Summary
본 문서에서는 저가형 상업용 3D 프린터를 세균 3D 프린터로 변환 하 여 패턴화 된 바이오 필름의 인쇄를 촉진할 수 있는 방법을 설명 합니다. 바이오 필름 및 바이오 잉크를 제조 하는 데 필요한 모든 측면 뿐만 아니라 생물 막의 형성을 평가 하기 위한 검증 방법도 설명 합니다.
Abstract
바이오 필름은 자체 생산 된 공간적으로 패턴화 된 세포 외 기질에 내장 된 박테리아의 집합체 이다. 생물 막 내의 박테리아는 잠재적인 건강 위험을 제기 하는 향상 된 항 생 저항을 개발 합니다, 그러나 또한 식 수의 정화와 같은 환경 신청을 위해 유익할 수 있습니다. 항균 치료제 및 생물 막에서 영감을 얻은 응용 분야의 추가 개발은 생물 막 생성을 위한 재현 가능 하 고 공학 가능한 방법의 개발을 요구할 것입니다. 최근에는 세균 잉크로 수정 된 3 차원 (3d) 프린터를 이용한 바이오 필름 제제의 신규 한 방법이 개발 되 고 있다. 이 문서에서는 세균 유도 재료 처리에 여러 응용 프로그램을 제공 하는이 효율적이 고 저렴 한 3D 바이오 제약 업체를 구축 하는 데 필요한 단계를 설명 합니다. 이 프로토콜은 적용 가능한 상업용 3D 프린터로 시작 하 여 압출 기를 주사기 펌프 시스템에 연결 된 바이오 잉크 디스펜서로 교체한 후 제어 되 고 연속적인 바이오 잉크 흐름을 가능 하 게 합니다. 생물 막 인쇄에 적합 한 바이오 잉크를 개발 하기 위해, 조작 된 대장균 박테리아를 알지 네이트 용액에 현 탁 시킨 후, 이들이 칼슘을 함유한 표면과 접촉 하 여 응고 되도록 하였다. 인쇄 기판 내에 유도 화학 물질의 포함은 인쇄 된 바이오 잉크 내에서 생물 막 단백질의 발현을 구동 한다. 이 방법을 사용 하면 인쇄 된 바이오 필름의 개별 레이어로 구성 된 다양 한 공간 패턴의 3D 인쇄가 가능 합니다. 이러한 공간적으로 제어 되는 생물 막은 모델 시스템의 역할을 할 수 있으며, 항생제 내성 예방 또는 음 용 수 정화 등 사회에 광범위 한 영향을 미치는 여러 분야의 응용 분야를 찾을 수 있습니다.
Introduction
현재 이러한 물질의 시장 수가 증가 함에 따라 공간적으로 패턴화 된 재료의 생산을 위한 친환경적이 고 지속 가능한 솔루션을 개발 해야 하는 필요성이 커지고 있다1. 이 문서는 이러한 재료의 생산을 위한 간단 하 고 경제적인 방법을 제시 하 고, 따라서 미래의 응용 프로그램의 큰 스펙트럼을 제공 합니다. 여기에 제시 된 방법은 살아있는 박테리아를 포함 하는 바이오 잉크를 사용 하 여 공간적으로 패턴 된 구조의 3 차원 (3d) 인쇄를 허용 한다. 박테리아는 자연 또는 공학적 된 신진 대사 활동을 수행 하는 박테리아를 가능 하 게 1 주일 이상 인쇄 된 구조 내에서 가능한 남아. 인쇄 된 박테리아는 예를 들어 기능적 가교 된 생물 막2를 생성 하 여 인쇄 된 구조 내에서 원하는 성분을 생성 하 고 침전 시킬 수 있다.
첨단 소재 생산을 위한 전통적인 방법에는 높은 에너지 지출 (예: 고온 및/또는 압력)이 포함 되며 대량의 화학 폐기물을 생산할 수 있으며, 종종 비용-광범위 한 활용도가 요구 되는 독성 물질을 생산 합니다.3 ,4. 대조적으로, 여러 세균 종은 다양 한 산업에서 쉽게 적용 할 수 있는 물질을 생산할 수 있다. 이들 물질은 폴 리 하이드 록 시 알 카 네이트 (PHA)5 또는 폴 리아 (락 티 드)6의 세균 셀 룰로 오 스7, 세균 콘크리트 물질8, 생물 모방 복합 재9와 같은 중합체를 포함 하며, 아 밀 로이드 계 접착제10또는 바이오 기반 전기 스위치 (11)는 그 중 에서도. 더욱이, 귀중 한 물질의 세균 생산은 일반적으로 독성 화합물을 요구 하거나 생산 하지 않고 주변 온도와 압력 및 수성 환경에서 일어난다. 박테리아로 재료를 생산 하는 것은 문헌에서 입증 되었지만 일부 산업 응용 분야는 이미12,13, 이러한 물질의 공간적 패터 닝을 위한 신뢰할 수 있는 방법은 여전히 과제로 남아 있다.
이 문서에서는 저비용 상업용 3D 프린터를 3D 세균 프린터로 변환 하는 방법을 보여 줍니다. 이 프로토콜은 살아있는 세균을 함유 하 고 유지 하는 바이오 잉크를 제조 하는 방법 뿐만 아니라, 3D 프린팅이 수행 될 수 있는 기판을 준비 하는 방법을 보여준다. 이 방법은 재료를 생산할 수 있는 다양 한 천연 및 공학적 세균 균 주와 함께 사용 하는 것이 적절 하다. 이러한 박테리아는 공간적으로 3D 프린팅 된 구조 내에서 분산 될 수 있고, 여전히 그들의 대사 활성을 계속 하며,이는 박테리아에 의해 생성 된 원하는 물질의 공간적 분포를 초래할 것 이다.
