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Bioengineering

一軸引張ひずみ下での生細胞における核動態の高分解能イメージング

doi: 10.3791/59474 Published: June 2, 2019

Summary

このペーパーでは、以前に設計したデバイスを使用して接着細胞に機械的ひずみを適用し、再設計された基層ジオメトリと、100x オイル浸漬の目的で歪んだセルを高解像度の単一細胞イメージング用にカスタマイズした装置について説明します。

Abstract

細胞外機械的株は、セルの表現型応答を惹起することが知られており、いくつかの組織系において生理学的関連性を有する。生化学的アッセイによって細胞集団に適用された細胞外引張株の効果を捕捉するために、デバイスは、単に作製することができ、組織培養インキュベーター内だけでなく、内部に収まるほど小さいものであることがあらかじめ設計されている顕微鏡の段階。しかし、ポリジメチルシロキサン基層の以前の設計では、油浸目的で高分解能の細胞内イメージングを行うことはできませんでした。本研究では、ポリジメチルシロキサン基層の再設計された幾何学的形状と、適用した菌株下での生細胞の高解像度の細胞内イメージングを容易にするカスタマイズ画像設定について説明する。この基層は、同じ、以前に設計されたデバイスで使用することができ、したがって、高解像度の光学イメージングを可能にすることに加えて、上記と同じ利点を有します。ポリジメチルシロキサン基層の設計は、ひずみの適用の前後に同じセルを追跡することを容易にするグリッドを組み込むことによって改善することができます。代表的な結果は、ここで説明した方法を用いて捕捉された、歪んだ細胞内での蛍光標識核の高解像度タイムラプス撮影を示している。これらの核力学データは、オリゴデンドロサイト前駆細胞の分化を促進する引張ひずみを適用するメカニズムについての洞察を与えます。

Introduction

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体内の細胞および組織は、引張株を含む様々な機械的手がかりを受ける。しかしながら、これらの手掛かりが神経細胞の生物学に及ぼす影響は、未だ広範囲に研究されておらず、十分に理解できていない。中枢神経系において、機械的ひずみの発生源には1234の発達的成長、脊髄の屈曲、血液、脳脊髄液などの生理的過程が含まれます。脈動、および外傷などの病的状態、軸索腫脹、グリア瘢痕、または腫瘍増殖5678。引張ひずみがオリゴデンドロサイトの分化にどのように影響するかを調査する価値があり、脊椎動物の中枢神経系における重要なプロセスである軸索のその後の髄鞘形成です。カスタム設計されたひずみ装置およびエラストマーマルチウェルの版を使用して、前の作品910は、静的な一軸株が遺伝子発現の世界的な変化によってオリゴデンドロサイトの分化を増加できることを示した10.これらの細胞における菌株 mechanotransduction のメカニズムのさらなる理解を得るためには、前の実験装置をここで説明するように再設計しなければならず、生活における核ダイナミクスの高分解能蛍光画像化を可能にする菌株の下の細胞。具体的には、1ウェルポリジメチルシロキサンプレートが開発され、100x オイル浸漬レンズを使用した生細胞の経時的なイメージングを可能にするために、撮像構成が再設計されています。光経路にポリジメチルシロキサンの負の光学的効果を排除するために、細胞は、ポリジメチルシロキサン板を通っていないが、反転位置に、細胞コンパートメントを覆うカバーガラスを介して画像化される。この新しい撮像設計を使用して、何百もの高解像度のタイムラプス動画が、無傷の付着細胞内の個々の細胞核の記録され、ここでクロマチンはヒストン H2B を緑色蛍光タンパク質にタグ付けすることによって標識される。これらの映画は、引張ひずみがオリゴデンドロサイトの分化の進行と一致するクロマチン構造およびダイナミクスの変化を誘導することを実証しています。

