Summary
この記事では、低コストの商用3D プリンタを、パターン化したバイオフィルムの印刷を容易にすることができる細菌3D プリンタに変換する方法について説明します。Bioprinter およびバイオインクの調製に必要なすべての側面、ならびにバイオフィルムの形成を評価するための検証方法について説明する。
Abstract
バイオフィルムは、自己産生空間的パターン化された細胞外マトリックスに埋め込まれる細菌の凝集体である。バイオフィルム内の細菌は、潜在的な健康上の危険をもたらす強化された抗生物質耐性を開発しますが、飲料水の浄化などの環境アプリケーションにも有益です。抗菌薬とバイオフィルムに触発されたアプリケーションのさらなる発展には、バイオフィルム作成のための再現性のある、engineerable 方法の開発が必要になります。近年、細菌インクを用いて改質された三次元 (3D) プリンタを用いたバイオフィルム調製の新規な方法が開発されるようになった。この記事では、bacterially によって誘導される材料処理に複数のアプリケーションを提供する、この効率的で低コストの 3D bioprinter を構築するために必要な手順について説明します。このプロトコルは適合した市販の3D プリンタで始まり、押出機がシリンジ・ポンプ・システムに接続されたバイオインクディスペンサーに交換されることにより、バイオインクの制御可能で連続的な流れができる。バイオフィルムの印刷に適した生体インクを開発するために、設計された大腸菌細菌はアルギン酸塩の溶液中に懸濁し、カルシウムを含有する表面と接触して固化する。印刷基板内のインデューサー化学物質の含有は、印刷されたバイオインク内のバイオフィルムタンパク質の発現を駆動する。この方法は、印刷されたバイオフィルムの離散層からなる様々な空間パターンの3D プリンティングを可能にします。このような空間的に制御されたバイオフィルムは、モデルシステムとして機能し、抗生物質耐性予防や飲料水の浄化など、社会に幅広い影響を与える複数の分野のアプリケーションを見つけることができます。
Introduction
現在、このような材料の市場の数が拡大しているため、空間的にパターン化された材料の生産のための環境に優しい、持続可能なソリューションを開発する必要性が高まっています1.この記事は、このような材料の生産のためのシンプルで経済的な方法を提示し、したがって、将来のアプリケーションの大規模なスペクトルを提供しています。ここで紹介する方法は、生きた細菌を含む生体インクを用いて、空間的にパターン化された構造物の三次元 (3D) 印刷を可能にする。細菌は、1週間以上にわたってプリントされた構造内で生存可能なままであり、細菌は自然または操作された代謝活動を行うことができる。印刷された細菌は、それにより、印刷構造内で所望の成分を生成及び堆積することができ、例えば機能的架橋型バイオフィルム2を作成する。
高度な材料を製造するための従来の方法は、高いエネルギー支出 (例えば、高温および/または圧力) を伴い、大量の化学廃棄物を生成することができ、多くの場合、コストを必要とする有毒物質3 、4.対照的に、複数の細菌種は、様々な産業で容易に適用できる材料を製造することができる。これらの材料は、polyhydroxyalkanoates (PHA)5またはポリ (グリコリドコポリマー) (PGLA)6、細菌セルロース7、細菌性コンクリート材料8、バイオミメティック複合材9などのポリマーを含む、アミロイド系接着剤10、またはバイオベースの電気スイッチ11、とりわけ。さらに、貴重な材料の細菌生産は、典型的には、有毒な化合物を必要または生成することなく、周囲の温度および圧力および水性環境で行われる。細菌を用いて材料を製造することは文献において実証されているが、いくつかの産業用途はすでに12,13に浮上しており、そのような材料の空間的パターニングのための信頼できる方法は課題のままである。
この記事では、低コストの商用3D プリンタを3D の細菌プリンタに変換するための簡単な方法を紹介します。このプロトコルは、生きている細菌を含むバイオインクを調製する方法、ならびに3D プリンティングを行うことができる基質を調製する方法を示しています。この方法は、材料を生産することができる天然および設計された細菌株の様々な使用に適しています。これらの細菌は、3D プリントされた構造内に空間的に分散することができ、依然としてその代謝活性を継続し、これは、細菌によって生成された所望の材料の空間的分布をもたらすであろう。