이 인쇄 방법은 자체 생산 된 세포 외 기질로 둘러싸인 생물 막, 세균 응집 체의 적 층 제조를 가능 하 게 한다. 바이오 필름은 단백질, 폴리머, 박테리아 세포, 산소 및 영양분이 모두 공간적으로 구조화 된 이종 3D 네트워크입니다. 생물 막의 형태로, 박테리아는 증가 된 항생제 저항과 구조적 견고성을 나타내며, 의료용 카 테 터 및 임 플 란 트를 포함 한 표면에서 근절 하기 어렵게 합니다. 생물 막 특성에 대 한 핵심은 생물 막 연구에도 가장 큰 과제 이며, 바이오 필름15,16,17의 이질성 일 것으로 보인다. 공간적으로 제어 되는 모델의 바이오 필름의 생산은 생물 막 성분의 공간적 패턴을 재생 하거나 조정 하는 것을 허용 하 고, 사실상 모든 표면에서 생물 막의 안정적인 침착에 대 한 이해를 돕는 것과 같은 특별 한 관심을가지고 있습니다. 자연.
이 기사는 바이오 필름 형성의 검증 방법 뿐만 아니라 유도 체의 존재 하에 바이오 필름 단백질을 생산 하는 엔지니어링 된 대장균 박테리아를 포함 하는 3d 프린팅 하이드로 젤을 사용 하는 바이오 필름의 제조 방법을 제시 합니다.2 . 이들 바이오 필름의 주요 세포 외 기질 성분은 자가 조립 된 CsgA 단백질을 함유 하는 curli 아 밀 로이드 섬유 (18 ) 이다. 개발 된 대장균 박테리아가 csga 단백질을 발현 하도록 유도 되 면, 이들은 인쇄 표면에서 씻 겨 지는 세포를 보호 하는 생물 막의 안정한 모델을 형성 한다. 이러한 3D 프린팅 생물 막은 공간적으로 제어 될 수 있고 다중 스케일 생물 막 구조 기능 역학 또는 물질 들 (19)의 조사를 위한 유용한 연구 도구로 서 작용할 수 있다. 이러한 맞춤형 바이오 필름은 바이오 필름 형성과 기계적 특성의 원리에 대 한 이해를 돕고, 다른 응용 프로그램 들 사이에서 항 생 저항의 메커니즘에 대 한 추가 연구를 가능 하 게 합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 상업용 3D 프린터를 3D 바이오 제약으로 변환
- 프린터 프레임에서 상업용 3D 프린터 (재질 테이블)의 압출 기와 히터를 분리 하 고 메인 회로 기판에서 이러한 요소를 제어 하는 배선을 분리 합니다 (그림 1a). 프린터의 작동 온도를 제어 하는 센서가 프린터 소프트웨어와 통신 하기 위해 작동 해야 하므로, 인쇄 소프트웨어에서 작동 온도에 도달할 때까지 인쇄를 지연 시키는 알고리즘을 제거 하십시오.
- 실리콘 튜빙 (내경 1mm)을 통해 피 펫 팁 (200 µ L 팁)을 주사기 펌프에 넣은 5Ml 주사기에 연결 합니다. 원래 압출 기의 대체품으로 3D 프린터 압출 기 헤드에 피 펫 팁을 장착 합니다 (그림 1b).
- 여러 종류의 바이오 잉크가 사용 되는 경우, 추가 튜빙 시스템 및 피 펫 팁을 프린터에 장착 하십시오.
2.3D 프린팅을 위한 기판 준비
- 5Mcacl2 용액 5ml를 400 ml의 1%에 첨가 하 여 적당 한 항생제와 유도 제 (여기에 34 µ 클로 람 페니 콜 및 0.5% 람 코)로 보충 한다.
- 각 150 mm x 15mm 페 트리 디쉬에 LB 한 천 용액 20ml를 분주 합니다. 뚜껑을 반쯤 연 후 상 온에서 30 분간 건조 시킵니다.
참고: 이러한 인쇄 기판을 최대 며칠 동안 4°c에서 저장 하 여 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.
3. 바이오 잉크 준비
- 알 긴 산 나트륨 용액 (3%)을 준비 하 고, 끓는 점에 3 회가 열 하 여 용액을 살 균 한다. 사용 될 때까지 4°c에서 보관 하십시오.
- 대장균 MG1655 균 주의 프로 δ Csga ompR234 (대장균δ csga) 세균 운반 플라스 미드 pSB1C3 녹색 형광 단백질 (Gfp)2 또는 pSB1C3-gfp-csga (구성형 Gfp 발현, 람 코 유도성 csga) 성장 발현) 37에서 밤새 250 rpm으로 흔들어 34 µ를 함유 하는 LB 배지에 50 mL의 클로 람 페니 콜과 0.5% 람 코.
- 3220 x g 에서 5 분 동안 세포 배양 액을 원심 분리 하 여 세균을 펠 릿 한다. 상층 액을 제거 합니다.
- 박테리아 펠 릿을 LB 배지 10ml에 재 일시 중단 하 고 알 긴 산 나트륨 10ml (3%)를 첨가 한다.
4.3D 프린팅 프로세스
- 컴퓨터에 3D 프린팅 소프트웨어 (자재 표)를 설치 하 고 엽니다. 3D 프린터를 컴퓨터에 연결 합니다. X, Y 및 Z 축의 홈 버튼을 클릭 하 여 프린트 헤드를 홈 위치로 이동 합니다.
- 각 인쇄에 대해 준비 된 인쇄 기판을 인쇄 베드의 특정 위치에 놓습니다.
- Z 축에서 프린트 헤드의 높이를 보정 합니다.
