Summary
توضح هذه المقالة طريقه تحويل طابعه ثلاثية الابعاد تجاريه منخفضه التكلفة إلى طابعه ثلاثية الابعاد بكتيرية يمكنها تسهيل طباعه الاغشيه البيولوجية المنقوشة. وتوصف جميع الجوانب الضرورية لاعداد البيولوجية والحبر الحيوي ، فضلا عن أساليب التحقق لتقييم تكوين الاغشيه البيولوجية.
Abstract
الاغشيه البيولوجية هي مجاميع من البكتيريا المضمنة في مصفوفة ذاتية الإنتاج ذات نقوش مكانيه. البكتيريا داخل بيوفيلم تطوير مقاومه المضادات الحيوية المعززة ، والتي تشكل المخاطر الصحية المحتملة ، ولكن يمكن أيضا ان تكون مفيده للتطبيقات البيئية مثل تنقيه مياه الشرب. سيتطلب تطوير المزيد من العلاجات المضادة للبكتيريا والتطبيقات المستوحية من بيوفيلم تطوير طرق قابله للنسخ والهندسة لإنشاء بيوفيلم. في الاونه الاخيره ، تم تطوير طريقه جديده لاعداد بيوفيلم باستخدام طابعه ثلاثية الابعاد (3D) معدله مع حبر بكتيري. توضح هذه المقالة الخطوات اللازمة لبناء هذا فعاله ، منخفضه التكلفة 3D بيوركانتر التي توفر تطبيقات متعددة في معالجه المواد المستحثة بالجراثيم. يبدا البروتوكول بطابعه تجاريه ثلاثية الابعاد تمت الاستعاضة فيها عن الطارد بموزع الحبر الحيوي المتصل بنظام ضخ المحاقن مما يتيح تدفقا مستمرا وقابلا للتحكم من الحبر الحيوي. لتطوير الحبر الحيوي مناسبه للطباعة بيوفيلم ، تم تعليق البكتيريا القولونية التي تمت هندستها في محلول من الجينات ، بحيث يصلب في اتصال مع سطح يحتوي علي الكالسيوم. ان ادراج ماده كيميائية محفز داخل الركيزة الطباعة يدفع التعبير عن البروتينات بيوفيلم داخل الحبر الحيوي المطبوعة. تمكن هذه الطريقة من الطباعة ثلاثية الابعاد للأنماط المكانية المختلفة المكونة من طبقات منفصلة من الاغشيه البيولوجية المطبوعة. ويمكن لهذه الاغشيه الحيوية المتحكم فيها مكانيا ان تكون بمثابه نظم نموذجيه ويمكن ان تجد تطبيقات في مجالات متعددة لها تاثير واسع النطاق علي المجتمع ، بما في ذلك منع مقاومه المضادات الحيوية أو تنقيه مياه الشرب ، من بين أمور أخرى.
Introduction
وهناك حاليا حاجه متزايدة إلى وضع حلول مستدامه وصديقه للبيئة لإنتاج المواد المنقوشة مكانيا ، بسبب العدد المتزايد من الأسواق لهذه المواد1. يقدم هذا المقال طريقه بسيطه واقتصاديه لإنتاج هذه المواد ، التالي يقدم طيفا واسعا من التطبيقات في المستقبل. تسمح الطريقة المعروضة هنا بالطباعة ثلاثية الابعاد (3D) للهياكل المنقوشة مكانيا باستخدام الحبر الحيوي الذي يحتوي علي البكتيريا الحية. تبقي البكتيريا قابله للحياة داخل الهياكل المطبوعة لأكثر من أسبوع واحد ، مما يمكن البكتيريا من أداء الانشطه الايضيه الطبيعية أو المهندسة. البكتيريا المطبوعة التالي يمكن ان تنتج وتودع المكونات المطلوبة داخل الهيكل المطبوع ، علي سبيل المثال خلق بيوفيلم الوظيفية عبر المرتبطة2.
وتنطوي الأساليب التقليدية لإنتاج المواد المتقدمة علي نفقات عاليه للطاقة (مثل ارتفاع درجات الحرارة و/أو الضغوط) ويمكن ان تنتج كميات كبيره من النفايات الكيميائية ، وكثيرا ما تكون مواد سامه تتطلب استخداما واسع النطاق للتكاليف3 ،4. وعلي النقيض من ذلك ، فان الأنواع البكتيرية المتعددة قادره علي إنتاج مواد يمكن تطبيقها بسهوله في مختلف الصناعات. وتشمل هذه المواد البوليمرات مثل polyhydroxyalkanoates (فا)5 أو بولي (غليكوليد-lactide) (pgla)6، السليلوز البكتيرية7، مواد الخرسانة البكتيرية8، المركبات الحيوية9، المواد اللاصقة اميلويد المستندة إلى10، أو الحيوي القائم علي مفاتيح الكهربائية11، من بين أمور أخرى. وعلاوة علي ذلك ، فان إنتاج البكتيريا من المواد الثمينة يحدث عاده عند درجات حرارة وضغوط شبه محيطه وفي بيئات مائية ، دون الحاجة إلى مركبات سامه أو إنتاجها. في حين ان إنتاج المواد مع البكتيريا قد ثبت في الأدبيات وبعض التطبيقات الصناعية قد ظهرت بالفعل12,13, ولا تزال طريقه موثوقه لزخرفه المكانية من هذه المواد تحديا.
توضح هذه المقالة طريقه مباشره لتحويل طابعه ثلاثية الابعاد تجاريه منخفضه التكلفة إلى طابعه بكتيرية ثلاثية الابعاد. ويوضح البروتوكول كيفيه اعداد الحبر الحيوي الذي يحتوي علي البكتيريا الحية والمحافظة عليها ، فضلا عن كيفيه اعداد الركائز التي يمكن ان تؤدي اليها الطباعة ثلاثية الابعاد. هذه الطريقة مناسبه للاستخدام مع مجموعه متنوعة من السلالات البكتيرية الطبيعية والمهندسة قادره علي إنتاج المواد. هذه البكتيريا يمكن توزيعها مكانيا ضمن بنيه مطبوعه ثلاثية الابعاد ولا تزال تواصل نشاطها الأيضي ، والذي سيؤدي إلى توزيع مكاني للمواد المطلوبة التي تنتجها البكتيريا.
