Summary
In questo articolo viene descritto un metodo per trasformare una stampante 3D commerciale a basso costo in una stampante 3D batterica che può facilitare la stampa di biofilm a motivi geometrici. Sono descritti tutti gli aspetti necessari della preparazione del biostampa e del bio-Ink, nonché i metodi di verifica per valutare la formazione dei biofilm.
Abstract
I biofilm sono aggregati di batteri incorporati in una matrice extracellulare a fantasia spazialmente autoprodotta. I batteri all'interno di un biofilm sviluppano una maggiore resistenza agli antibiotici, che pone potenziali pericoli per la salute, ma può anche essere vantaggioso per applicazioni ambientali come la purificazione dell'acqua potabile. L'ulteriore sviluppo di terapie antibatteriche e di applicazioni ispirate al biofilm richiederà lo sviluppo di metodi riproducibili e engineerabili per la creazione di biofilm. Recentemente, è stato sviluppato un nuovo metodo di preparazione del biofilm utilizzando una stampante tridimensionale (3D) modificata con un inchiostro batterico. In questo articolo vengono descritti i passaggi necessari per creare questo biostampa 3D efficiente e a basso costo che offre più applicazioni nell'elaborazione di materiali indotti da batterio. Il protocollo inizia con una stampante 3D commerciale adattata in cui l'estrusore è stato sostituito con un erogatore di Bio-inchiostro collegato ad un sistema di pompa a siringa che consente un flusso continuo e controllabile di bio-Ink. Per sviluppare un bio-inchiostro adatto per la stampa di biofilm, i batteri di Escherichia coli ingegnerizzati sono stati sospesi in una soluzione di alginato, in modo che si solidificino a contatto con una superficie contenente calcio. L'inclusione di una sostanza chimica induttore all'interno del substrato di stampa spinge l'espressione delle proteine del biofilm all'interno del bio-Ink stampato. Questo metodo consente la stampa 3D di vari modelli spaziali costituiti da strati discreti di biofilm stampati. Tali biofilm controllati spazialmente possono fungere da sistemi modello e possono trovare applicazioni in più campi che hanno un impatto di ampio respiro sulla società, tra cui la prevenzione della resistenza agli antibiotici o la purificazione dell'acqua potabile, tra gli altri.
Introduction
Vi è attualmente una crescente necessità di sviluppare soluzioni sostenibili e rispettose dell'ambiente per la produzione di materiali spazialmente modellati, a causa del crescente numero di mercati per tali materiali1. Questo articolo presenta un metodo semplice ed economico per la produzione di tali materiali e offre quindi un ampio spettro di applicazioni future. Il metodo qui presentato consente la stampa tridimensionale (3D) di strutture spazialmente modellate utilizzando un bio-Ink contenente batteri viventi. I batteri restano vitali all'interno delle strutture stampate per oltre una settimana, permettendo ai batteri di eseguire attività metaboliche naturali o ingegnerizzate. I batteri stampati possono quindi produrre e depositare i componenti desiderati all'interno della struttura stampata, ad esempio creando un biofilm Cross-Linked funzionale2.
I metodi tradizionali per la produzione di materiali avanzati comportano elevate spese energetiche (ad es. alte temperature e/o pressioni) e possono produrre grandi quantità di rifiuti chimici, sostanze spesso tossiche che richiedono un utilizzo esteso dei costi3 ,4. Al contrario, più specie batteriche sono in grado di produrre materiali che possono essere prontamente applicabili in vari settori. Questi materiali includono polimeri come i poliidrossialkanoati (PHA)5 o poli (glicolide-co-lattide) (PGLA)6, cellulosa batterica7, materiali batterici in calcestruzzo8, compositi biomimetici9, adesivi a base di amiloide10, o interruttori elettrici a base biologica11, tra gli altri. Inoltre, la produzione batterica di materiali preziosi avviene tipicamente a temperature e pressioni quasi ambientali e in ambienti acquosi, senza richiedere o produrre composti tossici. Durante la produzione di materiali con batteri è stato dimostrato in letteratura e alcune applicazioni industriali sono già emerse12,13, un metodo affidabile per il patterning spaziale di tali materiali rimane una sfida.
Questo articolo illustra un metodo semplice per convertire una stampante 3D commerciale a basso costo in una stampante batterica 3D. Il protocollo illustra come preparare un bio-inchiostro contenente e sostenere i batteri viventi, nonché come preparare i substrati su cui è possibile eseguire la stampa 3D. Questo metodo è appropriato da utilizzare con una varietà di ceppi batterici naturali e ingegnerizzati in grado di produrre materiali. Questi batteri possono essere distribuiti spazialmente all'interno di una struttura stampata in 3D e continuano ancora la loro attività metabolica, che si tradurrà in una distribuzione spaziale dei materiali desiderati prodotti dai batteri.
