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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

Padronização tridimensional de biofilmes projetados com uma Bioimpressora do-it-yourself

Published: May 16, 2019 doi: 10.3791/59477
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 2
1Department of Bionanoscience & Kavli Institute of Nanoscience, Delft University of Technology, 2Department of Biology, University of Rochester
* These authors contributed equally

Summary

Este artigo descreve um método de transformar uma impressora 3D comercial de baixo custo em uma impressora 3D bacteriana que pode facilitar a impressão de biofilmes padronizados. Todos os aspectos necessários da preparação da bioimpressora e da biostinta são descritos, bem como métodos de verificação para avaliar a formação de biofilmes.

Abstract

Biofilmes são agregados de bactérias incorporadas em uma matriz extracelular autoproduzida espacialmente padronizada. As bactérias dentro de um biofilme desenvolvem a resistência antibiótica aumentada, que levanta perigos potenciais da saúde, mas podem igualmente ser benéficas para aplicações ambientais tais como a purificação da água bebendo. O desenvolvimento de terapias antibacterianas e aplicações inspiradas no biofilme exigirá o desenvolvimento de métodos reprodutíveis e engeneráveis para a criação de biofilme. Recentemente, um novo método de preparação de biofilme usando uma impressora tridimensional modificada (3D) com uma tinta bacteriana foi desenvolvido. Este artigo descreve as etapas necessárias para criar essa bioimpressora 3D eficiente e de baixo custo que oferece várias aplicações em processamento de materiais induzido por bacterialmente. O protocolo começa com uma impressora 3D comercial adaptada em que a extrusora foi substituída por um dispensador de bio-tinta conectado a um sistema de bomba de seringa que permite um fluxo controlável e contínuo de biotinta. Para desenvolver uma bio-tinta apropriada para a impressão do biofilme, as bactérias projetadas de Escherichia coli foram suspendidas em uma solução do alginate, de modo que solidificar no contato com uma superfície que contem o cálcio. A inclusão de um indutor químico dentro do substrato de impressão impulsiona a expressão de proteínas de biofilme dentro da biotinta impressa. Este método permite a impressão 3D de vários padrões espaciais compostos de camadas discretas de biofilmes impressos. Tais biofilmes espacialmente controlados podem servir como sistemas modelo e podem encontrar aplicações em vários campos que têm um amplo impacto na sociedade, incluindo a prevenção de resistência a antibióticos ou a purificação de água potável, entre outros.

Introduction

Atualmente, há uma necessidade crescente de desenvolver soluções sustentáveis e ambientalmente amigáveis para a produção de materiais com padrões espaciais, devido ao número crescente de mercados para esses materiais1. Este artigo apresenta um método simples e econômico para a produção de tais materiais e, portanto, oferece um grande espectro de aplicações futuras. O método apresentado aqui permite a impressão tridimensional (3D) de estruturas espacialmente padronizadas usando uma bio-tinta contendo bactérias vivas. As bactérias permanecem viáveis dentro das estruturas impressas por mais de uma semana, permitindo que as bactérias realizem atividades metabólicas naturais ou projetadas. As bactérias impressas podem, assim, produzir e depositar os componentes desejados dentro da estrutura impressa, por exemplo, criando um biofilme funcional reticulado2.

Os métodos tradicionais para a produção de materiais avançados envolvem gastos de alta energia (por exemplo, altas temperaturas e/ou pressões) e podem produzir grandes quantidades de resíduos químicos, muitas vezes substâncias tóxicas que necessitam de custo-utilização extensiva3 ,4. Em contraste, várias espécies bacterianas são capazes de produzir materiais que podem ser prontamente aplicáveis em várias indústrias. Estes materiais incluem polímeros como polihidroxialcananoatos (PHA)5 ou poli (glycolide-co-lactide) (pgla)6, celulose bacteriana7, materiais concretos bacterianos8, compósitos Biomiméticos9, adesivos baseados em amiloide10, ou interruptores elétricos baseados em bio11, entre outros. Além disso, a produção bacteriana de materiais valiosos ocorre tipicamente em temperaturas e pressões Near-Ambient e em ambientes aquosos, sem exigir ou produzir compostos tóxicos. Enquanto a produção de materiais com bactérias tem sido demonstrada na literatura e algumas aplicações industriais já surgiram12,13, um método confiável para padronização espacial de tais materiais continua a ser um desafio.

