Summary
Ved hjælp af en tidligere designet enhed til at anvende mekanisk belastning til vedklædnings celler, dette papir beskriver en redesignet substrat geometri og et tilpasset apparat til høj opløsning enkelt celle billedbehandling af anstrengte celler med en 100x olie fordybelse mål.
Abstract
Ekstracellulær mekanisk stamme er kendt for at fremkalde celle fænotypiske reaktioner og har fysiologiske relevans i flere vævs systemer. For at indfange effekten af anvendt ekstracellulær træk stamme på cellepopulationer in vitro via biokemiske assays, en anordning er tidligere blevet designet, som kan være fremstillet enkelt og er lille nok til at passe inde væv kultur inkubatorer, samt på toppen af mikroskop stadier. Det tidligere design af Polydimethylsiloxan substrat tillod imidlertid ikke subcellulær billeddannelse i høj opløsning via olie-nedsænkning mål. Dette arbejde beskriver en redesignet geometri af Polydimethylsiloxan substrat og en tilpasset Imaging setup, der tilsammen kan lette høj opløsning subcellulær billeddannelse af levende celler, mens under anvendt belastning. Denne substrat kan bruges med den samme, tidligere designede enhed og dermed har de samme fordele som anført ovenfor, ud over at tillade høj opløsning optisk billedbehandling. Udformningen af Polydimethylsiloxan substrat kan forbedres ved at indarbejde et gitter, som vil lette sporing af samme celle før og efter anvendelsen af stammen. Repræsentative resultater viser høj opløsning tidsforskudt billeddannelse af optælling mærkede kerner i anstrengte celler fanget ved hjælp af den metode, der er beskrevet her. Disse nukleare dynamik data giver indsigt i den mekanisme, som anvendes trækstyrke stamme fremmer differentiering af oligodendrocyte progenitorceller.
Introduction
Celler og væv i kroppen er udsat for forskellige mekaniske stikord, herunder træk stammer. Men virkningerne af disse stikord på biologi neurale celler er endnu ikke blevet undersøgt udførligt og forstået fuldt ud. I det centrale nervesystem omfatter kilderne til mekanisk belastning udviklings vækst1,2,3,4, fysiologiske processer såsom bøjning af rygmarv, blod og cerebrospinalvæske pulsation, og patologiske tilstande såsom traumer, Axon hævelse, glia ardannelse, eller tumorvækst5,6,7,8. Det er værd at undersøge, hvordan trækstyrke påvirker differentieringen af oligodendrocytter og den efterfølgende myelination af axoner, som er en kritisk proces i det hvirveldyr centrale nervesystem. Ved hjælp af en specialdesignet stamme enhed og elastomer flerhulsplader plader, tidligere værker9,10 har vist, at statisk uniaksial stamme kan øge oligodendrocyt differentiering via globale ændringer i genekspression 10. for at opnå yderligere forståelse af mekanismerne for belastnings mekanismetransduktion i disse celler, skal det foregående forsøgs apparat redesignet som beskrevet her for at muliggøre højopløsnings fluorescens-afbildning af nuklear dynamik i levende celler under pres. Specifikt er en enkelt-brønd Polydimethylsiloxan plade udviklet, og billedbehandlings konfigurationen er redesignet til at give mulighed for time-lapse Imaging af levende celler under belastning ved hjælp af en 100x olie fordybelse linse. For at eliminere de negative optiske virkninger af Polydimethylsiloxan i lysvejen, er cellerne ikke gennem Polydimethylsiloxan-pladen, men i omvendt position, gennem dækglasset, der dækker celle rummet. Ved hjælp af denne nye Imaging design, hundredvis af høj opløsning time-lapse film registreres, af individuelle cellekerner i intakt vedstående celler, hvor kromatin er mærket ved tagging Histon H2B til grøn fluorescerende protein. Disse film viser, at træk stamme inducerer ændringer i kromatin struktur og dynamik, der er i overensstemmelse med progression af oligodendrocyt differentiering.