- 원하는 위치로 이동할 때 페 트리 디쉬의 가장자리와 충돌 하지 않도록 수동 제어에서 22mm의 높이로 프린트 헤드를 올립니다. 프린트 헤드를 판의 위에 놓고, 피 펫 팁이 인쇄 면에 접촉 할 때까지 아래로 움직입니다. 이 Z 축 위치를 Z1 (인쇄 표면의 높이)로 지정 합니다.
- 프린트 헤드를 올리고 X, Y 및 Z 축에서 수동 제어를 통해 플레이트 영역의 외부로 이동 합니다. 프린트 헤드와 플레이트 표면 사이의 작동 거리가 Z2로 정의 된 경우 인쇄 하는 동안 인쇄 프로그램에 Z1 + Z2를 Z 값으로 입력 하십시오.
- 원하는 궤적에 따라 자체 개발한 포인트 바이 포인트 좌표 결정 방법으로 인쇄 형상을 프로그래밍 합니다.
- 원하는 궤적이 직선이 면 시작점과 끝점만 정의 합니다. 곡선에 추가 점을 포함 하면 곡선이 부드러워집니다. 수동으로 프린트 헤드를 모든 지점으로 순차적으로 이동 하 고 이러한 점의 좌표를 순서 대로 기록 하십시오. G 코드 편집기에 각 인쇄 된 세그먼트에 대 한 프린트 헤드 이동 속도 뿐만 아니라 이러한 좌표를 모두 입력 합니다.
- 인쇄 전후 모두 프린트 헤드를 플레이트 가장자리 (20mm) 보다 높은 거리까지 들어올려 플레이트 영역에서 직접 이동 합니다. 이 프로그램을 G 코드 파일로 저장 하 고 새로운 인쇄 기판에 대 한 Z 축 높이를 다시 측정 하면서 후속 인쇄물에 사용 하기 위해 직접 로드 합니다.
참고: 정사각형 인쇄를 위한 G 코드 예제는 표 1 을 참조 하십시오. - 미리 프로그램 된 G 코드 파일을 로드 합니다. 소프트웨어에서 G 코드 편집기를 열고 원하는 모양을 인쇄 하는 명령에서 프로그램 합니다. 각 명령행에서 프린트 헤드의 위치는 X, Y 및/또는 Z 축에서 변경 될 수 있습니다. 모든 인쇄 단계에서 Z1 + Z2 (인쇄 면의 높이 + 작동 거리)로 Z 값을 입력 합니다.
참고: 이동 속도 또한 조정 가능 합니다. 9000 m/min은 일반적인 인쇄 속도에 적합 한 값입니다. - 액체 바이오 잉크를 주사기에 넣고 3D 바이오 바이 저의 주사기 펌프에 장착 합니다. "
- 인쇄 버튼을 클릭 하 여 인쇄 기판에 바이오 잉크를 인쇄 합니다.
- 인쇄 하는 동안, 소프트웨어에 의해 완전히 프린트 헤드의 움직임을 제어 합니다. 프린트 헤드가 인쇄 표면과 접촉 하기 전에 주사기 펌프를 수동으로 시작 합니다.
참고: 실린 지 펌프와 프린터의 조정은 돌출 속도, 프린트 헤드가 첫 번째 인쇄 지점으로 이동 하는 속도, 프린트 헤드의 초기 위치에 따라 경험적으로 결정 됩니다. 초기 프린트 헤드 위치가 20mm 인 경우, 9000의 프린트 헤드 속도와 0.1 mL/h의 압출 속도를 사용 하면 인쇄가 시작 된 직후 주사기 펌프를 시작 합니다. 압출 속도가 0.1 mL/h에서 0.3 mL/h로 변경 되 면 인쇄가 시작 된 후 2-3 초 동안 주사기 펌프를 시작 합니다. - 프린트 헤드가 마지막 인쇄 지점에 도착 하자마자 주사기 펌프를 중지 하십시오. 인쇄 과정의 끝에서 프린트 헤드가 상승 하기 전에 주사기 펌프를 정지, 그렇지 않으면 과도 한 바이오 잉크가 인쇄 기판에 드롭 인쇄 해상도를 줄일 수 있습니다.
- 3D 구조를 구성 하려면 G 코드 편집기에서 프린트 헤드의 모든 움직임을 제어 합니다. 첫 번째 레이어의 인쇄 높이를 입력 합니다. 두 번째 레이어에 대해 G 코드의 Z 값을 0.2 밀리미터 단위로 늘려 인쇄 높이를 늘립니다. 그런 후 상위 레이어로 이동할 때 Z 값을 0.1 밀리미터 만큼 늘립니다. 인쇄 과정에서 판을 움직이지 마십시오.
- 인쇄 된 하이드로 겔의 폭과 높이를 측정 하려면 샘플 아래 또는 옆에 배치 된 강철 눈금자를 사용 하십시오.
5. 대장균 에의 한 생물 막 생산의 효과를 성장 및 테스트
- 3-6 일 동안 실 온에서 인쇄 된 샘플을 배양 하 여 생물 막 성분 (curli 섬유)의 생산을 허용 합니다. 카메라 또는 형광 스캐너를 사용 하 여 플레이트를 이미지 합니다.