Este artigo demonstra um método direto para converter uma impressora 3D comercial de baixo custo em uma impressora bacteriana 3D. O protocolo mostra como preparar uma bio-tinta contendo e sustentar as bactérias vivas, bem como a forma de preparar substratos para o qual a impressão 3D pode ser realizada. Este método é apropriado usar-se com uma variedade de tensões bacterianas naturais e projetadas capazes de produzir materiais. Essas bactérias podem ser distribuídas espacialmente dentro de uma estrutura impressa em 3D e ainda continuar sua atividade metabólica, o que resultará em uma distribuição espacial dos materiais desejados produzidos pelas bactérias.

Este método de impressão permite a fabricação aditiva de biofilmes, agregados de bactérias cercadas por uma matriz extracelular autoproduzida. Os biofilmes são redes 3D heterogêneas nas quais proteínas, polímeros, células bacterianas, oxigênio e nutrientes são todos espacialmente estruturados14. Enquanto na forma de um biofilme, as bactérias exibem um aumento da resistência aos antibióticos e robustez estrutural, tornando-os difíceis de erradicar a partir de superfícies, incluindo cateteres médicos e implantes. A chave para as propriedades de biofilme, e também o maior desafio para a pesquisa de biofilme, parece ser a heterogeneidade dos biocombustíveis15,16,17. A produção de biofilmes modelo espacialmente controlados é de interesse especial, pois permitiria reproduzir ou ajustar os padrões espaciais dos componentes do biofilme, auxiliando na compreensão da deposição estável de Biofilo em praticamente qualquer superfície em Natureza.

Este artigo apresenta um método para a produção de biofilmes utilizando hidrogéis impressos em 3D contendo bactérias de E. coli projetadas que produzem proteínas de biofilme na presença de um indutor, bem como métodos de verificação da formação de biofilme2 . Os principais componentes da matriz extracelular desses biofilmes são as fibras amilóides de cabelo18 que contêm proteínas csga automontadas. Quando as bactérias projetadas de E. coli são induzidas para expressar proteínas de csga, formam um biofilme modelo estável que proteja as pilhas de encontro a ser lavado fora da superfície de impressão. Tal biofilme impresso em 3D pode ser controlado espacialmente e pode servir como uma ferramenta de pesquisa útil para a investigação da mecânica de função de estrutura de biofilme multiescala ou chamado19. Esses biofilmes medida auxiliarão na compreensão dos princípios da formação de biofilme e suas propriedades mecânicas, possibilitando mais pesquisas sobre os mecanismos de resistência aos antibióticos entre outras aplicações.

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Protocol

1. conversão de uma impressora 3D comercial em um bioimpressora 3D

  1. Retire a extrusora e o aquecedor de uma impressora 3D comercial (tabela de materiais) do quadro da impressora e desconecte a fiação controlando esses elementos da placa de circuito principal (Figura 1a). Uma vez que o sensor que controla a temperatura operacional da impressora precisa ser funcional para se comunicar com o software da impressora, retire do software de impressão o algoritmo que atrasa a impressão até que a temperatura operacional seja atingida.
  2. Ligue uma ponta de pipeta (200 μL de ponta) através da tubagem de silício (diâmetro interno de 1 mm) a uma seringa de 5 mL carregada numa bomba de seringa. Monte a ponta da pipeta na cabeça da extrusora da impressora 3D como um substituto para a extrusora original (Figura 1b).
  3. Se for utilizado mais do que um tipo de tinta biológica, monte o (s) sistema (es) de tubagem adicional e as pontas da pipeta na impressora.

