Summary
Daha önce tasarlanmış bir cihazı kullanarak bağlı hücrelere mekanik gerilme uygulamak için, bu yazıda bir yeniden tasarlanan substratum geometrisi ve 100 x yağ daldırma amacı ile gergin hücrelerin yüksek çözünürlüklü tek hücreli görüntüleme için özelleştirilmiş bir cihaz açıklanmaktadır.
Abstract
Ekstrelüler mekanik gerinim hücre fenotipi tepkiler ele almak için bilinmektedir ve çeşitli doku sistemlerinde fizyolojik alaka vardır. Biyokimyasal bilgiler aracılığıyla hücre popülasyonlarında uygulanan ekstrellüler çekme gerilimin etkisini yakalamak için, bir cihaz daha önce sadece imal edilebilir ve doku kültürü inküförleri içine sığdırmak için yeterli küçük, yanı sıra üzerine tasarlanmıştır mikroskop aşamaları. Ancak, polidimetilsiloksan substratum önceki tasarımı yağ daldırma hedefleri ile yüksek çözünürlüklü alt hücresel görüntüleme izin vermedi. Bu çalışma, polydimetylsiloxane substratum 'un yeniden tasarlanan geometrisini ve birlikte uygulanan gerinim altında canlı hücrelerin yüksek çözünürlüklü alt hücresel görüntülemeyi kolaylaştırabilecek özelleştirilmiş bir görüntüleme kurulumunu açıklar. Bu substratum aynı, daha önceki tasarlanmış cihaz ile kullanılabilir ve bu nedenle, yukarıda listelenen aynı avantajları vardır, ek olarak yüksek çözünürlüklü optik görüntüleme izin. Polidimetilsiloksan substratum tasarımı önce ve gerinim uygulamadan sonra aynı hücreyi izlemeyi kolaylaştıracak bir ızgara ekleyerek iyileştirilebilir. Temsili sonuçlar burada açıklanan yöntemi kullanarak yakalanan gergin hücreler içinde floresan etiketli çekirdeklerin yüksek çözünürlüklü zaman atlamalı görüntüleme gösterir. Bu nükleer dinamikler verileri, uygulanan çekme gerinim, oligodendrosit progenitör hücrelerinin farklılaşmasını teşvik eden mekanizmaya dair Öngörüler verir.
Introduction
Vücutta hücreler ve dokular, çekme suşları da dahil olmak üzere çeşitli mekanik ipuçlarına tabi tutulur. Ancak, bu ipuçların nöral hücrelerin biyolojisinde etkileri henüz kapsamlı bir şekilde incelenmedi ve tam olarak anlaşılmamıştır. Santral sinir sisteminde, mekanik gerinim kaynakları gelişimsel büyüme1,2,3,4, omurilik bükme, kan ve beyin omurilik sıvısı gibi fizyolojik süreçleri içerir Nabız ve travma, Akon şişmesi, glial skarlaşma veya tümör büyümesi gibi patolojik koşullar5,6,7,8. Bu çekme gerinim oligodendrositlerin farklılaşmasını ve omurga merkezi sinir sisteminde kritik bir süreçtir akonlar, sonraki miyelinasyon nasıl etkilediğini araştırmaya değer. Özel tasarımlı bir gerinim cihazı ve elastomerik multiwell plakaları kullanarak, önceki çalışmalar9,10 statik tek eksenli gerilimin gen ifadesinde küresel değişiklikler yoluyla oligodendrosit farklılaşmasını artırabilir göstermiştir 10. bu hücrelerde strain mechanotransdution mekanizmaları daha fazla anlayış elde etmek için, önceki deneysel cihaz burada açıklandığı gibi yeniden tasarlanmalıdır, yaşayan nükleer dinamiklerin yüksek çözünürlüklü floresan görüntüleme sağlamak için hücreler gerilme altında. Özellikle, tek-iyi polydimetilsiloxane plaka geliştirilmiştir, ve görüntüleme yapılandırması bir 100x yağ daldırma lens kullanarak gerginlik altında canlı hücrelerin zaman atlamalı görüntüleme için izin vermek için yeniden tasarlandı. Işık yolu polidimetilsiloksan negatif optik etkilerini ortadan kaldırmak için, hücreler polydimetilsiloxane plaka aracılığıyla değil, ancak ters pozisyonda, hücre bölmesi kapsayan kapak cam aracılığıyla görüntülenmiş. Bu yeni görüntüleme tasarımını kullanarak yüzlerce yüksek çözünürlüklü zaman atlamalı film, kromatinin histon H2B yeşil floresan proteini etiketleyerek etiketlendiği, bozulmamış yapışmaz hücrelerdeki bireysel hücre çekirdeğinden kaydedilir. Bu filmler, çekme gerinim, oligodendrosit farklılaşmasının ilerlemesi ile tutarlı olan kromatin yapısında ve dinamiklerdeki değişiklikleri ortaya koymasını göstermektedir.