適用された緊張の下の生きている細胞のイメージ投射は技術的に挑戦的で、顕微鏡システムと互換性がある装置設計を要求する。ここに記載されているカスタム設計は、商用ソリューションに代わる安価な方法を提供します。その次元は適用された緊張の間に高い空間分解能で顕微鏡の段階および生きている細胞のイメージ投射で取付けを可能にする。イメージングセットアップは、画像品質を低下させ、ほとんどの場合に一般的なポリジメチルシロキサンプレートの層を通してではなく、カバーガラスを通して、最高の透明度を持つ100x オイル浸漬レンズを使用して、生細胞イメージングを容易にするように設計されています。歪みの下でイメージングのセットアップ。この装置は、細胞を含む取り付けられたプレートを用いて、インキュベーター内に容易に貯蔵することもできる。この装置は付着細胞の文化を促進し、複数の日に安定した、均一な緊張を維持する substrata に一軸の緊張を適用するように設計されている。ここに記載されたセットアップは、菌株下の様々な付着細胞型の高解像度画像化に使用することができ、それを細胞メカノバイオロジーの多くの分野での mechanotransduction 研究に適用可能にする。

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Protocol

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1.高解像度イメージング用単井戸ポリジメチルシロキサン型の設計

注: ポリジメチルシロキサンプレートを製造するための金型は、以下の機能を備えて設計されており、100x オイル浸漬レンズを使用したイメージングと、カスタムビルド歪みデバイスでの適切な適合を可能にします (図 1a、B)。

  1. ひずみ装置のクランプに収まるようにプレート全体の寸法を保持します。
    注: ここでは、60 mm x 73 mm です。
  2. 適用されたひずみ時にポリジメチルシロキサンプレートのアンクランプエッジで発生するアーク放電 (面外の曲げ) 効果を避けるために、セルコンパートメントまたはウェルをプレート全体の側面寸法よりも大幅に小さくします。
    注: ここで、コンパートメントは23の mm x 23 の mm の正方形として設計されていた。
  3. セルコンパートメントの奥行きはできるだけ小さく (80 μ m 以下)、コンパートメントの上に配置されたカバーガラスを通して100x オイル浸漬レンズに焦点を合わせることができますが、メディアを含むように十分な大きさにして、接触や細胞を絞る。
  4. セルコンパートメントを高さ3mm の正方形に上げ、倒立顕微鏡設定でセルをレンズに近づけることで、簡単にピントを合わせることができます。
    注: 上記の特徴を有する金型は、例えば粉砕されたアルミニウムを含む多くの技術によって製造することができる。あるいは、マスターモールドは、レーザーカッターで切断されたアクリルシート、セルコンパートメント用のカバーガラス #0、およびスーパー接着剤を使用して組み立てることもできます。この鋳型は、ポリジメチルシロキサンを作るために使用され、その後、鋳造樹脂を使用して作業金型を作るために使用されます。

2. シングルウェルポリジメチルシロキサンプレートと四角コンパートメントの製作

  1. ポリジメチルシロキサンベースと硬化剤を使い捨てカップで 20:1 (重量) の割合で混合します。(1 つのポリジメチルシロキサンプレートを作るための) 金型ごとにポリジメチルシロキサンの合計 20 g を量り、150 mm の直径のプラスチック皿 (正方形コンパートメントの1つのバッチを作るための) ごとのポリジメチルシロキサンのグラムの 150 g。
  2. ポリジメチルシロキサンミックスは、0.8 bar の真空 degasser で30分間 (またはすべての泡が取り除かれるまで) 残します。
  3. ポリジメチルシロキサンミックスを鋳型 (プレート用) または 150 mm プラスチックディッシュ (四角コンパートメントの場合) に注ぎます。
  4. この段階で、追加の気泡を除去する (口で) 空気を吹き込むか、または-0.8 バー真空で再びポリジメチルシロキサン充填された金型/皿を脱気することによって30分。
  5. 2時間のレベリングテーブルに80° c のオーブンで金型/皿を残します。
  6. 慎重にオーブンから金型/皿を除去し、室温まで冷却してみましょう。ブレードで慎重にエッジを切断した後、硬化したポリジメチルシロキサンをゆっくりと剥がします (図 1c)。
  7. 直径 150 mm のポリジメチルシロキサンで、2 cm x 2 cm のグリッドをマーカー付きで描画します。各正方形内では、すべての側面に0.5 センチメートルの余白を残して、1センチメートル x 1 センチメートルの正方形を描きます。ブレードを使用して、線に沿って慎重にカットして、四角のコンパートメントを得ます (図 2a)。
  8. ポリジメチルシロキサンのプレート/四角のコンパートメントを4時間 100% のアセトンでインキュベートし、続いて 100% のエタノールを4時間、次いで4時間のオートクレーブ水で洗浄する。
  9. プレート/正方形のコンパートメントをパラフィンフィルムのバッキングペーパー (パラフィンフィルムではなく用紙) に、直径 150 mm のプラスチックディッシュの内側に置きます (図 2c)。
  10. 80° c のオーブンでポリジメチルシロキサンプレートを4時間乾燥させたままにしておきます。
  11. パラフィンフィルムでポリジメチルシロキサンプレートと容器の四角を含む 150 mm 径ディッシュを密封し、さらに使用するまで冷蔵室に保管してください。