2. preparação de substrato para impressão 3D

  1. Adicionar 4 mL de solução de 5 M de CaCl2 a 400 ml de agar 1% p/v dissolvido em meio de caldo Luria-BERTANI (lb), suplementado com antibióticos e indutores apropriados (aqui 34 μg/ml de cloranfenicol e 0,5% de rhamnose).
  2. Dispense 20 mL da solução de LB-Agar em cada prato de Petri de 150 mm x 15 mm. Seque 30 min à temperatura ambiente com a tampa meio aberta.
    Nota: o protocolo pode ser pausado aqui armazenando estes substratos da impressão em 4 ° c por até diversos dias.

3. preparação da bio-tinta

  1. Prepare uma solução de alginato de sódio (3% p/v) e aqueça para o ponto de ebulição três vezes para esterilizar a solução. Conservar a 4 ° c até ser utilizado.
  2. Cultivar e. coli MG1655 pro Δcsga ompR234 (e. coli δcsga) bactérias portadoras de plasmíos pSB1C3-proteína verde fluorescente (GFP) (expressão de GFP constitutiva)2 ou PSB1C3-GFP-csga (expressão de GFP constitutiva, rhamnose-inducible csga expressão) durante a noite a 37 ° c com agitação a 250 rpm em 50 mL de meio LB contendo 34 μg/mL de cloranfenicol e 0,5% de rhamnose.
  3. Centrifugue a cultura da pilha por 5 minutos em 3.220 x g para pellet as bactérias. Retire o sobrenadante.
  4. Re-suspender o pellet bactérias em 10 mL de LB médio e adicionar 10 mL de alginato de sódio (3% w/v).

4. processo de impressão 3D

  1. Instale e abra o software de impressão 3D (tabela de materiais) em um computador. Conecte a impressora 3D ao computador. Mova o cabeçote de impressão para a posição inicial clicando no botão Home para os eixos X, Y e Z.
  2. Para cada impressão, coloque um substrato de impressão preparado para um local específico na cama de impressão.
  3. Calibre a altura da cabeça de impressão no eixo Z.
    1. Levante o cabeçote de impressão para uma altura de 22 mm controle manual, de modo que ele não colide com a borda da placa de Petri quando se deslocam para a posição desejada. Posicione o overtop da cabeça de impressão da placa e mova-o para baixo até que a ponta da pipeta entre em contato com a superfície de impressão. Atribua esta posição do eixo Z como Z1 (a altura da superfície de impressão).
    2. Levante o cabeçote de impressão e mova-o para fora da área de placa por controle manual nos eixos X, Y e Z. Se a distância de trabalho entre a cabeça de impressão e a superfície da chapa for definida como Z2, insira Z1 + Z2 no programa de impressão como o valor Z durante a impressão.
  4. Programe a forma de impressão por um método autodesenvolvido de coordenadas ponto a ponto, de acordo com a trajetória desejada.
    1. Se a trajetória desejada for uma linha reta, defina apenas os pontos inicial e final. Incluindo pontos adicionais em linhas curvas resultará em curvas mais suaves. Mova a cabeça de impressão manualmente para cada ponto sequencialmente e registre as coordenadas desses pontos em ordem. Insira todas essas coordenadas, bem como a velocidade de movimento da cabeça de impressão para cada segmento impresso no editor de código G.
  5. Antes e depois da impressão, levante a cabeça de impressão para uma distância superior à borda da placa (20 mm) e mova-se diretamente para fora da região da chapa. Salve este programa como um arquivo de código G e carregue diretamente para uso em impressões subseqüentes, enquanto remedindo a altura do eixo Z para cada novo substrato de impressão.
    Nota: consulte a tabela 1 para obter um exemplo de código G para imprimir um quadrado.
  6. Carregue o arquivo de código G pré-programado. Abra o editor de código G no software e programe os comandos para imprimir a forma desejada. Em cada linha de comando, a posição do cabeçote de impressão pode ser alterada no eixo X, Y e/ou Z. Insira o valor Z durante todas as etapas de impressão como Z1 + Z2 (altura da superfície de impressão + distância de trabalho).
    Nota: a velocidade de movimento também é ajustável; 9.000 mm/min é um valor adequado para as taxas de impressão típicas.
  7. Coloque a bio-tinta líquida em seringa (s), e monte-as na bomba (s) da seringa da bioimpressora 3D.
  8. Imprima a tinta biológica no substrato de impressão clicando no botão Imprimir .
  9. Durante a impressão, controle o movimento da cabeça de impressão inteiramente pelo software. Inicie manualmente a bomba da seringa antes de a cabeça de impressão entrar em contacto com a superfície de
    Nota: a coordenação da bomba da seringa e da impressora é determinada empiricamente, dependendo da velocidade de extrusão, a velocidade na qual a cabeça de impressão se move para o primeiro ponto de impressão e a posição inicial do cabeçote. Se a posição inicial da cabeça de impressão for de 20 mm, com uma velocidade de cabeçote de impressão de 9.000 mm/min e uma velocidade de extrusão de 0,1 mL/h, inicie a bomba da seringa imediatamente após a impressão ser iniciada. Se a velocidade de extrusão for alterada de 0,1 mL/h para 0,3 mL/h, aguarde 2 − 3 s para iniciar a bomba da seringa após a impressão ser iniciada.
  10. Pare a bomba da seringa assim que a cabeça de impressão chegar ao último ponto de impressão. Pare a bomba da seringa antes que a cabeça de impressão Levante-se acima na extremidade do processo de impressão, se não a bio-tinta excedente cairá na carcaça da impressão e reduzirá a definição da impressão.
  11. Para a construção de estruturas 3D, controle todos os movimentos do cabeçote de impressão no editor de código G. Digite a altura de impressão da primeira camada. Aumente o valor-Z no código G por 0,2 milímetros para a segunda camada para aumentar a altura de impressão. Depois disso, aumente o valor-Z em 0,1 milímetros ao mover-se para uma camada superior. Não mova a placa durante o processo de impressão.
  12. Para medir a largura e a altura do Hydrogel impresso, use uma régua de aço coloc abaixo ou ao lado da amostra.

