Summary
Met behulp van een eerder ontworpen apparaat om mechanische belasting toe te passen op aanhangende cellen, dit document beschrijft een vernieuwde substratum geometrie en een aangepaste apparaat voor hoge-resolutie single-cell beeldvorming van gespannen cellen met een 100x olie onderdompeling doelstelling.
Abstract
Extracellulaire mechanische stam is bekend dat cel fenotypische reacties te lokken en heeft fysiologische relevantie in verschillende weefsel systemen. Om het effect van toegepaste extracellulaire trekspanning op cel populaties in vitro te vangen via biochemische assays, een apparaat is eerder ontworpen die kan eenvoudig worden vervaardigd en is klein genoeg om te passen in weefselkweek incubators, evenals op de top van Microscoop stadia. Echter, het vorige ontwerp van de Polydimethylsiloxaan substratum niet mogelijk hoge-resolutie subcellulaire beeldvorming via olie-onderdompeling doelstellingen. Dit werk beschrijft een herontworpen geometrie van de Polydimethylsiloxaan substratum en een aangepaste Imaging Setup die samen kunnen vergemakkelijken hoge-resolutie subcellulaire beeldvorming van levende cellen, terwijl onder toegepaste stam. Deze substratum kan worden gebruikt met dezelfde, eerder ontworpen apparaat en, dus, heeft dezelfde voordelen zoals hierboven vermeld, in aanvulling op het toestaan van hoge-resolutie optische beeldvorming. Het ontwerp van de Polydimethylsiloxaan substratum kan worden verbeterd door het opnemen van een raster dat zal vergemakkelijken het bijhouden van dezelfde cel voor en na de toepassing van de stam. Representatieve resultaten tonen een hoge-resolutie time-lapse beeldvorming van fluorescerende gelabelde kernen binnen gespannen cellen gevangen met behulp van de methode hier beschreven. Deze kern dynamiek gegevens geven inzicht in het mechanisme waarmee de toegepaste trekspanning de differentiatie van oligodendrocyte voorlopercellen bevordert.
Introduction
Cellen en weefsels in het lichaam worden onderworpen aan verschillende mechanische signalen, met inbegrip van trekspanningen. Echter, de effecten van deze signalen op de biologie van neurale cellen zijn nog niet uitvoerig bestudeerd en volledig begrepen. In het centrale zenuwstelsel, de bronnen van mechanische stam omvatten ontwikkelings groei1,2,3,4, fysiologische processen zoals het ruggenmerg buigen, bloed en hersenvocht pulsatie, en pathologische aandoeningen zoals trauma, axon zwelling, glial littekens, of tumorgroei5,6,7,8. Het is de moeite waard te onderzoeken hoe trekspanning invloed op de differentiatie van oligodendrocyten en de daaropvolgende myelination van axonen, dat is een kritisch proces in de gewervelde centrale zenuwstelsel. Met behulp van een op maat ontworpen stam apparaat en elastomere multiwell platen, vorige werken9,10 hebben aangetoond dat statische éénassige stam kan oligodendrocyte differentiatie te verhogen via de mondiale veranderingen in genexpressie 10. om verder inzicht te krijgen in de mechanismen van stam mechanotransduction in deze cellen, moet het vorige experimentele apparaat opnieuw worden ontworpen zoals hier beschreven, om een hoge-resolutie fluorescentie beeldvorming van kern dynamiek in het leven mogelijk te maken cellen onder spanning. Concreet, een single-well Polydimethylsiloxaan plaat is ontwikkeld, en de Imaging configuratie is vernieuwd om voor de time-lapse beeldvorming van levende cellen onder spanning met behulp van een 100x olie onderdompeling lens. Om de negatieve optische effecten van Polydimethylsiloxaan in het licht pad te elimineren, worden cellen niet door de Polydimethylsiloxaan plaat gebeeld, maar in de omgekeerde positie, door het afdekglas dat het compartiment van de cel bedekt. Met behulp van deze nieuwe Imaging design, honderden High-Resolution time-lapse films worden opgenomen, van de individuele celkern binnen intact aanhangende cellen, waar Chromatin wordt gekenmerkt door tagging histone H2B aan groene fluorescerende eiwitten. Deze films tonen aan dat de trekspanning veranderingen in Chromatin structuur en dynamica veroorzaakt die in overeenstemming met de vooruitgang van oligodendrocyte differentiatie zijn.