- 알 긴 산 매트릭스를 용 해 하려면, 0.5 M의 구 연산 나트륨 용액 20ml(naoh로 조정 된 pH = 7)을 인쇄 기판에 넣고 실 온에서 30 rpm으로 흔들어 2 시간 동안 배양 한다. 액체를 버리고 플레이트를 다시 이미지 하 여 시트 레이트 처리 전에 판의 이미지와 비교 하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
바이오 필름의 성공적인 3D 프린팅에 대 한 첫 번째 단계는 상업용 3D 프린터를 바이오 필름으로 변환 하는 것입니다. 이 변환은 폴리머 잉크로 인쇄 하도록 설계 된 프린터의 압출 기와 히터를 제거 하 고 살아있는 박테리아를 포함 하는 바이오 잉크를 인쇄 하는 데 적합 한 구성 요소로 대체 함으로써 달성 됩니다 (그림 1a). 압출 기는 주사기 펌프에 연결 된 튜빙 시스템에 부착 된 피 펫 팁 (또는 여러 개의 바이오 잉크가 인쇄 과정에서 사용 될 경우 팁)으로 대체 된다 (도 1b). 상용 프린터를 바이오 의약품으로 성공적으로 변환 하는 것은 주사기 펌프에서 튜브 시스템 및 피 펫 팁을 통해 원하는 바이오 잉크 (들)를 누설 또는가 열 하지 않고 인쇄 표면에 전달 하는 기능에 기초 하 여 평가할 수 있습니다 바이오 잉크. 인쇄 중에 바이오 잉크의 흐름으로 인해 튜브가 벌지 되 면 두꺼운 벽이 있는 튜빙으로 대체 될 수 있습니다. 이 인쇄 기술은 튜빙이 프린트 헤드에 부착 될 수 있는 상업용 3D 프린터의 모든 종류와 함께 작동 할 수 있어야 합니다.
3D 바이오 제약은 다양 한 2 차원 (2D) 및 3 차원 형상으로 세균 캡슐화 하이드로 겔을 만들 수 있습니다 (그림 2). 인쇄 기판의 칼슘 이온은 인쇄 시 바이오 잉크의 응고 (알지 네이트 카 르 복 실기로 칼슘 이온의 킬레이트 화)를 유도 하 고, 액체 바이오 잉크를 고체 하이드로 젤로 변환 한다. 생물 의약품의 해상도는 압출 속도, 피 펫 팁의 크기, 프린트 헤드의 속도, 한 천 용액에 첨가 된 CaCl2 용액의 부피 및 농도, 인쇄 표면의 평탄도 및 점도에 따라 달라 집니다 사용 된 바이오 잉크. CaCl2 용액의 농도는 하이드로 젤 선명도에 큰 영향을 미친다. CaCl2 의 4 개의 상이한 농도 (0.1, 0.2, 1m 및 5m)가 샘플링 되었고 5M cacl2 용액만이 인쇄 후에 흐리게 되지 않은 하이드로 겔을 초래 하였다. 따라서, 5m는 CaCl2 용액의 최적 농도로 선택 되었다.
이 프로토콜의 이전 버전에서, CaCl2 용액은 한 천 판을 붓는 전에 한 천 용액에 혼 입 하기 보다는 한 천 판의 표면 상에 적용 되었다. 이 버전을 사용 하는 경우 CaCl2 솔루션의 볼륨은 인쇄 품질 및 해상도에 중요 한 영향을 미칩니다. 150 x 15mm 페 트리 디쉬를 사용 하는 경우, 100 이상의 µ L의 염화 칼슘 용액 (또는 90-mm 페 트리 디쉬에 대 한 30µ L)을 적용 하면 인쇄 면에 너무 많은 양의 액체가 남아 있습니다. 이 액체는 플레이트가 움직일 때 고르지 않게 퍼질 수 있으며,이는 작업 거리를 변경 하 고 피 펫 팁의 막힘을 유발할 수 있습니다. CaCl2 의 너무 많은 양이 인쇄 된 하이드로 젤이 용액을 가로질러 떠 서 미 끄 러 지 게 하 여 인쇄 된 하이드로 겔의 모양과 위치를 변경 시킬 수도 있습니다. 염화 칼슘 용액의 부피가 너무 작으면, 판의 일부 영역은 CaCl2 용액을 받지 못할 수 있고, 하이드로 겔 응고가 불량 한 것 이다. 이러한 개선 된 프로토콜에서, 상기 CaCl2 용액을 한 천 판을 붓는 것에 앞서 한 천 용액에 직접 첨가 하 여 표면 적용 방법에 비하여 인쇄 기판의 표면에 실질적으로 적은 수 분을 초래 하였으며, 그 결과 극적으로 향상 된 인쇄 해상도.
압출 속도 및 프린트 헤드 이동은 상호 의존적 이며 조정 된 방식으로 조정 하 여 인쇄 해상도를 변경할 수 있습니다. 예를 들어, 프린터가 300 mm/min의 일정 한 프린트 헤드 이동 속도를 가진 0.1 ml/h 및 0.5 ml/h 사이의 압출 속도로 작동 하는 경우, 인쇄 된 하이드로 겔의 지름은 압출 속도2,20의 증가에 따라 증가 합니다. 0.5 mL/h 이상의 압출 속도에서는 인쇄 된 하이드로 겔의 바깥 가장자리가 직선, 평행선에서 물결 모양 선으로 변경 되 고 선 폭도 증가 합니다. 프린트 헤드의 속도는 인쇄 해상도에도 영향을 미칩니다. 0.3 mL의 일정 한 압출 속도를 사용 하 여 프린트 된 하이드로 겔의 폭을 300 mm/min에서 500 mm/min로 늘려, 1.8 mm에서 0.9 mm로 감소 하는 것으로, 인쇄 된 수 지의 크기를 보다 좁게 합니다. 프린트 헤드 이동 속도가 500 mm/min을 초과 하면 젤 라인이 쉽게 비연속이 될 것입니다. 현재 연구에서 사용 되는 200 µ L 피 펫 팁과 바이오 잉크의 경우, 인쇄 분해능의 여러 조합이 최적의 것으로 간주 됩니다 (표 2). 펌핑 속도 0.3 Ml/h, 프린트 헤드 이동 속도 500 mm/min 및 작동 거리 0.2 mm에서, 인쇄 된 하이드로 겔은 약 0.9 mm의 폭으로 생성 된다.