3. ポリジメチルシロキサンプレートの機能化

  1. パラフィンフィルムを取り出し、プラスチック皿のカバーを取り外し、ポリジメチルシロキサンのプレートと正方形のコンパートメントを紫外線の下に30分間置きます。
  2. プラズマ-御馳走 (5 分間 150 W で) ポリジメチルシロキサンプレート (セルコンパートメントを上向きにした状態) は、正方形のコンパートメントを持たずに、培養表面を親水性にする。
  3. 直ちに正方形のコンパートメントをプラズマ処理された表面 (図 2b) の上に置き、手動で押して2つを一緒に貼り付けます。
    注: 正方形のコンパートメントをプラズマ処理しないでください、またはそれらはポリジメチルシロキサンプレートに強く固執し、彼らは、イメージング中に剥離する必要があるときに簡単にオフになることはありません。
  4. 100 mM (3-aminopropyl) triethoxysilane の200μ l をポリジメチルシロキサンの表面に導入するために 2 h のための井戸に加えなさい。100 mM 溶液を作るために、234の純粋な (3-aminopropyl) triethoxysilane μ l の水を10ml に溶かします。2時間インキュベートした後、ウェル3倍を脱イオン水で洗浄する。
  5. 2分子架橋剤 bissulfosuccinimidyl suberate の重量を量り、700μ l の 1m (4-(2-ヒドロキシエチル)-1-piperazineethane スルホン酸バッファー (pH 8.0) および 2.8 mL の水に溶解します。
    注: 200 mM (4-(2-ヒドロキシエチル)-1-piperazineethane スルホン酸バッファーに 1 mM の bissulfosuccinimidyl suberate 溶液を与えます。50 mM 濃度バッファもうまく動作することに注意してください。
    1. この溶液に135μ l を加え、室温で4時間の各ポリジメチルシロキサンプレートで 1 mg/mL フィブロネクチンの15μ l を加えた。
  6. リン酸緩衝生理食塩水で3倍洗浄します。リン酸緩衝食塩水500μ l を井戸に添加します。ポリジメチルシロキサンを含む 150 mm 径のディッシュをパラフィンフィルムで覆い、さらに使用するまで冷蔵室に保管してください。

4. プラスチック皿およびフラスコの機能化

  1. ポリ D リジンの5μ g/mL 溶液 (PDL、滅菌水中) を1時間培養してプラスチックディッシュとフラスコをインキュベートします。この溶液 (リガンド) を 35 mm-直径ディッシュあたり 1.5 mL、そのうちの 3 mL に 60 mm 径ディッシュ、および 10 mL 75 cm2 培養フラスコ。
  2. 食器類とフラスコを滅菌水で2倍洗ってください。
  3. 1時間 (または乾燥するまで) のためのバイオセーフティキャビネットで乾燥させ、さらに使用するまで4° c で冷蔵室に保存するためにそれらを残します。

5. ネズミオリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖と分化培地

  1. 増殖および分化培地の 50 mL の100x 溶液を調製し、2.5 mL のアリコートを作り、-80 ° c でそれらを保存します。
    注: 増殖培地の組成は、0.1 mg/mL のウシ血清アルブミン、62 ng/ml のプロゲステロン、16μ g/ml のプトレシン、5μ g/ml のインスリン、50μ g/ml のホロトランスフェリン、5 ng/mL のナトリウムセレン、1x ペニシリン・ストレプトマイシン、10 ng/mL の血小板由来成長因子は、ダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM) 中の高グルコースおよびピルビン酸に 10 ng/mL 線維芽細胞増殖因子を含む。ウシ血清アルブミン、プロゲステロン、プトレシン、およびセレンナトリウムを100倍で構成し保存することができる一方、インスリン、ホロ・トランスフェリン、およびペニシリン-ストレプトマイシンは、1x 溶液を調製しながら新鮮に添加しなければならない。成長因子は、10μ g/mL で構成されなければならず、細胞に毎日新鮮に添加する必要があります (培地1μ l/mL)。分化培地の組成は、0.1 mg/mL ウシ血清アルブミン、62 ng/ml プロゲステロン、16μ g/ml プトレシン、5μ g/ml インスリン、50μトランスフェリン、5 ng/mL ナトリウムセレン、1x ペニシリン・ストレプトマイシン、400 ng/ml トリヨードサイロニン、400 ng/mLL-チロキシン、および 0.5%、高グルコースおよびピルビン酸を有する DMEM 中のウシ胎児血清。トリヨードサイロニンおよび L-チロキシンは、他の試薬で構成することができ、100x で保存されます。1x 溶液を調製しながら、インスリン、ホロトランスフェリン、およびペニシリン-ストレプトマイシンを新鮮に添加しなければなりません。
  2. 50ミリリットルの増殖培地を調製するために、ダルベッコ改変の培地の 17 mL でウシ血清アルブミンの 510 mg、プトレシンの31μ l 中のプロゲステロンの310μ g、80ダルベッコ改変の培地の500μ l 中のセレンナトリウム、ダルベッコ改変の培地の10μ l 中の25μ g の mg、50 mL までの完全な DMEM
  3. 分化培地の 50 mL の100x 溶液を調製するために、さらに水酸化ナトリウムの40μ l のトリヨードサイロニンを 2 mg、水酸化ナトリウムの40μ l 中の L-チロキシンの2mg を溶解し、ダルベッコ改変の培地で溶液を 50 mL に充填する。滅菌された使い捨てフィルターユニットを通して溶液を濾過し、アリコートし、-80 ° c でアリコートを保存する。
  4. 1倍の増殖/分化培地の 250 mL を調製するために、増殖/分化培地の 2.5 mL の100x 溶液を、ホロ-トランスフェリンの 12.5 mg、125μ l の 10mg/mL インスリン、および 2.5 mL の100x のペニシリン・ストレプトマイシンで混合する。ダルベッコ改変の媒体との 250 mL に解決を満たし、生殖不能の使い捨て可能なフィルター単位によってろ過する。
    注: 成長因子は、再構成された培地の全バッチに対してではなく、新鮮かつ直接細胞培養に添加しなければならない。

6. 細胞培養

  1. 増殖培地に懸濁したオリゴデンドロサイト前駆細胞から開始する。これらの細胞を、PDL コーティングされたプラスチック表面 (皿またはフラスコの上) に35000細胞/cm2 の密度で播種します (セクション4を参照)。プラスチック基層の表面積の10cm あたり 3 mL に増殖培地の容積を調整します。培地の体積が小さいと、表面張力から生じる細胞束になり、皿の中のより高い体積がこぼれを引き起こすことがあります。
  2. 成長因子 (血小板由来成長因子およびフィブロネクチン成長因子) を毎日追加し、その濃度を 10 ng/mL で維持し、別の日に増殖培地の半分を変化させる。
  3. 3日目に、穏やかな細胞剥離溶液 (例えば、accutase) を使用して、プラスチック表面から細胞を切り離します: 培地を除去し、リン酸緩衝生理食塩水で1x を洗浄し、20 cm2 の領域あたり 1 mL の剥離溶液を加え、皿/フラスコを残します37° c のインキュベーター内で10分間、すべての細胞が取り外されるまでそっとそれをタップします (顕微鏡下を見てください)。
  4. 200μ l の先端を使用して、塊を単一細胞に分解し、50 mL チューブに移し、増殖培地で希釈し、0.2 x gで10分間回転させ、上清を破棄し、増殖培地でペレットを再懸濁して 1 mL の総体積を作ります。サイトメーターを使用してセルをカウントします。
  5. フィブロネクチン-官能ポリジメチルシロキサンプレートは、増殖培地を用いて、1回の洗浄につき2倍、15分間洗浄する。
  6. 種子35000は、増殖培地の700μ l 中のポリジメチルシロキサンプレート当たりの細胞である。
  7. H2B-GFP のプラスミドコンストラクトを追加し、ヒストン H2B を緑色蛍光タンパク質で標識します。
    注: ここで、1.4 μ l の CellLight H2B − GFP BacMam2 トランスフェクション混合物を、各プレート (5万細胞当たり2μ l) に添加した。
  8. 24時間後、一軸ひずみ装置上に引き伸ばされるセルを使用してポリジメチルシロキサンサンプルをマウントします (図 2dを見て)。すべてのサンプルの媒体を分化培地に変更します。
  9. サンプルを緊張させるために、よっ細胞コンパートメント長 (図 3a) を測定し、所望の量によってセルコンパートメントの長さを増加させるために段階マイクロメータースクリューを回す (例えば、10%、図 3bを参照)。伸長および未延伸ポリジメチルシロキサンサンプルは、イメージングが行われるまで37° c でインキュベーター内に残します。