Uygulamalı gerginlik altında canlı hücre görüntüleme Teknik olarak zordur ve mikroskop sistemi ile uyumlu bir cihaz tasarımı gerektirir. Burada açıklanan özel tasarım ticari çözümlere ucuz bir alternatif sunar. Boyutları, uygulanan gerginlik sırasında yüksek uzamsal çözünürlükte mikroskop aşamaları ve canlı hücre görüntüleme üzerine kurulumunu sağlar. Görüntüleme kurulumu, yüksek netlik ile 100 x yağ daldırma lens kullanarak canlı hücre görüntüleme kolaylaştırmak için tasarlanmıştır, kapak cam aracılığıyla, aksi takdirde görüntü kalitesini azaltır ve en yaygın olan polidimetilsiloksan plaka tabakası ile değil görüntüleme kurulumları. Hücre içeren takılı bir plaka ile cihaz, ayrıca kuluçte kolayca depolanabilir. Bu cihaz, yapışan hücre kültürünü kolaylaştıran ve birden fazla gün boyunca istikrarlı ve Tekdüzen bir gerginlik sağlamak için kaybolduğu tek eksenli gerinim uygulamak için tasarlanmıştır. Burada açıklanan kurulum, hücre mechanobiology birçok alanda mechanotransdution çalışmalar için uygulanabilir hale, gerginlik altında çeşitli yapışkar hücre türlerinin yüksek çözünürlüklü görüntüleme için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. yüksek çözünürlüklü görüntüleme için tek-iyi polydimetilsiloxane kalıp tasarımı
Not: polydimetilsiloxane plakaları üretimi için kalıp, 100x yağ daldırma lens ile görüntüleme ve özel yapı gerinim cihazına doğru uyum sağlamak için aşağıdaki özelliklerle tasarlanmıştır (Şekil 1a, B).
- Genel plaka boyutlarını, gerinim cihazının kelepçeleri içine sığmasını sağlar.
Not: burada, 60 mm x 73 mm. - Uygulanan gerinim sırasında polydimetilsiloxane plakasının UNCL, kenarlarında meydana gelen ark (out-of-Plane büküm) etkilerini önlemek için, bir hücre bölmesi veya iyi önemli ölçüde tüm plaka lateral boyutlardan daha küçüktür olun.
Not: burada, bölme 23 mm x 23 mm kare olarak tasarlanmıştır. - Hücre bölmesinin derinliğini mümkün olan en az (80 μm ' den fazla değil) olarak tutun, bölme üzerine yerleştirilen kapak camından 100x yağ daldırma lensi ile odaklanmayı sağlamak için, ancak medyayı içermeye yetecek kadar yeterli hale getirmek ve temas veya hücreleri sıkarak.
- Hücre bölmesini 3 mm yüksekliğe sahip bir karenin üzerine getirin, hücreleri ters çevrilmiş mikroskop kurulumunda lense yakınlaştırmak için kolay odaklama sağlar.
Not: Yukarıdaki özellikleri ile kalıplar gibi birçok teknikleri tarafından imal edilebilir, örneğin, öğütülmüş alüminyum. Alternatif olarak, ana kalıplar da bir lazer kesici ile kesilmiş Akrilik levhalar kullanarak monte edilebilir, hücre bölmesi için kapak cam #0, ve süper tutkal. Bu Ana kalıp bir polidimetilsiloksan baskı yapmak için kullanılır, daha sonra bir döküm reçine kullanarak çalışma kalıpları yapmak için kullanılır.
2. tek-iyi polydimetilsiloxane plakaları ve kare bölmeler imalatı
- Tek kullanımlık bir bardak 20:1 (ağırlığa göre) bir oranda polydimetilsiloxane tabanı ve kür ajanı karıştırın. Toplam tartmak 20 g polidimetilsiloxane başına kalıp (bir polydimetilsiloxane plaka yapmak için) ve 150 g polidimetilsiloksan başına 150 mm-in-çapı plastik çanak (kare bölmeler bir toplu yapmak için).
- Polydimetylsiloxane karışımı bir vakum degasser at-0,8 Bar 30 dakika (veya tüm kabarcıklar kaldırılıncaya kadar) bırakın.
- Polidimetilsiloxane karışımı kalıplara (plakalar için) veya 150 mm plastik yemeklerle (kare bölmeler için) dökün.
- Bu aşamada herhangi bir ek kabarcıklar kaldırmak, ya hava üfleme (ağız) veya polisetilsiloxane dolu kalıplar/yemekler tekrar at-0,8 bar vakum 30 dakika.
- 2 h için bir seviyelendirme masasında 80 °C ' lik bir fırında kalıpları/yemekleri bırakın.
- Dikkatle fırın kalıpları/yemekleri kaldırmak ve onları oda sıcaklığında soğumaya bırakın. Bir Blade (Şekil 1C) ile kenarları dikkatle kestikten sonra tedavi polydimetilsiloxane yavaşça dışarı soyma.
- 150 mm çapında polydimetilsiloxane üzerinde, bir marker ile 2 cm x 2 cm ızgara çizin. Her meydanda, her tarafta 0,5 cm 'lik bir marj bırakarak 1 cm x 1 cm kare çizin. Kare bölmeler elde etmek için çizgiler boyunca dikkatle kesilmiş bir bıçak kullanarak (Şekil 2a).
- Polydimetilsiloxane plakaları/kare bölmeleri, 4 h için% 100 aseton içinde inküreme, 4 h için% 100 etanol, ardından da 4 h için otoklav su ile temizleyin.
- 150 mm çapında plastik bir tabak (Şekil 2C) içinde parafin film arka kağıt (değil parafin film ama kağıt) üzerinde plakalar/kare bölmeleri yerleştirin.