この印刷方法により、バイオフィルム、自己産生細胞外マトリックスに囲まれた細菌の凝集体の添加物製造が可能になる。バイオフィルムは、タンパク質、ポリマー、細菌細胞、酸素、および栄養素がすべて空間的に構造化された14の異種3d ネットワークです。バイオフィルムの形態では、バクテリアは抗生物質の耐性と構造的な頑健性を高め、医療用カテーテルやインプラントを含む表面からの根絶を困難にしています。バイオフィルムの特性にとって重要なことは、またバイオフィルム研究への最大の課題であり、バイオフィルム15、16、17の不均一性であると思われる。空間的に制御されたモデルバイオフィルムの生産は、バイオフィルム成分の空間パターンを再生または調整することを可能にし、事実上あらゆる表面のバイオフィルムの安定した沈着の理解を助けるため、特別な関心を持っています自然。
本稿では、インデューサーの存在下でバイオフィルムタンパク質を生成する工学的大腸菌細菌を含む3D プリントされたヒドロゲルを用いたバイオフィルムの製造方法、ならびにバイオフィルム形成の検証方法を紹介する。 .これらのバイオフィルムの主要な細胞外マトリックス成分は、自己組織化された CsgA タンパク質を含む curli アミロイド繊維18である。CsgA のタンパク質を発現させるために大腸菌の細菌が誘導されると、それらは、印刷面から洗い流されて細胞を保護する安定したモデルバイオフィルムを形成する。このような3D プリントバイオフィルムは、空間的に制御することができ、マルチスケールのバイオフィルム構造機能力学または materiomics19の調査のための有用な研究ツールとして機能することができます。これらのオーダーメイドのバイオフィルムは、バイオフィルム形成の原理とその機械的特性の理解を助け、他のアプリケーションの間で抗生物質耐性のメカニズムのさらなる研究を可能にする。
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Protocol
1. 商用3D プリンタの 3D bioprinter への変換
- 市販の3D プリンタ (材料表) の押出機とヒータをプリンタフレームから取り外し、これらの素子を制御する配線を主回路基板から抜きます (図 1a)。プリンタの動作温度を制御するセンサは、プリンタソフトウェアと通信するために機能する必要があるため、動作温度に達するまで印刷を遅らせるアルゴリズムを印刷ソフトウェアから削除します。
- シリコンチューブ (内径 1mm) を使って、ピペットチップ (200 μ l チップ) をシリンジポンプに装填した 5 mL シリンジに接続します。ピペットチップを元の押出機の代わりとして、3D プリンタ押出機ヘッドに取り付けます (図 1b)。
- 複数のタイプのバイオインクが使用される場合は、追加のチューブシステム (s) とピペットチップ (s) をプリンタに取り付けます。
2. 3D プリンティングのための基板準備
- Luria-Bertani ブロス (LB) 培地に溶解された 1% w/v 寒天の 400 mL に 4 mL の 5 M CaCl2溶液を加え、適切な抗生物質および誘導剤 (ここでは34μ g/mL のクロラムフェニコールおよび 0.5% ラムノース) を補充した。
- 各 150 mm x 15 mm ペトリディッシュに 20 mL の LB 寒天溶液を塗布します。蓋を半分開いた状態で室温で30分乾燥させます。
注: このプロトコルは、これらの印刷基板を4° c で最大数日間保存することによって、ここで一時停止することができます。
3. バイオインキ製剤
- アルギン酸ナトリウム溶液 (3% w/v) を調製し、沸騰点まで3回加熱し、溶液を殺菌する。使用するまで4° c で保管してください。
- 成長大腸菌MG1655 PRO ΔcsgA ompR234 (e.coli ΔcsgA) プラスミド pSB1C3-緑蛍光タンパク質 (GFP) を担持した細菌 (構成的 gfp 発現)2または pSB1C3-GFP-CsgA (恒常的 Gfp 発現、ラムノース誘導性 CsgA式) は、34μ g/mL クロラムフェニコールおよび 0.5% ラムノースを含有する LB 培地の 50 mL で 250 rpm で振盪しながら37° c で一晩放置した。
- 細胞培養物を 3220 x gで5分間遠心し、菌をペレットにする。上清を除去します。
