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Bioengineering

单轴拉伸应变下活细胞核动力学的高分辨率成像

doi: 10.3791/59474 Published: June 2, 2019

Summary

利用先前设计的设备将机械应变应用于粘附细胞, 本文介绍了重新设计的底层几何形状和具有100x 油浸目标的应变细胞高分辨率单细胞成像的定制设备。

Abstract

细胞外机械应变是已知的引起细胞表型反应, 并有生理相关性的几个组织系统。为了通过生化检测捕捉应用细胞外拉伸应变对体外细胞群的影响, 以前设计的一种装置可以简单地制作, 足够小, 可以容纳组织培养孵化器内, 也可以在显微镜阶段。然而, 以前的设计的聚二甲基硅氧烷亚基不允许高分辨率的亚细胞成像通过油浸没目标。这项工作描述了一个重新设计的几何形状的聚二甲基硅氧烷亚底层和定制的成像设置, 可以促进高分辨率亚细胞成像活细胞在施加应变。该底层可以与相同的、早期设计的设备一起使用, 因此, 除了允许高分辨率光学成像外, 还具有与上面列出的相同的优势。通过加入一个网格来改进聚二甲基硅氧烷底层的设计, 这将有助于在施加菌株之前和之后跟踪同一细胞。代表性的结果表明, 在使用这里描述的方法捕获的被捕获的神经细胞中, 荧光标记的细胞核具有高分辨率的延时成像。这些核动力学数据揭示了应用拉伸应变促进少突胶质细胞分化的机制。

Introduction

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体内的细胞和组织受到各种机械暗示的影响, 包括拉伸应变。然而, 这些线索对神经细胞生物学的影响还没有得到广泛的研究和充分的理解。在中枢神经系统中, 机械应变的来源包括发育生长 1,2,3, 4,生理过程, 如脊髓弯曲, 血液和脑脊液脉动, 和病理条件, 如创伤, 轴突肿胀, 胶质疤痕, 或肿瘤生长5,6, 7,8。拉伸应变如何影响少突胶质细胞的分化和随后的轴突髓鞘形成是脊椎动物中枢神经系统的一个关键过程, 值得研究。使用定制设计的应变装置和弹性体多井板, 以前的作品9,10已经表明, 静态单轴应变可以通过基因表达的全球变化增加少突胶质细胞的分化10. 为了进一步了解这些细胞中的应变机械转导机制, 必须按照此处所述重新设计以前的实验装置, 以便能够对生活中的核动力学进行高分辨率荧光成像细胞在应变下。具体而言, 开发了单井聚二甲基硅氧烷板, 并重新设计了成像配置, 以便使用100x 油浸没透镜对菌株下的活细胞进行延时成像。为了消除聚二甲基硅氧烷在光通路中的负面光学效应, 细胞不是通过聚二甲基硅氧烷板成像, 而是通过覆盖在细胞室的盖板玻璃在倒置位置成像。利用这种新的成像设计, 记录了数百部高分辨率延时电影, 记录了完整粘附细胞内的单个细胞核, 其中染色质被标记为组蛋白 H2B 至绿色荧光蛋白。这些电影表明, 拉伸应变诱导染色质结构和动力学的变化, 这与少突胶质细胞分化的进展是一致的。

在施加应变下的活细胞成像在技术上具有挑战性, 需要与显微镜系统兼容的设备设计。这里描述的定制设计提供了一种廉价的商业解决方案替代方案。它的尺寸使其能够安装在显微镜阶段, 并在施加应变期间以较高的空间分辨率进行活细胞成像。成像设置的目的是促进活细胞成像使用100x 油浸没镜头与最高的清晰度, 通过盖板, 而不是通过层的聚二甲基硅氧烷板, 否则降低图像质量, 是常见的大多数在应变下的成像设置。该装置有一个装有细胞的安装板, 也可以很容易地储存在孵化器中。该装置旨在将单轴菌株施加于底层, 促进粘附细胞培养, 并在多天内保持稳定均匀的应变。这里描述的设置可用于应变下各种粘附细胞类型的高分辨率成像, 使其适用于细胞机械生物学许多领域的机械转导研究。