Levende celle afbildning under påført belastning er teknisk udfordrende og kræver et enheds design, der er kompatibelt med mikroskop systemet. Det brugerdefinerede design, der beskrives her, udgør et billigt alternativ til kommercielle løsninger. Dens dimensioner gør det muligt at installere på mikroskop stadier og levende celle Imaging ved høj rumlig opløsning under anvendt stamme. Billedbehandlings opsætningen er designet til at lette levende celle billeder ved hjælp af en 100x olie fordybelse linse med den højeste klarhed, gennem dækglasset, ikke gennem lag af Polydimethylsiloxan plade, som ellers nedsætter billedkvaliteten og er almindelig i de fleste billedbehandlings opsætninger under belastning. Enheden, med en monteret plade, der indeholder celler, kan også opbevares let i inkubator. Denne enhed er designet til at anvende uniaksial stamme til substrater, der letter vedklædelig cellekultur og opretholder en stabil og ensartet stamme over flere dage. Opsætningen, der beskrives her, kan bruges til højopløselig billedbehandling af forskellige vedhæng ende celletyper under belastning, hvilket gør den anvendelig på mekanisotransduktion undersøgelser inden for mange områder af celle mekaniobiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. design af enkelt-godt Polydimethylsiloxan skimmelsvamp til høj opløsning Imaging
Bemærk: formen til fremstilling af Polydimethylsiloxan plader er designet med følgende funktioner til at muliggøre billeddannelse med en 100x olie fordybelse linse og en korrekt pasform i Custom-Build stamme enhed (figur 1a, B).
- Hold de samlede plade dimensioner således, at det passer i klemmerne af stammen enhed.
Bemærk: her er de 60 mm x 73 mm. - Lav et cellerum eller en brønd, der er betydeligt mindre end hele pladens tværgående dimensioner, for at undgå bukning (uden for plane bøjning), der sker ved de uskarpe kanter på polydimethylsiloxanpladen under påført belastning.
Bemærk: her er rummet designet som et 23 mm x 23 mm kvadrat. - Hold dybden af celle rummet så minimal som muligt (ikke mere end 80 μm), for at muliggøre fokusering med 100x olie fordybnings linsen gennem dækglasset placeret oven på rummet, men gør den tilstrækkelig til at indeholde medier og for at undgå at kontakte eller klemmer cellerne.
- Hæv celle rummet på en firkant med en højde på 3 mm, for at bringe cellerne tættere på linsen i det inverterede mikroskop setup for at gøre det nemt at fokusere.
Bemærk: forme med ovenstående funktioner kan fremstilles af mange teknikker, herunder, for eksempel, sleben aluminium. Alternativt kan Master forme også samles ved hjælp af akrylplader skåret med en laserskærer, Cover glas #0 til celle rummet, og super lim. Denne Master skimmel bruges til at gøre en Polydimethylsiloxan aftryk, som derefter bruges til at gøre arbejder forme ved hjælp af en støbning harpiks.
2. fabrikation af enkelt-brønd-Polydimethylsiloxan-plader og firkantede rum
- Bland Polydimethylsiloxan base og Hærdningsmiddel i et forhold på 20:1 (efter vægt) i en engangs kop. Der afvejes i alt 20 g Polydimethylsiloxan pr. skimmel (til fremstilling af en polydimethylsiloxanplade) og 150 g Polydimethylsiloxan pr. 150 mm-i-diameter plastik skål (til fremstilling af en portion firkantede rum).
- Lad Polydimethylsiloxan blandes i en vakuum afgasseren ved-0,8 bar i 30 min (eller indtil alle bobler er fjernet).
- Hæld Polydimethylsiloxan blandingen i forme (til plader) eller i 150 mm plastik retter (til firkantede rum).
- Fjern eventuelle yderligere bobler på dette tidspunkt, enten ved at blæse luft (gennem munden) eller afgasning de Polydimethylsiloxan-fyldte forme/retter igen ved-0,8 bar vakuum i 30 min.
- Lad forme/retter i en 80 °C ovn på en nivellering tabel for 2 h.
- Fjern forsigtigt forme/tallerkener fra ovnen og lad dem køle ned til stuetemperatur. Træk forsigtigt det hærdede Polydimethylsiloxan ud efter forsigtigt at skære i kanterne med en klinge (figur 1c).
- På den 150 mm-diameter Polydimethylsiloxan, tegne en 2 cm x 2 cm gitter med en markør. Inden for hvert kvadrat, tegne en 1 cm x 1 cm kvadrat, efterlader en margin på 0,5 cm på alle sider. Ved hjælp af en klinge skæres der forsigtigt langs linjerne for at opnå firkantede rum (figur 2a).
- Rengør Polydimethylsiloxan-pladerne/kvadrat rummene ved at inkuere dem i 100% acetone i 4 timer efterfulgt af 100% ethanol i 4 timer efterfulgt af autoklaveret vand i 4 timer.
- Anbring pladerne/kvadrat rummene på paraffin folie underlag (ikke paraffin folie, men papiret) inde i en 150 mm diameter plastik skål (figur 2c).
- Lad polydimethylsiloxanpladen i 80 °C-ovnen tørre i 4 timer.