5. crescendo e testando a eficácia da produção de biofilme por e. coli

  1. Incubar as amostras impressas à temperatura ambiente durante 3 − 6 dias para permitir a produção de componentes de biofilme (fibras de curli). Imagem das placas usando uma câmera ou scanner fluorescente.
  2. Para dissolver a matriz de alginato, adicione 20 mL de solução de citrato de sódio a 0,5 M (pH = 7 ajustado com NaOH) para os substratos de impressão, e incubar por 2 h com 30 RPM tremendo à temperatura ambiente. Descarte o líquido e a imagem das placas novamente para comparar com as imagens das placas antes do tratamento com citrato.

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Representative Results

O primeiro passo para a impressão 3D bem-sucedida de biofilmes é converter uma impressora 3D comercial em uma bioimpressora. Esta conversão é conseguida removendo o extrusor e o calefator da impressora, projetados imprimindo com uma tinta poliméricos, e substituindo estes com os componentes apropriados para a impressão bio-tinta que contem as bactérias vivas (Figura 1a). A extrusora é substituída por uma ponta de pipeta (ou pontas, se múltiplas BIOTINTAS serão utilizadas no processo de impressão) ligadas a um sistema de tubagem ligado a uma bomba de seringa (Figura 1b). A conversão bem-sucedida da impressora comercial em uma bioimpressora pode ser avaliada com base na capacidade de transferir a (s) bio-tinta desejada da bomba da seringa através do sistema de tubulação e ponta (s) da pipeta para uma superfície de impressão sem vazamento ou aquecimento da Bio-Ink. Se a tubulação protuberâncias devido ao fluxo da bio-tinta durante a impressão, pode ser substituída pela tubulação com paredes mais grossas. Deve notar-se que esta técnica de impressão deve ser capaz de trabalhar com qualquer tipo de impressora 3D comercial para o qual a tubulação pode ser anexado ao cabeçote de impressão.