- この菌ペレットを 10 mL の LB 培地に再懸濁し、アルギン酸ナトリウム (3% w/v) を10ml 添加する。
4. 3D プリンティングプロセス
- コンピュータに3D 印刷ソフトウェア (資料表) をインストールして開きます。3D プリンタをコンピュータに接続します。X、Y、Z 軸のホームボタンをクリックして、プリントヘッドをそのホーム位置に移動します。
- 各印刷について、印刷用ベッドの特定の位置に印刷用基板を配置します。
- Z 軸の印字ヘッドの高さを調整します。
- それは所望の位置に移動するときにペトリ皿の縁と衝突しないように、手動制御下で22ミリメートルの高さに印字ヘッドを上げます。印字ヘッドをプレートのオーバートップに置き、ピペットチップが印刷面に接触するまで下に移動します。この Z 軸の位置を Z1 (印刷面の高さ) として割り当てます。
- 印字ヘッドを持ち上げ、X、Y、Z 軸の手動制御でプレート領域の外側に移動します。印字ヘッドとプレート面の作動距離が Z2 と定義されている場合は、印刷時に Z 値として Z1 + Z2 を印刷プログラムに入力します。
- 所望の軌跡に応じて自己開発されたポイントバイポイントの座標決定方法によって印刷形状をプログラムする。
- 目的の軌道が直線の場合は、始点と終点のみを定義します。曲線上に追加の点を含めると、曲線がより滑らかになります。プリントヘッドを手動ですべてのポイントに順番に移動し、これらのポイントの座標を順に記録します。これらの座標をすべて入力し、印刷された各セグメントのプリントヘッドの移動速度を G コードエディタに入れます。
- 印刷の前後に、印字ヘッドをプレートのエッジ (20mm) よりも高い距離まで持ち上げ、プレート領域から直接移動します。このプログラムを G コードファイルとして保存し、後続のプリントで使用するために直接ロードし、新しいプリント基板ごとに Z 軸の高さを再測定します。
注: 正方形を印刷するための G コードの例については、表 1を参照してください。 - 事前にプログラムされた G コードファイルをロードします。ソフトウェアの G コードエディタを開き、希望の形状を印刷するためのコマンドでプログラムします。各コマンドラインにおいて、印字ヘッドの位置は、X、Y、および/または Z 軸において変更されてもよい。すべての印刷ステップにおいて、Z1 + Z2 (印刷面の高さ + 作業距離) として Z 値を入力します。
注: 移動速度も調整可能です。9000 mm/min は、一般的な印刷レートに適した値です。 - 液体バイオインクをシリンジ (複数可) に入れ、3D bioprinter のシリンジポンプに装着します。
- プリントボタンをクリックして、プリント基板上にバイオインクを印刷します。
- 印刷中は、ソフトウェアによってプリントヘッドの動きを完全に制御します。プリントヘッドは、印刷面に接触する前に、手動でシリンジポンプを起動します。
注: シリンジポンプとプリンタの調整は、押出速度、印字ヘッドが最初のプリントポイントに移動する速度、および印字ヘッドの初期位置に応じて経験的に決定されます。最初の印字ヘッド位置が 20 mm の場合は、プリントヘッドの速度が 9000 mm/min、押出速度が 0.1 mL/h である場合、印刷開始直後にシリンジ・ポンプを始動します。押出速度を 0.1 mL/h から 0.3 mL/h に変更した場合は、印刷開始後2−3秒待ってシリンジ・ポンプを始動します。 - プリントヘッドが印刷の最後のポイントに到着するとすぐにシリンジポンプを停止します。プリントヘッドが印刷プロセスの最後に上昇する前にシリンジポンプを停止し、それ以外の場合は過剰なバイオインクが印刷基板上に落下し、印刷解像度を低下させます。
- 3D 構造の構築のために、G コードエディタでプリントヘッドのすべての動きを制御します。最初のレイヤーの印刷高さを入力します。2番目のレイヤーが印刷の高さを大きくするには、G コードの Z 値を0.2 ミリメートルずつ増やします。その後、より高い層に移動するとき、Z 値を0.1 ミリメートル増加させる。印刷中は、プレートを動かさないでください。
- 印刷されたハイドロゲルの幅と高さを測定するには、サンプルの下または横に配置されたスチール定規を使用します。
5.大腸菌によるバイオフィルム製造の有効性の拡大と試験
- 印刷されたサンプルを室温で3−6日間インキュベートして、バイオフィルム成分 (curli 繊維) の生産を可能にします。カメラまたは蛍光スキャナーを使用してプレートをイメージします。
