Summary
本文介绍了一种将低成本商用3D 打印机转换为细菌3D 打印机的方法, 该打印机可促进图案生物膜的打印。介绍了制备生物打印机和生物油墨的所有必要方面, 以及评估生物膜形成的验证方法。
Abstract
生物膜是细菌的集合体, 嵌入在自产生的空间模式的细胞外基质中。生物膜内的细菌会产生增强的抗生素耐药性, 这对健康构成潜在的危害, 但也可能有利于环境应用, 如饮用水的净化。抗菌疗法和生物膜启发应用的进一步发展将需要开发可重复的、可工程化的生物膜制造方法。近年来, 一种利用改进型三维 (3D) 打印机制备细菌油墨的生物膜的新方法。本文介绍了构建这种高效、低成本的3D 生物打印机所需的步骤, 它在细菌诱导材料加工中提供多种应用。该协议从一个经过调整的商用3D 打印机开始, 在这种打印机中, 挤出机已被连接到注射器泵系统的生物墨水分配器所取代, 从而实现了可控的、连续的生物墨水流动。为了开发一种适用于生物膜印刷的生物油墨, 工程中的大肠杆菌被悬浮在海藻酸盐溶液中, 使其与含钙表面发生凝固。在印刷基板中加入诱导剂化学品会推动生物膜蛋白在印刷生物油墨中的表达。该方法可对由印刷生物膜的离散层组成的各种空间图案进行3D 打印。这种空间控制的生物膜可以作为模型系统, 并可以在对社会产生广泛影响的多个领域找到应用, 包括抗生素耐药性预防或饮用水净化等。
Introduction
由于空间图案材料的市场不断增加, 目前越来越需要开发环保、可持续的空间图案材料生产解决方案1。本文介绍了一种简单、经济的生产此类材料的方法, 因此提供了大量的未来应用。这里介绍的方法允许使用含有活细菌的生物油墨对空间图案结构进行三维 (3D) 打印。细菌在印刷结构中保持一周以上的活力, 使细菌能够进行自然或工程的代谢活动。因此, 印刷细菌可以在印刷结构中产生和沉积所需的成分, 例如创建一个功能交联生物膜2。
生产先进材料的传统方法涉及高能源支出 (如高温和高压), 并可能产生大量化学废物, 往往是需要成本广泛使用的有毒物质 3 ,4。相比之下, 多种细菌物种能够生产出容易适用于各种行业的材料。这些材料包括聚合物, 如聚羟基烷酸盐 (pha)5或聚 (乙二醇-异丙基)(pgla) 6, 细菌纤维素7, 细菌混凝土材料8, 仿生复合材料9,淀粉基胶粘剂10台, 或生物基电气开关 11, 等等。此外, 有价值材料的细菌生产通常在接近环境温度和压力的环境中, 在水环境中进行, 不需要或不产生有毒化合物。虽然用细菌生产材料已在文献中得到证明, 一些工业应用已经出现了12、13,但这种材料的空间模式的可靠方法仍然是一项挑战。
本文演示了一种将低成本商用3d 打印机转换为3D 细菌打印机的直接方法。该协议展示了如何制备含有和维持活细菌的生物油墨, 以及如何制备可以进行3D 打印的基板。这种方法适用于能够产生材料的各种天然和工程细菌株。这些细菌可以在三维打印结构中进行空间分布, 并继续其代谢活动, 这将导致细菌产生的所需材料的空间分布。
这种印刷方法使生物膜的添加剂制造, 细菌的聚集被一个自我产生的细胞外基质包围。生物膜是异质的3D 网络, 其中蛋白质、聚合物、细菌细胞、氧气和营养物质都是空间结构的 14。而以生物膜的形式, 细菌表现出更强的抗生素耐药性和结构鲁棒性, 使其难以从包括医疗导管和植入物在内的表面中根除。生物膜特性的关键, 也是生物膜研究面临的最大挑战, 似乎是生物膜15、16、17的异质性。空间控制模型生物膜的生产特别令人感兴趣, 因为它将允许复制或调整生物膜组件的空间模式, 有助于了解生物膜在几乎任何表面上的稳定沉积。自然。