Live Cell Imaging onder toegepaste stam is technisch uitdagend en vereist een apparaat ontwerp dat compatibel is met de Microscoop systeem. Het aangepaste ontwerp hier beschreven biedt een goedkoop alternatief voor commerciële oplossingen. Zijn afmetingen stellen de installatie op Microscoop stadia en live-cel beeldvorming bij hoge ruimtelijke resolutie tijdens de toegepaste stam. De Imaging Setup is ontworpen om te vergemakkelijken levende cel beeldvorming met behulp van een 100x olie onderdompeling lens met de hoogste duidelijkheid, door het deksel glas, niet door de laag van Polydimethylsiloxaan plaat die anders vermindert de beeldkwaliteit en is gebruikelijk in de meeste Imaging setups onder spanning. Het apparaat, met een gemonteerde plaat met cellen, kan ook gemakkelijk worden opgeslagen in de incubator. Dit apparaat is ontworpen om éénassige stam toe te passen op Substrata dat de aanhangende cel cultuur te vergemakkelijken en handhaven van een stabiele en uniforme spanning over meerdere dagen. De hier beschreven opstelling kan voor de High-Resolution beeldvorming van diverse aanhangende cel types onder spanning worden gebruikt, die het maakt van toepassing op mechanotransduction studies op vele gebieden van cel Mechanobiology.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ontwerp van de single-well Polydimethylsiloxaan mal voor High-Resolution Imaging
Opmerking: de mal voor de productie Polydimethylsiloxaan platen is ontworpen met de volgende functies om beeldvorming met een 100x olie onderdompeling lens en een juiste pasvorm in de custom-build spanning apparaat (Figuur 1a, B).
- Houd de totale plaatafmetingen zodanig dat het past in de klemmen van de stam apparaat.
Opmerking: hier zijn ze 60 mm x 73 mm. - Maak een cel compartiment of goed, dat is aanzienlijk kleiner dan de laterale afmetingen van de hele plaat, om te voorkomen dat vonken (out-of-Plane buigen) effecten die gebeuren op de niet-vastgeklemde randen van de Polydimethylsiloxaan plaat tijdens de toegepaste stam.
Opmerking: hier werd het compartiment ontworpen als een 23 mm x 23 mm vierkant. - Houd de diepte van de cel compartiment zo minimaal mogelijk (niet meer dan 80 µm), om scherp te stellen met de 100x olie onderdompeling lens door het deksel glas geplaatst op de top van het compartiment, maar voldoende genoeg om media te bevatten en om te voorkomen dat contact of knijpen de cellen.
- Verhoog de cel compartiment op een vierkant met een hoogte van 3 mm, om de cellen dichter bij de lens in de omgekeerde Microscoop Setup om gemakkelijk scherpstellen mogelijk te maken.
Nota: de vormen met de bovengenoemde eigenschappen kunnen door vele technieken worden vervaardigd met inbegrip van, bijvoorbeeld, gemalen aluminium. Alternatief, Master mallen kunnen ook worden geassembleerd met behulp van acryl vellen gesneden met een laser cutter, cover glas #0 voor de cel compartiment, en superlijm. Deze Master mal wordt gebruikt om een Polydimethylsiloxaan afdruk, die vervolgens wordt gebruikt om werken mallen met behulp van een gietende hars te maken.
2. fabricatie van single-well Polydimethylsiloxaan platen en vierkante compartimenten
- Meng Polydimethylsiloxaan basis en genezen agent in een verhouding van 20:1 (in gewicht) in een wegwerp beker. Weeg een totaal van 20 g Polydimethylsiloxaan per mal (voor het maken van een Polydimethylsiloxaan plaat) en 150 g van Polydimethylsiloxaan per 150 mm-in-diameter plastic schaal (voor het maken van een partij van vierkante compartimenten).
- Laat de Polydimethylsiloxaan mix in een vacuüm Ontgasser bij-0,8 bar voor 30 min (of totdat alle bubbels worden verwijderd).
- Giet de Polydimethylsiloxaan mix in de mallen (voor platen) of in 150 mm plastic schalen (voor vierkante compartimenten).
- Verwijder eventuele extra bubbels in dit stadium, hetzij door het blazen van de lucht (via de mond) of ontgassing de Polydimethylsiloxaan-gevulde mallen/gerechten weer at-0,8 bar vacuüm voor 30 min.
- Laat de mallen/schalen in een 80 °C oven op een nivellerende tafel voor 2 uur.
- Verwijder zorgvuldig de mallen/gerechten uit de oven en laat ze afkoelen tot kamertemperatuur. Voorzichtig schil de uitgeharde Polydimethylsiloxaan na zorgvuldig snijden van de randen met een mes (figuur 1c).
- Teken op de 150 mm diameter Polydimethylsiloxaan een 2 cm x 2 cm raster met een markeerdraad. In elk vierkant, teken een 1 cm x 1 cm vierkant, waardoor een marge van 0,5 cm aan alle kanten. Met behulp van een mes, zorgvuldig gesneden langs de lijnen te verkrijgen vierkante compartimenten (Figuur 2a).
- Reinig de Polydimethylsiloxaan platen/vierkante compartimenten door ze te bebroeden in 100% aceton voor 4 uur, gevolgd door 100% ethanol voor 4 uur, gevolgd door autoclaaf water voor 4 uur.
- Plaats de platen/vierkante compartimenten op paraffine film backing papier (niet de paraffine film, maar het papier) in een 150 mm diameter plastic schaal (figuur 2c).
- Laat de Polydimethylsiloxaan plaat in de 80 °C oven om te drogen voor 4 uur.