7. イメージング

  1. 顕微鏡をオンにしてください。顕微鏡インキュベーター温度を37° c に設定します。
  2. 客観的なタレットが後でアクセスすることができないので中心位置に使用される目的 (100x オイルの浸漬) を持って来なさい。目的を緩めて、目的をセルに近づけることができるように、客観的なリング (図 4a) と一緒にそれをねじ込みます。ここでオイルの目的が使用されている場合は、このステップでオイルのドロップを追加します。
  3. (3D プリンティングまたはマシニングを使用して) 事前に合成する2つの重要な特徴—斜めの窓と段差 (図 4b) を備えたプラスチックまたは金属ホルダー。
    注: このウィンドウは、ひずみ装置が反転状態にある間に媒体を保持する #0 ガラスカバースリップの厚さをサポートします。窓の端の斜めの切口 (図 4d) は目的がガラスカバースリップに近づくようにする。ホルダー内のステップを使用すると、ストレッチされたポリジメチルシロキサンをさらに下に持っていくことができ、目的に近づきます。
  4. 窓の外周に真空グリースを広げてホルダーの上面にガラスカバースリップ (厚さ #0、直径 25 mm ×25mm、または 35 mm) をかけ、プラスチックの窓を顕微鏡ステージにテープで貼り付けます (図 4c) (図 4Dおよび図 5a)。
  5. Z変換ステージを顕微鏡ステージにねじ込み、一番上のz位置に移動します (図 5a)。
  6. 画像化される延伸ポリジメチルシロキサン板から培地の500μ l を除去し、この培地を白いプラスチック製の窓にガラスカバースリップの上に加える。
  7. ポリジメチルシロキサンプレートから四角いコンパートメントを滅菌ピンセットで慎重に切り離します。
  8. ひずみ装置を白いプラスチック製の窓の上に直立した位置 (上向きのセル) に保持し、ひずみ装置を慎重に反転させて、ガラスカバースリップの中央に直接余分な媒体を落とすようにします (図 5b) (セルが下向きに向いています)。
  9. ひずみ装置の底部を両面テープでz変換ステージに置きます (図 5c、D)。
  10. 明視野の下の接眼レンズを通して見ながら、ひずみ装置をゆっくりと (図 5e) 下げて ( z-並進段階を下げて)、目的を最大にして細胞に焦点を合わせます。
    1. この手順を非常にゆっくり、段階的に実行します。ひずみデバイスがカバースリップに過度に押された場合、セルが圧縮され (それらが死ぬ原因となる)、目的がカバースリップに過度に押された場合、カバースリップは破壊する可能性があります (媒体が漏出して、目的にこぼれます)。
  11. ポリジメチルシロキサンプレートを x 軸と y 方向でスキャンし、蛍光核 (488 落射蛍光未満の波長励起) および適切な細胞形態 (明視野の下) を有する細胞を見つけます。
  12. 顕微鏡の段階の横の変位が縦の集中に影響を与えない場合は、ソフトウェアのマルチポイント機能を使用して、関心のある複数の領域を選択します。時には、集束は、ステージの任意の横方向の変位に非常に敏感です。このような場合は、一度に1つのセルをイメージします。対象のセルごとに、 xyzの位置をマークします。
  13. 488の波長励起の核の広いフィールド (またはオープンピンホール) の画像を、1フレームあたり30秒の間隔で明視野励起して、少なくとも30分間の合計持続時間を記録します。