本文介绍了一种使用3d 打印的含有工程大肠杆菌的水凝胶生产生物膜的方法, 这些水凝胶在感应器存在的情况下产生生物膜蛋白, 以及生物膜形成的验证方法2.这些生物膜的细胞外基质成分是含有自组装 CsgA 蛋白的 curli 淀粉样纤维 18.当工程中的大肠杆菌被诱导表达 csga 蛋白时, 它们形成一个稳定的生物膜模型, 保护细胞免受从印刷表面被冲走的影响。这种三维印刷生物膜可以在空间上进行控制, 可以作为研究多尺度生物膜结构-功能力学或材料组学的有用研究工具19。这些定制的生物膜将有助于了解生物膜形成的原理及其机械性能, 从而能够进一步研究抗生素耐药的机制等应用。
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Protocol
1. 将商用3D 打印机转换为3D 生物打印机
- 从打印机机架上取下商用3d 打印机 (材料表) 的挤出机和加热器, 然后从主电路板上拔下控制这些元件的接线 (图 1 a)。由于控制打印机工作温度的传感器需要能够与打印机软件进行通信, 因此请从打印软件中删除延迟打印直到达到工作温度的算法。
- 通过硅管 (内径为1毫米) 将移液器尖端 (200μl 尖端) 连接到装入注射器泵的5毫升注射器上。将移液器尖端安装到3D 打印机挤出机头上, 以替代原始挤出机 (图 1 b)。
- 如果将使用多种类型的生物墨水, 请将额外的管道系统和移液器尖端安装到打印机上。
2. 3D 打印的基板准备
- 将 5m Ccl 2 溶液的 4 ml 加入到溶于 Luria-Bertani 肉汤 (lb) 培养基中的 1% wv agar 的 400 ml 中, 辅以适当的抗生素和诱导剂 (这里为34μgml 氯霉素和0.5% 鼠李糖)。
- 将 LB-agar 溶液的20毫升分配到每个150毫米 X15 毫米 Petri 培养皿中。在室温下干燥 30分钟, 盖子半开。
注: 通过将这些打印基板存储在4°c 中最多几天, 可以在此处暂停该协议。
3. 生物油墨的制备
- 制备海藻酸钠溶液 (3% w v), 并将其加热到沸点三次, 对溶液进行灭菌。存放在 4°C, 直到使用。
- 培养大肠杆菌 MG1655 Pro Csga ompr234 (e. 携带 psb1c3-绿色荧光蛋白 (gfp) 的细菌2或 psb1c3-gfp-csga (本构 gfp 表达, 鼠氨酸诱导 csga表达) 隔夜在 37°c, 在250转每分钟晃动在50毫升的 LB 介质含有34μgml 氯霉素和0.5% 鼠李糖。
- 以 3220 x克的速度将细胞培养离心 5分钟, 使细菌进入颗粒。取出上清液。
- 在 LB 培养基10毫升中重新悬浮细菌颗粒, 加入10毫升海藻酸钠 (3% wv)。
4. 3D 打印过程
- 在计算机上安装并打开3D 打印软件 (材料表)。将3D 打印机连接到计算机。通过单击 X、Y 和 Z 轴的主按钮, 将打印头移动到其主位置。
- 对于每个打印, 将准备好的打印基板放置在打印床上的特定位置。
- 校准 z 轴上打印头的高度。
- 在手动控制下将打印头提升到22毫米的高度, 以便在移动到所需位置时不会与培养皿的边缘碰撞。将打印头放在印版的顶部, 并将其向下移动, 直到移液器尖端接触打印表面。将此 z 轴位置分配为 Z1 (打印表面的高度)。
- 通过在 X、Y 和 Z 轴的手动控制, 抬起打印头, 并将其移出板区域以外。如果打印头和印版表面之间的工作距离定义为 Z2, 请在打印过程中将 Z1 + Z2 作为 z 值输入打印程序。