- 80 °C ' de polydimetilsiloxane plakasını 4 h için kurumaya bırakın.
- Polydimetilsiloxane plakaları ve parafin filmi ile konteyner kareler içeren 150 mm çapında yemekleri mühürleyin ve daha fazla kullanıma kadar soğuk bir odada saklayın.
3. polydimetilsiloxane plakaların functionalization
- Parafin filmi çıkarın, plastik çanak kapağını çıkarın ve polidimetilsiloksan plakaları ve kare bölmeler ultraviyole ışık altında 30 dakika yerleştirin.
- Plazma-tedavi (5 dk için 150 W) polidimetilsiloksan plakaları (hücre bölmesi yukarı bakacak şekilde) kare bölmeler olmadan, kültür yüzeyi hidrofilik yapmak.
- Kare bölmeler hemen plazma işlenmiş yüzeye yerleştirin (Şekil 2B) ve elle geçici olarak iki araya sopa için basın.
Not: plazma-kare bölmeleri tedavi etmeyin, ya da başka onlar polidimetilsiloksan plaka şiddetle sopa ve onlar görüntüleme sırasında soyulmuş olmalıdır kolayca kapalı gelmiyor. - 200 μL, 100 mM (3-aminoprotransl) triethoxysilane için 2 h-NH2 gruplar polydimetilsiloxane yüzeyine tanıtmak için iyi ekleyin. 100 mM 'Lik bir çözelti yapmak için, 10 mL su içinde 234 μL saf (3-aminoproptif) triethoxysilane çözülür. 2 h İnkübasyon sonrasında, 3 ' ü deiyonize suyla yıkayın.
- 2 mg moleküler crosslinker bissulfosuccinimidyl suberate ağırlığında ve 700 μL 1 M (4-(2-hidroksiilil) -1-piperazineethane sülfonik asit tamponu (pH 8,0) ve 2,8 mL su içinde çözülür.
Not: Bu, 200 mM 'de 1 mM bissülfosuccinimidil suberat çözeltisi verecektir (4-(2-hidroksiil) -1-piperazineethane sülfonik asit tamponu. 50 mM konsantrasyon tamponunun da iyi çalıştığını unutmayın.- Bu çözelti 135 μL ve oda sıcaklığında 4 h için her polydimetilsiloxane plakasında da 15 μL 1 mg/mL fibronektin ekleyin.
- Fosfat tamponlu tuz çözeltisi ile 3x yıkayın. 500 ekleme μL fosfat-tamponlu tuz çözeltisi kuyunda. Parafin film ile polidimetilsiloksan içeren 150 mm çapı çanak kapak ve daha fazla kullanım kadar, soğuk bir odada saklayın.
4. plastik yemekleri ve flsorlar functionalization
- Plastik yemekleri ve flsorları 5 μg/mL 'Lik Poly-D-lizin çözeltisi (PDL, steril suda) ile 1 h. Ekle 1,5 mL (Ligand) 35 mm-çap çanak başına, 3 mL, 60 mm çap çanak başına ve 10 mL başına 75 cm2 kültür Flask.
- Yıkama yemekleri ve steril su ile 2x şişeler.
- Onları 1 saat (veya kurumaya kadar) için biyoemniyet kabininde kurumaya bırakın ve daha fazla kullanıma kadar 4 °C ' de soğuk odada saklayın.
5. murine oligodendrosit progenitör hücreler için proliferasyon ve farklılaşma ortamı
- Proliferasyon ve farklılaşma ortamının 100x çözeltileri 50 ml hazırlamak, 2,5 ml plakaya yapmak ve onları-80 °c ' de saklayın.
Not: proliferasyon ortamının bileşimi 0,1 mg/mL Sığır serum albumin, 62 ng/mL progesteron, 16 μg/mL putrescine, 5 μg/mL insülin, 50 μg/mL Holo-transferrin, 5 ng/mL Sodyum selenit, 1x penisilin-streptomisin, 10 ng/mL trombosit-türev büyüme faktörü ve 10 ng/mL fibroblast büyüme faktörü Dulbecco 'nun modifiye kartal Orta (DMEM) yüksek glikoz ve pyruvate ile. 1. çözelti hazırlarken Sığır serum albümin, progesteron, putrescine ve Sodyum selenit, 100x, insülin, holo-transferrin ve penisilin-streptomisin taze eklenmeli ve depolanabilir. Büyüme faktörleri 10 μg/mL 'de oluşturulmalı ve her gün hücrelere taze eklenmesi gerekir (1 μL/mL orta). Farklılaşma ortamının bileşimi 0,1 mg/mL Sığır serum albumin, 62 ng/mL progesteron, 16 μg/mL putrescine, 5 μg/mL insülin, 50 μg/mL Holo-transferrin, 5 ng/mL Sodyum selenit, 1x penisilin-streptomisin, 400 ng/mL triiodothyronine, 400 ng/mL L-tiroksin, ve 0,5% fetal Sığır serum DMEM yüksek glikoz ve pyruvate ile. Triiodothyronine ve L-tiroksin diğer reaktifler ile oluşturulur ve 100x saklanır. 1x solüsyonu hazırlarken insülin, holo-transferrin ve penisilin-streptomisin taze eklenmesi gerekir. - 50 ml 100x proliferasyon ortamını hazırlamak için, 510 mg sucul serum albümin 17 ml 'de Dulbecco 'nun medyası içinde, 31 μL etanol içinde 310 μg progesteron, 80 mg putresin, 10 μL 'de Dulbecco 'nun 500 Orta, 25 μg Sodyum selenit. ve 50 mL 'ye kadar tam DMEM
- 50 mL 100 x diferansiyel orta çözeltisi hazırlamak için, ayrıca 40 μL sodyum hidroksit içinde 2 mg triiodothyronin ve 40 μL sodyum hidroksit içinde 2 mg L-tiroksin çözülür, sonra solüsyonu, Dulbecco 'nun orta ile 50 mL 'ye doldurun. Solüsyonu steril tek kullanımlık filtre ünitesi, aliquot ile filtreleyin ve plakaya-80 °c ' de saklayın.