Questo metodo di stampa consente la produzione additiva di biofilm, aggregati di batteri circondati da una matrice extracellulare autoprodotta. I biofilm sono reti 3D eterogenee in cui proteine, polimeri, cellule batteriche, ossigeno e nutrienti sono tutti strutturati spazialmente14. Mentre nella forma di un biofilm, i batteri mostrano una maggiore resistenza agli antibiotici e robustezza strutturale, rendendoli difficili da sradicare dalle superfici, compresi cateteri medici e impianti. La chiave per le proprietà biofilm, e anche la più grande sfida alla ricerca biofilm, sembra essere l'eterogeneità di biofilm15,16,17. La produzione di biofilm di modelli controllati spazialmente è di particolare interesse in quanto consentirebbe di riprodurre o di ottimizzare i modelli spaziali dei componenti del biocarburante, aiutando la comprensione del deposito stabile di biofilmi su praticamente qualsiasi superficie in natura.
Questo articolo presenta un metodo per la produzione di biofilm che utilizzano idrogel stampati in 3D contenenti batteri E. coli ingegnerizzati che producono proteine del biofilm in presenza di un induttore, nonché metodi di verifica della formazione di biocarburante2 . I principali componenti della matrice extracellulare di questi biofilm sono le fibre amiloidi di curli18 che contengono proteine csga auto-assemblate. Quando i batteri E. coli ingegnerizzati sono indotti a esprimere le proteine csga, formano un biofilm modello stabile che protegge le cellule dall'essere lavato via dalla superficie di stampa. Tale biofilm stampato in 3D può essere controllato spazialmente e può fungere da utile strumento di ricerca per l'investigazione della meccanica di struttura-funzione biofilm multiscala o materiomics19. Questi biofilm su misura aiuteranno la comprensione dei principi della formazione del biocarburante e delle loro proprietà meccaniche, consentendo ulteriori ricerche sui meccanismi di resistenza agli antibiotici tra le altre applicazioni.
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Protocol
1. conversione di una stampante 3D commerciale in una biostampa 3D
- Rimuovere l'estrusore e il riscaldatore di una stampante 3D commerciale (tabella dei materiali) dal telaio della stampante e scollegare il cablaggio controllando questi elementi dal circuito principale (Figura 1a). Poiché il sensore che controlla la temperatura di funzionamento della stampante deve essere funzionale per comunicare con il software della stampante, rimuovere dal software di stampa l'algoritmo che ritarda la stampa fino a raggiungere la temperatura di esercizio.
- Collegare una punta della pipetta (200 μL di punta) tramite un tubo di silicio (diametro interno di 1 mm) a una siringa da 5 mL caricata in una pompa a siringa. Montare la punta della pipetta sulla testa dell'estrusore della stampante 3D come sostituto dell'estrusore originale (Figura 1B).
- Se si utilizza più di un tipo di bio-Ink, montare i sistemi di tubi aggiuntivi e le punte della pipetta alla stampante.
2. preparazione del substrato per la stampa 3D
- Aggiungere 4 mL di 5 M di soluzione di CaCl2 a 400 ml di agar 1% p/v disciolto nel brodo di Luria-Bertani (lb), integrato con antibiotici e induttori appropriati (qui 34 μg/ml cloramfenicolo e 0,5% rhamnose).
- Erogare 20 mL della soluzione LB-agar in ogni piatto di Petri da 150 mm x 15 mm. Asciugare 30 min a temperatura ambiente con il coperchio semi-aperto.
Nota: il protocollo può essere sospeso qui memorizzando questi substrati di stampa a 4 ° c per diversi giorni.
3. preparazione di bio-Ink
- Preparare una soluzione di alginato di sodio (3% p/v) e riscaldare il punto di ebollizione tre volte per sterilizzare la soluzione. Conservare a 4 ° c fino ad uso.
- Grow e. coli MG1655 Pro Δcsga ompR234 (e. coli δcsga) batteri portatori di plasmidi pSB1C3-proteina fluorescente verde (GFP) (espressione costitutiva del GFP)2 o PSB1C3-GFP-CSGA (espressione costitutiva del GFP, rhamnose-csga inducibile ) a 37 ° c con agitazione a 250 giri/min in 50 mL di LB Media contenente 34 μg/mL di cloramfenicolo e 0,5% di rhamnose.