- 根据所需的轨迹, 采用自行开发的逐点坐标确定方法对打印形状进行编程。
- 如果所需的轨迹是一条直线, 则只定义起点和终点。在曲线上包含额外的点将导致更平滑的曲线。按顺序将打印头手动移动到每个点, 并按顺序记录这些点的坐标。在 g 代码编辑器中输入所有这些坐标以及每个打印段的打印头移动速度。
- 打印前后, 将打印头提升到高于印版边缘 (20 毫米) 的距离, 然后直接移出印版区域。将此程序另存为 g 代码文件, 并直接加载以用于后续打印, 同时重新测量每个新打印基板的 Z 轴高度。
注: 有关打印正方形的 g 代码示例, 请参见表 1 。 - 加载预编程的 g 代码文件。在软件中打开 g 代码编辑器, 并在命令中编程以打印所需的形状。在每个命令行中, 打印头的位置可以在 X、Y 和 z 轴中更改。在所有打印步骤中输入 Z 值作为 Z1 + Z2 (打印表面高度 + 工作距离)。
注: 移动速度也是可调的;9, 000 mm/min 是典型打印速率的合适值。 - 将液体生物墨水装入注射器, 并将其安装在3D 生物打印机的注射器泵中。
- 单击 "打印" 按钮, 将生物油墨打印到打印基板上。
- 在打印过程中, 完全由软件控制打印头移动。在打印头与打印表面接触之前, 手动启动注射器泵。
注: 注射器泵和打印机的协调性是根据挤出速度、打印头移动到第一个打印点的速度以及打印头的初始位置而根据经验确定的。如果初始打印头位置为 20 mm, 打印头速度为 9, 000 mm/min, 挤出速度为 0.1 mlh, 则在打印开始后立即启动注射器泵。如果挤出速度从 0.1 mlh 变为 0.3 mlh, 则在开始打印后等待2-3秒启动注射器泵。 - 打印头到达打印头的最后一个打印点后, 立即停止注射器泵。在打印过程结束时, 在打印头抬起之前停止注射器泵, 否则多余的生物油墨会落在打印基板上, 降低打印分辨率。
- 对于3D 结构的构造, 请在 g 代码编辑器中控制打印头的所有移动。键入第一层的打印高度。将 g 码中的 z 值增加0.2 毫米, 以增加第二层的打印高度。此后, 移动到更高的层时, 将 z 值增加0.1 毫米。在打印过程中不要移动印版。
- 要测量印刷水凝胶的宽度和高度, 请使用放置在样品下方或旁边的钢尺。
5.大肠杆菌生物膜生产效果的生长和测试
- 在室温下对印刷样品进行3-6天的孵化, 以生产生物膜组件 (卷曲纤维)。使用相机或荧光扫描仪对印版进行成像。
- 要溶解海藻酸盐基质, 在印刷基板中加入 0.5 m 柠檬酸钠溶液 (pH = 7, 经 NaOH 调整) 的20毫升, 在室温下孵育 2小时, 每分钟30转。再次丢弃液体并将其图像, 以便与柠檬酸处理前的板材图像进行比较。
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Representative Results
成功的3D 生物膜打印的第一步是将商用3D 打印机转换为生物打印机。这种转换是通过拆卸打印机的挤出机和加热器 (设计用于使用聚合物油墨进行打印), 并将其替换为适合于印刷含有活菌的生物油墨的组件来实现的 (图 1 a)。挤出机被连接到注射器泵的管道系统上的移液器尖端 (或吸头, 如果在印刷过程中将使用多个生物油墨) 所取代 (图 1 b)。商业打印机成功转换为生物打印机的依据是能够将所需的生物油墨通过注射器系统从注射器泵和移液头转移到打印表面, 而不会泄漏或加热生物油墨。如果管材在印刷过程中由于生物油墨的流动而膨胀, 则可能会被壁厚的管材所取代。需要注意的是, 这种打印技术应该能够与任何类型的商业3D 打印机, 其管道可以连接到打印头。