- 250 mL 1x proliferasyon/farklılaşma orta hazırlamak için, Mix 2,5 mL proliferasyon/diferenitasyon orta 100x çözeltisi ile 12,5 mg Holo-transferrin, 125 μL 10 mg/mL insülin, ve 2,5 mL 100x penisilin-streptomisin. Dulbecco 'nun ortamıyla 250 mL 'ye kadar çözümü doldurun ve steril tek kullanımlık filtre ünitesi ile filtreleyin.
Not: büyüme faktörleri reconstituted orta tüm toplu değil, taze ve doğrudan hücre kültürünü eklenmesi gerekir.
6. hücre kültürü
- Proliferasyon ortamında askıya oligodendrosit progenitör hücreleri ile başlayın. Bu hücreleri 35.000 hücre/cm2 ' nın PDL kaplı plastik yüzeylere (yemekler veya flsorlar) yoğunluğunda tohum yerleştirin, bkz. Bölüm 4). 10 cm2 plastik substratum yüzey alanı başına proliferasyon orta hacmi 3 ml ayarlayın; Orta daha düşük bir hacim, yüzey gerilimi kuvvetlerinden kaynaklanan hücre kümeleme yol açabilir, yemeklerde orta daha yüksek bir hacim dökülmeye neden olabilir.
- Her gün büyüme faktörleri (trombosit-türev büyüme faktörü ve fibronektin büyüme faktörü) ekleyin, 10 ng/mL 'de konsantrasyonlarını koruyarak ve diğer günlerde proliferasyon ortamının yarısını değiştirin.
- Üçüncü gün, yumuşak bir hücre dekolmanı solüsyonu (örn., accutase) kullanarak plastik yüzeyden hücreleri ayırın: Orta çıkarın, 1 adet fosfat-tamponlu tuz çözeltisi ile yıkayın, 20 cm2 alan başına 10 ml dekolmanı çözeltisi ekleyin, çanak/Flask bırakın 37 ° c 'de bir kuluçta 10 dakika için, ve tüm hücreler ayrılıncaya kadar hafifçe dokunun (mikroskop altına bakın).
- Tek hücrelere yığınlar kırmak için bir 200 μL ipucu kullanarak pipette, onları bir 50 ml tüp aktarmak, proliferasyon ortamında onları seyreltmek, 10 dakika için 0,2 x g spin, supernatant atmak, ve toplam 1 ml hacim yapmak için proliferasyon ortamında Pelet pelletini. Bir cytometer kullanarak hücreleri saymak.
- Fibronektin-işlevselleştirilmiş polydimetilsiloxane plakaları 2x, yıkama başına 15 dk, proliferasyon orta ile yıkayın.
- Tohum 35.000, 700 μL proliferasyon ortamında polydimetilsiloxane plaka başına hücreler.
- Yeşil floresan protein ile histon H2B etiketleme için H2B-GFP bir Plasmid yapı ekleyin.
Not: burada, 1,4 Cell Light H2B-GFP BacMam2 transfeksiyon karışımı μL her plakaya eklenmiştir (50.000 hücre başına 2 μL). - 24 saat sonra, tek eksenli gerinim cihazına uzatılacak hücrelerle polydimetilsiloxane örneklerini monte edin ( Şekil 2D'de gösterildiği gibi). Tüm numunelerde ortamı farklılaşma ortamına değiştirin.
- Numuneleri germek için, düzensiz hücre bölmesi uzunluğunu ölçmek (Şekil 3A) ve sahne mikrometre vidasını istediğiniz miktara göre hücre bölmesi uzunluğunu artırmak için çevirin (örn.,% 10, bkz. Şekil 3B). 37 °c ' de kuluçta olan gergin ve gergin polidimetilsiloksan örneklerini görüntüleme kadar bırakın.
7. görüntüleme
- Mikroskobu açın. Mikroskop kuluçta sıcaklığını 37 °C ' ye ayarlayın.
- Objektif taret daha sonra erişilebilir olmayacaktır gibi merkezi konumuna (100x yağ daldırma) kullanılmak üzere amacı getirin. Hedefi sökün ve objektif bir yüzük ile birlikte geri vidalayın (Şekil 4A) böylece hedef hücrelere daha yakın getirilebilir. Burada bir yağ amacı kullanılırsa, bu adımda bir damla yağ ekleyin.