- アルギン酸マトリックスを溶解させるために、0.5 M のクエン酸ナトリウム溶液を 20 mL (NaOH で調整した pH = 7) を印刷基材に添加し、室温で 30 rpm 振とうして2時間インキュベートする。液体を廃棄し、再度クエン酸処理の前にプレートの画像と比較するためにプレートを画像。
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Representative Results
バイオフィルムの3D プリントを成功させるための第一歩は、市販の3D プリンタを bioprinter に変換することです。この変換は、ポリマーインクで印刷するために設計された押出機とプリンタのヒータを除去し、これらを生きた細菌を含むバイオインクを印刷するのに適した成分に置き換えることによって達成される (図 1a)。押出機は、スポイトポンプに接続されたチューブシステムに取り付けられた複数のバイオインクが印刷プロセスに使用される場合は、ピペットチップ (またはヒント) によって置き換えられる (図 1b)。商業用プリンタを bioprinter に正常に変換するには、必要なバイオインク (複数可) をシリンジ・ポンプからチューブ・システムを通して移動させ、表面上にピペット (s) を入れて漏れたり加熱したりすることなく、バイオインク印刷中にバイオインクの流れによってチューブが膨らんだ場合は、壁が厚いチューブに置き換えられることがあります。これは、この印刷技術は、チューブは、プリントヘッドに取り付けることができる市販の3D プリンタの任意のタイプで動作することができるべきであることに留意すべきです。
3D bioprinter は、様々な二次元 (2D) および3D 形状の細菌封入ヒドロゲルを作成することができます (図 2)。印刷基材中のカルシウムイオンは、印刷時にバイオインクの固化 (アルギン酸カルボキシル基群を用いたカルシウムイオンのキレート化) を誘発し、液状バイオインクを固体ヒドロゲルに変換する。Bioprinting の解像度は、押出速度、ピペットチップのサイズ、プリントヘッドの速度、寒天溶液に添加された CaCl2溶液の体積と濃度、印刷面の平坦度、および粘度に依存します使用したバイオインク。CaCl2溶液の濃度はヒドロゲルの鋭さに大きな影響を与える。4つの異なる濃度の CaCl2 (0.1 m、0.2 m、1 m、および 5 m) をサンプリングし、そして 5 m CaCl2溶液のみが、印刷後に不鮮明にならなかったヒドロゲルを生じた。従って、5m は CaCl2溶液の最適濃度として選ばれた。
このプロトコルの以前のバージョンでは、寒天プレートを注ぐ前に、寒天溶液に混合するのではなく、CaCl2溶液を寒天プレートの表面に塗布しました。このバージョンを使用する場合、CaCl2ソリューションのボリュームは、印刷の品質と解像度に重大な影響を与えます。150 x 15mm ペトリ皿を使用する場合、100μ l 以上の塩化カルシウム溶液 (90 のペトリ皿の場合は30μ l) を塗布すると、印刷面に過剰な量の液体が残ることになります。この液体は、プレートが移動したときに不均一に広がる可能性があり、これは、作業距離を変更し、ピペットチップの閉塞を引き起こす可能性があります。CaCl2の量が多すぎると、印刷されたヒドロゲルが浮遊して溶液を横切って滑り、印刷されたヒドロゲルの形状および位置を変えることもできる。塩化カルシウム溶液の量が少なすぎると、プレートの一部の領域が CaCl2溶液を受けず、ヒドロゲルの凝固が悪くなることがある。この改良されたプロトコルでは、寒天プレートを注ぐ前に CaCl2溶液を寒天溶液に直接添加すると、表面に塗布された方法と比較して印刷基板の表面に実質的に少ない水分が生じ、その結果印刷解像度を大幅に向上。
