dos dedos para evitar cualquier flacidez de la placa. Si la placa todavía se hunde un poco después del montaje, aumente la distancia entre los brazos del dispositivo de tensión girando la etapa de traducción. En este paso, la traducción de la etapa no debe inducir tensión en la placa de polidimetilsiloxano. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: estiramiento de la célula. (A) Mida la longitud inicial de la placa entre las abrazaderas, utilizando una regla. (B) estirar la placa girando el tornillo en la etapa de traducción para aumentar la longitud de la placa inicial por el porcentaje deseado. El aumento de la longitud del x% corresponde al X% de la cepa. Tenga en cuenta que, para generar la cepa deseada (X%) en el compartimento de cultivos celulares elevados, la placa principal debe ser tensada por una cantidad mayor (aproximadamente 2X%) debido a la diferencia en su espesor en la geometría de la placa descrita. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Preparación para la toma de imágenes. (A) llevar el objetivo 100x a la posición central en la torreta, desenroscar el objetivo y atornillar de nuevo junto con el anillo objetivo. (B) croquis del titular mostrando todas las cotas en milímetros. (C) extender la grasa de vacío en la periferia de la ventana en el soporte, utilizando una punta de pipetas, y colocar una tapa de vidrio en la parte superior. Utilice un vidrio de cubierta con espesor #0 o #1, para permitir el enfoque con la lente de inmersión de aceite 100x. (D) colocar el soporte (1) en la etapa del microscopio (2). Poner el aceite (6) objetivo (3) más cerca de la cobertura (5) que se pega al soporte, utilizando grasa de vacío (4). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: configuración de imágenes en el microscopio. (A) Ensamble la etapa de traducción z(flecha amarilla) y el soporte (flecha roja) en la etapa del microscopio. (B) Incline el dispositivo strain en la etapa del microscopio para permitir que cualquier gota de medio en el recubrimiento de vidrio del soporte. Pegue una cinta de doble cara (flecha azul) en el dispositivo de deformación que se pegarse en la etapa de traducción z. (C) Coloque el dispositivo strain en una posición invertida, apoyarlo en la etapa de traducción z. Las células deben alinearse con el recubrimiento de vidrio del soporte de plástico. (D) la geometría invertida del dispositivo de deformación unitaria minimiza la distancia entre las células y el objetivo, facilitando así la toma de imágenes de alta resolución (adaptada de Makhija et al.11). (E) vista lateral antes de poner el dispositivo de deformación unitaria (1); vista lateral después de llevar el dispositivo de deformación unitaria (2); vista superior después de poner el dispositivo de deformación unitaria (3). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Imágenes representativas y fluctuaciones de área de datos del núcleo. Esta figura está adaptada de Makhija et al.11. (A) imagen típica de un núcleo etiquetado con histona H2B etiquetada como proteína fluorescente verde, y una célula progenitora de oligodendrocitos diferenciadora. El núcleo está enfocado, mientras que los procesos celulares están fuera de foco. (B) serie temporal típica de una zona nuclear (en píxeles). (C) polinomio de tercer orden instalado en los datos. (D) porcentaje de la serie temporal de fluctuación de área residual. (E) fluctuaciones de las aristas nucleares de las células progenitoras de oligodendrocitos proliferantes y oligodendrocitos diferenciados de la terminal. (F) fluctuaciones de las aristas nucleares a 1 h, 24 h, y 48 h postinducción de diferenciación química sin deformación unitaria. (G) fluctuaciones de la zona nuclear a 1 h, 24 h, y 48 h postinducción de diferenciación química con una tensión de tracción del 10%. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Un dispositivo ha sido previamente1 diseñado para la aplicación de la tensión de tracción extracelular en las células adherentes. El diseño del sustrato de polidimetilsiloxano en ese trabajo fue suficiente para los ensayos bioquímicos, así como la imagen de baja resolución de las células estiradas. En este trabajo, se rediseñó el sustrato y se introdujo una nueva configuración de imágenes que facilita la imagen de células vivas subcelulares de alta resolución. Las ventajas de este sistema son numerosas: se puede construir en el laboratorio utilizando componentes simples, es barato en comparación con los dispositivos de deformación comercial (500 USD por dispositivo de deformación celular), y es lo suficientemente pequeño como para caber dentro de incubadoras de cultivo de tejido, así como en Microscopios. Por otra parte, aunque el sistema de imágenes se ha descrito aquí con la configuración del microscopio invertido, se puede ajustar fácilmente para la configuración del microscopio vertical.