هذه الطريقة الطباعة تمكن من تصنيع المضافة من الاغشيه البيولوجية ، والمجاميع من البكتيريا محاطه مصفوفة خارج الخلية المنتجة ذاتيا. الاغشيه البيولوجية هي شبكات ثلاثية الابعاد غير متجانسة حيث البروتينات والبوليمرات والخلايا البكتيرية والأكسجين والمواد المغذية كلها مهيكله مكانيا14. بينما في شكل بيوفيلم ، تظهر البكتيريا زيادة مقاومه المضادات الحيوية والمتانة الهيكلية ، مما يجعل من الصعب القضاء عليها من الأسطح بما في ذلك القسطرة الطبية ويزرع. المفتاح إلى [بيوفيلم] خاصيه, وأيضا التحدي كبيره إلى [بيوفيلم] بحث, يبدو ان التغاير من [بيوفيلومس]15,16,17. ويعد إنتاج الاغشيه البيولوجية النموذجية الخاضعة للمراقبة المكانية اهتماما خاصا لأنه سيسمح اما باستنساخ أو توليف الأنماط المكانية لمكونات بيوفيلم ، مما يساعد علي فهم ترسبات الاغشيه البيولوجية المستقرة علي اي سطح تقريبا في الطبيعه.
تقدم هذه المقالة طريقه لإنتاج الاغشيه البيولوجية باستخدام المواد الهلامية المائية المطبوعة ثلاثية الابعاد التي تحتوي علي بكتيريا القولونية المهندسة التي تنتج بروتينات بيوفيلم في وجود محفز ، فضلا عن أساليب التحقق من تشكيل بيوفيلم 2 . المكونات الرئيسية المصفوفة خارج الخلية من هذه الاغشيه البيولوجية هي curli اميلويد ألياف18 التي تحتوي علي البروتينات csga تجميعها ذاتيا. عند هندستها e. البكتيريا القولونية هي المستحثة للتعبير عن البروتينات csga ، فانها تشكل نموذج بيوفيلم مستقره التي تحمي الخلايا ضد يجري غسلها من سطح الطباعة. مثل هذا 3d المطبوعة بيوفيلم يمكن التحكم فيها مكانيا ، ويمكن ان تكون بمثابه أداه بحثيه مفيده للتحقيق في متعددة المقاييس بيوفيلم هيكل-وظيفة الميكانيكا أو المادية19. وسوف تساعد هذه الاغشيه الحيوية مفصل فهم مبادئ تشكيل بيوفيلم وخصائصها الميكانيكية ، مما يتيح المزيد من البحث في أليات مقاومه المضادات البيولوجية بين التطبيقات الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تحويل طابعه 3D تجاريه إلى 3D بيوركانتر
- أزاله الطارد وسخان الطابعة التجارية 3D (جدول المواد) من اطار الطابعة ، وافصل الأسلاك السيطرة علي هذه العناصر من لوحه الدوائر الرئيسية (الشكل 1a). وبما ان جهاز الاستشعار الذي يتحكم في درجه حرارة التشغيل في الطابعة يحتاج إلى ان يكون وظيفيا للتواصل مع برنامج الطابعة ، فقم بازاله برنامج الطباعة الخوارزميه التي تؤخر الطباعة حتى يتم الوصول إلى درجه الحرارة التشغيلية.
- توصيل طرف ماصه (200 μL غيض) عن طريق أنابيب السيليكون (القطر الداخلي من 1 ملم) إلى حقنه 5 مل تحميلها في مضخة حقنه. جبل طرف الماصة علي راس الطارد الطابعة 3D كبديل للطارد الأصلي (الشكل 1B).
- إذا كان سيتم استخدام أكثر من نوع واحد من الحبر الحيوي ، قم بتركيب نظام (أنظمه) أنابيب اضافيه وتلميح (أطراف) ماصه إلى الطابعة.
2. اعداد الركيزة للطباعة 3D
- أضافه 4 مل من 5 م CaCl حل2 إلى 400 مل من 1% ث/الخامس أجار المذاب في مرق لوريا-BERTANI (LB) المتوسطة ، تستكمل مع المضادات الحيوية والمحفزات المناسبة (هنا 34 ميكروغرام/مل الكلورامفينيكول و 0.5 ٪ rhamnose).
- الاستغناء عن 20 مل من الحل رطل أجار في كل 150 مم × 15 مم طبق بيتري. تجفيف 30 دقيقه في درجه حرارة الغرفة مع غطاء نصف مفتوحة.
ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا عن طريق تخزين هذه الركائز الطباعة في 4 درجه مئوية لمده تصل إلى عده أيام.
3. اعداد الحبر الحيوي
- اعداد محلول الجينات الصوديوم (3 ٪ ث/الخامس) ، والحرارة إلى نقطه الغليان ثلاث مرات لتعقيم الحل. يخزن عند درجه حرارة 4 درجات مئوية حتى يتم استخدامه.
- تنمو e. القولونية MG1655 PRO Δcsga ompR234 (e. كولاي δcsga) البكتيريا التي تحمل البلازميدات البروتين الفلوري الأخضر pSB1C3 (gfp) (التعبير gfp التاسيسيه)2 أو PSB1C3-gfp-CSGA (التعبير gfp التاسيسيه ، Rhamnose-المحرض csga التعبير) بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية مع اهتزاز في 250 دوره في الدقيقة في 50 mL من LB المتوسطة التي تحتوي علي 34 ميكروغرام/مل الكلورامفينيكول و 0.5 ٪ rhamnose.
- الطرد المركزي ثقافة الخلية لمده 5 دقائق في 3,220 x g إلى بيليه البكتيريا. أزاله الفائقة.
- أعاده تعليق البكتيريا بيليه في 10 مل من المتوسطة LB وأضافه 10 مل من الجينات الصوديوم (3 ٪ ث/الخامس).