押出速度とプリントヘッドの動きは相互依存しており、印刷解像度を変更するために調整された方法で調整することができます。例えば、プリンターが 300 mm/min の一定した印字ヘッド移動速度の 0.1 ml/h および 0.5 ml/h 間の押出速度と作動する場合、印刷されたハイドロゲルの直径は押出速度2,20の増加と増加する。0.5 mL/h を超える押出速度では、ヒドロゲルの印刷されたラインの外縁が直線から変化し、平行線が波線に変わり、線幅も増加する。印字ヘッドの速度も、印刷解像度に影響を与えます。0.3 mL/h の一定の押出速度では、300 mm/min から 500 mm/min までのプリントヘッドの速度を上げると、印刷されたヒドロゲルの幅が狭くなり、1.8 mm から 0.9 mm に減少します。印字ヘッドの移動速度が 500 mm/min を超えている場合、ゲルラインは容易に不連続になります。現在のスタディで使用されている200μ l のピペットチップおよびバイオインクの場合、印刷解像度のいくつかの組み合わせが最適と見なされます (表 2)。ポンピング速度 0.3 mL/h では、プリントヘッド移動速度 500 mm/min、および作動距離 0.2 mm であり、印刷されたヒドロゲルは、幅約 0.9 mm で生成する。
細菌3D プリンティング法の重要な成果の1つは、設計されたバイオフィルムを作成する能力です。エンジニアリングおよび空間的に制御されたバイオフィルムを作成するために、細菌は3D 印刷プロセスを生き残るだけでなく、印刷されたパターンの中に残っている間はバイオフィルムコンポーネントを生成する必要があります。このプロトコールで使用される工学的大腸菌細菌は、プラスミド PSB1C3-CsgA を担持した大腸菌ΔcsgA細菌を、curli タンパク質の制御可能な発現を有効にする。CsgA-ノックアウト株の使用は、csgA タンパク質がラムノースを有するプラスミドから誘導された場合にのみ発現されることを保証する。この細菌は、誘導された CsgA タンパク質サブユニットをエクスポートし、これを細菌外膜22上の CsgB タンパク質上に自己組織化して curli 繊維を形成する。これらのアミロイド様繊維は、バイオフィルム細胞外マトリックスの主要なタンパク質成分であり、細菌が埋め込まれているタンパク質およびポリマーの接続ネットワークである。3D プリンティングのバイオインクの印刷されたアルギン酸マトリックスは、curli 製造プロセス中に細菌に物理的なサポートと構造を貸す。構成的な GFP 発現の使用は、蛍光画像化を介して印刷された細胞の可視化および定量化を可能にする。
バイオフィルムの形成が成功したかどうかを評価するために、アルギネートオリゴマーをクエン酸ナトリウム溶液を用いて溶解し、そして印刷されたバイオインクの形状をクエン酸処理後に評価した (図 3)。誘導性 curli 生産用プラスミドを含まないバイオインクの場合、印刷パターンはクエン酸ナトリウム処理後完全に溶解し、バイオフィルム curli ネットワークが形成されていないことを意味する (図 3a、B)。誘導性 curli 生産用プラスミドを含有する細菌の場合、ゲルはクエン酸ナトリウム処理後に溶解しなかった (図 3c、D)。この結果は、印刷された細菌が、細菌2の印刷パターンを安定化させるのに十分広範な curli ネットワークを形成することができたことを示している。
多層構造を構築するために、G コードエディタの印刷高さと印刷軌跡を調整することによって、追加のレイヤが印刷されました (図 4)。サンプル内の印刷レイヤーの数を増やすと、印刷された構造物の幅と高さが徐々に増加します (図 5)2,20ですが、5層の印刷構造でさえ、解像度で作成することができましたミリメートルからサブミリメートルまで。Curli タンパク質を生成活性化するために設計された大腸菌が多層構造にプリントした場合、クエン酸ナトリウム処理はサンプルを溶解せず、一方、非 curli 産生大腸菌を含む多層構造はクエン酸ナトリウム溶液に溶解した (図 6)。この実験は、設計されたバイオフィルムが多層、三次元印刷構造、および単層印刷構造で作成できることを示しています。
図 1: 商用3d プリンタの 3d bioprinter への変換を示す写真。(A) 市販の3d プリンタからの変換後の 3d bioprinter のコンポーネント。(B) ピペットチップに取り付けられたチューブシステムによって形成されたバイオインク押出機。追加の印刷のヒントは、2番目のプリントヘッドの穴にまたはバイオインクの複数のタイプの印刷に使用するために、印字ヘッドに追加の穴を追加することによって追加することができます。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2:大腸菌PSB1C3-CsgA を含む 3d bioprinted パターンの例これらの画像は、印刷後2日間撮影した。