三维生物打印机可以在各种二维 (2D) 和三维形状中创建细菌包封水凝胶 (图 2)。印刷基材中的钙离子在印刷时诱导生物油墨凝固 (钙离子与海藻酸羧基螯合), 将液体生物油墨转化为固体水凝胶。生物冲洗的分辨率将取决于挤出速度、移液器尖端的大小、打印头的速度、添加到琼脂溶液中的 Ccl 2 溶液的体积和浓度、印刷表面的平整度以及粘度。使用的生物油墨。Ccl 2 溶液的浓度对水凝胶锐度有很大影响。对四种不同浓度的 CaCl2 (0.1 m、0.2 m、1 m 和 5 m) 进行了采样, 仅有 5 m CaCl2溶液导致水凝胶在印刷后不会变得模糊。因此, 选择5M 作为 Ccl 2 溶液的最佳浓度 。
在该协议的早期版本中, 在浇注琼脂板之前, 将 Ccl 2 溶液应用到琼脂板表面, 而不是混合到琼脂溶液中。使用此版本时, Ccl 2 解决方案的体积对打印质量和分辨率有关键影响。当使用 150 x 15 mm Petri 培养皿时, 使用超过 100Μl (或90μl 的 Petri 培养皿为 30μl) 的氯化钙溶液量会导致印刷表面剩余的液体过多。当板材移动时, 这种液体可能分布不均匀, 从而改变工作距离, 造成移液器尖端堵塞。过多的 Ccl2也会导致印刷水凝胶在溶液中浮动和滑动, 从而改变印刷水凝胶的形状和位置。如果氯化钙溶液的体积太小, 某些区域的板材可能不会收到 Ccl 2 溶液,并会有不良的水凝胶凝固。在这个改进的协议中, 在浇注琼脂板之前, 将 cicl 2 溶液直接添加到琼脂溶液中, 与表面应用的方法相比, 打印基板表面的水分大大降低, 从而导致极大地提高了打印分辨率。
挤压速度和打印头运动是相互依存的, 可以以协调的方式进行调整, 以改变打印分辨率。例如, 如果打印机的挤出速度在 0.1 mll h 和 0.5 ml h 之间, 打印头移动速度恒定为 300 mL/h, 则打印的水凝胶直径会随着挤出速度的增加 2,20而增大。在挤压速度超过 0.5 mlh 的情况下, 水凝胶印刷线的外缘从直线、平行线变为波浪线, 线宽也会增加。打印头的速度也会对打印分辨率产生影响。在 0.3 mlh 的恒定挤出速度下, 将打印头的速度从 300 mmmin 提高到 500 mL/h, 从而使印刷水凝胶的宽度变窄, 从1.8 毫米减小到 0.9 mm。如果打印头的移动速度超过 500 mm/min min, 凝胶线很容易变得不连续。对于在当前研究中使用的200Μl 移液器尖端和生物油墨, 可将几种打印分辨率组合视为最佳组合 (表 2)。在泵送速度 0.3 ml h 时, 打印头移动速度为 500 mm/min, 工作距离为 0.2 mm, 可生产宽度约为 0.9 mm 的印刷水凝胶。
细菌三维打印方法的一个重要成就是它能够创建工程生物膜。为了创建一个工程和空间控制的生物膜, 细菌不仅应该在3D 打印过程中存活下来, 而且还应该在保持打印图案的同时产生生物膜组件。该协议中使用的工程大肠杆菌,即携带质粒 psb1c3-gfp-csga 的大肠杆菌, 使凝乳蛋白的可控表达成为可能。使用Csga敲除菌株可确保只有当 csga 蛋白从 rhamnam 从质粒中诱导时才会表达。细菌输出诱导的 CsgA 蛋白亚基, 然后在细菌外膜 22 上自组装21到 CsgA 蛋白,形成卷曲纤维。这些淀粉样纤维是生物膜细胞外基质的主要蛋白质成分: 细菌嵌入的蛋白质和聚合物的连接网络。3d 印刷生物油墨的印刷海藻酸盐基体在卷曲生产过程中为细菌提供了物理支撑和结构。使用本构 GFP 表达, 可以通过荧光成像对印刷细胞进行可视化和定量。