Hay algunos pasos críticos involucrados en la preparación de la muestra y la toma de imágenes. En primer lugar, las placas de polidimetilsiloxano y los compartimentos cuadrados deben limpiarse minuciosamente antes de la siembra celular (paso de protocolo 2,8) para garantizar la supervivencia celular (como el polidimetilsiloxano no curado es tóxico para las células). En segundo lugar, dado que el volumen del medio fluido que puede caber dentro del compartimento cuadrado es inferior a 1 mL, puede evaporarse si la muestra está en la incubadora durante unos días. Por lo tanto, el medio debe ser revisado todos los días y reabastecido cuando sea necesario. Además, el área elevada de la placa de polidimetilsiloxano puede cubrirse con un plato de plástico invertido de 60 mm de diámetro para minimizar la evaporación. En tercer lugar, se debe extremar la precaución mientras se mueve el dispositivo de deformación unitaria en el microscopio hacia abajo a través de la etapa de traducción zpara acercar las celdas a la cobertura de vidrio. La compresión de las células (incluso por un momento) entre el sustrato de polidimetilsiloxano y el revestimiento de vidrio puede causar la muerte celular. En cuarto, las células muertas y los desechos celulares pueden permanecer pegados al recubrimiento de vidrio después de haber extraído la muestra de polidimetilsiloxano. Por lo tanto, después de la toma de imágenes, el recubrimiento de vidrio debe ser arrancada de la grasa de vacío y se debe adjuntar un cubrición fresca antes de montar una nueva muestra.
Las limitaciones del dispositivo de deformación unitaria son que la aplicación del desplazamiento lateral de la etapa no puede programarse para realizar tensiones cíclicas o de tracción y que sólo puede aplicar una cepa uniaxial. La limitación del sustrato de polidimetilsiloxano en la geometría descrita es que una cepa superior al 25% puede causar una fractura del polidimetilsiloxano.
Una futura modificación para mejorar el diseño del sustrato de polidimetilsiloxano podría ser la incorporación de una rejilla en la superficie de cultivo celular. Esto permitiría rastrear la misma célula antes y después de la aplicación de la tensión de tracción.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Todos los autores reconocen con gratitud el apoyo a la financiación de la Fundación Nacional de investigación de Singapur a través del grupo de investigación interdisciplinar de la Alianza de Singapur-MIT para la investigación y la tecnología (SMART) BioSystems y Micromechanics (BioSyM). Los autores Dr. Jagielska y el Dr. van Vliet también reconocen con gratitud la financiación y el apoyo de la Fundación Saks-Kavanaugh. Los autores agradecen a William ONG y al Dr. Sing Yian Chew de la Universidad Tecnológica de Nanyang, Singapur, por proporcionar células progenitoras de oligodendrocitos de rata para algunos experimentos descritos en este trabajo, y los autores agradecen al Dr. g. v. Shivashankar de Instituto de mecanobiología, Universidad Nacional de Singapur, Singapur, para discusiones sobre las fluctuaciones de la zona nuclear.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary cells | Primary Oligodendrocyte Progenitor Cells isolated from Neonatal Rats were provided by Dr. S. Y. Chew's lab at Nanyang Technological University |
||
| Media | |||
| DMEM high glucose | Gibco | 11996-065-500ml | |
| Pen/Strep | Gibco | 15070-063-100ml | |
| FGF | Prospec | CYT-608-50ug | |
| PDGF | Prospec | CYT-776-10ug | |
| Media Stock components | |||
| BSA | Sigma | A9418-10G | |
| Progesterone | Sigma | P8783-1G | |
| Putrescine | Sigma | P5780-5G | |
| Sodium Selenite | Sigma | S5261-10G | |
| Tri-iodothyronine | Sigma | T6397-100MG | |
| Thyroxine | Sigma | T1775-100MG | |
| Holo-Transferrin | Sigma | T0665-500MG | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Mold and PDMS plate | |||
| PDMS - Dow Corning Sylgard 184 | Ellsworth | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Mold - Liquid Plastic | Smooth-On | Smooth Cast 310 - Trail Size | |
| Substrate Coatings | |||
| poly-D-lysine | Sigma | P6407-5MG | |
| Fibronectin | Sigma | F1141-2MG | |
| Histone staining | |||
| CellLigt H2B-GFP BacMam | Molecular Probes | C10594 | |
| Surface functionalization | |||
| APTES | Sigma | A3648-100ml | |
| BS3 | Covachem | 13306-100mg | |
| HEPES buffer pH 8.0 | Alfa Aesar | J63578-AK-250ml | |
| Cell detachment | |||
| Accutase | Invitrogen | A1110501-100ml |
References
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