この印刷解像度は、ポンプ速度 0.3 mL/h、プリントヘッド移動速度 300 mm/min、および作動距離 0.2 mm で得られました。これらの形状を印刷するための G コードは、補足ファイルに記載されています。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3:電子膜成分が印刷パターン内で大腸菌によって生成されたかどうかを検証する方法。Curli 誘導用にコードしなかったプラスミドを印刷した大腸菌が含まれていた場合には、印刷したパターンをクエン酸ナトリウム処理 (aおよびB) により完全に溶解させた。誘導性 curli タンパク質をコードするプラスミドを含む大腸菌が用いられた場合、印刷されたバイオフィルムは、クエン酸ナトリウム処理 (CおよびD) に対して抵抗性であった。この正方形パターンを印刷するための G コードのプログラミングプロセスと説明については、表 1をご紹介します。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4:大腸菌pSB1C3-GFP-CsgA を含む多層印刷構造物の上面図 (A) および側面図 (B)。このサンプルは、ポンプ速度 0.3 mL/h、プリントヘッド移動速度 200 mm/min、および作動距離 0.2 mm で印刷されました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 5: 異なる数の印刷層を含む印刷されたヒドロゲルの線幅および高さ。測定は、ポンピング速度 0.3 mL/h、プリントヘッド移動速度 500 mm/min、および作動距離 0.2 mm で印刷されたサンプルに対して実施した。こちらをクリックして、この図の大規模なバージョンをご覧ください。
図 6: 多層印刷構造内の大腸菌によってバイオフィルム成分が生成されたかどうかを検証する方法。設計された大腸菌を、1、3、または5層のヒドロゲルに印刷し、6日間インキュベートした。印刷された大腸菌に curli 誘導のためにコード化しなかったプラスミドが含まれていた場合には、印刷パターンをクエン酸ナトリウム処理 (aおよびB) により完全に溶解させた。印刷された大腸菌が誘導性 curli タンパク質をコードするプラスミドを含有したとき、印刷されたバイオフィルムは、クエン酸ナトリウム処理 (CおよびD) に対して抵抗性であった。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| G コードコマンド | タスク |
| G1 Z20 F9000 | Z 軸を 9000 mm/min の移動速度で 20 mm の高さに持ち上げます。 |
| G1 X95 Y65 F9000 | 9000 mm/min の移動速度で最初のラインの開始点に移動します。 |
| G1 Z6 F9000 | Z 方向の下方に、適切な (ここでは Z = 6 mm) 印刷距離を移動します。 |
| G1 X95 Y105 F300 | 2行目の最初の行と開始点の終点。 |
| G1 X135 Y105 | 第2ラインの終点と3行目の開始点。 |
| G1 X135 Y65 | 3番目のラインの終点と4行目の開始点。 |
| G1 X95 Y65 | 最初の行の4番目の行と開始点の終了点。正方形が形成されます。 |
| G1 Z20 F9000 | Z 軸を 9000 mm/min で 20 mm の高さに持ち上げます。 |
| G1 X55 Y40 F9000 | ペトリ皿範囲の外側の座標 (55, 40) に移動します。 |
表 1: 正方形を印刷するための G コードのプログラミングプロセスと説明。
| 押出速度 (mL/h) | プリントヘッドの移動速度 (mm/min) | ゲル幅 (mm) |
| 0.1 | 100 | 1.6 ±0.1 |
| 0.1 | 200 | 1.1 ±0.1 |
| 0.1 | 300 | 1.0 ±0.1 |
| 0.3 | 300 | 1.8 ±0.1 |
| 0.3 | 400 | 1.2 ±0.1 |
| 0.3 | 500 | 0.9 ±0.1 |
| 0.5 | 200 | 2.2 ±0.2 |
| 0.5 | 1200 | 1.2 ±0.2 |
| 0.7 | 200 | 2.8 ±0.1 |
| 0.7 | 1200 | 1.3 ±0.1 |
表 2: 高分解能を有するヒドロゲルに対する最適な印刷パラメータ。各条件につき5点を測定した。平均値と標準偏差が表に示されています。