- Seal de 150 mm-diameter gerechten met Polydimethylsiloxaan platen en container pleinen met paraffine folie, en bewaar ze in een koude ruimte tot verder gebruik.
3. Functionalization van Polydimethylsiloxaan platen
- Verwijder de paraffine folie, verwijder de cover van de plastic schotel, en plaats de Polydimethylsiloxaan platen en vierkante compartimenten onder Ultravioletlicht voor 30 min.
- Plasma-Treat (bij 150 W voor 5 min) de Polydimethylsiloxaan platen (met de cel compartiment naar boven) zonder de vierkante compartimenten, om de cultuur oppervlak hydrofiele maken.
- Plaats onmiddellijk de vierkante compartimenten op het plasma behandelde oppervlak (Figuur 2b) en druk handmatig om de twee tijdelijk aan elkaar te plakken.
Opmerking: niet plasma-behandel de vierkante compartimenten, of anders zullen ze sterk vasthouden aan de Polydimethylsiloxaan plaat en zal niet loskomen gemakkelijk wanneer ze moeten worden afgepeld tijdens de beeldvorming. - Voeg 200 µ L van 100 mM (3-aminopropyl) triethoxysilane aan de put voor 2 uur in te voeren-NH2 groepen aan de Polydimethylsiloxaan oppervlak. Om een 100 mM oplossing te maken, los 234 µ L van zuivere (3-aminopropyl) triethoxysilane op in 10 mL water. Na een incubatie van 2 uur was de putjes 3x met deioniseerde water.
- Weeg 2 mg van de moleculaire vernetter bissulfosuccinimidyl suberate en los het op in 700 µ L van 1 M (4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethane sulfonic acid buffer (pH 8,0) en 2,8 mL water.
Nota: dit zal een 1 mM bissulfosuccinimidyl suberate oplossing in 200 mM (4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethane sulfonic zure buffer geven. Merk op dat een 50 mM concentratie buffer ook goed werkt.- Voeg 135 µ L van deze oplossing en 15 µ L van 1 mg/mL fibronectine aan de put in elke Polydimethylsiloxaan plaat voor 4 h bij kamertemperatuur.
- Was 3x met fosfaat-gebufferde zoutoplossing. Voeg 500 µ L van fosfaat-gebufferde zoutoplossing aan de put. Bedek de 150 mm-diameter schotel met de Polydimethylsiloxaan met paraffine folie en bewaar deze in een koude ruimte, tot verder gebruik.
4. Functionalization van plastic schalen en kolven
- Incubeer plastic schalen en kolven met een 5 µ g/mL oplossing van poly-D-Lysine (PDL, in steriel water) voor 1 h. Voeg 1,5 mL van deze oplossing (ligand) per 35 mm-diameter schaal, 3 mL van het per 60 mm-diameter schaal, en 10 mL per 75 cm2 kweek kolf.
- Was de afwas en de kolven 2x met steriel water.
- Laat ze drogen in de bioveiligheid voor 1 uur (of tot droog) en bewaar ze in de koude ruimte bij 4 °C tot verder gebruik.
5. proliferatie en differentiatie medium voor muizen oligodendrocyte voorlopercellen
- Bereid 50 mL 100x oplossingen van de proliferatie en differentiatie medium, maak een hoeveelheid van 2,5 mL, en bewaar ze op-80 °C.
Opmerking: de samenstelling van proliferatie medium is 0,1 mg/mL boviene serum albumine, 62 ng/mL progesteron, 16 µ g/mL putrescine, 5 µ g/mL insuline, 50 µ g/mL holo-transferrin, 5 ng/mL Natriumseleniet, 1x penicilline-streptomycine, 10 ng/mL bloedplaatjes-afgeleide groei factor, en 10 ng/mL fibroblastgroei factor in Dulbecco modified Eagle medium (DMEM) met hoge glucose en pyruvaat. Terwijl boviene serum albumine, progesteron, putrescine, en Natriumseleniet kan worden gevormd en opgeslagen op 100x, insuline, holo-transferrin, en penicilline-streptomycine moet vers worden toegevoegd tijdens de voorbereiding van de 1x oplossing. De groeifactoren moeten worden gevormd op 10 µ g/mL en moeten elke dag vers worden toegevoegd aan de cellen (1 µ L/mL medium). De samenstelling van het differentiatie medium is 0,1 mg/mL boviene serum albumine, 62 ng/mL progesteron, 16 µ g/mL putrescine, 5 µ g/mL insuline, 50 µ g/mL holo-transferrin, 5 ng/mL Natriumseleniet, 1x penicilline-streptomycine, 400 ng/mL triiodothyronine, 400 ng/mL L-thyroxine, en 0,5% foetale boviene serum in DMEM met hoge glucose en pyruvaat. Triiodothyronine en L-thyroxine kan worden gevormd met andere reagentia en opgeslagen op 100x. Insuline, holo-transferrin, en penicilline-streptomycine moet vers worden toegevoegd tijdens de voorbereiding van de 1x oplossing. - Voor de voorbereiding van 50 mL 100x proliferatie medium, oplossen van 510 mg serum albumine van runderen in 17 mL van het Dulbecco medium, 310 µ g progesteron in 31 µ L ethanol, 80 mg putrescine in 500 µ L van Dulbecco medium, 25 µ g Natriumseleniet in 10 µ L van Dulbecco medium , en volledige DMEM tot 50 mL
- Voor de voorbereiding van 50 mL 100x oplossing van differentiatie medium, bovendien los 2 mg triiodothyronine in 40 µ L van natriumhydroxide en 2 mg L-thyroxine in 40 µ L van natriumhydroxide, vul dan de oplossing tot 50 mL met Dulbecco medium. Filtreer de oplossing door een steriele wegwerp filtereenheid, hoeveelheid, en bewaar de fracties bij-80 °C.