- Önceden sentezlemek (3D baskı veya işleme yoluyla) iki önemli özelliği olan bir plastik veya metal tutucu — açılı bir pencere ve bir adım (Şekil 4b).
Not: pencere, gerinim aygıtı ters bir durumda iken orta tutacak bir kalınlık #0 cam lamel magazini destekler. Pencere kenarlarındaki açılı kesim (Şekil 4d), hedefin cam coverslip 'a daha yakın olmasını sağlar. Tutucu adım bize daha aşağı, hedefe yakın gergin polidimetilsiloksan getirmek için izin verir. - Pencerenin çevresindeki vakum yağını (Şekil 4c) yaymak suretiyle, tutucunun üst yüzeyine (25 mm x 25 mm veya 35 mm 'lik ebatlarda) cam kaplama kayma (kalınlık #0) yerleştirin ve plastik pencereyi mikroskop aşamasına takın ( Şekil 4D ve Şekil 5A).
- Z-çeviri aşamasını mikroskop aşamasına takın ve en üstteki zkonumuna taşıyın (Şekil 5A).
- 500 μL 'yi, orta tabakalı polydimetilsiloxane plakasını görüntüleyecek şekilde çıkarın ve bu ortamı beyaz plastik penceredeki cam lamel magazini üzerine ekleyin.
- Kare bölmesini özenle steril cımbız ile polydimetilsiloxane plakasına ayırın.
- Gerinim cihazını beyaz plastik pencerenin üstündeki dik konumda tutun (hücreler yukarı dönük) ve gerinim cihazını dikkatlice ters çevirin, böylece doğrudan cam lamel magazini (Şekil 5B) (hücreler aşağı bakacak şekilde) ortasında herhangi bir ekstra orta düşüş sağlar.
- Gerinim cihazının alt kısmını, Çift taraflı teyp (Şekil 5c, D) ile z-çeviri aşamasına yerleştirin.
- Parlak alan altında objektif bakarak iken, yavaşça (Şekil 5E) aşağı gerinim cihazı getirmek ( z-çeviri aşaması düşürerek) ve hücrelere odaklanmak için hedef kadar hareket.
- Bu adımı son derece yavaş, adım adim gerçekleştirin. Gerinim cihazı lamel magazini üzerine çok fazla baskı yaparsa, hücreler sıkıştırılmış alabilirsiniz (onları ölüme neden) ve objektif pres lamel magazini üzerine çok fazla, lamel magazini (orta sızıntı ve objektif üzerine dökülme neden) kırabilir.
- X-ve y-yön polidimetilsiloksan plaka tarama floresan çekirdeği olan bir hücre bulmak için (altında epifluorescence ile 488 nm dalga boyu uyarılma) ve uygun hücre morfoloji (altında Brightfield).
- Mikroskop aşamasının lateral deplasman dikey odaklama çok fazla etkilemez, yazılım üzerinde çok noktalı bir özelliği kullanarak ilgi alanları birden fazla bölge seçin. Bazen, odaklanma, sahnenin herhangi bir lateral deplasmanında çok duyarlıdır. Bu gibi durumlarda, bir defada bir hücre görüntü. İlgi her hücre için x-, y-ve z-konumlarını işaretleyin.
- 488 ile çekirdeğin geniş alan (veya açık pinhole) görüntülerini, en az 30 dk. toplam süresi için kare başına 30 s 'lik aralıklarda aydınlık alan uyarma ve dalga boyu uyarma ile hücrenin kaydını yapın.
8. veri analizi
-
Nükleer dalgalanmalar
- Bir görüntü analiz yazılımındaki çekirdek görüntüleri (Şekil 6a) dizisini açın ve çekirdek zaman atlamalı görüntüleri eşik (örneğin, ımagej 'de Threshold komutunu veya yazılım MATLAB 'daki graythresh komutunu kullanın).
- Bir zaman fonksiyonu olarak çekirdek alanı (piksel cinsinden) alın, bir veri komplo yazılımı (Şekil 6B) içinde çizmek ve veri (Şekil 6c) bir üçüncü sipariş polinomial sığar (örneğin, analiz kullanın | Fitting | Köken olarak polinomial fit komutu veya yazılım MATLAB polyfit komutu).
- Takılan polinom değerini her zaman noktası için gerçek alandan (piksel cinsinden) çıkarın. Bu düzeltilmiş alan, kalıntı alanı olarak bilinir.
Not: Bu işlem, enstrümantal hatalardan gelen verilerdeki artan veya azalan eğilimi kaldırır ve detrending olarak adlandırılır.- Her zaman noktasında kalan alanı, o zaman noktasında takılan polinomial değeri ile bölerek kalıntı alanının yüzdesini hesaplayın (Şekil 6D).
- Kalıntı alan zaman serisinin standart sapmasını hesaplayın. Bu standart sapma nükleer dalgalanmaların genliğini gösterir.
-
Veri çizimi ve istatistiksel analiz
- Durum başına en az 20 çekirdekler ortalama olarak nükleer dalgalanmaların amplitüd hesaplayın.