8. データ分析

  1. 核変動
    1. 画像解析ソフトウェアで nucleus イメージのシーケンスを開き (図 6a)、nucleus のタイムラプス画像をしきい値にします (たとえば、ImageJ のしきい値コマンドまたはソフトウェア MATLAB のGraythreshコマンドを使用します)。
    2. 原子核領域 (ピクセル単位) を時間の関数として取得し、それをデータ印刷ソフトウェア (図 6b) にプロットし、3番目の多項式をデータに当てはめます (図 6c) (たとえば、分析を使用します |フィッティング|多項式が発生元またはソフトウェア MATLAB のPolyfitコマンドに適合します)。
    3. 各時点の実際の領域 (ピクセル単位) から適合した多項式の値を減算します。この補正された領域は、残余領域として知られています。
      注: このプロセスは、終止と呼ばれる、器械エラーから来るデータの増加または減少傾向を除去します。
      1. 各時点での残面積を、その時点での適合多項式の値で除算して、残面積の割合を計算します (図 6d)。
    4. 残余面積時系列の標準偏差を計算します。この標準偏差は、核変動の振幅を示す。
  2. データプロットと統計解析
    1. 1つの条件につき少なくとも20個の核の平均として、核変動の振幅を計算する。
    2. ボンフェローニの補正による分散分析の一方向の統計検定を実行して、変動の振幅に関心のある条件の関数として有意な差があるかどうかを判断します (たとえば、適用されたひずみの有無にかかわらず)。

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Representative Results

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オリゴデンドロサイト10に対する引張歪の影響を調査することを目的とした最近の研究では、10% の一軸引張株が、遺伝子発現の世界的変化によってオリゴデンドロサイト前駆細胞の分化を促進することを示した。遺伝子発現におけるこれらの変化の背後にあるメカニズムは、細胞骨格構造、転写因子局在、核力学およびクロマチン組織などの細胞内パラメータの画像化を介してプローブすることができる。しかし、ポリジメチルシロキサン基層の以前の形状では、高分解能の単一細胞イメージングができませんでした。この作業で説明したように、ポリジメチルシロキサン基層の再設計されたジオメトリとイメージングセットアップは、セルと目的の間の距離を最小化しました。これにより、100x オイル浸漬の目的を使用して、蛍光標識された細胞核のタイムラプス画像をキャプチャすることができます (図 6a)。

核の投影面積の変動は、細胞11,12の分化状態に依存する。オリゴデンドロサイト前駆細胞の核変動と終末分化オリゴデンドロサイトの比較では, 後者の変動が有意に低いことが示された (図 6e)。次に、オリゴデンドロサイト前駆細胞の1時間、24時間、および 48 h 後の核変動について、10% の引張ひずみと共に分化の誘導を行った。化学的誘導だけでは、核変動の振幅は 48 h で有意な減少を示したが、24時間ではなかった (図 6f)。一方、10% の引張株とともに化学誘導は、48 h でさらなる減少なしに一定のままであった24時間で有意な減少を示した (図 6g)。

この論文で説明されている基層幾何学的形状および撮像構成は、歪んだ細胞の高解像度映画の記録を可能にした。これらの映画のその後の分析は、株が分化のマーカーである核変動のダンピングを早めることを実証しました。これらの結果は、株がオリゴデンドロサイト分化を促進するメカニズムについての洞察を与える。これらの結果の解釈と今後の実験についての更なる議論は、Makhija et al.13に記載されている。