A bioimpressora 3D pode criar hidrogéis encapsulantes de bactérias em uma variedade de formas bidimensionais (2D) e 3D (Figura 2). Os íons de cálcio no substrato de impressão induzem a solidificação (quelação de íons de cálcio com grupos carboxilo de alginato) da biotinta ao imprimir, convertendo a bio-tinta líquida em um hidrogel sólido. A resolução da bioimpressão dependerá da velocidade de extrusão, do tamanho da ponta da pipeta, da velocidade da cabeça de impressão, do volume e da concentração da solução de CaCl2 adicionada à solução de agar, da planeza da superfície de impressão e da viscosidade do a bio-tinta usada. A concentração da solução de CAcl2 tem uma grande influência na agudeza do hidrogel. Quatro concentrações diferentes de CAcl2 (0,1 m, de 0,2 m, de 1 m, e de 5 m) foram amostradas, e somente a solução de 5 m CAcl2 conduziu ao hidrogel que não se tornou borrado após a impressão. Portanto, 5 M foi escolhida como a concentração ótima de solução de CaCl2 .

Em uma versão anterior deste protocolo, a solução CaCl2 foi aplicada na superfície da placa de agar em vez de misturada na solução de agar antes de derramar a placa de agar. Ao usar esta versão, o volume da solução CaCl2 tem uma influência crítica sobre a qualidade e a resolução da impressão. Ao utilizar uma placa de Petri de 150 x 15 mm, a aplicação de um volume de solução de cloreto de cálcio de mais de 100 μL (ou 30 μL para uma placa de Petri de 90 mm) resulta em muito líquido remanescente na superfície de impressão. Este líquido pode espalhar-se desigualmente quando a placa é movida, que pode mudar a distância de trabalho e causar o bloqueio da ponta da pipeta. Demasiado volume de CAcl2 pode igualmente fazer com que os hidrogéis impressos flutuem e deslizem através da solução, mudando a forma e a posição do Hydrogel impresso. Se o volume de solução de cloreto de cálcio é muito pequeno, algumas regiões da placa não pode receber CaCl2 solução e terá a solidificação hidrogel pobres. Neste protocolo melhorado, adicionar a solução CaCl2 diretamente na solução de agar antes de derramar a placa de agar resultou em substancialmente menos umidade na superfície do substrato de impressão em comparação com o método aplicado à superfície, resultando em melhorou drasticamente a resolução de impressão.

A velocidade de extrusão e o movimento da cabeça de impressão são interdependentes e podem ser ajustados de forma coordenada para alterar a resolução de impressão. Por exemplo, se a impressora for operada com velocidade de extrusão entre 0,1 ml/h e 0,5 ml/h com uma velocidade de movimento constante de cabeçote de impressão de 300 mm/min, o diâmetro do hidrogel impresso aumentará com o aumento da velocidade de extrusão2,20. Em velocidades de extrusão acima de 0,5 mL/h, as bordas externas das linhas impressas de hidrogel mudam de linhas retas, paralelas para linhas onduladas, e a largura da linha também aumenta. A velocidade da cabeça de impressão também tem uma influência sobre a resolução da impressora. Com uma velocidade de extrusão constante de 0,3 mL/h, aumentar a velocidade da cabeça de impressão de 300 mm/min para 500 mm/min resulta na largura do hidrogel impresso tornando-se mais estreito, diminuindo de 1,8 mm para 0,9 mm. Se a velocidade de movimento da cabeça de impressão estiver acima de 500 mm/min, a linha de gel se tornará facilmente descontínua. Para uma ponta de pipeta de 200 μL e a biotinta usada no estudo atual, várias combinações da resolução de impressão são consideradas ideais (tabela 2). Na velocidade de bombeamento 0,3 ml/h, velocidade de movimento da cabeça de impressão 500 mm/min, e distância de trabalho 0,2 mm, o hidrogel impresso é produzido com uma largura de aproximadamente 0,9 mm.

Uma conquista crucial do método de impressão 3D bacteriana é a sua capacidade de criar biofilmes projetados. Para criar um biofilme projetado e espacialmente controlado, as bactérias não só devem sobreviver ao processo de impressão 3D, mas também devem produzir componentes de biofilme enquanto permanecem dentro do padrão impresso. As bactérias de e. coli projetadas usadas neste protocolo, bactérias de e. coli δcsga que carreg o plasmídeo pSB1C3-GFP-csga, permitem a expressão controlável de proteínas do cabelo. O uso de uma estirpe csga-Knockout assegura que a proteína csga só é expressa quando é induzida a partir de um plasmídeo com rhamnose. As bactérias exportam as subunidades induzidas da proteína de csga, que montam então a21 em proteínas de csgb na membrana exterior bacteriana22 para formar fibras do cabelo. Estas fibras amilóides-like são os principais componentes proteico da matriz extracelular de biofilme: uma rede conectada de proteínas e polímeros em que as bactérias são incorporadas. A matriz impressa do alginato da bio-tinta da impressão 3D empresta o apoio físico e a estrutura às bactérias durante o processo de produção do cabelo. O uso da expressão constitutiva de GFP permite a visualização e quantificação de células impressas por meio de imagens de fluorescência.