为了评估生物膜的形成是否成功, 使用柠檬酸钠溶液溶解海藻酸盐基质, 并在柠檬酸处理后评估印刷生物油墨的形状 (图 3)。在没有诱导卷曲生产质粒的生物油墨的情况下, 柠檬酸钠处理后, 印刷图案完全溶解, 表明没有生物膜卷曲网络形成 (图 3a, b)。在含有诱导凝乳生产质粒的细菌的情况下, 凝胶在柠檬酸钠处理后不会溶解 (图 3C, d)。结果表明, 印刷细菌能够形成足够广泛的卷曲网络, 以稳定细菌2的印刷模式。
为了构造多层结构, 通过调整 g 代码编辑器中的打印高度和打印轨迹, 打印了更多的图层 (图 4)。增加示例中打印图层的数量会导致打印结构的宽度和高度逐渐增加 (图 5)2、20, 但即使是5层打印结构也可以以分辨率创建毫米到亚毫米。当设计用于诱导产生卷曲蛋白的大肠杆菌被打印成多层结构时, 柠檬酸钠处理并没有溶解样品, 而含有非卷曲产生的大肠杆菌的多层结构则是溶于柠檬酸钠溶液中 (图 6)。该实验表明, 工程生物膜可以在多层、三维印刷结构中创建, 也可以在单层印刷结构中创建。
图 1: 显示商用3d 打印机转换为3D 生物打印机的照片.(A) 从商用3d 打印机转换后的3d 生物打印机组件。(B) 由连接在移液器尖端上的管道系统形成的生物油墨挤出机。可在第二个打印头孔中添加其他打印提示, 或通过在打印头中添加额外的孔, 用于打印多种类型的生物油墨。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 包含大肠杆菌Psb1c3-gfp-气相 Ga 的3d 生物冲洗图案示例.这些图像是在打印两天后拍摄的。该印刷分辨率为 0.3 mlw, 打印头移动速度为 300 mm/min, 工作距离为 0.2 mm。用于打印这些形状的 g 代码可以在补充文件中找到。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 一种验证是否由印刷图案中的大肠杆菌产生生物膜成分的方法.当印刷大肠杆菌含有质粒, 不编码为居里诱导, 印刷图案完全溶解柠檬酸钠处理 (a和b)。当使用含有质粒编码诱导凝乳蛋白的大肠杆菌时, 印刷的生物膜对柠檬酸钠的处理具有耐药性 (c和d)。表 1提供了用于打印此正方形图案的 g 代码的编程过程和说明。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 包含大肠杆菌Psb1c3-gfp-气相 ga 的多层印刷结构的顶视图 (a) 和侧面视图 (b).此样品打印速度为 0.3 mlh, 打印头移动速度为 200 mm/min, 工作距离为 0.2 mm , 请点击此处查看此图的较大版本.
图 5: 包含不同打印层数的打印水凝胶的线宽和高度.测量是在泵送速度 0.3 mlw、打印头移动速度 500 mm/min 和工作距离 0.2 mm 的印刷样品上进行的,请点击此处查看此图的较大版本.
图 6: 一种验证大肠杆菌在多层印刷结构中是否产生生物膜成分的方法.工程大肠杆菌被印制成1层、3层或5层的水凝胶, 孵育6天。当印刷的大肠杆菌中含有一种质粒, 不编码为卷曲诱导时, 印刷图案完全被柠檬酸钠处理 (a和b) 溶解。当印刷的大肠杆菌含有一种质粒编码诱导凝乳蛋白时, 印刷的生物膜对柠檬酸钠的处理具有耐药性 (c和d)。请点击这里查看此图的较大版本.