- Centrifugare la coltura cellulare per 5 min a 3.220 x g per pellet i batteri. Rimuovere il supernatante.
- Risospendere il pellet batterico in 10 mL di LB medio e aggiungere 10 mL di alginato di sodio (3% p/v).
4. processo di stampa 3D
- Installare e aprire il software di stampa 3D (tabella dei materiali) su un computer. Collegare la stampante 3D al computer. Spostare la testina di stampa nella posizione iniziale facendo clic sul pulsante Home per gli assi X, Y e Z.
- Per ogni stampa, collocare un substrato di stampa preparato su una particolare posizione sul letto di stampa.
- Calibrare l'altezza della testina di stampa nell'asse Z.
- Sollevare la testina di stampa ad un'altezza di 22 mm sotto il controllo manuale, in modo che non collidere con il bordo della capsula di Petri quando si sposta nella posizione desiderata. Posizionare la testina di stampa sopra la piastra e spostarla verso il basso fino a quando la punta della pipetta non contatta la superficie. Assegnare questa posizione dell'asse Z come Z1 (l'altezza della superficie di stampa).
- Sollevare la testina di stampa e spostarla all'esterno dell'area della piastra mediante il controllo manuale negli assi X, Y e Z. Se la distanza di lavoro tra la testina di stampa e la superficie della piastra è definita come Z2, immettere Z1 + Z2 nel programma di stampe come valore Z durante la stampa.
- Programmare la forma di stampa con un metodo di coordinata punto per punto auto-sviluppato in base alla traiettoria desiderata.
- Se la traiettoria desiderata è una linea retta, definire solo i punti iniziale e finale. L'inclusione di punti aggiuntivi sulle linee curve risulterà in curve più morbide. Spostare la testina di stampa manualmente in ogni punto in sequenza e registrare le coordinate di questi punti in ordine. Inserire tutte queste coordinate e la velocità di movimento della testina di stampa per ogni segmento stampato nell'editor del codice G.
- Sia prima che dopo la stampa, sollevare la testina a una distanza superiore al bordo della piastra (20 mm) e spostarsi direttamente dalla regione della piastra. Salvare questo programma come file G-code e caricarlo direttamente per l'uso nelle stampe successive, mentre si rimisura l'altezza dell'asse Z per ogni nuovo substrato di stampa.
Nota: vedere la tabella 1 per un esempio di codice G per la stampa di un quadrato. - Caricare il file G-Code pre-programmato. Aprire l'editor del codice G nel software e programmare nei comandi per la stampa della forma desiderata. In ogni riga di comando, la posizione della testina di stampa può essere modificata nell'asse X, Y e/o Z. Immettere il valore Z durante tutti i passaggi di stampa come Z1 + Z2 (altezza della superficie di stampa + distanza di lavoro).
Nota: la velocità di movimento è anche regolabile; 9.000 mm/min è un valore adatto per le velocità di stampa tipiche. - Caricare il Bio-inchiostro liquido nella siringa (s), e montarli nella pompa (e) della siringa del bioprinter 3D.
- Stampare il bio-Ink sul substrato di stampa facendo clic sul pulsante stampa .
- Durante la stampa, controllare il movimento della testina interamente dal software. Avviare manualmente la pompa della siringa prima che la testina di stampa venga a contatto con la superficie.
Nota: il coordinamento della pompa della siringa e della stampante viene determinato empiricamente in base alla velocità di estrusione, alla velocità di spostamento della testina di stampa al primo punto di stampe e alla posizione iniziale della testina di stampe. Se la posizione iniziale della testina di stampa è di 20 mm, con una velocità della testina di stampa di 9.000 mm/min e una velocità di estrusione di 0,1 mL/h, avviare la pompa della siringa immediatamente dopo l'avvio. Se la velocità di estrusione viene cambiata da 0,1 mL/h a 0,3 mL/h, attendere 2 − 3 s per avviare la pompa della siringa dopo l'avvio della stampa. - Fermare la pompa della siringa non appena la testina di stampa arriva all'ultimo punto di stampare. Arrestare la pompa della siringa prima che la testina di stampa si sollevi alla fine del processo, altrimenti il bio-Ink in eccesso scenderà sul substrato di stampa e ridurrà la risoluzione di stampa.
- Per la costruzione di strutture 3D, controllare tutti i movimenti della testina di stampa nell'editor G-code. Digitare l'altezza di stampa del primo layer. Aumentare il valore Z nel codice G di 0,2 millimetri per il secondo livello per aumentare l'altezza di stampa. Successivamente, aumentare il valore Z di 0,1 millimetri quando si sposta su un livello superiore. Non muovere la piastra durante il processo di stampa.