박테리아 3D 프린팅 방법의 한 가지 중요 한 성취는 엔지니어링 된 바이오 필름을 만드는 능력입니다. 설계 되 고 공간적으로 제어 되는 생물 막을 만들기 위해 박테리아는 3D 프린팅 공정에서 살아남을 수 있을 뿐만 아니라 인쇄 패턴 내에 남아 있는 동안 생물 막 구성 요소를 생성 해야 합니다. 이러한 프로토콜 에 사용 된, 대장균 용 균은 플라스 미드 pSB1C3를 담지 한 대장균 δ csga 박테리아, curli 단백질의 제어 가능한 발현을 가능 하 게 한다. Csga 녹아웃 스트레인 을 사용 하면 csga 단백질이 람 코를 가진 플라스 미드에서 유도 될 때만 발현 됩니다. 박테리아는 유도 된 CsgA 단백질 서브 유닛을 수출 하 고,이는 세균 외부 막 (22 ) 상에 서 csga 단백질에21 개를 자기 조립 하 여 curli 섬유를 형성 한다. 이러한 아 밀 로이드-유사 섬유는 바이오 필름 세포 외 기질의 주요 단백질 성분 이며, 박테리아가 내장 된 단백질과 중합체의 연결 된 네트워크 이다. 3D 프린팅 바이오 잉크의 인쇄 된 알지 네이트 매트릭스는 curli 생산 공정 동안 박테리아에 물리적 지 지체 및 구조를 빌려 준다. 헌법 GFP 표현의 사용은 형광 화상 진 찰을 통해 인쇄 한 세포의 구상 그리고 정량화를 허용 합니다.
생물 막의 형성이 성공 했는지를 평가 하기 위해, 알 긴 산 매트릭스는 구 연산 나트륨 용액을 이용 하 여 용 해 되었고, 인쇄 된 바이오 잉크의 형상은 시트르산 처리 후에 평가 되었다 (도 3). 유도성 curli 생산 플라스 미드가 없는 바이오 잉크의 경우, 프린트 패턴이 구 연산 나트륨 처리 후 완전히 용 해 되었고, 바이오 필름 curli 네트워크가 형성 되지 않음을 의미 한다 (도 3a, B). 유도성 curli 생산 플라스 미드를 함유 하는 세균의 경우, 구 연산 나트륨 처리 후에 겔을 용 해 하지 않았다 (도 3c, D). 이 결과는 인쇄 된 세균이 인쇄 된 세균2의 패턴을 안정화 시키기에 충분히 광범위 한 curli 네트워크를 형성할 수 있음을 나타낸다.
다중 계층 구조를 구성 하기 위해 G 코드 편집기에서 인쇄 높이 및 인쇄 궤적을 조정 하 여 추가 레이어가 인쇄 되었습니다 (그림 4). 샘플의 인쇄 된 레이어 수를 늘리면 인쇄 된 구조의 폭과 높이가 점진적으로 증가 하 게 됩니다 (그림 5)2,20이지만 해상도로 5 레이어 인쇄 구조를 만들 수 있습니다. 밀리미터에서 서브 밀리미터 까지입니다. 이 콜 리 단백질을 산업 적으로 생산 하도록 설계한 대장균은 다층 구조로 인쇄 되었고, 구 연산 나트륨 처리는 샘플을 용 해 하지 않았고, 반면에 비 curli 생산 대장균을 함유 하는 다층 구조는 구 연산 나트륨 용액에 용 해 시켰다 (그림 6). 이 실험은 다층, 입체 인쇄 구조 뿐만 아니라 단층 인쇄 구조에서 설계 된 바이오 필름을 만들 수 있음을 보여줍니다.
그림 1: 상업용 3d 프린터를 3d 바이오 제약으로 변환 하는 모습을 보여주는 사진. (A) 상업용 3d 프린터로 변환한 후 3d 바이오 테 터의 구성 요소. (B) 피 펫 팁에 부착 된 튜빙 시스템에 의해 형성 된 바이오 잉크 압출 기. 추가 인쇄 팁은 두 번째 프린트 헤드 구멍에 추가 하거나 여러 종류의 바이오 잉크를 인쇄 하는 데 사용 하기 위해 프린트 헤드에 구멍을 추가 하 여 추가할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 대장균 pSB1C3-GFP-CsgA를 포함 하는 3 차원 바이오 페 린 패턴의 예. 이러한 이미지는 인쇄 후 이틀 후에 촬영 되었습니다. 이 인쇄 해상도는 펌핑 속도 0.3 mL/h, 프린트 헤드 이동 속도 300 mm/min 및 작동 거리 0.2 mm로 획득 되었습니다. 이러한 셰이프를 인쇄 하기 위한 G 코드는 보조 파일에서 찾을 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
도 3: 바이오 필름 성분이 인쇄 된 패턴 내에서 대장균 박테리아 에 의해 생산 되었는지 여부를 확인 하는 방법. 인쇄 된 대장균이 curli 유도를 위해 부호화 하지 않은 플라스 미드를 함유 하면, 인쇄 된 패턴이 구 연산 나트륨 처리 (a 및 B)에 의해 완전히 용 해 되었다. 유도성 curli 단백질을 인코딩하는 플라스 미드를 함유 하는 대장균이 사용 된 경우, 인쇄 된 생물 막은 구 연산 나트륨 처리 (C 및 D)에 내성이 있었다. 이 사각형 패턴을 인쇄 하기 위한 G 코드에 대 한 프로그래밍 과정과 설명은 표 1에 나와 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: pSB1C3-GFP-CsgA를 포함 한 다층 인쇄 구조의 평면도 및 측면도 (B) . 