4.3D عمليه الطباعة
- تثبيت وفتح برنامج الطباعة ثلاثية الابعاد (جدول المواد) علي جهاز كمبيوتر. قم بتوصيل الطابعة ثلاثية الابعاد بالكمبيوتر. انقل راس الطباعة إلى موضعه الرئيسي بالنقر فوق زر الصفحة الرئيسية للمحور X و Y و Z.
- لكل طباعه ، ضع ركيزة الطباعة المعدة علي موقع معين علي سرير الطباعة.
- معايره ارتفاع راس الطباعة في المحور Z.
- رفع راس الطباعة إلى ارتفاع 22 ملم تحت السيطرة اليدوية ، بحيث انها لن تصطدم مع حافه طبق بتري عند الانتقال إلى الموضع المطلوب. ضع راس الطباعة فوق اللوحة ، وحركها لأسفل حتى تلامس طرف الماصة سطح الطابعة. تعيين هذا الموضع المحور Z ك Z1 (ارتفاع سطح الطباعة).
- رفع راس الطباعة ، ونقله خارج منطقه لوحه بواسطة التحكم اليدوي في X ، Y ، والمحاور Z. إذا تم تعريف مسافة العمل بين راس الطباعة وسطح اللوحة باسم Z2 ، ادخل Z1 + Z2 في برنامج الطباعة كقيمه Z اثناء الطباعة.
- برمجه شكل الطباعة من خلال طريقه محدده ذاتيا للتنسيق حسب النقطة وفقا للمسار المطلوب.
- إذا كان المسار المطلوب هو خط مستقيم ، حدد نقاط البداية والنهاية فقط. بما في ذلك نقاط اضافيه علي الخطوط المنحنية سيؤدي إلى منحنيات أكثر سلاسة. نقل راس الطباعة يدويا إلى كل نقطه بالتسلسل ، وتسجيل إحداثيات هذه النقاط في الترتيب. ادخل كافة هذه الإحداثيات بالاضافه إلى سرعه نقل راس الطباعة لكل قطعه مطبوعه في محرر G-code.
- علي حد سواء قبل وبعد الطباعة ، ورفع راس الراس إلى مسافة اعلي من حافه لوحه (20 ملم) ، والانتقال مباشره من المنطقة لوحه. حفظ هذا البرنامج كملف رمز G وتحميل مباشره للاستخدام في المطبوعات اللاحقة ، في حين أعاده قياس ارتفاع محور Z لكل ركيزة الطباعة الجديدة.
ملاحظه: راجع الجدول 1 للحصول علي مثال رمز G لطباعه مربع. - تحميل ملف التعليمات البرمجية G-المبرمجة مسبقا. افتح محرر رمز G في البرنامج ، والبرنامج في الأوامر لطباعه الشكل المطلوب. في كل سطر الأوامر ، قد يتم تغيير موضع راس الطباعة في المحور س ، ص ، و/أو Z. إدخال قيمه Z اثناء كافة خطوات الطباعة كما Z1 + Z2 (ارتفاع سطح الطباعة + مسافة العمل).
ملاحظه: سرعه التحريك هو أيضا قابل للتعديل. 9,000 مم/دقيقه هي قيمه مناسبه لمعدلات الطباعة النموذجية. - تحميل السائل الحيوي الحبر في حقنه (ق) ، وتركيبها في مضخة حقنه (ق) من بيوركانتر 3D.
- اطبع الحبر الحيوي علي ركيزة الطباعة بالنقر علي زر الطباعة.
- اثناء الطباعة ، والسيطرة علي حركه راس الطباعة تماما من قبل البرنامج. يدويا بدء ضخ حقنه قبل راس الطباعة ياتي في اتصال مع سطح الطبعة.
ملاحظه: يتم تحديد التنسيق من مضخة حقنه والطابعة بشكل تجريبي اعتمادا علي سرعه البثق ، والسرعة التي يتحرك راس الطباعة إلى نقطه البداية الاولي ، والموقف الاولي لراس الراس. إذا كان الموقف راس الطباعة الاولي هو 20 ملم ، مع سرعه راس الطباعة من 9,000 مم/دقيقه وسرعه البثق من 0.1 mL/h ، بدء ضخ حقنه مباشره بعد بدء الطباعة. إذا تم تغيير سرعه البثق من 0.1 mL/h إلى 0.3 mL/h ، ثم الانتظار 2 − 3 s لبدء ضخ حقنه بعد بدء الطباعة. - وقف مضخة حقنه بمجرد وصول راس الطباعة في النقطة الاخيره للطباعة. وقف مضخة حقنه قبل المصاعد راس الطباعة حتى في نهاية عمليه الطبع ، والا فان الحبر الحيوي الزائدة تسقط علي الركيزة الطباعة والحد من دقه الطباعة.
- لبناء هياكل 3D ، والسيطرة علي جميع حركات راس الطباعة في محرر G-رمز. اكتب في ارتفاع الطباعة من الطبقة الاولي. زيادة القيمة Z في رمز G ب0.2 ملليمتر للطبقة الثانية لزيادة ارتفاع الطباعة. بعد ذلك, زدت ال [ز-فلو] ب 0.1 ملليمتر عندما يتحرك إلى [هيغر] طبقه. لا تقم بتحريك اللوحة اثناء عمليه الطباعة.
- لقياس العرض والارتفاع من هيدروجيل المطبوعة ، واستخدام مسطره الصلب وضعت تحت أو إلى جانب العينة.
5. زراعه واختبار فعاليه إنتاج بيوفيلم من قبل كولاي
- احتضان العينات المطبوعة في درجه حرارة الغرفة لمده 3 − 6 أيام للسماح بإنتاج مكونات بيوفيلم (ألياف curli). صوره لوحات باستخدام كاميرا أو الماسح الضوئي الفلورسنت.