- Faiz koşullarının bir işlevi olarak dalgalanmaların amplitüsündeki önemli bir fark olup olmadığını belirlemek için Bonferroni düzeltmesi ile tek yönlü analiz-of-Varyans istatistik testini gerçekleştirin (örneğin, uygulanan gerginlik ile ve olmadan).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Son çalışma oligodendrosit üzerinde çekme geriliminin etkisini araştırmayı amaçlayan10 % 10 tek eksenli çekme gerinim gen ifadesinde küresel değişiklikler ile oligodendrosit progenitör hücrelerin farklılaşma teşvik gösterdi. Gen ifadesinde bu değişikliklerin arkasındaki mekanizma, sitroiskelet yapısı, transkripsiyon faktörü lokalizasyonu, nükleer dinamikler ve kromatin organizasyonu gibi alt hücresel parametrelerin görüntülenmesi yoluyla probed edilebilir. Ancak, polidimetilsiloksan substratum önceki geometri yüksek çözünürlüklü tek hücreli görüntüleme izin vermedi. Bu çalışma açıklandığı gibi, polidimetilsiloksan substratum ve görüntüleme kurulumu yeniden tasarlanan geometri hücreler ve amaç arasındaki mesafeyi minimize. Bu, 100x yağ daldırma objektif kullanarak floresan etiketli hücre çekirdeğinin zaman atlamalı görüntüleri yakalama sağlar (Şekil 6a).
Nükleer yansıtılan alandaki dalgalanmalar, hücrelerin farklılaşma durumuna bağlıdır11,12. Oligodendrosit progenitör hücrelerin nükleer dalgalanmaların bir karşılaştırması ve bu ölümcül farklılaşmış oligodendrosit ikinci önemli ölçüde düşük dalgalanmalar olduğunu gösterdi (Şekil 6e). Daha sonra, oligodendrosit progenitör hücrelerinin nükleer dalgalanmaları 1 h, 24 saat, ve 48 h sonrası kimyasal farklılaşma indüksiyon ve% 10 çekme gerinim olmadan karşılaştırıldı. Tek başına kimyasal indüksiyon ile, nükleer dalgalanmaların amplitüd 48 h de önemli bir düşüş gösterdi ama değil 24 h (Şekil 6F). Öte yandan,% 10 çekme gerinim ile birlikte kimyasal indüksiyon, 48 h 'de daha fazla azalma olmaksızın, sabit kalan 24 h 'de önemli bir azalma göstermiştir (Şekil 6G).
Bu yazıda açıklanan substratum geometrisi ve görüntüleme konfigürasyonu, gergin hücrelerin yüksek çözünürlüklü filmlerinin kaydını sağladı. Bu filmlerin sonraki analizi, gerilimin, farklılaşma belirteci olan nükleer dalgalanmaların sönümlerini hızlandırmasını göstermiştir. Bu sonuçlar, hangi gerinim oligodendrosit farklılaşma teşvik mekanizması içine anlayış verir. Bu sonuçların ve gelecekteki deneylerin yorumlanması hakkında daha fazla tartışma Makhija ve al.13' te açıklanmıştır.
Şekil 1: Tasarım ve geometri polydimetilsiloxane Mold. (A) milimetrelik tüm boyutları gösteren kalıp çizimi (Bu çizim, Singapur teknolojileri tarafından üretilir). (B) kalıp üç boyutlu görünümü (Makhija ve al.11uyarlanmıştır). Inset kalıp bir fotoğraf gösterir. (C) kalıp kullanılarak üretilmiş polydimetilsiloxane plakasının üç boyutlu görünümü (Makhija ve al.11' den uyarlanmış). Inset, polydimetilsiloxane plakasının bir fotoğrafını gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: Numune hazırlama. (A) polydimetilsiloxane plaka ve kare bölme fotoğrafı. (B) kare bölme polydimetilsiloxane plaka üzerinde yükseltilmiş kare yerleştirilir. Amacı hücreler için orta içermek. (C) polydimetilsiloxane plakaları, polydimetilsiloxane plastik üzerine yapışmasını önlemek için Parafilm kağıt kullanarak 150 mm çapında plastik yemekler saklanır. (D) plakayı gerinim cihazına takarken, plakanın herhangi bir sarkmasını önlemek için iki parmağınızı kullanarak alt kısmından destek yapın. Eğer plaka montajdan sonra hala biraz sarkırsa, çeviri aşamasını çevirerek gerinim cihazı kolları arasındaki mesafeyi artırın. Bu adımda, sahnenin çevirisi polydimetilsiloxane plakasında gerinmeye neden olmamalıdır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: hücre germe. (A) cetvel kullanarak plakanın ilk uzunluğunu kelepçeler arasında ölçün. (B) ilk plaka uzunluğunu istenilen yüzdeye göre artırmak için çeviri aşamasının vidasını çevirerek plakayı uzatın. Uzunluğu% x artışa karşılık X% gerilme. İstenen gerginlik (X%) oluşturmak için unutmayın yükseltilmiş hücre kültürü bölmesinde, ana plaka daha yüksek bir miktar (yaklaşık% 2X) ile gergin olmalıdır Belirtilen plaka geometrisindeki kalınlıklarında fark nedeniyle. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4: Görüntüleme hazırlığı. (A) 100 x hedefini taretteki merkezi pozisyona getirin, hedefi sökün ve objektif yüzük ile birlikte geri vidalayın. (B) tüm ölçümlendirmeleri milimetre cinsinden gösteren tutucunun çizimi. (C) yuvasının kenarında, Pipet ucunu kullanarak ve üst kısmında bir cam lamel magazini yerleştirmek için vakum gresine yayılır. 