- Forsegl de 150 mm-diameter skåle, der indeholder Polydimethylsiloxan-plader og container firkanter med paraffin folie, og opbevar dem i et koldt rum indtil videre brug.
3. funktionalisering af Polydimethylsiloxan-plader
- Fjern paraffin filmen, Fjern dækslet af plastik skålen, og Anbring Polydimethylsiloxan-pladerne og kvadrat rummene under ultraviolet lys i 30 minutter.
- Plasma-Treat (ved 150 W i 5 min) Polydimethylsiloxan-pladerne (med celle rummet opad) uden firkantede rum, for at gøre kultur overfladen hydrofile.
- Anbring straks kvadrat rummene på den plasma behandlede overflade (figur 2b), og tryk manuelt på for midlertidigt at holde de to sammen.
Bemærk: Undlad at plasma behandle kvadrat rummene, ellers vil de holde sig stærkt til polydimethylsiloxanpladen og vil ikke let komme ud, når de skal skrælles af under billeddannelse. - Der tilsættes 200 μL af 100 mM (3-aminopropyl) triethoxysilan til brønden i 2 timer for at introducere – NH2 -grupper til Polydimethylsiloxan-overfladen. For at lave en 100 mM opløsning opløses 234 μL ren (3-aminopropyl) triethoxysilan i 10 mL vand. Efter en 2 timer inkubation vaskes brøndene 3x med deioniseret vand.
- Der afvejes 2 mg molekyle krydsbinderens bissulfosuccinimidylsuberat og opløses i 700 μL 1 M (4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethan sulfonsyrebuffer (pH 8,0) og 2,8 mL vand.
Bemærk: Dette vil give en 1 mM bissulfosuccinimidyl suberate opløsning i 200 mM (4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethan sulfonsyrebuffer. Bemærk, at en 50 mM koncentrations buffer også fungerer godt.- Der tilsættes 135 μL af denne opløsning og 15 μL 1 mg/mL fibronectin til brønden i hver Polydimethylsiloxan-plade i 4 timer ved stuetemperatur.
- Vask 3x med fosfat-bufferet saltvandsopløsning. Tilsæt 500 μL fosfat-bufferopløsning til brønden. Dæk den 150 mm-diameter skål, der indeholder Polydimethylsiloxan, med paraffin folie, og opbevar den i et koldt rum, indtil den videre anvendes.
4. funktionalisering af plastik retter og kolber
- Plast skåle og-kolber med 5 μg/mL opløsning af poly-D-lysin (PDL, i sterilt vand) inkube i 1 time. Tilsæt 1,5 mL af denne opløsning (ligand) pr. 35 mm-diameter skål, 3 mL af den pr. 60 mm-diameter skål og 10 mL pr. 75 cm2 dyrknings kolbe.
- Vask tallerkener og kolber 2x med sterilt vand.
- Lad dem tørre i biosikkerheds kabinettet i 1 time (eller indtil tørre), og opbevar dem i det kolde rum ved 4 °C, indtil de bliver brugt yderligere.
5. spredning og differentierings medium for murine oligodendrocyt progenitorceller
- Forbered 50 mL 100x opløsninger af sprednings-og differentierings mediet, foretag aliquoter på 2,5 mL, og opbevar dem ved-80 °C.
Bemærk: sammensætningen af sprednings mediet er 0,1 mg/mL bovint serumalbumin, 62 ng/mL progesteron, 16 μg/mL putrescine, 5 μg/mL insulin, 50 μg/mL Holo-transferrin, 5 ng/mL natriumselenit, 1x penicillin-streptomycin, 10 ng/mL trombocytafledt vækst faktor og 10 ng/mL fibroblast vækstfaktor i Dulbeccos modificerede Eagle's medium (DMEM) med højt glucose og pyruvat. Mens serumalbumin af kvæg, progesteron, putrescin og natriumselenit kan konstitueres og opbevares ved 100x, skal insulin, Holo-transferrin og penicillin-streptomycin tilsættes frisk under forberedelsen af 1x opløsningen. Vækstfaktorerne skal udgøre 10 μg/mL og skal tilsættes frisk til cellerne hver dag (1 μL/mL medium). Differentierings mediets sammensætning er 0,1 mg/mL bovint serumalbumin, 62 ng/mL progesteron, 16 μg/mL putrescine, 5 μg/mL insulin, 50 μg/mL Holo-transferrin, 5 ng/mL natriumselenit, 1x penicillin-streptomycin, 400 ng/mL triiodothyronin, 400 ng/mL L-thyroxin, og 0,5% føtal kvægserum i DMEM med høj glukose og pyruvat. Triiodothyronin og L-thyroxin kan konstitueres med andre reagenser og opbevares ved 100x. Insulin, Holo-transferrin og penicillin-streptomycin skal tilsættes frisk under klargøring af 1x opløsningen. - Til klargøring af 50 mL 100x sprednings medium opløses 510 mg bovint serumalbumin i 17 mL af Dulbeccos medium, 310 μg progesteron i 31 μL ethanol, 80 mg putrescin i 500 μL af Dulbeccos medium, 25 μg natriumselenit i 10 μL af Dulbeccos medium og fuld DMEM op til 50 mL
- Til klargøring af 50 mL 100x opløsning af differentierings medium opløses desuden 2 mg triiodothyronin i 40 μL natriumhydroxid og 2 mg L-thyroxin i 40 μL natriumhydroxid, hvorefter opløsningen fyldes op til 50 mL med Dulbeccos medium. Opløsningen filtreres gennem en steril engangs filterenhed, alikvot, og aliquoterne opbevares ved-80 °C.