- لحل مصفوفة الجينات ، أضافه 20 مل من 0.5 M الصوديوم الحل سيترات (pH = 7 تعديل مع NaOH) إلى ركائز الطباعة ، واحتضان لمده 2 ح مع 30 دوره في الدقيقة تهتز في درجه حرارة الغرفة. تجاهل السائل وصوره لوحات مره أخرى للمقارنة مع صور لوحات قبل العلاج سيترات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الخطوة الاولي لنجاح الطباعة ثلاثية الابعاد من الاغشيه البيولوجية هو تحويل طابعه 3D التجارية إلى بيوركانتر. ويتحقق هذا التحويل عن طريق أزاله الطارد وسخان من الطابعة ، والمصممة للطباعة بالحبر البوليمر ، واستبدال هذه مع المكونات المناسبة لطباعه الحبر الحيوي التي تحتوي علي البكتيريا الحية (الشكل 1A). يتم استبدال الطارد بطرف ماصه (أو نصائح ، إذا كان سيتم استخدام العديد من الأحبار الحيوية في عمليه الطباعة) المرفقة بنظام أنابيب متصل بمضخة الحقنه (الشكل 1B). يمكن تقييم التحويل الناجح للطابعة التجارية إلى بيوركانتر استنادا إلى القدرة علي نقل الحبر الحيوي (الأحبار) المطلوبة من مضخة الحقنه من خلال نظام الأنابيب وطرف الماصة (ق) علي سطح الطباعة دون تسريب أو تسخين الحبر الحيوي. إذا كانت أنابيب الانتفاخات بسبب تدفق الحبر الحيوي اثناء الطباعة ، فانه يمكن استبدالها بالأنابيب مع الجدران سمكا. وتجدر الاشاره إلى ان هذه التقنية الطباعة يجب ان تكون قادره علي العمل مع اي نوع من الطابعة التجارية 3D التي يمكن ان تعلق الأنابيب إلى راس الطباعة.
ويمكن لل 3D بيوركانتر إنشاء البكتيريا-تغليف الهيدروجيل في مجموعه متنوعة من ثنائي الابعاد (2D) والاشكال 3D (الشكل 2). أيونات الكالسيوم في الركيزة الطباعة للحث علي التصلب (أزاله المعدن العضوي من أيونات الكالسيوم مع مجموعات الكربوكسيل الجينات) من الحبر الحيوي عند الطباعة ، وتحويل السائل الحيوي الحبر إلى هيدروجيل الصلبة. سيعتمد القرار من القرصنة البيولوجية علي سرعه البثق ، وحجم غيض ماصه ، وسرعه راس الطباعة ، وحجم وتركيز CaCl2 الحل أضافه إلى حل أجار ، والتسطيح من سطح الطباعة ، ولزوجه الحبر الحيوي المستخدم. تركيز محلول CaCl2 له تاثير كبير علي الحده هيدروجيل. وقد عينت أربعه تركيزات مختلفه من CaCl2 (0.1 m ، 0.2 m ، 1 m ، و 5 m) ، وفقط 5 m cacl2 حل ادي إلى هيدروجيل التي لم تصبح واضحة بعد الطباعة. لذلك ، تم اختيار 5 M كالتركيز الأمثل للحل CaCl2 .
في إصدار سابق من هذا البروتوكول ، تم تطبيق حل CaCl2 علي سطح لوحه أجار بدلا من خلطها في محلول أجار قبل صب لوحه أجار. عند استخدام هذا الإصدار ، فان حجم الحل CaCl2 له تاثير حاسم علي جوده الطباعة والدقة. عند استخدام 150 x 15 مم طبق بيتري ، وتطبيق حجم محلول كلوريد الكالسيوم من أكثر من 100 μL (أو 30 μL لطبق بيتري 90 ملم) نتائج في الكثير من السائل المتبقية علي سطح الطباعة. قد ينتشر هذا السائل بشكل غير متساو عند نقل الصفيحة ، والتي يمكن ان تغير مسافة العمل وتسبب انسداد طرف الماصة. حجم الكثير من CaCl2 يمكن أيضا ان يسبب المواد الهلامية المطبوعة لتعويم والانزلاق عبر الحل ، وتغيير شكل وموقف هيدروجيل المطبوعة. إذا كان حجم محلول كلوريد الكالسيوم صغير جدا ، قد لا تتلقي بعض المناطق من اللوحة حل CaCl2 سيكون لها التصلب هيدروجيل الفقراء. في هذا البروتوكول المحسن ، أضافه حل CaCl2 مباشره إلى حل أجار قبل صب لوحه أجار أسفرت عن رطوبة اقل إلى حد كبير علي سطح الركيزة الطباعة بالمقارنة مع طريقه السطح التطبيقية ، مما ادي إلى دقه طباعه محسنه بشكل كبير.
سرعه البثق وحركه راس الطباعة مترابطة ويمكن ضبطها بطريقه منسقه لتغيير دقه الطباعة. علي سبيل المثال ، إذا تم تشغيل الطابعة مع سرعه البثق بين 0.1 ml/h و 0.5 ml/h مع سرعه حركه راس الطباعة ثابت من 300 mm/min ، والقطر من هيدروجيل المطبوعة يزيد مع زيادة سرعه البثق2،20. في سرعات البثق أكثر من 0.5 mL/h ، الحواف الخارجية للخطوط المطبوعة من هيدروجيل تغيير من خطوط مستقيمة ومتوازية إلى خطوط متموجة ، وعرض الخط أيضا يزيد. سرعه راس الطباعة أيضا له تاثير علي دقه الطبع. مع سرعه البثق ثابت من 0.3 mL/h ، وزيادة سرعه راس الطباعة من 300 مم/دقيقه إلى 500 مم/دقيقه النتائج في عرض هيدروجيل المطبوعة تصبح أضيق ، وانخفاض من 1.8 مم إلى 0.9 مم. إذا كانت السرعة المتحركة لراس الطباعة أكثر من 500 مم/دقيقه ، سيصبح خط الهلام بسهوله متقطعا. بالنسبة لطرف ماصه 200 μL والحبر الحيوي المستخدم في الدراسة الحالية ، تعتبر عده تركيبات من دقه الطباعة الأمثل (الجدول 2). في ضخ سرعه 0.3 mL/h ، راس الطباعة حركه سرعه 500 مم/دقيقه ، والعمل مسافة 0.2 ملم ، يتم إنتاج هيدروجيل المطبوعة مع عرض ما يقرب من 0.9 مم.