- Voor de voorbereiding van 250 mL van 1x proliferatie/differentiatie medium, Meng 2,5 mL van 100x oplossing van proliferatie/differentiatie medium met 12,5 mg holo-transferrin, 125 µ L van 10 mg/mL insuline, en 2,5 mL van 100x penicilline-streptomycine. Vul de oplossing in op 250 mL met Dulbecco medium en filtreer het door een steriele wegwerp filterunit.
Nota: de groeifactoren moeten vers en direct aan de cultuur van de cel, niet aan de gehele partij van opnieuw samengesteld middel worden toegevoegd.
6. de cultuur van de cel
- Begin met oligodendrocyte voorlopercellen geschorst in proliferatie medium. Zaad deze cellen bij een dichtheid van 35.000 cellen/cm2 op PDL-gecoate plastic oppervlakken (schalen of kolven, zie punt 4). Pas het volume van de proliferatie medium tot 3 mL per 10 cm2 van de oppervlakte van plastic substratum; een lager volume van het medium kan leiden tot cel klonteren als gevolg van de oppervlakte spanning krachten, terwijl een hoger volume van het medium in de afwas kan leiden tot morsen.
- Voeg groeifactoren (bloedplaatjes-afgeleide groeifactor en fibronectine groeifactor) elke dag, het behoud van hun concentratie op 10 ng/mL en verander de helft van de proliferatie medium op alternatieve dagen.
- Op de derde dag, Los de cellen van het plastic oppervlak met behulp van een zachte cel loslating oplossing (bijv. accutase): Verwijder het medium, was 1x met fosfaat-gebufferde zoutoplossing, voeg 1 mL aflossings oplossing per 20 cm2 gebied, laat de schotel/kolf in een incubator bij 37 °C voor 10 min, en Tik voorzichtig het tot alle cellen hebben losgemaakt (kijk onder een Microscoop).
- Pipetteer met behulp van een 200 µ L tip om klonten in enkelvoudige cellen te breken, breng ze naar een 50 mL Tube, Verdun ze in proliferatie medium, draai bij 0,2 x g voor 10 min, gooi de bovendrijvende, en de pellet in proliferatie medium opnieuw op te schorten om een totaal volume van 1 ml te maken. Tel de cellen met behulp van een cytometer.
- Was de fibronectine-gefunctionele Polydimethylsiloxaan platen 2x, 15 min per wasbeurt, met proliferatie medium.
- Zaad 35.000 cellen per Polydimethylsiloxaan plaat in 700 µ L van proliferatie medium.
- Voeg een plasmide construct van H2B-GFP toe voor het labelen van histone H2B met groene fluorescerende eiwitten.
Opmerking: hier 1,4 µ L van CellLight H2B-GFP BacMam2 transfectie mix is toegevoegd aan elke plaat (2 µ L per 50.000 cellen). - Monteer na 24 uur de Polydimethylsiloxaan monsters met cellen die moeten worden uitgerekt op het éénassige strain-apparaat (Zie figuur 2D). Verander het middel in alle steekproeven aan differentiatie middel.
- Om de steekproeven te belasten, meet de lengte van de niet-gespannen cel compartiment (Figuur 3a) en draai de fase micrometer schroef om de lengte van de cel compartiment te verhogen met het gewenste bedrag (bijv. 10%, Zie Figuur 3b). Laat de gestrekte en ongestrekte Polydimethylsiloxaan monsters in de incubator bij 37 °C tot Imaging.
7. Imaging
- Zet de Microscoop aan. Stel de Microscoop incubator temperatuur tot 37 ° c.
- Breng de doelstelling te gebruiken (100x olie onderdompeling) naar de centrale positie als de objectieve torentje zal niet later toegankelijk zijn. Draai de doelstelling los en schroef deze weer samen met een objectieve ring (figuur 4a) zodat de doelstelling dichter bij de cellen kan worden gebracht. Als er een olie-doelstelling wordt hier gebruikt, voeg een druppel olie bij deze stap.
- Op voorhand synthetiseren (via 3D printen of machinale bewerking) een plastic of metalen houder die twee belangrijke kenmerken heeft-een schuine raam en een stap (figuur 4b).