- Til klargøring af 250 mL 1x proliferation/differentierings medium blandes 2,5 mL 100x opløsning af proliferation/differentierings medium med 12,5 mg Holo-transferrin, 125 μL 10 mg/mL insulin og 2,5 mL 100x penicillin-streptomycin. Opløsningen fyldes op til 250 mL med Dulbeccos medium og filtreres gennem en steril engangs filterenhed.
Bemærk: vækstfaktorerne skal tilsættes frisk og direkte til cellekulturen, ikke til hele partiet af rekonstitueret medium.
6. cellekultur
- Start med oligodendrocyte progenitorceller suspenderet i spredning medium. Frø disse celler med en densitet på 35.000 celler/cm2 på PDL-belagte plast flader (fade eller kolber, se punkt 4). Volumenet af sprednings mediet justeres til 3 mL pr. 10 cm2 af overfladearealet af plastic understratum. en lavere mængde medium kan føre til celle sammenklumpning som følge af overflade spændings kræfter, mens en større mængde medium i opvasken kan forårsage spild.
- Tilsæt vækstfaktorer (trombocytafledt vækstfaktor og fibronectin vækstfaktor) hver dag, opretholde deres koncentration ved 10 ng/mL og ændre halvdelen af spredningen medium på alternative dage.
- På den tredje dag løsnes cellerne fra plastik overfladen ved hjælp af en blid celle løsrivelse (f. eks. accutase): Fjern mediet, vask 1x med fosfat-Buffered saltvandsopløsning, tilsæt 1 mL løsningens opløsning pr. 20 cm2 område, lad skålen/kolben i en inkubator ved 37 °C i 10 minutter, og tryk forsigtigt på den, indtil alle celler har løsnet sig (Se under et mikroskop).
- Pipette ved hjælp af en 200 μL spids til at bryde klumper i enkeltceller, overføre dem til et 50 mL rør, fortynde dem i proliferation medium, spin ved 0,2 x g i 10 min, kassér supernatanten, og opslæk pellet i sprednings medium for at gøre en samlet volumen på 1 ml. Tæl cellerne ved hjælp af et cytometer.
- Vask fibronectin-funktionaliserede Polydimethylsiloxan plader 2x, 15 min per vask, med proliferation medium.
- Frø 35.000 celler pr. Polydimethylsiloxan-plade i 700 μL sprednings medium.
- Tilsæt en plasmid-konstruktion af H2B-GFP til mærkning af Histon H2B med grønt fluorescerende protein.
Bemærk: her blev 1,4 μl af celllight H2B-gfp BacMam2 transfektering mix føjet til hver plade (2 μl pr. 50.000 celler). - Efter 24 timer monteres Polydimethylsiloxan-prøverne med celler, der skal strækkes på enheden med uniaksiale belastninger (som vist i figur 2D). Skift mediet i alle prøver til differentierings mediet.
- For at belaste prøverne skal du måle den ubelastede celle rums længde (figur 3a) og dreje fase mikrometer skruen for at øge celle rummets længde med den ønskede mængde (f. eks. 10%, se figur 3b). Lad de strakte og ustrakte Polydimethylsiloxan-prøver i inkubatoren være ved 37 °C indtil billeddannelse.
7. billeddannelse
- Tænd for mikroskopet. Indstil mikroskop-inkubatortemperaturen til 37 °C.
- Bring målet til at blive brugt (100x olie fordybelse) til den centrale position, da det objektive tårn vil ikke være tilgængelig senere. Skru målet og skru det tilbage sammen med en objektivring (figur 4a), så målet kan bringes tættere på cellerne. Hvis der bruges en olie målsætning her, tilsættes en dråbe olie på dette trin.