이 샘플은 펌핑 속도 0.3 mL/h, 프린트 헤드 이동 속도 200 mm/min 및 작동 거리 0.2 mm로 인쇄 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 인쇄 된 다양 한 수의 인쇄 된 하이드로 겔의 선 폭과 높이 이 측정은 펌핑 속도 0.3 mL/h, 프린트 헤드 이동 속도 500 mm/min 및 작동 거리 0.2 mm로 인쇄 된 샘플에서 수행 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: 다층 인쇄 구조 내에서 대장균 박테리아에 의해 생물 막 성분이 생산 되었는지 여부를 확인 하는 방법. 공학적 대장균은 1, 3 또는 5 층 하이드로 젤에 인쇄 하 여 6 일간 배양 하였다. 인쇄 된 대장균 에 curli 유도 용으로 부호화 하지 않은 플라스 미드가 포함 되 면, 인쇄 된 패턴이 구 연산 나트륨 처리 (a 및 B)에 의해 완전히 용 해 되었다. 인쇄 된 대장균 이 유도성 curli 단백질을 인코딩하는 플라스 미드를 포함 하는 경우, 인쇄 된 생물 막은 구 연산 나트륨 처리 (C 및 D)에 내성이 있었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| G 코드 명령 | 작업 |
| G1 Z20 F9000 | 9000 mm/min의 이동 속도로 Z 축을 20mm 높이로 들어올립니다. |
| G1 X95 Y65 F9000 | 첫 번째 라인의 시작 점으로 이동 하 여 9000 mm/min의 이동 속도를 제공 합니다. |
| G1 Z6 F9000 | Z 방향으로 아래쪽으로 이동 (여기 Z = 6mm) 인쇄 거리. |
| G1 X95 Y105 F300 | 첫 번째 줄의 끝점 및 두 번째 줄의 시작점입니다. |
| G1 X135 Y105 | 두 번째 줄의 끝점 및 세 번째 줄의 시작점입니다. |
| G1 X135 Y65 | 세 번째 줄의 끝점 및 네 번째 줄의 시작점입니다. |
| G1 X95 Y65 | 첫 번째 줄의 시작 지점과 네 번째 줄의 끝 지점입니다. 사각형이 형성 됩니다. |
| G1 Z20 F9000 | Z 축을 9000 mm/min에서 20mm 높이로 들어올립니다. |
| G1 X55 Y40 F9000 | 페 트리 디쉬 범위 밖의 좌표 (55, 40)로 이동 한다. |
표 1: 정사각형 인쇄를 위한 G 코드의 프로그래밍 과정과 설명.
| 압출 속도 (mL/시간) | 프린트 헤드 이동 속도 (밀리미터/분) | 겔 폭 (mm) |
| 0.1 | 100 | 1.6 ± 0.1 |
| 0.1 | 200 | 1.1 ± 0.1 |
| 0.1 | 300 | 1.0 ± 0.1 |
| 0.3 | 300 | 1.8 ± 0.1 |
| 0.3 | 400 | 1.2 ± 0.1 |
| 0.3 | 500 | 0.9 ± 0.1 |
| 0.5 | 200 | 2.2 ± 0.2 |
| 0.5 | 1200 | 1.2 ± 0.2 |
| 0.7 | 200 | 2.8 ± 0.1 |
| 0.7 | 1200 | 1.3 ± 0.1 |
표 2: 고해상도 하이드로 겔에 대 한 최적의 인쇄 매개 변수. 각 조건에 대해 5 개의 점을 측정 하였다. 평균 값과 표준 편차가 표에 표시 됩니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
엔지니어링 된 바이오 필름의 3D 프린팅을 위해 여기에 제시 된 프로토콜은 두 가지 중요 한 단계를가지고 있습니다. 첫 번째는 특정 인쇄 해상도를 생산 하는 가장 중요 한 요인이 되는 한 천 인쇄 면의 준비입니다. 인쇄 표면이 평평 하 고 프린트 헤드의 피 펫 팁이 표면에서 올바른 높이로 배치 되었는지 확인 하는 것이 중요 합니다. 표면이 평평 하지 않으면 인쇄 과정에서 작동 거리가 변경 됩니다. 작동 거리가 0.1 mm 미만인 경우, CaCl2 용액은 피 펫 팁 내부에 들어가서 하이드로 겔 형성을 일으켜 피 펫 팁이 막히는 원인이 될 수 있습니다. 작동 거리가 0.3 mm 이상인 경우 젤을 연속적으로 인쇄할 수 없습니다. 이 연구에서 최적의 작업 거리는 0.2 mm입니다. 평평한 한 천을 준비 하기 위한 좋은 접근법 인쇄 표면은 더 큰 직경의 페 트리 접시 (90-mm 직경 플레이트 보다는 150-지름 페 트리 디쉬)를 사용 하 여 평평한 테이블에 플레이트를 배치 하 고 천을 부 어 신속 하 고 균일 한 속도와 솔루션, 그리고 응고 하는 동안 한 천 판을 이동 하지 마십시오.
두 번째 중요 한 단계는 펌핑 속도, 사용 되는 바이오 잉크의 점도, 인쇄 해상도를 결정 하는 프린트 헤드 속도 등 원하는 인쇄 매개 변수를 선택 하는 것입니다. 효율적인 방식으로 이러한 파라미터를 선택 하기 위해 사용자는 각 조건 세트에 대해 인쇄 된 하이드로 겔의 폭을 지적 하 여 일정 한 압출 속도로 프린트 헤드 속도에 대 한 몇 가지 극한 값을 샘플링할 수 있습니다. 그런 다음 4 개의 다른 돌출 속도를 사용 하 여이 실험을 반복 합니다. 다음으로, 응용 프로그램에 가장 적합 한 인쇄 해상도를 생성 한 5 가지 조합을 취하고 원하는 해상도를 얻을 때까지 작고 작은 단계에서 인쇄 매개 변수 (펌핑 및 프린트 헤드 속도)를 모두 변경 합니다.