Nota: het venster steunt een dikte #0 glas dekglaasje dat het middel zal houden terwijl het spannings apparaat in een omgekeerde staat is. De schuine snede aan de raam randen (figuur 4D) laat de doelstelling om dichter bij de glazen dekglaasje te komen. De stap in de houder stelt ons in staat om de uitgerekte Polydimethylsiloxaan verder naar beneden te brengen, dichter bij de doelstelling. - Plaats een glazen dekglaasje (dikte #0, met afmetingen van 25 mm x 25 mm of 35 mm in diameter) op het bovenste oppervlak van de houder door het verspreiden van vacuüm vet aan de periferie van het venster (figuur 4c), en tape het plastic venster op de Microscoop fase ( Figuur 4D en figuur 5a).
- Schroef een z-Translation podium op de Microscoop podium en verplaats het naar de bovenste z-positie (figuur 5a).
- Verwijder 500 µ L van het medium van de uitgerekte Polydimethylsiloxaan plaat te worden afgebeeld en voeg dit medium op de glazen dekglaasje in de witte plastic venster.
- Maak het vierkante compartiment voorzichtig los van de Polydimethylsiloxaan plaat met steriele pincet.
- Houd de spanning apparaat in een rechtopstaande positie (cellen naar boven) boven het witte plastic venster en zorgvuldig omkeren van de stam apparaat, zodat een extra medium laten vallen direct in het midden van de glazen dekglaasje (Figuur 5b) (cellen naar beneden).
- Plaats het onderste deel van het zeef apparaat op het z-Translation stadium met de dubbelzijdige tape (figuur 5c, D).
- Terwijl het kijken door het oculair onder helderveld, breng langzaam het spannings apparaat neer (figuur 5e) (door het z-vertalings stadium te verminderen) en beweeg het doel omhoog om zich op de cellen te concentreren.
- Voer deze stap zeer langzaam, stap voor stap. Als het spannings apparaat teveel op de dekglaasje drukt, kunnen de cellen samengeperst worden (veroorzakend hen om te sterven) en als de doelstelling teveel op de dekglaasje drukt, kan dekglaasje breken (veroorzakend middel om te lekken en op het doel te morsen).
- Scan de Polydimethylsiloxaan plaat in x-en y-richtingen te vinden een cel die een fluorescerende kern (onder epifluorescence met 488 nm van golflengte excitatie) en de juiste cel morfologie (onder helderveld).
- Als de zijdelingse verplaatsing van de Microscoop fase heeft geen invloed op de verticale scherpstelling te veel, selecteert u meerdere regio's van belangen met behulp van een multipoint-functie op de software. Soms is de scherpstelling is zeer gevoelig voor een zijdelingse verplaatsing van het podium. In dergelijke gevallen, afbeelding een cel tegelijk. Markeer de x-, y-en z-posities voor elke cel van belang.
- Record Wide-veld (of open-pinhole) beelden van de kern met 488 nm van de golflengte excitatie en van de cel met helderveld excitatie met intervallen van 30 s per frame voor een totale duur van ten minste 30 min.
8. gegevensanalyse
-
Nucleaire fluctuaties
- Open de volgorde van Nucleus images (Figuur 6a) in een beeldanalyse software en de drempel van de Nucleus time-lapse images (gebruik bijvoorbeeld de drempel opdracht in ImageJ of het GRAYTHRESH commando in de software Matlab).
- Verkrijg de Nucleus gebied (in pixels) als een functie van de tijd, plot het in een Data-plotten software (Figuur 6b), en past een derde orde veelterm aan de gegevens (figuur 6C) (bijvoorbeeld, gebruik maken van de analyse | Montage | Polynoom fit commando in Origin of het Polyfit commando in de software Matlab).
- Trek de waarde van de gepaste veelterm van het daadwerkelijke gebied (in pixel) voor elk tijdpunt af. Dit gecorrigeerde gebied staat bekend als het rest gebied.
Nota: dit proces verwijdert om het even welke stijgende of dalende tendens in de gegevens die uit instrumentale fouten komen en wordt genoemd detrending.- Bereken het percentage van het rest oppervlak door het rest oppervlak te delen op elk moment punt met de waarde van het ingepaste polynoom op dat moment punt (figuur 6d).
- Bereken de standaarddeviatie van de resterende gebiedstijd reeks. Deze standaarddeviatie duidt op de amplitude van de nucleaire fluctuaties.
-
Data plotten en statistische analyse
- Bereken de amplitude van de nucleaire fluctuaties als een gemiddelde van ten minste 20 kernen per voorwaarde.