- Syntetisere på forhånd (via 3D-udskrivning eller bearbejdning) en plastik-eller metalholder, der har to vigtige funktioner — et vinklet vindue og et trin (figur 4b).
Bemærk: vinduet understøtter en tykkelse #0 glas dækglas, der vil holde mediet, mens stammen enheden er i en inverteret tilstand. Det vinklede snit ved vindueskanterne (figur 4d) gør det muligt at nå målet om at komme tættere på glas dæksedlen. Trinnet i holderen giver os mulighed for at bringe den strakte Polydimethylsiloxan længere nede, tættere på målet. - Anbring en dækplade af glas (tykkelse #0 med en diameter på 25 mm x 25 mm eller 35 mm) på beholderens øverste overflade ved at sprede vakuum fedtet i vinduets periferi (figur 4c) og tape plast vinduet over på mikroskopet ( Figur 4D og figur 5a).
- Skru et z-oversættelses stadie på mikroskopet og Flyt det til den øverste z-position (figur 5a).
- Fjern 500 μL af mediet fra den strakte Polydimethylsiloxan-plade, der skal indlagres, og tilsæt dette medium på glas dæksedlen i det hvide plastik vindue.
- Tag forsigtigt det firkantede rum ud af polydimethylsiloxanpladen med sterile pincetter.
- Hold stammen enhed i en opretstående position (celler vender opad) over det hvide plastik vindue og forsigtigt invertere stammen enhed, så at lade enhver ekstra medium dråbe direkte i midten af glasset dækglas (figur 5b) (celler vender nedad).
- Anbring den nederste del af stamme enheden på z-oversættelses stadiet med dobbeltsidet tape (figur 5c, D).
- Mens du kigger gennem okularet under brightfield, langsomt bringe stammen enheden ned (figur 5E) (ved at sænke z-oversættelse etape) og flytte målet op til at fokusere på cellerne.
- Udfør dette trin ekstremt langsomt, trin for trin. Hvis stammen enhed presser for meget på dækglas, cellerne kan få komprimeret (forårsager dem til at dø), og hvis målet presser for meget på dækglas, kan dækglas bryde (forårsager medium til lækage og spill på målet).
- Scan Polydimethylsiloxan pladen i x-og y-retninger for at finde en celle, der har en fluorescerende kerne (under epifluorescens med 488 nm bølgelængde excitation) og passende celle morfologi (under brightfield).
- Hvis den laterale forskydning af mikroskopet ikke påvirker den lodrette fokusering for meget, skal du vælge flere interesseområder ved hjælp af en multipunkts funktion på softwaren. Nogle gange er fokus meget følsom over for enhver sideforskydning af scenen. I sådanne tilfælde skal du afbilde en celle ad gangen. Markér x-, y-og z-positionerne for hver celle af interesse.
- Optag Wide-felt (eller Open-pinhole) billeder af kernen med 488 nm bølgelængde excitation og af cellen med lysfelt excitation med intervaller på 30 s pr ramme for en samlet varighed på mindst 30 min.
8. data analyse
-
Nukleare udsving
- Åbn sekvensen af kerne billeder (figur 6a) i en billedanalyse software, og tærskel kerne tidsforløbs billederne (brug f. eks. kommandoen Threshold i ImageJ eller kommandoen GRAYTHRESH i softwaren MATLAB).
- Få kernen område (i pixels) som en funktion af tid, plot det i en data plot software (figur 6b), og passe en tredje ordre polynomium til data (figur 6c) (for eksempel, bruge analysen | Fitting | Kommandoen polynomial fit i Origin eller polyfit -KOMMANDOEN i softwaren MATLAB).
- Subtrahere værdien af den monterede polynomium fra det faktiske område (i pixels) for hvert tidspunkt. Dette korrigerede område er kendt som rest arealet.
Bemærk: denne proces fjerner enhver stigende eller faldende tendens i de data, der kommer fra instrumental fejl og kaldes detrending.- Procentdelen af rest arealet beregnes ved at dividere rest arealet på hvert tidspunkt med værdien af den monterede polynomium på dette tidspunkt (fig. 6d).
- Beregn standardafvigelsen for rest områdets tidsserie. Denne standardafvigelse betegner amplituden af nukleare udsving.
-
Data plot og statistisk analyse
- Amplituden af nukleare udsving beregnes som et gennemsnit af mindst 20 kerner pr. tilstand.