| G 代码命令 | 任务 |
| G1 Z20 F9000 | 以 9, 000 mm/min 的移动速度将 z 轴提升到20毫米的高度。 |
| G1 X95 Y65 F9000 | 移动到第一行的起点, 移动速度为 9, 000 mmm/min。 |
| G1 Z6 F9000 | 在 z 方向向下移动到适当的打印距离 (此处 Z = 6 mm)。 |
| G1 X95 Y105 F300 | 第一行的终点和第二行的起点。 |
| G1 X135 Y105 | 第二行的终点和第三行的起点。 |
| G1 X135 Y65 | 第三行的终点和第四行的起点。 |
| G1 X95 Y65 | 第四行的终点和第一行的起点;一个正方形形成。 |
| G1 Z20 F9000 | 提起 z 轴到20毫米的高度, 在 9, 000 mm/min。 |
| G1 X55 Y40 F9000 | 移动到 Petri 培养皿范围之外的坐标 (55, 40)。 |
表 1: 用于打印正方形的 g 代码的编程过程和说明。
| 挤出速度 (mlh) | 打印头移动速度 (mm/min) | 凝胶宽度 (毫米) |
| 0。1 | 100元 | 1.6±0。1 |
| 0。1 | 200人 | 1.1±0。1 |
| 0。1 | 300元 | 1.0±0。1 |
| 0。3 | 300元 | 1.8±0。1 |
| 0。3 | 400人 | 1.2±0。1 |
| 0。3 | 500元 | 0.9±0。1 |
| 0。5 | 200人 | 2.2±0。2 |
| 0。5 | 1, 200 | 1.2±0。2 |
| 0。7 | 200人 | 2.8±0。1 |
| 0。7 | 1, 200 | 1.3±0。1 |
表 2: 高分辨率水凝胶的最佳印刷参数.测量了每个条件的五个点。表中显示了平均值和标准偏差。
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Discussion
这里介绍的工程生物膜3D 打印协议有两个关键步骤。首先是琼脂印刷表面的制备, 这是产生特定印刷分辨率的最关键因素。重要的是要确保打印表面是平的, 并且打印头上的移液器尖端位于表面的正确高度。如果表面不平整, 则在打印过程中工作距离会发生变化。如果工作距离小于 0.1 mm, Ccl2溶液可能进入移液器尖端内, 导致水凝胶形成, 导致移液器尖端堵塞。如果工作距离超过 0.3 mm, 则无法连续打印凝胶。本研究的最佳工作距离为 0.2 mm, 制备扁角印刷表面的好方法是使用较大直径的 Petri 培养皿 (直径150毫米的 Petri 培养皿, 而不是直径90毫米的印版), 将印版放在平桌上, 倒琼脂解决方案, 速度快, 速度均匀, 避免在凝固过程中移动琼脂板。
第二个关键步骤是选择所需的打印参数, 包括泵送速度、所使用的生物油墨的粘度和打印头速度, 这些参数决定了所产生的打印分辨率。要有效地选择这些参数, 用户可以以恒定的挤压速率采样几个用于打印头速度的极值, 并注意打印的水凝胶在每一组条件下的宽度。然后, 用其他4个挤出速率重复本实验。接下来, 采用为应用产生最佳打印分辨率的五种组合, 并以更小的步骤改变打印参数 (泵送和打印头速度), 直到获得所需的分辨率。
印刷线的厚度会影响印刷工程细菌形成稳定生物膜的能力。在最佳打印条件下 (泵送速度 0.3 mlw、打印头速度 300 mL/h 和工作距离 0.2 mm), 生物油墨的印刷生产线在室温下孵育3-6 后, 可产生稳定的生物膜。如果线路变厚, 如通过提高抽水速度, 每条线路的中间区域可能无法充分诱导产生柠檬酸稳定的生物膜。
在打印多层生物油墨水凝胶时, 每个印刷层在接触扩散到以前印刷层的钙离子时都会凝固。由于印刷基板中的 Ca2 +浓度较高, ca2 +离子可以通过较低的层迅速扩散。因此, 只需调整 g 代码编辑器中的打印高度, 就可以在打印完以前的图层后立即打印上层。此外, 上层的打印距离应限制在比上一层的打印距离高0.1-0.2 毫米。如果增加的打印距离小于 0.1 mm, 则尖端将拖动到第一层, 并降低打印的水凝胶的分辨率。如果添加的打印距离大于 0.2 mm, 生物油墨在挤出过程中会形成液滴, 导致印刷的水凝胶变得不连续。