100x yağ daldırma lens ile odaklama sağlamak için, kalınlık #0 veya #1 ile bir kapak cam kullanın. (D) tutucuyu (1) mikroskop aşamasına yerleştirin (2). Yağ (6) objektif (3), vakum Gresini (4) kullanarak tutucuya sıkışmış olan lamel magazini 'a (5) daha yakın bir şekilde getirin. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 5: mikroskop üzerinde görüntüleme kurulumu. (A) z-çeviri aşamasını (sarı ok) ve tutucuyu (kırmızı ok) mikroskop aşamasına monte edin. (B) gerinim cihazını mikroskop aşamasına eğerek, herhangi bir orta damlasını tutucunun cam kapağına bırakın. Z-çeviri aşamasına yapışacak olan gerinim cihazına çift taraflı bant (mavi ok) takın. (C) strain cihazını ters bir konuma yerleştirin ve z-çeviri aşamasında destekler. Hücreler plastik tutucu cam lamel magazini ile hizalanmalıdır. (D) gerinim cihazının ters geometrisi, hücreler ile amaç arasındaki mesafeyi en aza indirir, böylece yüksek çözünürlüklü görüntülemenin kolaylaştırılması (Makhija ve al.11' den uyarlanır). (E) gerinim cihazını aşağı getirmeden önce yan görünüm (1); gerilme cihazını aşağı getirdikten sonra yan görünüm (2); gerilme cihazını aşağı getirdikten sonra üst görünüm (3). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 6: Çekirdeğin temsili görüntüleri ve alan dalgalanmaları verileri. Bu rakam Makhija ve al.11' den uyarlanmıştır. (A) histon ile etiketli bir çekirdeğin tipik görüntü H2B yeşil floresan protein Tagged, ve bir farklılaşan oligodendrosit progenitör hücre. Hücre süreçleri odak dışında iken çekirdeği, odaklanmaktadır. (B) bir nükleer alanın tipik zaman serisi (piksel cinsinden). (C) verilere takılan üçüncü sipariş polinomial. (D) kalıntı alan dalgalanması zaman serisinin yüzdesi. (E) proliferasyon oligodendrosit progenitör hücrelerin nükleer kenar dalgalanmaları ve ölümcül farklılaşmış oligodendrocytes. (F) nükleer kenar dalgalanmaları 1 saat, 24 saat, ve 48 h indüksiyon olmadan kimyasal farklılaşma sonrası. (G) nükleer alan dalgalanmaları 1 saat, 24 saat, ve 48 h% 10 çekme gerilme ile kimyasal farklılaşma postindüksiyon. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bir cihaz daha önce1 ' i yapışkanı hücrelerde hücre içi çekme gerilme uygulaması için tasarlandı. Bu çalışmanın polydimetylsiloxane substratum tasarımı biyokimyasal çalışmalar için yeterli, hem de gergin hücrelerin düşük çözünürlüklü görüntüleme. Bu çalışmada, substratum yeniden tasarlandı ve yüksek çözünürlüklü alt hücresel canlı hücre görüntülemeyi kolaylaştıran yeni bir görüntüleme konfigürasyonu tanıtıldı. Bu sistemin avantajları çok sayıda: Bu basit bileşenleri kullanarak laboratuvar içinde inşa edilebilir, ticari gerinim cihazlara göre ucuz (500 hücre gerinim cihazı başına USD), ve doku kültürü inküförleri içine sığacak kadar küçük, hem de üzerine Mikroskoplar. Dahası, görüntüleme sistemi burada ters mikroskop kurulumu ile tarif edilmiş olsa da, dik mikroskop konfigürasyonu için kolayca ayarlanabilir.
Örnek hazırlama ve görüntüleme ile ilgili birkaç kritik adım vardır. İlk olarak, polidimetilsiloksan plakaları ve kare bölmeleri hücre tohumlama önce iyice temizlenmelidir (protokol adım 2,8) hücre sağkalım sağlamak için (gibi sertleşmemiş resinin polydimetilsiloxane hücrelere toksik). İkinci olarak, kare bölmesinin içine sığabilecek sıvı orta hacmi 1 mL 'den az olduğundan, örnek birkaç gün boyunca kuluçside ise Buharlaştırıcı olabilir. Bu nedenle, orta her gün kontrol edilmelidir ve gerektiğinde yenilenmelidir. Ayrıca, polydimetilsiloxane plaka üzerinde yükseltilmiş alan buharlaşma en aza indirmek için ters 60 mm çapında plastik çanak ile kaplanmıştır. Üçüncü olarak, hücreler cam coverslip daha yakın getirmek için z-çeviri aşaması üzerinden mikroskop üzerindeki strain cihazı hareket ederken aşırı dikkatli yapılmalıdır. Polydimetilsiloxane substratum ve cam lamel magazini arasında hücrelerin sıkıştırılması (bir an için bile) hücre ölümüne neden olabilir. Dördüncü olarak, polydimetilsiloxane örneği kaldırıldıktan sonra ölü hücreler ve hücre enkaz cam lamel magazini sıkışmış kalabilir. Bu nedenle, görüntüleme sonrası, cam lamel magazini vakum yağından çekilmelidir ve yeni bir örnek monte etmeden önce taze bir lamel magazini bağlı olmalıdır.