- Udfør en envejs analyse af varians statistisk test med Bonferroni-korrektion for at afgøre, om der er en signifikant forskel i udsving i svingningerne som funktion af interesseforhold (f. eks. med og uden anvendt stamme).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nylige arbejde med henblik på at undersøge effekten af trækstyrke på oligodendrocytter10 viste, at en 10% uniaksial trækstyrke fremmer differentieringen af oligodendrocyt stamceller ved globale ændringer i genekspression. Mekanismen bag disse ændringer i genekspression kan være probed via billeddannelse af subcellulære parametre, såsom cytoskelet struktur, transkription faktor lokalisering, nuklear dynamik, og kromatin organisation. Men den tidligere geometri af Polydimethylsiloxan substrat tillod ikke høj opløsning enkeltcellebilleddannelse. Som beskrevet i dette arbejde, har den redesignede geometri af Polydimethylsiloxan substrat og billedbehandlings opsætningen minimeret afstanden mellem cellerne og målet. Dette gør det muligt at opfange time-lapse billeder af optælling mærkede cellekerner ved hjælp af en 100x olie fordybelse mål (figur 6a).
Udsving i det projekterede nukleare område afhænger af den differentierede tilstand af cellerne11,12. En sammenligning af de nukleare udsving i oligodendrocyt stamceller og af terminalt differentierede oligodendrocytter viste, at sidstnævnte har betydeligt lavere udsving (figur 6E). Næste, de nukleare udsving i oligodendrocyte progenitorceller ved 1 time, 24 h, og 48 h post-kemisk induktion af differentiering med og uden en 10% træk stamme blev sammenlignet. Med kemisk induktion alene viste amplituden af nukleare udsving et signifikant fald ved 48 h, men ikke ved 24 timer (figur 6F). På den anden side viste kemisk induktion sammen med en trækstyrke på 10% et signifikant fald ved 24 timer, som forblev konstant, uden yderligere reduktion ved 48 h (figur 6G).
Under stratum geometrien og billedbehandlings konfigurationen, der er beskrevet i dette papir, gjorde det muligt at optage film med høj opløsning af anstrengte celler. Efterfølgende analyse af disse film viste, at stamme fremskynder dæmpning af nukleare udsving, som er en markør for differentiering. Disse resultater giver indsigt i den mekanisme, hvormed stammen fremmer oligodendrocyt differentiering. Yderligere drøftelser om fortolkningen af disse resultater og fremtidige eksperimenter er beskrevet i Makhija et al.13.
Figur 1: Design og geometri af Polydimethylsiloxan mug. (A) skitse af formen viser alle dimensioner i millimeter (denne skitse blev genereret af whits Technologies, Singapore). (B) tredimensionelt billede af formen (tilpasset fra Makhija et al.11). Inset viser et billede af formen. C) tredimensionalt syn af Polydimethylsiloxan-pladen, der er fremstillet ved hjælp af formen (tilpasset fra Makhija et al.11). Inset viser et foto af Polydimethylsiloxan-pladen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Prøveforberedelse. A) foto af en Polydimethylsiloxan-plade og et firkantet rum. B) kvadrat rummet anbringes på den hævede firkant på polydimethylsiloxanpladen. Dens formål er at indeholde medium for cellerne. C) Polydimethylsiloxan-plader opbevares i plast retter i 150 mm-diameter ved hjælp af parafilm papir for at forhindre, at Polydimethylsiloxan klæber på plasten. (D) under montering af pladen på stammen enhed, støtte den fra bunden med to fingre for at forhindre enhver sagging af pladen. Hvis pladen stadig er lidt efter montering, øge afstanden mellem stammen enhed arme ved at dreje oversættelses fasen. På dette trin bør oversættelsen af scenen ikke inducere en stamme i polydimethylsiloxanpladen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: celle stretching. (A) mål pladens begyndelses længde mellem klemmerne ved hjælp af en lineal. (B) stræk pladen ved at dreje skruen på oversættelses stadiet for at forøge den oprindelige plade længde med den ønskede procentsats. X% stigning i længden svarer til X% af stammen. Bemærk, at for at generere den ønskede stamme (X%) i det hævede celle kulturrum skal hoved pladen være belastet med et højere beløb (ca. 2X%) på grund af forskellen i deres tykkelse i den beskrevne plade geometri. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Forberedelse til billedbehandling. (A) bringe 100x mål til den centrale position i tårnet, skrue målet, og skrue det tilbage sammen med den objektive ring. (B) skitse af holderen, der viser alle dimensioner i millimeter. (C) Spred vakuum fedt i periferien af vinduet i holderen ved hjælp af en pipettespids, og Anbring en glas dækseddel ovenpå. Brug et cover glas med tykkelse #0 eller #1, for at aktivere fokusering med 100x olie fordybelse linse. D) Anbring holderen (1) på mikroskop stadiet (2). Bring olie (6)-målet (3) tættere på dæksedlen (5), der sidder fast på holderen, ved hjælp af vakuum fedt (4). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Opsætning af Imaging på mikroskop. (A) Monter z-oversættelses stadiet (gul pil) og holderen (rød pil) på mikroskopet. (B) hæld stamme anordningen på mikroskopet, så enhver medium dråbe kan falde på holderen på glas dæksedlen. Stick en dobbeltsidet tape (blå pil) på stammen enhed, der vil holde sig på z-oversættelse fase. C) Anbring stamme anordningen i en omvendt position, og støt den på z-oversættelses stadiet. Cellerne skal justeres efter plastik holderens glas dækseddel. D) stamme enhedens inverterede geometri minimerer afstanden mellem cellerne og målet, hvilket letter billeddannelse med høj opløsning (tilpasset fra Makhija et al.11). (E) side visning, før stamme anordningen bringes ned (1); sidevisning efter at stamme anordningen er bragt ned (2) efter at stamme anordningen er bragt ned (3). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Repræsentative billeder og område svingninger data for kernen. Dette tal er tilpasset fra Makhija et al.11. A) typisk billede af en kerne, der er mærket med HISTON H2B mærket til grønt fluorescerende protein, og en differentierende oligodendrocyt progenitorcelle. Kernen er i fokus, mens celle processerne er ude af fokus. B) typiske tidsserier for et nukleart område (i pixels). C) tredje ordre polynomium monteret på dataene. D) procentdel af rest områdets udsvings tidsserier. E) udsving i den nukleare kant af prolifererende oligodendrocyt-stamceller og terminalt differentierede oligodendrocytter. (F) nuklear kant udsving ved 1 time, 24 h, og 48 h post induktion af kemisk differentiering uden belastning. G) udsving i nukleare områder ved 1 time, 24 timer og 48 h efter induktion af kemisk differentiering med 10% trækbelastning. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En anordning er tidligere1 blevet konstrueret til anvendelse af ekstracellulær trækstyrke på vedklædige celler. Designet af polydimethylsiloxansubstratum i dette arbejde var tilstrækkeligt til biokemiske assays samt lavopløselige billeder af strakte celler. I dette arbejde, under stratum blev redesignet, og en ny Imaging konfiguration, der letter høj opløsning subcellulære levende celle Imaging blev introduceret. Fordelene ved dette system er talrige: det kan bygges in-Lab ved hjælp af enkle komponenter, det er billigt i forhold til kommercielle stamme enheder (500 USD per celle stamme enhed), og det er lille nok til at passe ind i vævskultur inkubatorer, samt på Mikroskoper. Selv om billed systemet er beskrevet her med det inverterede mikroskop setup, kan det desuden let justeres for den opretstående mikroskopi konfiguration.
Der er et par kritiske trin involveret i prøven forberedelse og Imaging. For det første skal Polydimethylsiloxan-pladerne og kvadrat rummene rengøres grundigt før celle såning (protokol trin 2,8) for at sikre cellernes overlevelse (da uhærdet Polydimethylsiloxan er giftigt for cellerne). For det andet, da mængden af væske medium, der kan passe ind i kvadrat rummet er mindre end 1 mL, kan det fordampe, hvis prøven er i inkubator i et par dage. Derfor skal mediet kontrolleres hver dag og genopfyldes efter behov. Derudover kan det hævede område på polydimethylsiloxanpladen dækkes med en inverteret plastik skål på 60 mm i diameter for at minimere fordampningen. For det tredje skal der udvises ekstrem forsigtighed, mens belastnings anordningen flyttes på mikroskopet ned via z-oversættelses stadiet for at bringe cellerne tættere på glas dæksedlen. Komprimering af cellerne (selv for et øjeblik) mellem Polydimethylsiloxan substrat og glas dækglas kan forårsage celledød. For det fjerde kan de døde celler og celle resterne forblive fastgjort til glas dæksedlen, efter at Polydimethylsiloxan-prøven er blevet fjernet. Derfor, efter billeddannelse, skal glasset dækglas trækkes fra vakuum fedt og en frisk dækglas skal fastgøres før montering af en ny prøve.
Belastnings anordningens begrænsninger er, at anvendelsen af lateralforskydning af scenen ikke kan programmeres til at udføre cyklisk eller rampet stamme, og at den kun kan anvende uniaksial stamme. Begrænsningen af polydimethylsiloxansubstratum i den beskrevne geometri er, at en stamme, der er højere end 25%, kan forårsage en fraktur af Polydimethylsiloxan.