- Per misurare la larghezza e l'altezza dell'idrogel stampato, utilizzare un righello di acciaio posizionato sotto o accanto al campione.
5. coltivazione e collaudo dell'efficacia della produzione di biofilm da parte di e. coli
- Incubare i campioni stampati a temperatura ambiente per 3 − 6 giorni per consentire la produzione di componenti di biofilm (fibre Curli). Immagine delle piastre utilizzando una fotocamera o uno scanner fluorescente.
- Per sciogliere la matrice di alginato, aggiungere 20 mL di soluzione di citrato di sodio 0,5 M (pH = 7 regolato con NaOH) ai substrati di stampa e incubare per 2 h con 30 rpm scuotendo a temperatura ambiente. Gettare il liquido e l'immagine delle piastre di nuovo per confrontare con le immagini delle piastre prima del trattamento del citrato.
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Representative Results
Il primo passo per la stampa 3D di successo dei biofilm è la conversione di una stampante 3D commerciale in un bioprinter. Questa conversione si ottiene rimuovendo l'estrusore e il riscaldatore della stampante, progettati per la stampa con un inchiostro polimerico, e sostituendoli con componenti appropriati per la stampa di bioinchiostri contenenti batteri viventi (Figura 1a). L'estrusore è sostituito da una punta della pipetta (o punte, se nel processo di stampa vengono utilizzati più Bio-inchiostri) collegati ad un sistema di tubazioni collegato ad una pompa a siringa (Figura 1B). La corretta conversione della stampante commerciale in un biostampa può essere valutata in base alla capacità di trasferire i Bio-inchiostri desiderati dalla pompa della siringa attraverso il sistema di tubazioni e le punte della pipetta su una superficie di stampa senza fuoriuscire o riscaldare il Bio-Ink. Se il tubo si sporge a causa del flusso di bio-Ink durante la stampa, può essere sostituito da tubi con pareti più spesse. Va notato che questa tecnica di stampa dovrebbe essere in grado di lavorare con qualsiasi tipo di stampante 3D commerciale per cui tubo può essere collegato alla testina di stampa.
Il biostampa 3D può creare idrogel incapsulanti di batteri in una varietà di forme bidimensionali (2D) e 3D (Figura 2). Gli ioni di calcio nel substrato di stampa inducono la solidificazione (chelazione degli ioni di calcio con gruppi carbossilati di alginato) del Bio-inchiostro al momento della stampa, convertendo il Bio-inchiostro liquido in un idrogel solido. La risoluzione del bioprinting dipenderà dalla velocità di estrusione, dalla dimensione della punta della pipetta, dalla velocità della testina di stampa, dal volume e dalla concentrazione della soluzione di CaCl2 aggiunta alla soluzione di agar, dalla planarità della superficie di stampatura e dalla viscosità del il bio-Ink utilizzato. La concentrazione della soluzione di CaCl2 ha una grande influenza sulla nitidezza dell'idrogel. Sono state campionate quattro diverse concentrazioni di CaCl2 (0,1 m, 0,2 m, 1 m e 5 m) e solo 5 m di soluzione di CAcl2 ha provocato idrogel che non è diventato sfocato dopo la stampa. Pertanto, 5 M è stato scelto come la concentrazione ottimale della soluzione di CaCl2 .
In una versione precedente di questo protocollo, la soluzione di CaCl2 è stata applicata sulla superficie della piastra agar piuttosto che miscelata nella soluzione di agar prima di versare la piastra di agar. Quando si utilizza questa versione, il volume della soluzione CaCl2 ha un'influenza critica sulla qualità di stampa e la risoluzione. Quando si utilizza una piastra di Petri di 150 x 15 mm, applicando un volume di soluzione di cloruro di calcio superiore a 100 μL (o 30 μL per una capsula di Petri da 90 mm) si traduce in troppo liquido rimanente sulla superficie di stampa. Questo liquido può diffondersi in modo non uniforme quando la piastra viene spostata, il che può cambiare la distanza di lavoro e causare il blocco della punta della pipetta. Troppo volume di CaCl2 può anche causare idrogel stampati a galleggiante e scivolare attraverso la soluzione, cambiando la forma e la posizione del Hydrogel stampato. Se il volume di soluzione di cloruro di calcio è troppo piccolo, alcune regioni della piastra potrebbero non ricevere la soluzione di CaCl2 e avranno scarsa solidificazione dell'idrogel. In questo protocollo migliorato, aggiungendo la soluzione di CaCl2 direttamente nella soluzione di agar prima di versare la piastra agar ha provocato sostanzialmente meno umidità sulla superficie del substrato di stampa rispetto al metodo applicato in superficie, con conseguente risoluzione di stampa notevolmente migliorata.