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Protocol

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1.用于高分辨率成像的单井聚二甲基硅氧烷模具的设计

注: 用于制造聚二甲基硅氧烷板的模具具有以下特点, 可使用100x 油浸没镜头进行成像, 并在定制应变装置中进行正确的拟合 (图 1 a, b)。

  1. 保持整体板材尺寸, 使其适合应变装置的夹具。
    注: 在这里, 他们是60毫米 x 73 毫米。
  2. 制造一个明显小于整个板的侧向尺寸的细胞室或井, 以避免在施加应变期间在聚二甲基硅氧烷板的未夹紧边缘发生电弧 (平面外弯曲) 效应。
    注: 在这里, 隔间被设计为一个23毫米 x 23 毫米的正方形。
  3. 将电池隔间的深度保持在尽可能小的 (不超过 80μm), 以便通过放置在隔间顶部的盖板玻璃使用100x 油浸没镜头进行聚焦, 但要使其足以包含介质, 并避免接触或挤压细胞。
  4. 将电池隔间提升到高度为3毫米的正方形上, 使细胞更接近倒置显微镜设置中的镜头, 以便于对焦。
    注: 具有上述特征的模具可以通过许多技术制造, 例如, 铣削铝。或者, 主模具也可以通过使用用激光切割机切割的丙烯酸板、电池隔间的盖玻璃 #0 和超级胶水进行组装。该主模具用于制作聚二甲基硅氧烷印迹, 然后用于使用铸造树脂制作工作模具。

2. 单井聚二甲基硅氧烷板和方形隔间的制备

  1. 将聚二甲基硅氧烷碱基和固化剂混合在一次性杯中, 比例为 20:1 (按重量)。每模总重量20克聚二甲基硅氧烷 (用于制作一个聚二甲基硅氧烷板), 每直径150米塑料盘称量150克聚二甲基硅氧烷 (用于制造一批方形隔间)。
  2. 将聚二甲基硅氧烷混合物放在真空脱气器中, 时间为-0.8 bar, 时间为 30分钟 (或直到所有气泡被去除)。
  3. 将聚二甲基硅氧烷混合到模具 (板) 或150毫米塑料盘 (方隔) 中。
  4. 在此阶段, 通过吹气 (口) 或在-0.8 bar 真空中再次脱气, 再次将充满聚二甲基硅氧烷的模具/洗碗剂去除任何其他气泡。
  5. 将模具盘放在80°c 的烤箱中, 放在平整的桌子上2小时。
  6. 小心地从烤箱中取出模具盘, 让它们冷却到室温。用刀片小心切割边缘后, 轻轻剥离固化后的聚二甲基硅氧烷 (图 1C)。
  7. 在150毫米直径的聚二甲基硅氧烷上, 用标记绘制一个2厘米 x 2 厘米的网格。在每个正方形内, 绘制一个1厘米 x 1 厘米的正方形, 在所有侧面留下0.5 厘米的边缘。使用刀片, 小心地沿着线条切割, 以获得方形隔间 (图 2a)。
  8. 用100% 丙酮孵育4小时, 然后用100% 乙醇 4年, 然后用蒸压水 4年, 将聚二甲基硅氧烷方形隔间清洗干净。
  9. 将方形隔间放在直径150毫米的塑料盘内的石蜡底纸 (不是石蜡膜, 而是纸)上。
  10. 将聚二甲基硅氧烷板放在80°c 的烤箱中晾干4小时。
  11. 用石蜡膜密封含有聚二甲基硅氧烷板和容器方块的150毫米直径的盘子, 并将其存放在冷藏室中, 直至进一步使用。