인쇄 된 라인의 두께는 안정적인 바이오 필름을 형성 하기 위해 인쇄 된 공학적 박테리아의 능력에 영향을 미칩니다. 최적의 인쇄 조건 (펌핑 속도 0.3 Ml/h, 프린트 헤드 속도 300 mm/min 및 작동 거리 0.2 mm)의 인쇄 된 바이오 잉크 라인은 실 온에서 배양 한 3-6 일 후에 안정 된 생물 막을 생성 합니다. 펌핑 속도가 증가 하 여 라인이 두꺼워 지 면, 각 라인의 중간 영역은 시트 레이트-안정한 바이오 필름을 생성 하기에 충분히 유도 되지 않을 수 있다.
다층 바이오 잉크 하이드로 젤을 인쇄 하는 경우, 각 인쇄 층은 이전 인쇄 층으로 확산 된 칼슘 이온과 접촉 시 응고 된다. 인쇄 기판에서 Ca2 + 농도가 높으면, ca2 + 이온은 하위 계층을 통해 빠르게 확산 될 수 있습니다. 따라서 위 레이어는 G 코드 편집기에서 인쇄 높이를 조정 하는 것 만으로도 이전 레이어가 인쇄 된 직후에 인쇄 될 수 있습니다. 또한 상위 레이어의 인쇄 거리는 이전 레이어의 인쇄 거리 보다 0.1-0.2 mm 이상으로 제한 되어야 합니다. 추가 된 인쇄 거리가 0.1 mm 미만인 경우, 팁은 첫 번째 층을 가로질러 드래그 하 여 인쇄 된 하이드로 젤의 해상도를 줄입니다. 추가 된 인쇄 거리가 0.2 mm 보다 큰 경우, 바이오 잉크는 압출 중에 액체 방울을 형성 하 여 인쇄 된 하이드로 젤이 비연속이 되도록 합니다.
현재 바이오 제약 접근법은 생물 막의 기계적 성질 또는 생물 막 박테리아의 생물학적 저항성 연구에 사용 하기에 적합 한 재현 가능 하 고 공간적으로 제어 된 공학적 바이오 필름을 생산할 수 있도록 합니다. 항생제, 계면 활성 제 등 이 기능은 제안 된 방법의 직접적인 유용성을 보장 합니다. 인쇄 작업 거리를 유지 하면서 프린트 헤드의 펌핑 속도와 이동 속도를 낮추고, 또는 다른 압출 기 형상을 샘플링 하 여 고정밀 (DIY) 생체의 개발이 가능 합니다. 바이오 잉크 화학. 인쇄 해상도에 대 한 향후 개선 사항으로 조직 엔지니어링 또는 약물 전달과 같은 추가 응용 프로그램을 사용할 수 있습니다. 여기에 기술 된 3D 바이오 제약 접근법은 또한 우리의 알지 네이트 계 바이오 잉크와 함께 생체 적합성을 갖는 추가적인 종류의 세균 종을 인쇄 하는 것으로 확대 될 수 있어야 한다. 현재 프로토콜은 준비 중에 바이오 잉크를 반복적으로 끓이 고 멸 균 주사기 및 인쇄 팁을 사용 하며 바이오 잉크 및 인쇄판 모두에서 항생제를 활용 하 여 충분 한 불 임을 제공 합니다. 야생 형 세균을 이용한 향후 실험은 인쇄 사이에 튜빙 시스템을 교체 하거나 소독 하는 등 추가적인 살 균 대책을 요구할 수 있다.
저자의 가장 좋은 지식에 대 한, 제시 된 방법 (원래 Lener 외.20에서 개발)은 박테리아의 3d 프린팅에 대 한 적 층 제조 스타일의 첫 번째 출판 된 예입니다. 이 프로토콜의 첫 번째 부분에서이 일반적인 방법은 설계 된 바이오 필름2의 생산에 적용 되는 박테리아의 3d 프린팅에 대해 자세히 설명 합니다. 이 방법을 사용 하면 3D 프린팅 바이오 필름의 여러 미래 응용이 가능 합니다. 본질적으로, 여러 세균 시스템은이 기사에서 단일 시스템을 탐구 하는 다양 한 종류의 바이오 필름을 만드는 진화 했습니다. 다 수의 다른 시스템은 바 실러 스 서브 틸 리스 또는 Acetobacter 자일 륨과 같은 다른 세균 시스템과 함께 3d 프린팅 된 바이오 필름을 생성 하 여 쉽게 검사 가능 합니다. 대체 방법 (23 )은 광학 신호를 이용 하 여 고해상도에서 세균의 공간적 패터 닝을 위해서도 개발 되었다. 이러한 접근법은이 프린터와 비교 하 여이를 달성 하기 위해 더 비싸고 복잡 한 장비가 필요 하며 유전적으로 조작 된 박테리아의 패터 닝에만 적합 합니다.