La velocità di estrusione e il movimento della testina di stampa sono interdipendenti e possono essere sintonizzati in modo coordinato per alterare la risoluzione di stampe. Ad esempio, se la stampante viene utilizzata con velocità di estrusione compresa tra 0,1 ml/h e 0,5 ml/h con una velocità di movimento costante della testina di stampa di 300 mm/min, il diametro dell'idrogel stampato aumenta con l'aumento della velocità di estrusione2,20. A velocità di estrusione superiori a 0,5 ml/h, i bordi esterni delle linee stampate di idrogel cambiano da linee rette, parallele a linee ondulate e la larghezza della linea aumenta anche. La velocità della testina di stampa influisce anche sulla risoluzione della stampante. Con una velocità di estrusione costante di 0,3 mL/h, aumentando la velocità della testina di stampa da 300 mm/min a 500 mm/min, la larghezza dell'idrogel stampato diventa più stretta, diminuendo da 1,8 mm a 0,9 mm. Se la velocità di movimento della testina di stampa è superiore a 500 mm/min, la linea del gel diventerà facilmente discontinua. Per una punta della pipetta da 200 μL e il Bio-inchiostro utilizzato nello studio corrente, diverse combinazioni della risoluzione di stampa sono considerate ottimali (tabella 2). Alla velocità di pompaggio 0,3 ml/h, velocità di movimento della testina di stampa 500 mm/min, e distanza di lavoro 0,2 mm, idrogel stampato è prodotto con una larghezza di circa 0,9 mm.
Un risultato cruciale del metodo di stampa 3D batterica è la sua capacità di creare biofilm ingegnerizzati. Per creare un biofilm ingegnerizzato e controllato spazialmente, i batteri dovrebbero non solo sopravvivere al processo di stampa 3D, ma dovrebbero anche produrre componenti di biofilm pur rimanendo all'interno del modello stampato. I batteri e. coli ingegnerizzati utilizzati in questo protocollo, e. coli δcsga batteri che trasportano il plasmide pSB1C3-GFP-csga, consentono l'espressione controllabile delle proteine curli. L'uso di un ceppo csga-Knockout assicura che la proteina csga sia espressa solo quando è indotta da un plasmide con rhamnose. I batteri esportano le subunità della proteina CsgA indotta, che poi auto-assemblare21 su CSGB proteine sulla membrana batterica esterna22 per formare le fibre curli. Queste fibre simili all'amiloide sono le principali componenti proteinacee della matrice extracellulare del biofilm: una rete connessa di proteine e polimeri in cui i batteri sono incorporati. La matrice di alginato stampato del bio-Ink stampa 3D presta supporto fisico e la struttura ai batteri durante il processo di produzione curli. L'uso dell'espressione GFP costitutiva consente la visualizzazione e la quantificazione delle cellule stampate attraverso l'imaging a fluorescenza.
Al fine di valutare se la formazione di biofilm ha avuto successo, la matrice di alginato è stata sciolta utilizzando una soluzione di citrato di sodio e la forma del Bio-inchiostro stampato è stata valutata dopo il trattamento del citrato (Figura 3). Nel caso di bio-Ink senza il plasmide inducibile di produzione di curli, il motivo stampato è stato completamente sciolto dopo il trattamento con citrato di sodio, significante che non si era formata alcuna rete di biofilm Curli (Figura 3A, B). Nel caso di batteri contenenti il plasmide inducibile di produzione di curli, il gel non è stato sciolto dopo il trattamento con citrato di sodio (Figura 3C, D). Questo risultato indica che i batteri stampati sono stati in grado di formare una rete Curli abbastanza estesa per stabilizzare il modello stampato di batteri2.
Per costruire strutture a più livelli, sono stati stampati altri livelli (Figura 4) regolando l'altezza di stampa e la traiettoria di stampa nell'editor del codice G. Aumentando il numero di strati stampati in un campione, la larghezza e l'altezza delle strutture stampate aumentano in modo incrementale (Figura 5)2,20, ma anche le strutture stampate a 5 strati potrebbero essere create con una risoluzione da millimetri a Sub-millimetri. Quando E. coli progettati per produrre inducibilmente le proteine Curli sono stati stampati in strutture multistrato, il trattamento con citrato di sodio non ha dissolto i campioni, mentre le strutture multistrato contenenti E. coli che producono non-Curli sono state disciolto in soluzione di citrato di sodio (Figura 6). Questo esperimento dimostra che i biofilm ingegnerizzati possono essere creati in strutture stampate a più livelli e tridimensionali, nonché in strutture stampate a strato singolo.