3. 聚二甲基硅氧烷板的功能化

  1. 取下石蜡膜, 取下塑料盘的盖子, 并将聚二甲基硅氧烷板和方形隔间放置在紫外线下30分钟。
  2. 等离子处理 (在 150 W 为 5分钟) 的聚二甲基硅氧烷板 (与细胞室朝上) 没有方形隔间, 使培养表面亲水。
  3. 立即将方形隔间放置在处理等离子的表面 (图 2B) 上, 然后手动按下, 将两者暂时粘合在一起。
    注: 不要对方形隔间进行等离子处理, 否则它们会强烈粘附在聚二甲基硅氧烷板上, 并且在成像过程中必须剥落时不会轻易脱落。
  4. 将 100μl (3-氨基丙基) 三乙氧基硅烷加入井中 2小时, 将–NH2 基团引入聚二甲基硅氧烷表面。要使 100 mM 溶液在10毫升的水中溶解234μl 的纯 (3-氨基丙基) 三乙氧基硅烷。孵育2小时后, 用去离子水清洗3x 井。
  5. 称量2毫克分子交联剂双磺酸亚酯, 并将其溶解在100μl 的 1 M (4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸缓冲液 (pH 8.0) 和 2.8 mL 水中。
    注: 这将使 1 mM 的双磺酰胺-琥珀酰亚甲酸酯溶液在 200 mM (4-(2-羟乙基)-1-吡嗪乙烷磺酸缓冲液中。请注意, 50 mM 浓度缓冲液也能很好地工作。
    1. 在室温下4小时的每个聚二甲基硅氧烷板的井中加入135Μl 的该溶液, 并在每个聚二甲基硅氧烷板中加入15μl 的 1 mgml 纤维连接蛋白。
  6. 用磷酸盐缓冲盐水清洗3倍。在井中加入500Μl 的磷酸盐缓冲盐水。用石蜡膜覆盖150毫米直径的含有聚二甲基硅氧烷的盘, 并将其存放在冷藏室中, 直至进一步使用。

4. 塑料盘子和烧瓶的功能化

  1. 用5μgml 溶液的聚 d-赖氨酸 (PDL, 无菌水) 将塑料盘和烧瓶在 1 h 处. 每35毫米直径的盘加入 1.5 mL 的这种溶液 (配体), 每60毫米直径的盘子添加3毫升, 每75厘米2培养瓶10毫升.
  2. 用无菌水清洗盘子和烧瓶2x。
  3. 让它们在生物安全柜里干燥 1小时 (或直到干燥), 并在4°c 的冷藏室中存放, 直到进一步使用。

5. 小鼠少突胶质细胞增殖和分化培养基

  1. 制备增殖和分化介质的100x 溶液的50毫升, 制成 2.5 mL 的等价物, 并将其存放在-80°c。
    注: 增殖培养基的组成为 0.1 mg/mL 牛血清白蛋白, 62 ngml 黄体酮, 16μgml put撤销 ine, 5μgml 胰岛素, 50μgml 全转铁蛋白, 5 Ng/ml 硒酸钠, 1x 青霉素-链霉素, 10 ngml 血小板衍生生长在 Dulbecco 的改良鹰培养基 (DMEM) 中, 与高葡萄糖和丙酮酸的 10 ngml 成纤维细胞生长因子。虽然牛血清白蛋白、黄体酮、硬皮石和硒酸钠可以在100x 处形成和储存, 但在制备1x 溶液时, 必须添加新鲜的胰岛素、全息转铁蛋白和青霉素。生长因子必须在10μgml 时形成, 并且必须每天在细胞中添加新鲜的生长因子 (培养基的 1μlml)。分化培养基的组成为 0.1 mgml 牛血清白蛋白, 62 Ng/ml 黄体酮, 16μml 酯, 5μgml 胰岛素, 50μgml holo-redfrin, 5 ngml 硒酸钠, 1x penicillin 链霉素, 400 ngml 三碘胸苷, 400 Ng/mlL-甲状腺素和0.5% 的胎儿牛血清在高葡萄糖和丙酮酸 DMEM。三碘胸苷和 l-甲状腺素可以与其他试剂组成, 并存储在100x。在制备1x 溶液时, 必须添加新鲜的胰岛素、全息转铁蛋白和青霉素。
  2. 用于制备100x 增殖介质的50毫升, 在 Dulbecco 培养基17毫升中溶解510毫克的牛血清白蛋白, 在31μl 乙醇中溶解310微克黄体酮, 在 500Μl Dulbecco 培养基中溶解80毫克的酯类, 在 Dulbecco 培养基中溶解25微克的硒酸钠, 和完整的 DMEM 高达50毫升
  3. 为制备分化培养基100x 溶液的50毫升, 另外在40Μl 氢氧化钠中溶解2毫克的三碘胸苷, 在40μl 氢氧化钠中溶解2毫克 l-甲状腺素, 然后用 Dulbecco 培养基将溶液灌满50毫升。通过无菌一次性过滤单元过滤溶液, 并将脂肪储存在-80°c。
  4. 为制备1x 增殖/分化培养基的250毫升, 将扩散/广氨酸的100x 溶液的 2.5 mL 与12.5 毫克的全转铁蛋白、125μl 的 10 mgml 胰岛素和 2.5 mL 的100x 青霉素。用 Dulbecco 的培养基将溶液填充到250毫升, 并通过无菌一次性过滤单元进行过滤。
    注: 生长因子必须添加新鲜和直接的细胞培养, 而不是整个批次重组的介质。