이 방법으로 3D 프린팅 바이오 필름을 공간적으로 패턴화 할 수 있는 능력은 자연 생물 막 (25)의 공간적 이질성을 재현 하는 공학적 생물 막의 생성을 가능 하 게 한다. 바이오 필름 내에서 단백질 및 폴리머 섬유의 고도로 세부적인 배열 때문에, 바이오 필름 상태에서 박테리아는 동일한 것에 비하여 항생제에 대 한 저항성 증가와 같은 화학적 및 물리적 자극에 훨씬 더 높은 저항성을 달성 한다 플 라 닉 상태에서 박테리아. 또한, 생물 막 내의 세균은 유체 흐름에 대 한 저항성을 증가 시켜 이식 형 의료 기기의 유지 및 멸 균을 훨씬 더 어렵게 합니다.26. 바이오 필름 구성 요소의 특정 공간 분포를 재현 하려고 시도 하는 인쇄 된 엔지니어링 생물 막은 생물 막 내의 박테리아가 저항 표현 형을 달성 하는 메커니즘을 연구 하는 강력한 도구입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작업은 AOARD 보조금에 의해 지원 되었다 (아니. FA2386-4059)은 나노 과학 프로그램의 선구자로 서 과학 연구 (NWO/OCW) 및 첨단 소재 NWO-NSFC 프로그램 (No. 729.001.016)의 일환으로 개발 되었습니다. 저자는 라몬 밴 데 어 발 크와 롤랜드 키에 프의 실험실 지원을 인정 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printer | CoLiDo | 3D-P Kit | |
| 3D printing software | CoLiDo | Print-Rite ColiDo Repetier-Host v2.0.1 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 05040 | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | 3886.1 | |
| LB broth powder | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-092 | Model 3500 |
| Petri dish | VWR | 25384-326 | 150 x 15 mm |
| Rhamnose | Sigma-Aldrich | 83650 | |
| Silicon tubing | VWR | DENE 3100103/25 | |
| Syringe pump | ProSense B.V. | NE-300 | |
| Sodium alginate | Sigma-Aldrich | W201502 | |
| Sodium citrate monobasic | Sigma-Aldrich | 71498 | |
| Sodium hydrooxide | VWR | 28244.295 |
References
- Tibbitt, M. W., Rodell, C. B., Burdick, J. A., Anseth, K. S. Progress in material design for biomedical applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (47), 14444-14451 (2015).
- Schmieden, D. T., et al. Printing of Patterned, Engineered E. coli Biofilms with a Low-Cost 3D Printer. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1328-1337 (2018).
- Mao, L. B., et al. Synthetic nacre by predesigned matrix-directed mineralization. Science. 354 (6308), 107-110 (2016).
- Gao, H. L., et al. Mass production of bulk artificial nacre with excellent mechanical properties. Nature Communications. 8 (1), 287 (2017).
- Poirier, Y., Nawrath, C., Somerville, C. Production of Polyhydroxyalkanoates, a Family of Biodegradable Plastics and Elastomers, in Bacteria and Plants. Nature Biotechnology. 13, 142-150 (1995).
- Choi, S. Y., et al. One-step fermentative production of poly(lactate-co-glycolate) from carbohydrates in Escherichia coli. Nature Biotechnology. 34 (4), 435-440 (2016).
- Mohammadi, P., Toivonen, M. S., Ikkala, O., Wagermaier, W., Linder, M. B. Aligning cellulose nanofibril dispersions for tougher fibers. Scientific Reports. 7 (1), 11860 (2017).
- Jonkers, H. M. Bacteria-based self-healing concrete. Heron. 56 (1/2), (2011).
- Schmieden, D. T., Meyer, A. S., Aubin-Tam, M. E. Using bacteria to make improved, nacre-inspired materials. MRS Advances. 1 (8), 559-564 (2016).
- Zhong, C., et al. Strong underwater adhesives made by self-assembling multi-protein nanofibres. Nature Nanotechnology. 9 (10), 858-866 (2014).
- Chen, A. Y., et al. Synthesis and patterning of tunable multiscale materials with engineered cells. Nature Materials. 13 (5), 515-523 (2014).
- Gatenholm, P., Klemm, D. Bacterial Nanocellulose as a Renewable Material for Biomedical Applications. MRS Bulletin. 35, 208-213 (2010).
- Rodriguez-Carmona, E., Villaverde, A. Nanostructured bacterial materials for innovative medicines. Trends in Microbiology. 18 (9), 423-430 (2010).
- Hung, C., et al. Escherichia coli biofilms have an organized and complex extracellular matrix structure. MBio. 4 (5), (2013).
- Donlan, R. M., Costerton, J. W. Biofilms: Survival Mechanisms of Clinically Relevant Microorganisms. Clinical Microbiology Reviews. 15 (2), 167-193 (2002).
- Wu, H., Moser, C., Wang, H. Z., Hoiby, N., Song, Z. J. Strategies for combating bacterial biofilm infections. International Journal of Oral Science. 7 (1), 1-7 (2015).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).
- Kikuchi, T., Mizunoe, Y., Takade, A., Naito, S., Yoshida, S. Curli Fibers Are Required for Development of Biofilm Architecture in Escherichia coli K-12 and Enhance Bacterial Adherence to Human Uroepithelial Cells. Microbiology and Immunology. 49 (9), 875-884 (2005).
- Cranford, S., Buehler, M. J. Materiomics: biological protein materials, from nano to macro. Nanotechnology, Science and Applications. 3, 127-148 (2010).
- Lehner, B. A. E., Schmieden, D. T., Meyer, A. S. A Straightforward Approach for 3D Bacterial Printing. ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1124-1130 (2017).
- Wang, X., Smith, D. R., Jones, J. W., Chapman, M. R. In vitro polymerization of a functional Escherichia coli amyloid protein. Journal of Biological Chemistry. 282 (6), 3713-3719 (2007).
- Hammar, M., Bian, Z., Normark, S. Nucleator-dependent intercellular assembly of adhesive curli organelles in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (13), 6562-6566 (1996).
- Huang, Y. J., Xia, A. G., Yang, G., Jin, F. Bioprinting Living Biofilms through Optogenetic Manipulation. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1195-1200 (2018).
- Jin, X. F., Riedel-Kruse, I. H. Biofilm Lithography enables high-resolution cell patterning via optogenetic adhesin expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (14), 3698-3703 (2018).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).
- Percival, S. L., Suleman, L., Vuotto, C., Donelli, G. Healthcare-associated infections, medical devices and biofilms: risk, tolerance and control. Journal of Medical Microbiology. 64, 323-334 (2015).