- Het uitvoeren van een analyse-of-variantie-statistische test met een Bonferroni correctie om te bepalen of er een significant verschil is in de amplitude van fluctuaties als functie van de voorwaarden van belang (bijvoorbeeld met en zonder toegepaste stam).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Recent werk gericht op het onderzoeken van het effect van trekspanning op oligodendrocyten10 toonde aan dat een 10% éénassige trekspanning de differentiatie van oligodendrocyte voorlopercellen door globale veranderingen in genexpressie bevordert. Het mechanisme achter deze veranderingen in genexpressie kan worden geprobeerd via de beeldvorming van subcellulaire parameters, zoals de cytoskelet structuur, transcriptiefactor lokalisatie, nucleaire dynamiek, en Chromatin organisatie. Echter, de vorige geometrie van de Polydimethylsiloxaan substratum niet mogelijk High-Resolution single-cell Imaging. Zoals beschreven in dit werk, de herontworpen geometrie van de Polydimethylsiloxaan substratum en de Imaging Setup geminimaliseerd de afstand tussen de cellen en de doelstelling. Dit maakt het vastleggen van time-lapse beelden van fluorescerende gelabelde cel kernen met behulp van een 100x olie onderdompeling doelstelling (Figuur 6a).
De schommelingen in het nucleaire geprojecteerde gebied hangen van de differentiatie staat van cellen11,12af. Een vergelijking van de kern schommelingen van oligodendrocyte voorlopercellen en die van terminaal gedifferentieerde oligodendrocyten toonde aan dat de laatstgenoemden beduidend lagere schommelingen hebben (figuur 6e). Vervolgens werden de nucleaire fluctuaties van oligodendrocyte voorlopercellen bij 1 h, 24 h, en 48 h post-chemische inductie van differentiatie met en zonder een 10% trekspanning vergeleken. Met chemische inductie alleen, de amplitude van de nucleaire fluctuaties toonde een significante daling op 48 h, maar niet op 24 h (figuur 6F). Aan de andere kant, chemische inductie samen met een 10% trekspanning toonde een significante daling op 24 uur, die constant bleef, zonder verdere reductie op 48 h (figuur 6G).
De substratum geometrie en de Imaging-configuratie die in dit document wordt beschreven, hebben de opname van films met een hoge resolutie van gespannen cellen mogelijk gemaakt. Latere analyse van deze films aangetoond dat stam haast het dempen van de nucleaire fluctuaties, dat is een marker van differentiatie. Deze resultaten geven inzicht in het mechanisme waarmee de stam oligodendrocyte differentiatie bevordert. Verdere discussie over de interpretatie van deze resultaten en toekomstige experimenten worden beschreven in Marijke et al.13.
Figuur 1: Ontwerp en geometrie van de Polydimethylsiloxaan mal. (A) schets van de matrijs die alle afmetingen in millimeter toont (deze schets werd geproduceerd door Whits Technologies, Singapore). (B) driedimensionale weergave van de mal (aangepast van Marijke et al.11). Inzet toont een foto van de mal. (C) driedimensionale weergave van de Polydimethylsiloxaan plaat vervaardigd met behulp van de mal (aangepast van Marijke et al.11). Inzet toont een foto van de Polydimethylsiloxaan plaat. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Monstervoorbereiding. (A) foto van een Polydimethylsiloxaan plaat en een vierkant compartiment. (B) het vierkante compartiment wordt geplaatst op het verhoogde vierkant op de Polydimethylsiloxaan plaat. Het doel is het medium voor de cellen te bevatten. (C) Polydimethylsiloxaan platen worden opgeslagen in 150 mm-diameter plastic gerechten met behulp van Parafilm papier om te voorkomen dat de Polydimethylsiloxaan steken op het plastic. (D) terwijl het monteren van de plaat op de zeef apparaat, steun het van de bodem met behulp van twee vingers om een verzakking van de plaat te voorkomen. Als de plaat nog steeds zakt een beetje na de montage, Verhoog de afstand tussen de spanning apparaat armen door het draaien van de vertaling podium. Bij deze stap, zou de vertaling van het stadium geen spanning in de Polydimethylsiloxaan plaat moeten veroorzaken. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: cel stretching. (A) meet de begin lengte van de plaat tussen de klemmen, met behulp van een liniaal. (B) strek de plaat door het draaien van de schroef op de vertaling podium om de oorspronkelijke plaatlengte te verhogen met het gewenste percentage. X% toename in lengte komt overeen met X% van de stam. Merk op dat, om de gewenste spanning (X%) te genereren in het opgeheven compartiment van de cel cultuur, moet de belangrijkste plaat door een hoger bedrag (ongeveer 2X%) worden gespannen wegens het verschil in hun dikte in de beschreven plaat meetkunde. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Voorbereiding voor Imaging. (A) Breng de 100x doelstelling op de centrale positie in het torentje, schroef de doelstelling, en schroef het terug samen met de objectieve ring. Bschets van de houder die alle afmetingen in millimeters weergeeft. (C) strooi vacuüm aan de rand van het raam in de houder, met behulp van een pipet uiteinde, en plaats een glazen dekglaasje op de top. Gebruik een afdekglas met een dikte #0 of #1, om scherp te stellen met de 100x olie onderdompeling lens. (D) plaats de houder (1) op de Microscoop fase (2). Breng de olie (6) doelstelling (3) dichter bij de dekglaasje (5) die vastzitten aan de houder, met behulp van vacuüm vet (4). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Imaging Setup op de Microscoop. (A) Monteer de z-Translation fase (gele pijl) en de houder (rode pijl) op de Microscoop fase. (B) kantel het spannings apparaat op het Microscoop stadium om om het even welk middel druppel op de glas dekglaasje van de houder te laten. Plak een dubbelzijdige tape (blauwe pijl) op de stam apparaat dat zal vasthouden aan de z-vertaling podium. (C) plaats het strain-apparaat in een omgekeerde positie en steun het op het z-Translation stadium. De cellen moeten worden uitgelijnd met de glazen dekglaasje van de plastic houder. (D) omgekeerde geometrie van de spanning apparaat minimaliseert de afstand tussen de cellen en de doelstelling, waardoor het vergemakkelijken van hoge-resolutie beeldvorming (aangepast van Marijke et al.11). (E) zijaanzicht alvorens het spannings apparaat neer te brengen (1); Zijaanzicht na het instellen van de stam apparaat naar beneden (2); Top-View na het instellen van de stam apparaat omlaag (3). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: Representatieve beelden en gebieds schommelingen gegevens van de kern. Dit cijfer is aangepast van Marijke et al.11. (A) typisch beeld van een Nucleus gelabeld met histone H2B gecodeerd met groene fluorescerende eiwitten, en een differentiërende oligodendrocyte stamvader cel. De kern is in focus, terwijl de cel processen zijn onscherp. (B) typische tijdreeksen van een kerngebied (in pixel). (C) derde orde veelterm die aan de gegevens wordt gepast. (D) percentage van de schommelings tijdreeks van het resterende gebied. (E) nucleaire rand schommelingen van de proliferatie van oligodendrocyte voorlopercellen en terminaal gedifferentieerde oligodendrocyten. (F) nucleaire rand schommelingen bij 1 h, 24 h, en 48 h postinduction van chemische differentiatie zonder spanning. Gkern fluctuaties bij 1 h, 24 uur en 48 h postinduction van chemische differentiatie met 10% trekspanning. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een apparaat heeft eerder1 is ontworpen voor de toepassing van de extracellulaire trekspanning op aanhangende cellen. Het ontwerp van de Polydimethylsiloxaan substratum in dat werk was voldoende voor biochemische analyses, evenals de lage-resolutie beeldvorming van uitgerekte cellen. In dit werk werd de substratum herontworpen, en een nieuwe Imaging configuratie die een hoge-resolutie subcellular Live Cell Imaging vergemakkelijkt werd geïntroduceerd. De voordelen van dit systeem zijn talrijk: het kan worden ingebouwd in het lab met behulp van eenvoudige componenten, is het goedkoop in vergelijking met commerciële spanning apparaten (500 USD per cel stam apparaat), en het is klein genoeg om te passen binnen weefselkweek incubators, evenals op Microscopen. Bovendien, hoewel de Imaging-systeem is hier beschreven met de omgekeerde Microscoop Setup, kan het gemakkelijk worden aangepast voor de rechtop Microscoop configuratie.
Er zijn een paar kritische stappen die betrokken zijn bij de monstervoorbereiding en beeldvorming. Ten eerste, de Polydimethylsiloxaan platen en vierkante compartimenten moeten grondig worden gereinigd voordat cel zaaien (protocol stap 2,8) om de cel te overleven (zoals niet-genezen Polydimethylsiloxaan is giftig voor cellen). Ten tweede, aangezien het volume van de vloeistof medium dat kan passen in het vierkante compartiment is minder dan 1 mL, kan het verdampen als het monster is in de incubator voor een paar dagen. Daarom moet het medium worden gecontroleerd elke dag en aangevuld wanneer nodig. Bovendien, kan het opgeheven gebied op de Polydimethylsiloxaan plaat met een omgekeerde 60 mm-diameter plastic schotel worden behandeld om verdamping te minimaliseren. Ten derde, moet de extreme voorzichtigheid worden uitgeoefend terwijl het bewegen van het spannings apparaat op de Microscoop neer via het z-Vertaal stadium om de cellen aan de glas dekglaasje dichter te brengen. Het comprimeren van de cellen (zelfs voor een moment) tussen de Polydimethylsiloxaan substratum en het glas dekglaasje kan leiden tot celdood. Ten vierde, kunnen de dode cellen en de cel puin blijven geplakt aan het glas dekglaasje nadat de Polydimethylsiloxaan steekproef is verwijderd. Vandaar, na beeldvorming, moet het glas dekglaasje van het vacuüm vet worden getrokken en een verse dekglaasje zou voorafgaand aan het monteren van een nieuw steekproef moeten worden vastgemaakt.