En fremtidig ændring for at forbedre designet af Polydimethylsiloxan substrat kan være inkorporering af et gitter på celle kulturens overflade. Dette vil give mulighed for at spore den samme celle før og efter anvendelsen af træk stamme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Alle forfattere anerkender taknemmeligt finansieringsstøtte fra den nationale forskningsfond i Singapore gennem Singapore-MIT Alliance for Research and Technology (SMART) BioSystems og Micromechanics (BioSyM) tværfaglige forskningsgruppe. Forfatterne Dr. Jagielska og Dr. van Vliet anerkender også taknemmeligt støtte og støtte fra saks-Kavanaugh Foundation. Forfatterne takker William Ong og Dr. Sing Yian chew fra Nanyang Technological University, Singapore, for at give rotte oligodendrocyt progenitorceller for nogle eksperimenter, der er beskrevet i dette arbejde, og forfatterne takke Dr. G. V. Shivashankar fra Mechanobiology Institute, National University of Singapore, Singapore, med henblik på diskussioner om udsving i nukleare områder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary cells | Primary Oligodendrocyte Progenitor Cells isolated from Neonatal Rats were provided by Dr. S. Y. Chew's lab at Nanyang Technological University |
||
| Media | |||
| DMEM high glucose | Gibco | 11996-065-500ml | |
| Pen/Strep | Gibco | 15070-063-100ml | |
| FGF | Prospec | CYT-608-50ug | |
| PDGF | Prospec | CYT-776-10ug | |
| Media Stock components | |||
| BSA | Sigma | A9418-10G | |
| Progesterone | Sigma | P8783-1G | |
| Putrescine | Sigma | P5780-5G | |
| Sodium Selenite | Sigma | S5261-10G | |
| Tri-iodothyronine | Sigma | T6397-100MG | |
| Thyroxine | Sigma | T1775-100MG | |
| Holo-Transferrin | Sigma | T0665-500MG | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Mold and PDMS plate | |||
| PDMS - Dow Corning Sylgard 184 | Ellsworth | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Mold - Liquid Plastic | Smooth-On | Smooth Cast 310 - Trail Size | |
| Substrate Coatings | |||
| poly-D-lysine | Sigma | P6407-5MG | |
| Fibronectin | Sigma | F1141-2MG | |
| Histone staining | |||
| CellLigt H2B-GFP BacMam | Molecular Probes | C10594 | |
| Surface functionalization | |||
| APTES | Sigma | A3648-100ml | |
| BS3 | Covachem | 13306-100mg | |
| HEPES buffer pH 8.0 | Alfa Aesar | J63578-AK-250ml | |
| Cell detachment | |||
| Accutase | Invitrogen | A1110501-100ml |
References
- Bray, D. Mechanical tension produced by nerve cells in tissue culture. Journal of Cell Science. 410, 391-410 (1979).
- Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension. Developmental Biology. 389, (1983).
- Van Essen, D. C. A tension-based theory of morphogenesis and compact wiring in the central nervous system. Nature. , (1997).
- Smith, D. H. Stretch growth of integrated axon tracts: Extremes and exploitations. Progress in Neurobiology. 89, 231-239 (2011).
- Cullen, D. K., Simon, C. M., LaPlaca, C. M. Strain rate-dependent induction of reactive astrogliosis and cell death in three-dimensional neuronal-astrocytic co-cultures. Brain Research. , 103-115 (2011).
- Fisher, E., et al. Imaging correlates of axonal swelling in chronic multiple sclerosis brains. Annals of Neurology. 2, 219-228 (2007).
- Nikić, I., et al. A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Nature Medicine. 17, 495-500 (2011).
- Payne, S. C., Bartlett, C. A., Harvey, A. R., Dunlop, S. A., Fitzgerald, M. Functional loss during chronic secondary degeneration in rat optic nerve. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53, (2018).
- Zeiger, A. S., et al. Static mechanical strain induces capillary endothelial cell cycle re-entry and sprouting. Physical Biology. 13, 1-16 (2017).
- Jagielska, A., et al. Mechanical strain promotes oligodendrocyte differentiation by global changes of gene expression. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 93 (2017).
- Pajerowski, J. D., Dahl, K. N., Zhong, F. L., Sammak, P. J., Discher, D. E. Physical plasticity of the nucleus in stem cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1, 0-5 (2007).
- Talwar, S., Kumar, A., Rao, M., Menon, G. I., Shivashankar, G. V. Correlated spatio-temporal fluctuations in chromatin compaction states characterize stem cells. Biophysical Journal. 104, 553-564 (2013).
- Makhija, E., et al. Mechanical strain alters cellular and nuclear dynamics at early stages of oligodendrocyte differentiation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 59 (2018).