6. 细胞培养

  1. 从悬浮在增殖培养基中的少突胶质细胞祖细胞开始。将这些细胞以 35, 000 细胞/厘米2的密度播种到 pdl 涂层的塑料表面 (盘子或烧瓶, 见第4节)。将增殖介质的体积调整到塑料底层表面积的每10厘米 2 3 毫升;较低的介质体积可能会导致细胞聚集产生于表面张力, 而较高的培养基体积可能会导致溢出。
  2. 每天添加生长因子 (血小板衍生生长因子和纤维连接蛋白生长因子), 将其浓度保持在 10 ngml, 并在隔天改变一半的增殖介质。
  3. 第三天, 用温和的细胞分离液 (如辅酶) 将细胞从塑料表面分离出来: 取出培养基, 用磷酸盐缓冲盐水清洗 1x, 每20厘米2面积加入1毫升分离液, 离开洗碗瓶在37°c 的孵化器中, 在37°c 下轻轻点击它, 直到所有细胞都分离 (在显微镜下观察)。
  4. 移液器使用200μl 尖端将团块分解成单个细胞, 将其转移到 50 mL 管中, 在增殖介质中稀释, 在 0.2 x 克旋转 10分钟, 丢弃上清液, 并在增殖介质中重新悬浮颗粒, 使总体积为1毫升。用细胞仪数数细胞。
  5. 用增殖培养基清洗纤维功能化的聚二甲基硅氧烷板 2倍, 每次清洗15分钟。
  6. 在700μl 增殖培养基中, 每粒聚二甲基硅氧烷板种子 35, 000 细胞。
  7. 加入 H2B-gfp 质粒结构, 用绿色荧光蛋白标记 H2B 组蛋白。
    注: 在这里, 在每个板 (每 50, 000个细胞2μl) 中加入 1.4ΜH22-GP Bacm2 转染混合物。
  8. 24小时后, 将聚二甲基硅氧烷样品与要拉伸的细胞一起安装在单轴应变装置上 (如图 2D所示)。将所有样品中的培养基转化为分化培养基。
  9. 要对样品进行应变, 请测量未应变的电池室长度 (图 3 a), 并转动阶段千分尺螺钉, 以将电池室长度增加所需的量 (例如, 10%, 见图 3A)。将拉伸和未拉伸的聚二甲基硅氧烷样品放在37°c 的孵化器中, 直到成像。

7. 成像

  1. 打开显微镜。将显微镜孵化器温度设置为37°c。
  2. 将要使用的目标 (100x 油浸) 带到中心位置, 因为目标炮塔以后将无法进入。拧下目标, 然后用一个目标环 (图 4 a) 将其拧回一起, 以便使目标更接近细胞。如果这里使用的是石油目标, 请在此步骤中添加一滴油。
  3. 事先 (通过3D 打印或加工) 合成具有两个重要特征 (角度窗口和步骤) 的塑料或金属支架 (图 4b)。
    注: 窗口支持在应变装置处于倒置状态时保持介质的厚度 #0 玻璃盖板。窗口边缘的角度切割 (图 4d) 使目标更接近玻璃覆盖物。支架的步骤使我们能够使拉伸的聚二甲基硅氧烷进一步向下, 更接近目标。
  4. 通过将真空润滑脂铺在窗玻璃外围 (图 4C), 将玻璃盖板 (厚度 #0, 尺寸为25毫米 x 25 毫米或直径35毫米) 放在支架的顶部表面, 并将塑料窗粘在显微镜舞台上 (图 4D图 5a)。
  5. 将 z 平移阶段拧紧到显微镜舞台上, 并将其移动到最顶部的 z 位置 (图 5a)。
  6. 从拉伸的聚二甲基硅氧烷板上取出500Μl 进行成像, 并将该介质添加到白色塑料窗的玻璃盖板上。
  7. 用无菌推拿器小心地将方形隔间从聚二甲基硅氧烷板上分离。
  8. 将应变装置保持在白色塑料窗上方的垂直位置 (细胞朝上), 并小心地倒置应变装置, 以便让任何额外的介质直接落在玻璃覆盖件的中间 (图 5B) (细胞朝下)。
  9. 使用双面胶带将应变装置的底部放置在z平移阶段 (图 5c, d)。
  10. 在明亮场下查看目镜时, 慢慢地将应变装置向下 (图 5e) (通过降低z-翻译阶段), 并将目标向上移动, 以集中在细胞上。
    1. 执行此步骤非常缓慢, 一步一步。如果应变装置压在覆盖上的太多, 细胞可能会被压缩 (导致它们死亡), 如果目标压在覆盖板上太多, 覆盖物可能会破裂 (导致介质泄漏并溢出到目标上)。
  11. xy方向上扫描聚二甲基硅氧烷板, 以找到具有荧光核的细胞 (在具有 488 nm 波长激发的卵荧光下) 和适当的细胞形态 (在明亮场下)。
  12. 如果显微镜阶段的横向位移对垂直对焦的影响不大, 请使用软件上的多点特征选择多个感兴趣的区域。有时, 对焦对舞台的任何横向位移都非常敏感。在这种情况下, 一次对一个单元格进行成像。标记每个感兴趣的单元格的xyz位置。
  13. 记录具有 488 nm 波长激发的核的广域 (或开孔) 图像, 并记录每帧每帧30秒间隔具有明亮场激发的电池的广域 (或开孔) 图像, 总持续时间至少为30分钟。