De beperkingen van het spannings apparaat zijn dat de toepassing van stadium zijdelingse verplaatsing niet kan worden geprogrammeerd om cyclische of ramped spanning uit te voeren en dat het slechts éénassige spanning kan toepassen. De beperking van de Polydimethylsiloxaan substratum in de beschreven geometrie is dat een stam hoger dan 25% een breuk van de Polydimethylsiloxaan kan veroorzaken.
Een toekomstige wijziging ter verbetering van het ontwerp van de Polydimethylsiloxaan substratum zou de integratie van een raster op de cel cultuur oppervlak. Dit zou voor het volgen van de zelfde cel vóór en na de toepassing van trekspanning toestaan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Alle auteurs dankbaar erkennen steun van de financiering van de National Research Foundation van Singapore via de Singapore-MIT Alliantie voor onderzoek en technologie (SMART) biosystemen en micromechanica (BioSyM) interdisciplinair Onderzoekgroep. Auteurs Dr. Jagielska en Dr. van Vliet erkennen ook de financiering en steun van de Saks-Kavanaugh Foundation. De auteurs bedanken William Ong en Dr zingen Yian kauwen van Nanyang technologische universiteit, Singapore, voor het verstrekken van Rat oligodendrocyte voorlopercellen voor een aantal experimenten beschreven in dit werk, en de auteurs bedanken Dr. G. V.. Mechanobiology Institute, Nationale Universiteit van Singapore, Singapore, voor discussies over nucleaire gebied schommelingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary cells | Primary Oligodendrocyte Progenitor Cells isolated from Neonatal Rats were provided by Dr. S. Y. Chew's lab at Nanyang Technological University |
||
| Media | |||
| DMEM high glucose | Gibco | 11996-065-500ml | |
| Pen/Strep | Gibco | 15070-063-100ml | |
| FGF | Prospec | CYT-608-50ug | |
| PDGF | Prospec | CYT-776-10ug | |
| Media Stock components | |||
| BSA | Sigma | A9418-10G | |
| Progesterone | Sigma | P8783-1G | |
| Putrescine | Sigma | P5780-5G | |
| Sodium Selenite | Sigma | S5261-10G | |
| Tri-iodothyronine | Sigma | T6397-100MG | |
| Thyroxine | Sigma | T1775-100MG | |
| Holo-Transferrin | Sigma | T0665-500MG | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Mold and PDMS plate | |||
| PDMS - Dow Corning Sylgard 184 | Ellsworth | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Mold - Liquid Plastic | Smooth-On | Smooth Cast 310 - Trail Size | |
| Substrate Coatings | |||
| poly-D-lysine | Sigma | P6407-5MG | |
| Fibronectin | Sigma | F1141-2MG | |
| Histone staining | |||
| CellLigt H2B-GFP BacMam | Molecular Probes | C10594 | |
| Surface functionalization | |||
| APTES | Sigma | A3648-100ml | |
| BS3 | Covachem | 13306-100mg | |
| HEPES buffer pH 8.0 | Alfa Aesar | J63578-AK-250ml | |
| Cell detachment | |||
| Accutase | Invitrogen | A1110501-100ml |
References
- Bray, D. Mechanical tension produced by nerve cells in tissue culture. Journal of Cell Science. 410, 391-410 (1979).
- Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension. Developmental Biology. 389, (1983).
- Van Essen, D. C. A tension-based theory of morphogenesis and compact wiring in the central nervous system. Nature. , (1997).
- Smith, D. H. Stretch growth of integrated axon tracts: Extremes and exploitations. Progress in Neurobiology. 89, 231-239 (2011).
- Cullen, D. K., Simon, C. M., LaPlaca, C. M. Strain rate-dependent induction of reactive astrogliosis and cell death in three-dimensional neuronal-astrocytic co-cultures. Brain Research. , 103-115 (2011).
- Fisher, E., et al. Imaging correlates of axonal swelling in chronic multiple sclerosis brains. Annals of Neurology. 2, 219-228 (2007).
- Nikić, I., et al. A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Nature Medicine. 17, 495-500 (2011).
- Payne, S. C., Bartlett, C. A., Harvey, A. R., Dunlop, S. A., Fitzgerald, M. Functional loss during chronic secondary degeneration in rat optic nerve. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53, (2018).
- Zeiger, A. S., et al. Static mechanical strain induces capillary endothelial cell cycle re-entry and sprouting. Physical Biology. 13, 1-16 (2017).
- Jagielska, A., et al. Mechanical strain promotes oligodendrocyte differentiation by global changes of gene expression. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 93 (2017).
- Pajerowski, J. D., Dahl, K. N., Zhong, F. L., Sammak, P. J., Discher, D. E. Physical plasticity of the nucleus in stem cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1, 0-5 (2007).
- Talwar, S., Kumar, A., Rao, M., Menon, G. I., Shivashankar, G. V. Correlated spatio-temporal fluctuations in chromatin compaction states characterize stem cells. Biophysical Journal. 104, 553-564 (2013).
- Makhija, E., et al. Mechanical strain alters cellular and nuclear dynamics at early stages of oligodendrocyte differentiation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 59 (2018).