أحد الإنجازات الحاسمة لطريقه الطباعة ثلاثية الابعاد البكتيرية هو قدرتها علي إنشاء الاغشيه الحيوية المهندسة. لإنشاء بيوفيلم المهندسة والخاضعة للرقابة المكانية ، يجب الا تنجو البكتيريا من عمليه الطباعة ثلاثية الابعاد فحسب ، بل يجب أيضا ان تنتج مكونات بيوفيلم بينما تبقي ضمن النقش المطبوع. والبكتيريا القولونية المهندسة المستخدمة في هذا البروتوكول ، e. كولاي δcsga البكتيريا التي تحمل البلازميد pSB1C3-gfp-csga ، وتمكين التعبير التي يمكن السيطرة عليها من البروتينات curli. استخدام سلاله csga-ضربه قاضيه يضمن ان يتم التعبير عن بروتين csga فقط عندما يتم المستحثة من البلازميد مع rhamnose. البكتيريا تصدير وحدات البروتين CsgA المستحثة ، والتي ثم الذاتي تجميع21 علي البروتينات csga علي الغشاء الخارجي البكتيري22 لتشكيل ألياف curli. هذه ألياف الشبيهة اميلويد هي المكونات البروتينية الرئيسية لمصفوفة البيوفيلم الخلوية: شبكه متصلة من البروتينات والبوليمرات التي يتم تضمين البكتيريا فيها. المصفوفة الجينات المطبوعة من 3D-طباعه الحبر الحيوي يضفي الدعم المادي وهيكل للبكتيريا خلال عمليه الإنتاج curli. استخدام التعبير GFP التاسيسيه يسمح لتصور والتقدير الكمي للخلايا المطبوعة عن طريق التصوير الفلوري.
من أجل تقييم ما إذا كان تشكيل بيوفيلم ناجحا ، تم حل مصفوفة الجينات باستخدام محلول سيترات الصوديوم ، وتم تقييم شكل الحبر الحيوي المطبوع بعد علاج سيترات (الشكل3). في حاله الحبر الحيوي بدون الإنتاج القابل للحشو curli ، تم حل النمط المطبوع تماما بعد العلاج سيترات الصوديوم ، مما يدل علي انه لا توجد شبكه بيوفيلم curli قد شكلت (الشكل 3a، B). في حاله البكتيريا التي تحتوي علي البلازما الإنتاج القابل للحث ، لم يذوب الهلام بعد العلاج سيترات الصوديوم (الشكل 3C، D). وتشير هذه النتيجة إلى ان البكتيريا المطبوعة كانت قادره علي تشكيل شبكه curli واسعه بما يكفي لتحقيق الاستقرار في نمط المطبوعة من البكتيريا2.
لإنشاء هياكل متعددة الطبقات ، تمت طباعه طبقات اضافيه (الشكل 4) عن طريق ضبط ارتفاع الطباعة ومسار الطباعة في محرر رمز G. زيادة عدد الطبقات المطبوعة في عينه تسبب عرض وارتفاع الهياكل المطبوعة لزيادة تدريجيا (الشكل 5)2،20، ولكن حتى الهياكل المطبوعة 5-طبقه يمكن ان تنشا مع قرار مليمترات إلى المليمترات الفرعية. عندما e. القولونية المهندسة لإنتاج البروتينات curli التي تم طباعتها في هياكل متعددة الطبقات ، لم العلاج سيترات الصوديوم حل العينات ، في حين ان الهياكل متعددة الطبقات التي تحتوي علي غير curli المنتجة e. القولونية كانت حلها في محلول سيترات الصوديوم (الشكل 6). وتبين هذه التجربة انه يمكن إنشاء الاغشيه البيولوجية المهندسة في هياكل مطبوعه متعددة الطبقات وثلاثية الابعاد ، وكذلك في هياكل مطبوعه أحاديه الطبقة.
الشكل 1: الصور التي تظهر تحويل طابعه ثلاثية الابعاد تجاريه إلى بيوركانتر ثلاثية الابعاد. (ا) مكونات القرصنة البيولوجية ثلاثية الابعاد بعد التحويل من طابعه ثلاثية الابعاد تجاريه. (ب) طارد الحبر الحيوي الذي شكله نظام أنابيب ملحق بطرف ماصه. ويمكن أضافه نصائح الطباعة اضافيه في فتحه راس راس الثاني أو عن طريق أضافه ثقوب اضافيه إلى راس الطباعة ، لاستخدامها في طباعه أنواع متعددة من الحبر الحيوي. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: أمثله للأنماط البيولوجية ثلاثية الابعاد التي تحتوي علي e. كولاي pSB1C3-Gfp-csga. وقد أخذت هذه الصور بعد يومين من الطباعة. تم الحصول علي هذا القرار الطباعة مع ضخ سرعه 0.3 mL/h ، راس الطباعة حركه سرعه 300 مم/دقيقه ، والعمل مسافة 0.2 مم. يمكن العثور علي رموز G لطباعه هذه الاشكال في الملفاتالاضافيه. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: طريقه للتحقق مما إذا كانت مكونات بيوفيلم قد تم إنتاجها بواسطة بكتيريا كولاي ضمن نمط مطبوع. عندما المطبوعة e. القولونية الواردة البلازميد التي لم ترميز للاستقراء curli ، تم حل النمط المطبوع تماما من قبل العلاج سيترات الصوديوم (a و B). عندما e. القولونية التي تحتوي علي ترميز البلازميد البروتينات curli تم استخدامها ، وكان بيوفيلم المطبوعة مقاومه لعلاج سيترات الصوديوم (C و D). وترد في الجدول 1عمليه البرمجة وشروح المدونة G لطباعه هذا النمط المربع. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: العرض العلوي (A) والعرض الجانبي (B) للهياكل المطبوعة متعددة الطبقات التي تحتوي علي e. كولاي pSB1C3-Gfp-csga. تمت طباعه هذه العينة مع ضخ سرعه 0.3 mL/h ، راس الطباعة حركه سرعه 200 مم/دقيقه ، والعمل مسافة 0.2 مم. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: عرض الخط وارتفاع الهلام المائي المطبوع الذي يحتوي علي اعداد مختلفه من الطبقات المطبوعة. وأجريت القياسات علي عينات المطبوعة مع سرعه الضخ 0.3 mL/h ، راس الطباعة سرعه الحركة 500 مم/دقيقه ، والعمل مسافة 0.2 مم. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: طريقه للتحقق مما إذا كانت مكونات بيوفيلم قد تم إنتاجها بواسطة بكتيريا كولاي داخل الهياكل المطبوعة متعددة الطبقات. تمت طباعه القولونية الهندسية في 1-، 3 ، أو 5-طبقه المواد الهلامية المائية وحضنت لمده 6 أيام. عندما المطبوعة e. القولونية الواردة البلازميد التي لم ترميز للاستقراء curli ، تم حل النمط المطبوع تماما من قبل العلاج سيترات الصوديوم (a و B). عندما المطبوعة e. القولونية الواردة الترميز البلازميد البروتينات curli ، كان بيوفيلم المطبوعة مقاومه لعلاج سيترات الصوديوم (C و D). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
| أوامر G-رمز | المهام |
| G1 Z20 F9000 | رفع Z-المحور إلى ارتفاع 20 ملم مع 9,000 mm/min سرعه التحرك. |
| G1 X95 Y65 F9000 | الانتقال إلى نقطه البداية من السطر الأول مع 9,000 mm/min سرعه التحرك. |
| G1 Z6 F9000 | التحرك للأسفل في اتجاه Z إلى السليم (هنا Z = 6 ملم) مسافة الطباعة. |
| G1 X95 Y105 F300 | نقطه النهاية للسطر الأول ونقطه البداية للسطر الثاني. |
| G1 X135 Y105 | نقطه نهاية السطر الثاني ونقطه البداية للسطر الثالث. |
| G1 X135 Y65 | نقطه نهاية السطر الثالث ونقطه البداية للخط الرابع. |
| G1 X95 Y65 | نقطه نهاية السطر الرابع ونقطه البداية من السطر الأول; يتم تشكيل مربع. |
| G1 Z20 F9000 | رفع المحور Z إلى ارتفاع 20 ملم في 9,000 مم/دقيقه. |
| G1 X55 Y40 F9000 | الانتقال إلى احداثي (55 ، 40) خارج نطاق طبق بيتري. |
الجدول 1: عمليه البرمجة وشروح رمز G لطباعه مربع.
| سرعه البثق (mL/h) | راس الطباعة المتحركة السرعة (مم/دقيقه) | هلام العرض (مم) |
| 0.1 | 100 | 1.6 ± 0.1 |
| 0.1 | 200 | 1.1 ± 0.1 |
| 0.1 | 300 | 1.0 ± 0.1 |
| 0.3 | 300 | 1.8 ± 0.1 |
| 0.3 | 400 | 1.2 ± 0.1 |
| 0.3 | 500 | 0.9 ± 0.1 |
| 0.5 | 200 | 2.2 ± 0.2 |
| 0.5 | 1,200 | 1.2 ± 0.2 |
| 0.7 | 200 | 2.8 ± 0.1 |
| 0.7 | 1,200 | 1.3 ± 0.1 |
الجدول 2: معلمات الطباعة المثلي للهيدروجيل مع دقه عاليه. وتم قياس خمس نقاط لكل حاله. يتم عرض متوسط القيمة والانحراف المعياري في الجدول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
البروتوكول المعروض هنا للطباعة ثلاثية الابعاد من الاغشيه الحيوية المهندسة له خطوتين حاسمتين. الأول هو اعداد سطح الطباعة أجار ، وهو العامل الأكثر اهميه لإنتاج دقه الطباعة محدده. من المهم التاكد من ان سطح الطباعة مسطح وانه يتم وضع طرف الماصة علي الراس في الارتفاع الصحيح من السطح. إذا لم يكن السطح مسطحا ، ستتغير مسافة العمل اثناء عمليه الطباعة. إذا كانت مسافة العمل اقل من 0.1 مم ، يمكن ان يدخل محلول CaCl2 داخل طرف الماصة ويسبب تشكيل هيدروجيل ، مما يتسبب في انسداد طرف الماصة. إذا كانت مسافة العمل أكثر من 0.3 مم ، لا يمكن طباعه الهلام بشكل مستمر. مسافة العمل الأمثل في هذه الدراسة هو 0.2 مم. النهج الجيدة لاعداد مسطحه أجار السطوح الطباعة هي لاستخدام أكبر--قطرها اطباق بيتري (150-mm-القطر طبق بتري بدلا من لوحه 90-مم-قطر) ، وضع لوحات علي طاوله مسطحه ، صب أجار حل مع سريعة وحتى السرعة ، وتجنب تحريك لوحه أجار خلال التصلب لها.
الخطوة الحاسمة الثانية هي اختيار معلمات الطباعة المطلوبة بما في ذلك سرعه الضخ ، واللزوجة من الحبر الحيوي المستخدمة ، وسرعه راس الطباعة ، والتي تحدد دقه الطبع الناتجة. لتحديد هذه المعلمات بطريقه فعاله ، يمكن للمستخدم عينه العديد من القيم المتطرفة لسرعه راس الطباعة مع معدل البثق ثابت ، مشيرا إلى عرض هيدروجيل المطبوعة لكل مجموعه من الشروط. ثم ، كرر هذه التجربة مع 4 معدلات البثق الأخرى. بعد ذلك ، خذ التركيبات الخمسة التي أنتجت أفضل دقه الطباعة للتطبيق ، وتختلف كلا من معلمات الطباعة (سرعات الضخ وراس الطباعة) في خطوات أصغر وأصغر حتى يتم الحصول علي الدقة المطلوبة.