Figura 1: foto che mostrano la conversione di una stampante 3D commerciale in un bioprinter 3D. (A) i componenti del biostampa 3D dopo la conversione da una stampante 3D commerciale. B) l'estrusore Bio-inchiostro formato da un sistema di tubazioni attaccato ad una punta della pipetta. Ulteriori suggerimenti per la stampa possono essere aggiunti nel secondo foro della testina o aggiungendo ulteriori fori alla testina di stampa, per l'uso in stampare più tipi di bio-Ink. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 2: esempi di modelli 3D biopraccennato contenenti E. coli pSB1C3-GFP-csga. Queste immagini sono state scattate due giorni dopo la stampa. Questa risoluzione è stata ottenuta con velocità di pompaggio 0,3 mL/h, velocità di movimento della testina di stampa 300 mm/min e distanza di lavoro 0,2 mm. I codici G per la stampa di queste forme possono essere trovati nei file supplementari. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 3: un metodo per verificare se i componenti del biofilm sono stati prodotti dai batteri di E. coli all'interno di un modello stampato. Quando stampato E. coli conteneva un plasmide che non codificava per l'induzione di curli, il modello stampato è stato completamente sciolto dal trattamento di citrato di sodio (a e B). Quando è stato utilizzato E. coli contenente una codifica plasmide di proteine Curli inducibili, il biofilm stampato è stato resistente al trattamento con citrato di sodio (C e D). Il processo di programmazione e le spiegazioni del codice G per la stampa di questo modello quadrato sono riportati nella tabella 1. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 4: Vista dall'alto (A) e vista laterale (B) delle strutture stampate a più strati contenenti E. coli pSB1C3-GFP-csga. Questo campione è stato stampato con velocità di pompaggio 0,3 mL/h, velocità di movimento della testina di stampa 200 mm/min, e distanza di lavoro 0,2 mm. fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 5: la larghezza e l'altezza della linea degli idrogel stampati contenenti diversi numeri di strati stampati. Le misurazioni sono state effettuate su campioni stampati con velocità di pompaggio 0,3 mL/h, velocità di movimento della testina di stampa 500 mm/min e distanza di lavoro 0,2 mm. fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 6: un metodo per verificare se i componenti del biofilm sono stati prodotti dai batteri di E. coli all'interno di strutture stampate multistrato. L'ingegnerizzato e. coli è stato stampato in idrogel a 1, 3 o 5 strati e incubato per 6 giorni. Quando l' E. coli stampato conteneva un plasmide che non codificava per l'induzione di curli, il motivo stampato è stato completamente sciolto dal trattamento con citrato di sodio (a e B). Quando l' E. coli stampato conteneva una codifica plasmide di proteine Curli inducibili, il biofilm stampato era resistente al trattamento con citrato di sodio (C e D). Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
| Comandi G-Code | Attività |
| G1 Z20 F9000 | Sollevare l'asse Z ad un'altezza di 20 mm con una velocità di movimento di 9.000 mm/min. |
| G1 X95 Y65 F9000 | Spostarsi al punto iniziale della prima linea con una velocità di movimento di 9.000 mm/min. |
| G1 Z6 F9000 | Spostarsi verso il basso nella direzione Z per una distanza di stampa corretta (qui Z = 6 mm). |
| G1 X95 Y105 F300 | Punto finale della prima linea e punto di partenza della seconda linea. |
| G1 X135 Y105 | Punto finale della seconda linea e punto di partenza della terza riga. |
| G1 X135 Y65 | Punto finale della terza linea e punto di partenza della quarta riga. |
| G1 X95 Y65 | Punto finale della quarta riga e punto iniziale della prima riga; si forma un quadrato. |
| G1 Z20 F9000 | Sollevare l'asse Z ad un'altezza di 20 mm a 9.000 mm/min. |
| G1 X55 Y40 F9000 | Spostarsi su una coordinata (55, 40) al di fuori della gamma di piastre di Petri. |
Tabella 1: processo di programmazione e spiegazioni del codice G per la stampa di un quadrato.