8. 数据分析

  1. 核波动
    1. 在图像分析软件中打开原子核图像序列 (图 6a), 并阈值原子核延时图像 (例如, 使用 ImageJ 中的阈值命令或 Matlab 软件中的gray阈 h命令)。
    2. 获取核心区域 (以像素为单位) 作为时间的函数, 在数据绘图软件中绘制它 (图 6b), 并将三阶多项式与数据相匹配 (图 6B) (例如, 使用分析管接头"起源" 中的多项式拟合命令或软件 matlab 中的 "多拟合" 命令).
    3. 从每个时间点的实际区域 (以像素为单位) 减去拟合多项式的值。此校正区域称为剩余区域。
      注: 此过程消除仪器错误产生的数据中任何增加或减少的趋势, 称为 "去趋势"。
      1. 通过将每个时间点的剩余面积与该时间点的拟合多项式值除以剩余面积的百分比来计算残差面积的百分比 (图 6D)。
    4. 计算剩余面积时间序列的标准偏差。此标准偏差表示核波动的幅度。
  2. 数据绘制和统计分析
    1. 计算核波动的振幅为每个条件至少20个原子核的平均值。
    2. 使用 Bonferroni 校正进行单向方差分析统计测试, 以确定波动幅度是否与感兴趣的条件的函数有显著差异 (例如, 有和没有施加应变)。

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Representative Results

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最近旨在研究拉伸应变对少突胶质细胞10的影响的研究表明, 10% 的单轴拉伸应变通过基因表达的全球变化促进少突胶质细胞的分化。通过对细胞骨架结构、转录因子定位、核动力学和染色质组织等亚细胞参数的成像, 可以探讨基因表达变化背后的机制。然而, 以前的几何形状的聚二甲基硅氧烷底物不允许高分辨率的单细胞成像。如本文所述, 重新设计的聚二甲基硅氧烷底层几何形状和成像设置最大限度地缩短了细胞与目标之间的距离。这允许使用100x 的油浸没目标捕获荧光标记的细胞核的延时图像 (图 6a)。

核投射区域的波动取决于细胞的分化状态11,12。少突胶质细胞的核波动与最终分化的少突胶质细胞的核波动比较表明, 后者的波动明显较低 (图 6E)。其次, 比较了少突胶质细胞在1小时、24小时和48小时后化学诱导分化时的核波动, 并对其拉伸应变和不拉伸应变有10% 进行了比较。仅化学感应, 核波动幅度就显著下降, 为 48小时, 但不为 24小时 (图 6F)。另一方面, 化学诱导加上10% 的拉伸应变, 在24小时时明显下降, 保持不变, 而在48小时没有进一步减少 (图 6G)。

本文描述的底层几何和成像配置使紧张细胞的高分辨率电影能够被记录。随后对这些电影的分析表明, 应变加速了核波动的抑制, 而核波动是分化的标志。这些结果使人们深入了解菌株促进少突胶质细胞分化的机制。Makhia 等人对这些结果的解释和今后的实验作了进一步的讨论