سمك الخطوط المطبوعة له تاثير علي قدره البكتيريا المهندسة المطبوعة لتشكيل الاغشيه البيولوجية مستقره. تحت ظروف الطباعة الأمثل (سرعه الضخ 0.3 mL/h ، راس الطباعة سرعه 300 مم/دقيقه ، والعمل مسافة 0.2 مم) ، وخطوط مطبوعه من الحبر الحيوي سوف تنتج مستقره بيوفيلومس بعد 3-6 أيام من الحضانة في درجه حرارة الغرفة. إذا أصبحت الخطوط أكثر سمكا ، مثل زيادة سرعه الضخ ، فان المناطق الوسطي من كل خط قد لا تكون مستحثه بما فيه الكفاية لإنتاج الاغشيه البيولوجية المستقرة سيترات.
عند طباعه هيدروجيل متعدد الطبقات من الحبر الحيوي ، يتم تدعيم كل طبقه مطبوعه عند الاتصال بأيونات الكالسيوم التي انتشرت في الطبقة المطبوعة السابقة. منذ Ca2 + تركيز في الركيزة الطباعة عاليه ، ca2 + أيونات يمكن ان ينتشر بسرعة حتى من خلال الطبقات السفلي. ولذلك ، يمكن طباعه الطبقات العليا مباشره بعد طباعه الطبقات السابقة ، ببساطه عن طريق ضبط ارتفاع الطباعة في محرر رمز G. بالاضافه إلى ذلك ، يجب ان تقتصر مسافة الطباعة من الطبقة العليا إلى 0.1-0.2 مم فقط اعلي من مسافة الطباعة من الطبقة السابقة. إذا كانت مسافة الطباعة المضافة اقل من 0.1 مم ، سيتم سحب الطرف عبر الطبقة الاولي وتقليل دقه هيدروجيل المطبوع. إذا كانت مسافة الطباعة المضافة أكبر من 0.2 مم ، فان الحبر الحيوي سيشكل قطرات من السائل اثناء القذف ، مما يسبب هيدروجيل المطبوع ليصبح متقطعا.
ويتيح نهج القرصنة البيولوجية الحالي إنتاج الاغشيه الحيوية الهندسية القابلة للاستنساخ والخاضعة للرقابة المكانية ، والمناسبة للاستخدام في دراسة الخواص الميكانيكية بيوفيلم أو المقاومة الاحيائيه لبكتيريا بيوفيلم لعوامل مختلفه بما في ذلك المضادات الحيوية ، السطحي ، الخ. وتضمن هذه القدرة امكانيه الاستخدام المباشر للأسلوب المقترح. تطوير عاليه الدقة تفعل ذلك بنفسك (DIY) القرصنة البيولوجية من المرجح ان يكون من الممكن من خلال الحفاظ علي الطباعة العمل المسافة ولكن خفض سرعه الضخ وسرعه التحرك من راس الراس ، أو عن طريق أخذ العينات هندسي الطارد مختلفه chemistries الحبر الحيوي. مع التحسينات المستقبلية لدقه الطباعة ، يمكن تمكين تطبيقات اضافيه مثل هندسه الانسجه أو تسليم المخدرات. يجب أيضا ان يكون النهج البيولوجي ثلاثي الابعاد الموصوف هنا قادرا علي التوسع لطباعه أنواع اضافيه من أنواع البكتيريا المتوافقة بيولوجيا مع الحبر الحيوي القائم علي الجينات. يوفر البروتوكول الحالي العقم الكافي عن طريق الغليان المتكرر للحبر الحيوي اثناء التحضير ، وذلك باستخدام المحاقن المعقمة ونصائح الطباعة ، واستخدام المضادات الحيوية في كل من الحبر الحيوي ولوحه الطباعة. قد تتطلب التجارب المستقبلية باستخدام البكتيريا من النوع البري إجراءات تعقيم اضافيه مثل استبدال أو تعقيم نظام الأنابيب بين المطبوعات.
النسبة لأفضل معارف المؤلفين ، فان الطريقة المعروضة (التي وضعت أصلا في لينر وآخرون20) هي المثال الأول المنشور لأسلوب التصنيع المضاف للطباعة ثلاثية الابعاد للبكتيريا. في الجزء الأول من هذا البروتوكول ، يتم وصف هذه الطريقة العامة بالتفصيل للطباعة ثلاثية الابعاد من البكتيريا ، والتي يتم تطبيقها علي إنتاج الاغشيه البيولوجية المهندسة2. التطبيقات المستقبلية متعددة من المواد البيولوجية المطبوعة ثلاثية الابعاد ممكنة باستخدام هذا الأسلوب. في الطبيعة ، تطورت النظم البكتيرية المتعددة التي تخلق أنواع مختلفه من الاغشيه البيولوجية ، والتي في هذه المقالة تم استكشاف نظام واحد. يمكن فحص العديد من الانظمه الأخرى بسهوله من خلال إنشاء الاغشيه الثلاثية الابعاد المطبوعة مع الانظمه البكتيرية الأخرى ، مثل العصي الفرعية أو الاستيفه الشحمية. الطرق البديلة23,24 وقد وضعت أيضا لزخرفه المكانية من البكتيريا بدقه عاليه باستخدام الإشارات البصرية. تتطلب هذه الطرق معدات أكثر تكلفه وتعقيدا لتحقيقها بالمقارنة مع هذه الطابعة ، وهي مناسبه فقط لزخرفه من البكتيريا المهندسة وراثيا.