| Velocità di estrusione (mL/h) | Velocità di movimento della testina di stampa (mm/min) | Larghezza gel (mm) |
| 0,1 a | 100 a | 1,6 ± 0,1 |
| 0,1 a | 200 a | 1,1 ± 0,1 |
| 0,1 a | 300 a | 1,0 ± 0,1 |
| 0,3 a | 300 a | 1,8 ± 0,1 |
| 0,3 a | 400 a | 1,2 ± 0,1 |
| 0,3 a | 500 a | 0,9 ± 0,1 |
| 0,5 a | 200 a | 2,2 ± 0,2 |
| 0,5 a | 1.200 a | 1,2 ± 0,2 |
| 0,7 a | 200 a | 2,8 ± 0,1 |
| 0,7 a | 1.200 a | 1,3 ± 0,1 |
Tabella 2: i parametri di stampa ottimali per gli idrogel ad alta risoluzione. Sono stati misurati cinque punti per ogni condizione. Il valore medio e la deviazione standard sono mostrati nella tabella.
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Discussion
Il protocollo qui presentato per la stampa 3D di biofilm ingegnerizzati ha due passaggi critici. In primo luogo è la preparazione della superficie di stampa agar, che è il fattore più critico per la produzione di una specifica risoluzione di stampa. È importante assicurarsi che la superficie di stampa sia piatta e che la punta della pipetta sulla testina di stampe sia posizionata all'altezza corretta dalla superficie. Se la superficie non è piatta, la distanza di lavoro cambierà durante il processo di stampa. Se la distanza di lavoro è inferiore a 0,1 mm, la soluzione di CaCl2 potrebbe penetrare all'interno della punta della pipetta e causare la formazione di idrogel, causando l'intasamento della punta della pipetta. Se la distanza di lavoro è superiore a 0,3 mm, il gel non può essere stampato continuamente. La distanza di lavoro ottimale in questo studio è di 0,2 mm. buoni approcci per la preparazione di superfici di stampa di agar piatte sono l'uso di piastre di Petri di diametro maggiore (150 mm-diametro piatto di Petri piuttosto che una piastra di diametro 90-mm), posizionare i piatti su un tavolo piatto, versare l'agar rapida e uniforme, evitando di muovere la piastra agar durante la sua solidificazione.
Il secondo passo critico è la selezione dei parametri di stampa desiderati, tra cui la velocità di pompaggio, la viscosità del bio-Ink utilizzato e la velocità della testina di stampa, che determinano la risoluzione della stampante risultante. Per selezionare questi parametri in modo efficiente, l'utente può campionare diversi valori estremi per la velocità della testina di stampa con un tasso di estrusione costante, rilevando la larghezza dell'idrogel stampato per ogni set di condizioni. Quindi, Ripeti questo esperimento con altri 4 tassi di estrusione. Successivamente, prendere le cinque combinazioni che hanno prodotto la migliore risoluzione di stampa per l'applicazione, e variare entrambi i parametri di stampa (velocità di pompaggio e testina) in piccoli e piccoli passi fino a ottenere la risoluzione desiderata.
Lo spessore delle linee stampate ha un impatto sulla capacità dei batteri ingegnerizzati stampati di formare biofilm stabili. In condizioni di stampa ottimali (velocità di pompaggio 0,3 mL/h, velocità testina 300 mm/min e distanza di lavoro 0,2 mm), le linee stampate di bio-Ink produrranno biofilm stabili dopo 3-6 giorni di incubazione a temperatura ambiente. Se le linee diventano più spesse, ad esempio aumentando la velocità di pompaggio, le regioni centrali di ciascuna linea non possono essere sufficientemente indotte per produrre biofilm stabili al citrato.
Quando si stampa un Hydrogel multi-strato bio-Ink, ogni strato stampato viene solidificato al contatto con gli ioni di calcio che hanno diffuso nel precedente strato stampato. Poiché la concentrazione di CA2 + nel substrato di stampa è elevata, gli ioni Ca2 + possono diffondersi rapidamente attraverso gli strati inferiori. Pertanto, i livelli superiori possono essere stampati immediatamente dopo la stampa dei livelli precedenti, semplicemente regolando l'altezza di stampa nell'editor del codice G. Inoltre, la distanza di stampa dello strato superiore deve essere limitata a solo 0,1 − 0,2 mm in più rispetto alla distanza di stampa del livello precedente. Se la distanza di stampa aggiunta è inferiore a 0,1 mm, la punta si trascinerà sul primo strato e ridurrà la risoluzione dell'idrogel stampato. Se la distanza di stampa aggiunta è maggiore di 0,2 mm, il bio-Ink formerà gocce di liquido durante l'estrusione, causando l'idrogel stampato a diventare discontinuo.