Figure 1
图 1:的设计和几何形状.聚二甲基硅氧烷模具.(A) 显示所有尺寸 (该草图由新加坡 whits technologies 生成)。(B) 模具的三维视图 (改编自 makyia 等人.插入显示模具的照片。(C) 使用该模具制作的聚二甲基硅氧烷板的三维视图 (改编自makhia 等人, 第11款)。插入物显示了聚二甲基硅氧烷板的照片。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2:样品制备.(A) 聚二甲基硅氧烷板和方形隔间的照片。(B) 方形隔间放置在聚二甲基硅氧烷板上凸起的正方形上。其目的是为细胞含有培养基。(C) 聚二甲基硅氧烷板储存在150毫米直径的塑料盘子中, 使用副乙烯醇纸, 以防止聚二甲基硅氧烷粘附在塑料上。(D) 将板材安装到应变装置上时, 用两根手指从底部支撑, 以防止板材下垂。如果板在安装后仍有一点下垂, 则通过转动转换阶段来增加应变装置臂之间的距离。在此步骤中, 阶段的平移不应引起聚二甲基硅氧烷板的应变。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 细胞拉伸.(A) 使用标尺测量夹子之间板的初始长度。(B) 通过在平移阶段转动螺钉来拉伸板, 以增加所需的初始板长度。X% 的长度增加对应于 x% 的应变。请注意, 要生成所需的应变 (x%)在凸起的细胞培养室中, 主板必须被更高的量 (约 2倍) 拉紧因为它们在所述板材几何形状中的厚度不同。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4:成像准备.(A) 将100x 目标带到炮塔的中心位置, 拧下目标, 并将其与目标环拧回一起。(B) 持有人的素描, 以毫米为单位显示所有尺寸。(C) 在支架的窗体外围涂上真空润滑脂, 使用移液器尖端, 并在顶部放置玻璃盖板。使用厚度 #0 或 #1 的盖板玻璃, 使100x 油浸镜片能够聚焦。(D) 将支架 (1) 置于显微镜舞台 (2) 上。使用真空润滑脂 (4), 使油 (6) 目标 (3) 更接近卡在支架上的盖板 (5)。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5: 显微镜上的成像设置.(A) 将z平移阶段 (黄色箭头) 和支架 (红色箭头) 组装到显微镜舞台上。(B) 将应变装置倾斜到显微镜下, 以便使任何介质落在支架的玻璃盖板上。在应变装置上贴上双面胶带 (蓝色箭头), 该装置将粘附在 z 翻译阶段。(C) 将应变装置置于倒置位置, 在z-翻译阶段提供支持。电池必须与塑料支架的玻璃盖板对齐。(D) 应变装置的倒置几何形状最大限度地减少了细胞与目标之间的距离, 从而促进了高分辨率成像 (改编自makhia 等人.(E) 将应变装置放下之前的侧视图 (1);将应变装置放下后的侧面视图 (2);将应变装置放下后的顶视图 (3)。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 6
图 6:代表核心的图像和区域波动数据.这一数字改编自 makhia 等。(A) 标记为绿色荧光蛋白的组蛋白 h2b 标记的细胞核的典型图像, 以及分化的少突胶质细胞祖细胞。细胞核处于焦点状态, 而细胞过程则失去了焦点。(B) 核区域的典型时间序列 (以像素为单位)。(C) 与数据拟合的三阶多项式。(D) 剩余面积波动时间序列的百分比。(E) 增殖少突胶质细胞和终末分化少突胶质细胞的核边缘波动。(F) 在1小时、24小时和48小时的核边缘波动诱导后, 在没有应变的情况下进行化学分化。(G) 在诱导10% 拉伸应变的化学分化后1小时、24小时和48小时的核区域波动。请点击这里查看此图的较大版本.