القدرة علي نمط مكاني المطبوعة ثلاثية الابعاد الاغشيه البيولوجية مع هذا الأسلوب يمكن ان تسمح لخلق الاغشيه البيولوجية المهندسة التي تتكاثر التغاير المكاني من الاغشيه البيولوجية الطبيعية25. بسبب ترتيب مفصل للغاية من البروتين وألياف البوليمريه داخل بيوفيلم ، البكتيريا في دوله بيوفيلم تحقيق مقاومه اعلي بكثير من المحفزات الكيميائية والفيزيائية ، مثل زيادة المقاومة للمضادات الحيوية بالمقارنة مع نفس البكتيريا في الدولة بلانكتونيك. وعلاوة علي ذلك ، تظهر البكتيريا داخل بيوفيلم مقاومه متزايدة لتدفق السوائل ، مما يجعل الصيانة والعقم من الاجهزه الطبية القابلة للزرع أكثر صعوبة26. الاغشيه البيولوجية المهندسة المطبوعة التي تحاول أعاده إنتاج التوزيعات المكانية المحددة لمكونات بيوفيلم هي أدوات قويه لدراسة أليات التي البكتيريا داخل بيوفيلم تحقيق الأنماط الظاهرية المقاومة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
وكان هذا العمل مدعوما بمنحه من الأرض (رقم FA2386-4059) ، المنظمة الهولندية للبحوث العلمية (NWO/أؤبن كورس واير) كجزء من برنامج افاق العلوم النانويه ، وبرنامج المواد المتقدمة NWO-NSFC (رقم 729.001.016). ويعترف المؤلفون بالمساعدة المختبرية لرامون فان دير فألك ورولان Kieffer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printer | CoLiDo | 3D-P Kit | |
| 3D printing software | CoLiDo | Print-Rite ColiDo Repetier-Host v2.0.1 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 05040 | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | 3886.1 | |
| LB broth powder | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-092 | Model 3500 |
| Petri dish | VWR | 25384-326 | 150 x 15 mm |
| Rhamnose | Sigma-Aldrich | 83650 | |
| Silicon tubing | VWR | DENE 3100103/25 | |
| Syringe pump | ProSense B.V. | NE-300 | |
| Sodium alginate | Sigma-Aldrich | W201502 | |
| Sodium citrate monobasic | Sigma-Aldrich | 71498 | |
| Sodium hydrooxide | VWR | 28244.295 |
References
- Tibbitt, M. W., Rodell, C. B., Burdick, J. A., Anseth, K. S. Progress in material design for biomedical applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (47), 14444-14451 (2015).
- Schmieden, D. T., et al. Printing of Patterned, Engineered E. coli Biofilms with a Low-Cost 3D Printer. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1328-1337 (2018).
- Mao, L. B., et al. Synthetic nacre by predesigned matrix-directed mineralization. Science. 354 (6308), 107-110 (2016).
- Gao, H. L., et al. Mass production of bulk artificial nacre with excellent mechanical properties. Nature Communications. 8 (1), 287 (2017).
- Poirier, Y., Nawrath, C., Somerville, C. Production of Polyhydroxyalkanoates, a Family of Biodegradable Plastics and Elastomers, in Bacteria and Plants. Nature Biotechnology. 13, 142-150 (1995).
- Choi, S. Y., et al. One-step fermentative production of poly(lactate-co-glycolate) from carbohydrates in Escherichia coli. Nature Biotechnology. 34 (4), 435-440 (2016).
- Mohammadi, P., Toivonen, M. S., Ikkala, O., Wagermaier, W., Linder, M. B. Aligning cellulose nanofibril dispersions for tougher fibers. Scientific Reports. 7 (1), 11860 (2017).
- Jonkers, H. M. Bacteria-based self-healing concrete. Heron. 56 (1/2), (2011).
- Schmieden, D. T., Meyer, A. S., Aubin-Tam, M. E. Using bacteria to make improved, nacre-inspired materials. MRS Advances. 1 (8), 559-564 (2016).
- Zhong, C., et al. Strong underwater adhesives made by self-assembling multi-protein nanofibres. Nature Nanotechnology. 9 (10), 858-866 (2014).
- Chen, A. Y., et al. Synthesis and patterning of tunable multiscale materials with engineered cells. Nature Materials. 13 (5), 515-523 (2014).
- Gatenholm, P., Klemm, D. Bacterial Nanocellulose as a Renewable Material for Biomedical Applications. MRS Bulletin. 35, 208-213 (2010).
- Rodriguez-Carmona, E., Villaverde, A. Nanostructured bacterial materials for innovative medicines. Trends in Microbiology. 18 (9), 423-430 (2010).
- Hung, C., et al. Escherichia coli biofilms have an organized and complex extracellular matrix structure. MBio. 4 (5), (2013).
- Donlan, R. M., Costerton, J. W. Biofilms: Survival Mechanisms of Clinically Relevant Microorganisms. Clinical Microbiology Reviews. 15 (2), 167-193 (2002).
- Wu, H., Moser, C., Wang, H. Z., Hoiby, N., Song, Z. J. Strategies for combating bacterial biofilm infections. International Journal of Oral Science. 7 (1), 1-7 (2015).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).
- Kikuchi, T., Mizunoe, Y., Takade, A., Naito, S., Yoshida, S. Curli Fibers Are Required for Development of Biofilm Architecture in Escherichia coli K-12 and Enhance Bacterial Adherence to Human Uroepithelial Cells. Microbiology and Immunology. 49 (9), 875-884 (2005).
- Cranford, S., Buehler, M. J. Materiomics: biological protein materials, from nano to macro. Nanotechnology, Science and Applications. 3, 127-148 (2010).
- Lehner, B. A. E., Schmieden, D. T., Meyer, A. S. A Straightforward Approach for 3D Bacterial Printing. ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1124-1130 (2017).
- Wang, X., Smith, D. R., Jones, J. W., Chapman, M. R. In vitro polymerization of a functional Escherichia coli amyloid protein. Journal of Biological Chemistry. 282 (6), 3713-3719 (2007).
- Hammar, M., Bian, Z., Normark, S. Nucleator-dependent intercellular assembly of adhesive curli organelles in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (13), 6562-6566 (1996).
- Huang, Y. J., Xia, A. G., Yang, G., Jin, F. Bioprinting Living Biofilms through Optogenetic Manipulation. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1195-1200 (2018).
- Jin, X. F., Riedel-Kruse, I. H. Biofilm Lithography enables high-resolution cell patterning via optogenetic adhesin expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (14), 3698-3703 (2018).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).
- Percival, S. L., Suleman, L., Vuotto, C., Donelli, G. Healthcare-associated infections, medical devices and biofilms: risk, tolerance and control. Journal of Medical Microbiology. 64, 323-334 (2015).