L'attuale approccio di bioprinting consente la produzione di biofilm ingegnerizzati riproducibili e controllati spazialmente, idonei per l'uso nello studio delle proprietà meccaniche del biocarburolo o della resistenza biologica dei batteri biofilm a vari fattori, tra cui antibiotici, tensioattivi, ecc. Questa funzionalità garantisce una fruibilità diretta del metodo proposto. Lo sviluppo di biopregge fai-da-te (DIY) di precisione superiore sarà probabilmente possibile mantenendo la distanza di lavoro di stampa, ma abbassando la velocità di pompaggio e la velocità di movimento della testina, o campionandone diverse geometrie di estrusore e Bio-inchiostri. Con miglioramenti futuri alla risoluzione di stampa, è possibile abilitare applicazioni aggiuntive come l'ingegneria tissutale o la consegna di farmaci. L'approccio di bioprinting 3D qui descritto dovrebbe anche essere in grado di essere ampliato alla stampa di ulteriori tipi di specie batteriche che sono biocompatibili con il nostro Bio-inchiostro a base di alginato. Il protocollo attuale fornisce sufficiente sterilità facendo bollire ripetutamente il bio-Ink durante la preparazione, utilizzando siringhe sterili e punte di stampa, e utilizzando antibiotici sia nel bio-Ink che nella lastra di stampa. Esperimenti futuri con batteri Wild-Type possono richiedere ulteriori misure di sterilizzazione, come la sostituzione o la disinfezione del sistema di tubazioni tra le stampe.
Per la migliore conoscenza degli autori, il metodo presentato (originariamente sviluppato in Lehner et al.20) è il primo esempio pubblicato di uno stile di produzione additiva per la stampa 3D di batteri. Nella prima parte di questo protocollo, questo metodo generale è descritto in dettaglio per la stampa 3D dei batteri, che viene applicato alla produzione di biofilm ingegnerizzati2. Più applicazioni future di biofilm stampati in 3D sono possibili utilizzando questo metodo. In natura, si sono evoluti diversi sistemi batterici che creano vari tipi di biofilm, di cui in questo articolo è stato esplorato un unico sistema. Molti altri sistemi possono essere facilmente esaminati creando biofilm stampati in 3D con altri sistemi batterici, come il Bacillus subtilis o l' Acetobacter xylinum. Metodi alternativi23,24 sono stati sviluppati anche per patterning spaziale di batteri ad alta risoluzione utilizzando segnali ottici. Questi approcci richiedono attrezzature più costose e complicate per raggiungerli in confronto a questa stampante, e sono adatte solo per il patterning di batteri geneticamente modificati.
La capacità di modelare spazialmente i biofilm stampati in 3D con questo metodo può consentire la creazione di biofilm ingegnerizzati che riproducono l'eterogeneità spaziale dei biofilm naturali25. A causa della disposizione altamente dettagliata delle proteine e delle fibre polimeriche all'interno di un biofilm, i batteri in uno stato di biofilm raggiungono una resistenza molto più elevata agli stimoli chimici e fisici, come una maggiore resistenza agli antibiotici rispetto allo stesso batteri in uno stato planctonico. Inoltre, i batteri all'interno di un biofilm mostrano una maggiore resistenza al flusso di fluido, rendendo il mantenimento e la sterilità dei dispositivi medici impiantabili molto più difficili26. I biofilm ingegnerizzati stampati che tentano di riprodurre le distribuzioni spaziali specifiche dei componenti del biocarburanti sono strumenti potenti per studiare i meccanismi mediante i quali i batteri all'interno di un biofilm raggiungono fenotipi di resistenza.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione AOARD (No. FA2386-18-1-4059), l'organizzazione olandese per la ricerca scientifica (NWO/OCW) come parte del programma Frontiers of nanoScience, e il programma Advanced Materials NWO-NSFC (n. 729.001.016). Gli autori riconoscono l'assistenza di laboratorio di Ramon van der Valk e Roland Kieffer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printer | CoLiDo | 3D-P Kit | |
| 3D printing software | CoLiDo | Print-Rite ColiDo Repetier-Host v2.0.1 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 05040 | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | 3886.1 | |
| LB broth powder | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-092 | Model 3500 |
| Petri dish | VWR | 25384-326 | 150 x 15 mm |
| Rhamnose | Sigma-Aldrich | 83650 | |
| Silicon tubing | VWR | DENE 3100103/25 | |
| Syringe pump | ProSense B.V. | NE-300 | |
| Sodium alginate | Sigma-Aldrich | W201502 | |
| Sodium citrate monobasic | Sigma-Aldrich | 71498 | |
| Sodium hydrooxide | VWR | 28244.295 |
References
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