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Discussion

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以前设计的一种装置是为粘附细胞应用细胞外拉伸应变而设计的。该工作中的聚二甲基硅氧烷底层的设计足以进行生化检测, 以及拉伸细胞的低分辨率成像。在这项工作中, 对底层进行了重新设计, 并介绍了一种新的成像配置, 以促进高分辨率的亚细胞活细胞成像。该系统的优点是多方面的: 它可以在实验室中使用简单的组件, 它是便宜的商业应变设备 (500 美元每个细胞应变设备), 它是足够小, 以适应组织培养孵化器, 以及到显微镜。此外, 尽管这里已经用倒置显微镜装置描述了成像系统, 但它可以很容易地调整为直立显微镜的配置。

样品制备和成像涉及几个关键步骤。首先, 在细胞播种之前必须彻底清洗聚二甲基硅氧烷板和方形隔间 (协议步骤 2.8), 以确保细胞存活 (因为未固化的聚二甲基硅氧烷对细胞有毒)。其次, 由于可放入方舱内的流体介质体积小于1毫升, 如果样品在孵化器中几天, 可能会蒸发。因此, 必须每天检查介质, 并在需要时补充。此外, 聚二甲基硅氧烷板上的凸起面积可以用直径60毫米的倒置塑料盘覆盖, 以最大限度地减少蒸发。第三, 在通过z-翻译阶段将显微镜上的应变装置向下移动时, 必须格外小心, 以使细胞更接近玻璃覆盖层。压缩细胞 (甚至片刻) 之间的聚二甲基硅氧烷底层和玻璃覆盖物可能会导致细胞死亡。第四, 在去除聚二甲基硅氧烷样品后, 死细胞和细胞碎片可能会粘附在玻璃覆盖片上。因此, 在成像后, 玻璃盖板必须从真空润滑脂中取出, 在安装新样品之前, 应安装一张新的盖板。

应变装置的局限性在于, 阶段侧向位移的应用不能被编程来进行循环或拉紧应变, 只能施加单轴应变。在所述几何学中, 聚二甲基硅氧烷底层的局限性在于, 高于25% 的菌株可能会导致聚二甲基硅氧烷断裂。

今后为改进聚二甲基硅氧烷底层的设计而进行的改进可能是在细胞培养表面加入网格。这将允许在应用拉伸应变之前和之后跟踪同一细胞。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

所有作者都感谢新加坡国家研究基金会通过新加坡麻省理工学院研究与技术联盟 (SMART) 生物系统和微力学 (BioSyM) 跨学科研究小组提供的资金支持。作者 Jagielska 博士和 Van Vliet 博士也感激地感谢 Sks-kavanaugh 基金会的资助和支持。作者感谢新加坡南洋理工大学的王威廉和郑一周博士为本文中描述的一些实验提供了大鼠少突胶质细胞, 并感谢来自新加坡南洋理工大学的 g. v. Shivashankar 博士。新加坡国立大学机械生物学研究所, 讨论核区域波动问题。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Primary cells Primary Oligodendrocyte Progenitor Cells isolated from Neonatal Rats
were provided by Dr. S. Y. Chew's lab at Nanyang Technological University
Media
DMEM high  glucose Gibco 11996-065-500ml
Pen/Strep Gibco 15070-063-100ml
FGF Prospec CYT-608-50ug
PDGF Prospec CYT-776-10ug
Media Stock components
BSA Sigma A9418-10G
Progesterone Sigma P8783-1G
Putrescine Sigma P5780-5G
Sodium Selenite Sigma S5261-10G
Tri-iodothyronine Sigma T6397-100MG
Thyroxine Sigma T1775-100MG
Holo-Transferrin Sigma T0665-500MG
Insulin Sigma I9278
Mold and PDMS plate
PDMS - Dow Corning Sylgard 184 Ellsworth 184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Mold - Liquid Plastic Smooth-On Smooth Cast 310 - Trail Size
Substrate Coatings
poly-D-lysine Sigma P6407-5MG
Fibronectin Sigma F1141-2MG
Histone staining
CellLigt H2B-GFP BacMam Molecular Probes C10594
Surface functionalization
APTES Sigma A3648-100ml
BS3 Covachem 13306-100mg
HEPES buffer pH 8.0 Alfa Aesar J63578-AK-250ml
Cell detachment
Accutase Invitrogen A1110501-100ml

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References

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单轴拉伸应变下活细胞核动力学的高分辨率成像
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Makhija, E., Jagielska, A., Van Vliet, K. J. High-resolution Imaging of Nuclear Dynamics in Live Cells under Uniaxial Tensile Strain. J. Vis. Exp. (148), e59474, doi:10.3791/59474 (2019).More

Makhija, E., Jagielska, A., Van Vliet, K. J. High-resolution Imaging of Nuclear Dynamics in Live Cells under Uniaxial Tensile Strain. J. Vis. Exp. (148), e59474, doi:10.3791/59474 (2019).

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