目前的生物浸出方法可生产可重复的、空间控制的工程生物膜, 适用于生物膜的机械性能或生物膜细菌对各种因素的生物耐受性的研究。抗生素、表面活性剂等。此功能可确保所建议方法的直接可用性。通过保持打印工作距离, 但降低打印头的泵送速度和移动速度, 或通过采样不同的挤出机几何形状, 可能会开发出更高精度的自行操作 (DIY) 生物打印机。生化油墨化学。随着打印分辨率的未来改进, 可以启用其他应用程序, 如组织工程或药物交付。这里描述的3D 生物印迹方法也应该能够扩展到打印与我们的藻类生物油墨生物相容性的其他类型的细菌物种。目前的协议提供了足够的无菌性, 通过反复煮沸生物油墨在制备过程中, 使用无菌注射器和印刷技巧, 并在生物油墨和印版中使用抗生素。未来使用野生细菌的实验可能需要额外的灭菌措施, 例如在打印之间更换或消毒管道系统。
据作者们最好的了解, 所提出的方法 (最初是在 Lehner 等人. 20 中开发的) 是第一个发表的细菌三维印刷添加剂制造风格的例子。在本协议的第一部分中, 详细介绍了细菌三维打印的一般方法, 该方法适用于工程生物膜2的生产。使用此方法可以在将来应用多种三维打印生物膜。在自然界中, 多种细菌系统已经进化, 产生了各种类型的生物膜, 本文探讨了其中的一个系统。通过与其他细菌系统 (如枯草芽孢杆菌或木糖杆菌) 一起创建3d 打印生物膜, 可以很容易地检测多个其他系统。还开发了使用光学信号在高分辨率下对细菌进行空间模式的替代方法 23, 24。与这种打印机相比, 这些方法需要更昂贵、更复杂的设备来实现, 而且只适用于转基因细菌的图案。
利用这种方法对空间打印3d 打印的生物膜进行空间图案的能力可以创造出再现自然生物膜空间异质性的工程生物膜25。由于蛋白质和聚合物纤维在生物膜内的排列非常详细, 生物膜状态下的细菌对化学和物理刺激的抵抗力要高得多, 例如与相同的细菌相比, 对抗生素的抵抗力增加了在浮游状态下的细菌。此外, 生物膜内的细菌对液体流动的抵抗力增加, 使得植入医疗设备的维护和无菌变得更加困难.打印的工程生物膜, 试图重现生物膜组件的特定空间分布是研究机制的机制, 细菌在生物膜内实现耐药表型。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了 AOARD 赠款的支持 (没有。FA2386-18-1-4059), 荷兰科学研究组织 (NWO/OCW), 作为纳米科学前沿方案和先进材料 NWO-NSFC 方案 (729.001.016) 的一部分。作者承认 Ramon van der Valk 和 Roland Kieffer 的实验室援助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printer | CoLiDo | 3D-P Kit | |
| 3D printing software | CoLiDo | Print-Rite ColiDo Repetier-Host v2.0.1 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 05040 | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | 3886.1 | |
| LB broth powder | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-092 | Model 3500 |
| Petri dish | VWR | 25384-326 | 150 x 15 mm |
| Rhamnose | Sigma-Aldrich | 83650 | |
| Silicon tubing | VWR | DENE 3100103/25 | |
| Syringe pump | ProSense B.V. | NE-300 | |
| Sodium alginate | Sigma-Aldrich | W201502 | |
| Sodium citrate monobasic | Sigma-Aldrich | 71498 | |
| Sodium hydrooxide | VWR | 28244.295 |
References
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