Gerinim cihazının sınırlamaları, sahne lateral deplasmanında uygulamanın cyclik veya rampalı gerinim gerçekleştirmek için programlanamaz ve sadece tek eksenli gerinim uygulayabilir. Açıklanan geometrideki polydimetilsiloxane substratumun sınırlaması,% 25 ' ten yüksek bir gerilimin polydimetilsiloxane kırılmasına neden olabilir.
Polidimetilsiloksan substratum tasarımını geliştirmek için gelecekteki bir değişiklik hücre kültürü yüzeyi üzerinde bir Grid birleşmesi olabilir. Bu çekme gerinim uygulamadan önce ve sonra aynı hücreyi izlemek için izin verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Tüm yazarlar minnetle Singapur-MıT Alliance araştırma ve teknoloji (SMART) BioSystems ve mikromekanik (BioSyM) disiplinlerarası araştırma grubu aracılığıyla Singapur Ulusal Araştırma Vakfı 'ndan fon desteğini kabul eder. Yazarlar Dr. Jagielska ve Dr. Van Vliet de minnetle Saks-Kavanaugh Vakfı 'ndan fon ve destek kabul. Yazarlar, bu çalışma açıklanan bazı deneyler için sıçan oligodendrosit progenitör hücreleri sağlamak için Nanyang teknolojik Üniversitesi, Singapur, William Ong ve Dr Sing Yian Chew teşekkür ve yazarlar Dr G. V. shivashankar teşekkür Mechanobiology Enstitüsü, Singapur Ulusal Üniversitesi, Singapur, nükleer alan dalgalanmaları hakkında tartışmalar için.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary cells | Primary Oligodendrocyte Progenitor Cells isolated from Neonatal Rats were provided by Dr. S. Y. Chew's lab at Nanyang Technological University |
||
| Media | |||
| DMEM high glucose | Gibco | 11996-065-500ml | |
| Pen/Strep | Gibco | 15070-063-100ml | |
| FGF | Prospec | CYT-608-50ug | |
| PDGF | Prospec | CYT-776-10ug | |
| Media Stock components | |||
| BSA | Sigma | A9418-10G | |
| Progesterone | Sigma | P8783-1G | |
| Putrescine | Sigma | P5780-5G | |
| Sodium Selenite | Sigma | S5261-10G | |
| Tri-iodothyronine | Sigma | T6397-100MG | |
| Thyroxine | Sigma | T1775-100MG | |
| Holo-Transferrin | Sigma | T0665-500MG | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Mold and PDMS plate | |||
| PDMS - Dow Corning Sylgard 184 | Ellsworth | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Mold - Liquid Plastic | Smooth-On | Smooth Cast 310 - Trail Size | |
| Substrate Coatings | |||
| poly-D-lysine | Sigma | P6407-5MG | |
| Fibronectin | Sigma | F1141-2MG | |
| Histone staining | |||
| CellLigt H2B-GFP BacMam | Molecular Probes | C10594 | |
| Surface functionalization | |||
| APTES | Sigma | A3648-100ml | |
| BS3 | Covachem | 13306-100mg | |
| HEPES buffer pH 8.0 | Alfa Aesar | J63578-AK-250ml | |
| Cell detachment | |||
| Accutase | Invitrogen | A1110501-100ml |
References
- Bray, D. Mechanical tension produced by nerve cells in tissue culture. Journal of Cell Science. 410, 391-410 (1979).
- Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension. Developmental Biology. 389, (1983).
- Van Essen, D. C. A tension-based theory of morphogenesis and compact wiring in the central nervous system. Nature. , (1997).
- Smith, D. H. Stretch growth of integrated axon tracts: Extremes and exploitations. Progress in Neurobiology. 89, 231-239 (2011).
- Cullen, D. K., Simon, C. M., LaPlaca, C. M. Strain rate-dependent induction of reactive astrogliosis and cell death in three-dimensional neuronal-astrocytic co-cultures. Brain Research. , 103-115 (2011).
- Fisher, E., et al. Imaging correlates of axonal swelling in chronic multiple sclerosis brains. Annals of Neurology. 2, 219-228 (2007).
- Nikić, I., et al. A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Nature Medicine. 17, 495-500 (2011).
- Payne, S. C., Bartlett, C. A., Harvey, A. R., Dunlop, S. A., Fitzgerald, M. Functional loss during chronic secondary degeneration in rat optic nerve. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53, (2018).
- Zeiger, A. S., et al. Static mechanical strain induces capillary endothelial cell cycle re-entry and sprouting. Physical Biology. 13, 1-16 (2017).
- Jagielska, A., et al. Mechanical strain promotes oligodendrocyte differentiation by global changes of gene expression. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 93 (2017).
- Pajerowski, J. D., Dahl, K. N., Zhong, F. L., Sammak, P. J., Discher, D. E. Physical plasticity of the nucleus in stem cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1, 0-5 (2007).
- Talwar, S., Kumar, A., Rao, M., Menon, G. I., Shivashankar, G. V. Correlated spatio-temporal fluctuations in chromatin compaction states characterize stem cells. Biophysical Journal. 104, 553-564 (2013).
- Makhija, E., et al. Mechanical strain alters cellular and nuclear dynamics at early stages of oligodendrocyte differentiation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 59 (2018).