Figure 1
図 1:デザインとジオメトリポリジメチルシロキサン金型。(A) ミリメートル単位のすべての寸法を示す金型のスケッチ (このスケッチは Whits 技術、シンガポールによって生成されました)。(B) 金型の三次元図 (Makhija et al.11から適合)。インセットは、金型の写真を示しています。(C) 鋳型を用いて作製したポリジメチルシロキサン板の三次元図 (Makhija et al.11から適合)。インセットは、ポリジメチルシロキサンプレートの写真を示しています。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図 2:サンプル調製。(A) ポリジメチルシロキサン板と四角いコンパートメントの写真。(B) 正方形コンパートメントは、ポリジメチルシロキサンプレート上の隆起した正方形の上に配置されています。その目的は、細胞のための媒体を含むことである。(C) ポリジメチルシロキサンプレートは、プラスチックに付着するポリジメチルシロキサンを防ぐためにパラフィルム紙を使用して、直径 150 mm のプラスチック皿に格納されています。(D) プレートをひずみ装置に取り付けながら、2本の指で底面から支えてプレートのたるみを防ぎます。プレートが取り付け後も少したるみがある場合は、トランスレーションステージを回すことでひずみ装置アーム間の距離を大きくします。この段階では、ステージの翻訳は、ポリジメチルシロキサンプレートにひずみを誘導してはなりません。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図 3: 細胞の伸張。(A) 定規を使用して、クランプ間のプレートの初期の長さを測定します。(B) 変換段のねじを回すことでプレートを伸ばし、初期プレート長を所望の割合で増加させる。X% の長さの増加は、ひずみの X% に相当します。なお、目的のひずみ (X%) を生成するには、隆起した細胞培養コンパートメントでは、メインプレートは、より高い量 (約 2X%) によって緊張しなければなりません記述されたプレート形状におけるそれらの厚さの違いのため。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図 4:イメージングの準備。(A) タレットの中央の位置に100x の目的を持って、目的を緩め、目的のリングと一緒にそれをねじ込みます。(B) ミリメートル単位ですべての寸法を示すホルダーのスケッチ。(C) ホルダー内の窓の周囲に真空グリースを広げ、ピペットチップを使用して、上にガラスカバースリップを置きます。厚さ #0 または #1 のカバーガラスを使用して、100x オイル浸漬レンズにピントを合わせます。(D) ホルダ (1) を顕微鏡ステージ (2) 上に置く。オイル (6) 対物レンズ (3) をホルダーに貼ってあるカバースリップ (5) に近づけ、真空グリース (4) を使用してください。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図 5: 顕微鏡でのイメージングのセットアップ。(A) z-トランスレーションステージ (黄色矢印) とホルダー (赤矢印) を顕微鏡ステージ上に組み立てる。(B) 歪み装置を顕微鏡ステージ上に傾けて、ホルダーのガラスカバースリップ上に任意の培地を落とすようにする。Z変換の段階に固執するひずみ装置に両面テープ (青い矢印) を貼り付けます。(C) ひずみ装置を倒立位置に置き、 z変換段階で支持する。セルは、プラスチックホルダのガラスカバースリップに位置合わせされている必要があります。(D) ひずみ装置の倒立幾何学は、細胞と目的との間の距離を最小化し、それによって高解像度イメージングを容易にする (Makhija et al.11から適合)。(E) ひずみ装置をダウンさせる前の側面図 (1);ひずみ装置を下に持って来た後の側面図 (2);ひずみ装置を下に持ってきた後のトップビュー (3)。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 6
図 6:核の代表的な画像及び領域変動データ。この図は、Makhija et al.11から適合されている。(A) 典型的な画像をヒストン H2B で標識した核を緑色蛍光タンパク質にタグ付けし、オリゴデンドロサイト前駆細胞を分化させる。細胞プロセスが焦点を当てていない間、核は焦点を当てています。(B) 核領域の典型的な時系列 (ピクセル単位)。(C) データに適合した第3の次数多項式。(D) 残余面積変動時系列の割合(E) 増殖性オリゴデンドロサイト前駆細胞及び最終分化オリゴデンドロサイトの核内端変動。(F) 1 h、24時間、および 48 h の postinduction での核の端の変動は、ひずみのない化学的分化を行う。(G) 1 時間、24時間、および 48 h の postinduction での核領域変動は 10% の引張ひずみとの化学分化。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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Discussion

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装置は、接着細胞上の細胞外引張株の適用のために、以前に1が設計されている。その作業におけるポリジメチルシロキサン基層の設計は、生化学的アッセイだけでなく、延伸細胞の低解像度イメージングにも十分であった。本研究では、基層を再設計し、高分解能細胞内細胞イメージングを容易にする新規イメージング構成を導入した。このシステムの利点は多数あります: それは、単純なコンポーネントを使用してラボ内に構築することができます、それは市販のひずみデバイス (500 USD 1 細胞株デバイス) と比較して安価であり、それは上だけでなく、組織培養インキュベーター内に収まるのに十分小さいです顕微鏡。さらに、画像化システムは倒立顕微鏡セットアップでここで説明されているが、直立顕微鏡構成については容易に調整することができる。