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Discussion
エンジニアリングバイオフィルムの3D プリンティングのためにここに提示されたプロトコルは、2つの重要なステップを持っています。まず、特定の印刷解像度を生成するための最も重要な要因である寒天印刷面の調製です。印刷表面が平らであり、プリントヘッド上のピペットチップが表面から正しい高さに位置していることを確認することが重要です。サーフェスが平坦でない場合、印刷プロセス中に作業距離が変化します。作動距離が 0.1 mm 未満の場合、CaCl2溶液がピペットチップ内に入り、ヒドロゲルが形成され、ピペットチップが詰まる原因となる可能性があります。作動距離が 0.3 mm を超える場合は、ゲルを連続して印刷することはできません。この調査の最適の作動距離は 0.2 mm である。平らな寒天の印刷面を準備するための良いアプローチは、より大きな直径のペトリ皿 (90 mm 径のプレートではなく、150 mm 径のペトリ皿) を使用し、平らなテーブルの上にプレートを置き、寒天を注ぐことです速く、さらに速度の解決は、凝固の間に寒天の版を動かすことを避ける。
第2の重要なステップは、ポンピング速度、使用されるバイオインクの粘度、およびプリントヘッドの速度を含む所望の印刷パラメータの選択であり、結果として得られる印刷解像度を決定する。効率的な方法でこれらのパラメータを選択するには、ユーザは、条件のセットごとに印刷されたハイドロゲルの幅を注意して、一定の押出速度でプリントヘッドスピードのためのいくつかの極端な値をサンプリングすることができます。次に、他の4つの押出率でこの実験を繰り返します。次に、アプリケーションのための最高の印刷解像度を生成した5つの組み合わせを取り、所望の解像度が得られるまで、より小さく、より小さなステップで印刷パラメータ (ポンピングとプリントヘッドの速度) の両方を変更します。
印刷されたラインの厚さは、印刷された細菌が安定したバイオフィルムを形成する能力に影響を与えます。最適な印刷条件 (排気速度 0.3 mL/h、プリントヘッド速度 300 mm/min、および作動距離 0.2 mm) の下で、バイオインクの印刷ラインは、室温で3-6 日のインキュベーション後に安定したバイオフィルムを生成します。圧送速度を上げるなどして線が厚くなると、各線の中間領域がクエン酸安定なバイオフィルムを生成するために十分に誘導されないことがある。
多層バイオインクヒドロゲルを印刷する場合、各印刷層は、前の印刷層に拡散したカルシウムイオンと接触すると固化する。印刷基板中の Ca2+濃度が高いため、ca2+イオンは下層を介して急速に拡散することができる。したがって、上位層は、単に G-コードエディタで印刷高さを調整することによって、前の層が印刷された直後に印刷することができます。さらに、上層の印刷距離は、前の層の印刷距離よりも 0.1 ~ 0.2 mm に制限する必要があります。追加された印刷距離が 0.1 mm 未満の場合、先端部は最初の層を横切ってドラッグし、印刷されたハイドロゲルの解像度を下げます。追加された印刷距離が 0.2 mm より大きい場合、放出時にバイオインクが液滴を形成し、印刷されたヒドロゲルが不連続になってしまいます。
現在の bioprinting アプローチにより、再現性のある空間的に制御されたエンジニアリングバイオフィルムの製造が可能になり、バイオフィルムの機械的特性またはバイオフィルム細菌の生物学的耐性の研究での使用に適しています。抗生物質、界面活性剤などこの機能により、提案された方法を直接使いやすくなります。より高精度の bioprinters (DIY) の開発は、印刷作業距離を維持することによって可能になりますが、プリントヘッドの排気速度と移動速度を下げたり、異なる押出機ジオメトリをサンプリングすることによって、バイオインク化学。印刷解像度の将来の改善により、組織工学やドラッグデリバリーなどの追加のアプリケーションを有効にすることができます。また、ここで説明する 3D bioprinting のアプローチは、アルギン酸をベースとしたバイオインクに適合している細菌種を追加で印刷するためにも拡大できるはずです。現在のプロトコルは、製剤中にバイオインクを繰り返し沸騰させることによって十分な無菌性を提供し、滅菌シリンジおよび印刷チップを使用し、バイオインクおよび印刷プレートの両方で抗生物質を利用する。野生型細菌を用いた将来の実験では、プリント間でのチューブシステムの交換や消毒など、追加の滅菌対策が必要になる場合があります。
著者の最良の知識に対して、提示された方法 (元々は Lehner et al.20で開発された) は、細菌の3d 印刷のための添加剤製造スタイルの最初の公表例である。このプロトコルの最初の部分では、この一般的な方法は、エンジニアリングされたバイオフィルム2の生産に適用される細菌の3d 印刷のために詳細に記載されている。3D プリントバイオフィルムの複数の将来のアプリケーションは、この方法を使用して可能です。自然界では、さまざまなタイプのバイオフィルムを作成する複数の細菌系が進化しており、そのうちの1つのシステムを調査しました。他の複数のシステムは、枯草菌またはアセトバクター xylinumのような他の細菌系を用いて3d プリントされたバイオフィルムを作成することによって容易に調べることができます。代替方法23,24はまた、光学的信号を用いて高解像度で細菌の空間的なパターニングのために開発された。これらのアプローチは、このプリンタと比較してそれらを達成するために、より高価で複雑な装置を必要とし、遺伝子組み換え細菌のパターニングのためにのみ適しています。
この方法で3D プリントされたバイオフィルムを空間的にパターン化する機能により、天然バイオフィルム25の空間的不均一性を再現するように設計されたバイオフィルムを作成することができます。バイオフィルム内のタンパク質およびポリマー繊維の非常に詳細な配置のために、バイオフィルム状態の細菌は、同一と比較して抗生物質に対する耐性の増加などの化学的および物理的刺激に対してはるかに高い耐性を達成するプランクトン状態の細菌。さらに、バイオフィルム内の細菌は、流動流に対する耐性の増加を示し、埋め込み型医療装置の維持および無菌性をはるかに困難にする26.プリントされたバイオフィルムは、生物膜成分の特定の空間分布を再現しようとする、バイオフィルム内の細菌が抵抗表現型を達成するメカニズムを研究するための強力なツールです。
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Disclosures
作者は何も開示することはありません。
Acknowledgments
この作品は AOARD の助成金によって支えられました (No.FA2386-1-4059)、オランダ科学研究機構 (NWO/OCW) は、ナノサイエンスプログラムのフロンティアの一部として、先端材料 NWO ・ NSFC プログラム (729.001.016)。著者たちは、ラモン・ヴァン・デル・ヴァルクとローランド・ Kieffer の実験支援を承認した。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printer | CoLiDo | 3D-P Kit | |
| 3D printing software | CoLiDo | Print-Rite ColiDo Repetier-Host v2.0.1 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 05040 | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | 3886.1 | |
| LB broth powder | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-092 | Model 3500 |
| Petri dish | VWR | 25384-326 | 150 x 15 mm |
| Rhamnose | Sigma-Aldrich | 83650 | |
| Silicon tubing | VWR | DENE 3100103/25 | |
| Syringe pump | ProSense B.V. | NE-300 | |
| Sodium alginate | Sigma-Aldrich | W201502 | |
| Sodium citrate monobasic | Sigma-Aldrich | 71498 | |
| Sodium hydrooxide | VWR | 28244.295 |
References
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