サンプル調製およびイメージングには、いくつかの重要な手順が含まれています。まず、細胞の生存を確保するために、細胞播種 (プロトコルステップ 2.8) を行う前に、ポリジメチルシロキサンプレートと四角コンパートメントを完全に洗浄する必要があります (未硬化のポリジメチルシロキサンは細胞に有毒)。第2に、正方形コンパートメントの中に入ることができる液体媒体の容積が1ml 未満であるので、サンプルが数日間インキュベーター内にある場合には蒸発することがある。したがって、媒体は、毎日チェックし、必要なときに補充する必要があります。さらに、ポリジメチルシロキサン版の上げられた区域は蒸発を最小にするために逆に 60 mm 直径のプラスチック皿で覆うことができる。第3に、細胞をガラスカバースリップに近づけるために、 z変換ステージを介して顕微鏡上のひずみ装置を下方に移動させながら、細心の注意を払わなければなりません。ポリジメチルシロキサン基層とガラスカバースリップの間で (一瞬でも) 細胞を圧縮すると、細胞死を引き起こすことがある。第四に、ポリジメチルシロキサン試料が取り除かれた後に、死細胞および細胞破片がガラスカバースリップに固着したままになることがある。したがって、撮像後、ガラスカバースリップを真空グリースから引き抜き、新しい試料を取り付ける前に新鮮なカバースリップを取り付ける必要があります。

歪み装置の限界は、ステージ側変位の適用は、環状またはランプの歪みを実行するようにプログラムすることができず、それは一軸株のみを適用することができるということです。記述された幾何学におけるポリジメチルシロキサン基層の制限は、25% より高いひずみがポリジメチルシロキサンの骨折を引き起こす可能性があるということである。

ポリジメチルシロキサン基層の設計を改善するための将来の修正は、細胞培養表面に格子を組み込むことであり得る。これは、引張ひずみの適用前後に同じセルを追跡することができます。

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Disclosures

作者は何も開示することはありません。

Acknowledgments

すべての著者は、シンガポール・ MIT 研究技術連合 (SMART) バイオテクノロジー (スマート) バイオ・マイクロメカニックス (BioSyM) 学際研究グループを通じて、シンガポール国立研究財団からの資金援助を感謝しています。著者の Jagielska 博士とヴァン・フリート博士も、Saks ・ Kavanaugh 財団の資金と支援を感謝しています。著者たちは、この作品に記載されたいくつかの実験のためにラットオリゴデンドロサイト前駆細胞を提供するために、シンガポールの南洋理工大学でウィリアム・ Yian 氏と Dr. シンシンに感謝し、著者らは Shivashankar 博士に感謝した。シンガポール国立大学メカノバイオロジー研究所は、核地域の変動について議論しています。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Primary cells Primary Oligodendrocyte Progenitor Cells isolated from Neonatal Rats
were provided by Dr. S. Y. Chew's lab at Nanyang Technological University
Media
DMEM high  glucose Gibco 11996-065-500ml
Pen/Strep Gibco 15070-063-100ml
FGF Prospec CYT-608-50ug
PDGF Prospec CYT-776-10ug
Media Stock components
BSA Sigma A9418-10G
Progesterone Sigma P8783-1G
Putrescine Sigma P5780-5G
Sodium Selenite Sigma S5261-10G
Tri-iodothyronine Sigma T6397-100MG
Thyroxine Sigma T1775-100MG
Holo-Transferrin Sigma T0665-500MG
Insulin Sigma I9278
Mold and PDMS plate
PDMS - Dow Corning Sylgard 184 Ellsworth 184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Mold - Liquid Plastic Smooth-On Smooth Cast 310 - Trail Size
Substrate Coatings
poly-D-lysine Sigma P6407-5MG
Fibronectin Sigma F1141-2MG
Histone staining
CellLigt H2B-GFP BacMam Molecular Probes C10594
Surface functionalization
APTES Sigma A3648-100ml
BS3 Covachem 13306-100mg
HEPES buffer pH 8.0 Alfa Aesar J63578-AK-250ml
Cell detachment
Accutase Invitrogen A1110501-100ml

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References

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一軸引張ひずみ下での生細胞における核動態の高分解能イメージング
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Makhija, E., Jagielska, A., Van Vliet, K. J. High-resolution Imaging of Nuclear Dynamics in Live Cells under Uniaxial Tensile Strain. J. Vis. Exp. (148), e59474, doi:10.3791/59474 (2019).More

Makhija, E., Jagielska, A., Van Vliet, K. J. High-resolution Imaging of Nuclear Dynamics in Live Cells under Uniaxial Tensile Strain. J. Vis. Exp. (148), e59474, doi:10.3791/59474 (2019).

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