Para avaliar se a formação de biofilme foi bem-sucedida, a matriz de alginato foi dissolvida por meio de solução de citrato de sódio, e a forma da biotinta impressa foi avaliada após o tratamento do citrato (Figura 3). No caso da bio-tinta sem o plasmídeo induzível da produção do cabelo, o teste padrão impresso foi dissolvido completamente após o tratamento do citrato de sódio, significando que nenhuma rede do cabelo do biofilme tinha dado forma (Figura 3a, B). No caso das bactérias que contêm o plasmídeo induzível da produção do cabelo, o gel não foi dissolvido após o tratamento do citrato de sódio (Figura 3C, D). Este resultado indica que as bactérias impressas foram capazes de formar uma rede de cabelo extensa o suficiente para estabilizar o padrão impresso de bactérias2.

Para construir estruturas multicamada, camadas adicionais foram impressas (Figura 4) ajustando a altura de impressão e a trajetória de impressão no editor de código G. Aumentar o número de camadas impressas em uma amostra causou a largura e a altura das estruturas impressas para aumentar incrementalmente (Figura 5)2,20, mas mesmo as estruturas impressas de 5 camadas poderiam ser criadas com uma resolução de milímetros a submilimetros. Quando a e. coli foi projetada para produzir inducivelmente as proteínas de cabelo foram impressas em estruturas multicamadas, o tratamento com citrato de sódio não dissolveu as amostras, enquanto as estruturas multicamadas contendo E. coli produtora de não-cabelo foram dissolvido em solução de citrato de sódio (Figura 6). Esta experiência demonstra que os biofilmes projetados podem ser criados em estruturas impressas multi-camadas, tridimensionais, assim como em estruturas impressas single-layer.

Figure 1
Figura 1: fotos mostrando a conversão de uma impressora 3D comercial em uma bioimpressora 3D. (A) os componentes do bioimpressora 3D após a conversão de uma impressora 3D comercial. (B) a extrusora da bio-tinta formada por um sistema da tubulação unida a uma ponta da pipeta. As pontas adicionais da impressão podem ser adicionadas no segundo furo da cabeça de impressão ou adicionando furos adicionais ao cabeçote de impressão, para o uso em imprimir tipos múltiplos de bio-Ink. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: exemplos de padrões bioimpressos em 3D contendo E. coli pSB1C3-GFP-csga. Estas imagens foram tiradas dois dias após a impressão. Esta resolução de impressão foi obtida com velocidade de bombeamento 0,3 mL/h, velocidade de movimento da cabeça de impressão 300 mm/min, e distância de trabalho 0,2 mm. Os códigos G para imprimir essas formas podem ser encontrados nos arquivos suplementares. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: um método de verificar se os componentes de biofilme foram produzidos por bactérias de E. coli dentro de um padrão impresso. Quando a e . coli impressa continha um plasmídeo que não codificava para indução de cabelo, o padrão impresso foi completamente dissolvido pelo tratamento com citrato de sódio (a e B). Quando foi utilizada a E. coli contendo uma codificação plasmídica de proteínas de cabelo induzível, o biofilme impresso foi resistente ao tratamento com citrato de sódio (C e D). O processo de programação e as explicações do código G para a impressão deste padrão quadrado são fornecidos na tabela 1. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: vista superior (A) e vista lateral (B) de estruturas impressas multicamada contendo E. coli pSB1C3-GFP-csga. Esta amostra foi impressa com velocidade de bombeamento 0,3 mL/h, velocidade de movimento da cabeça de impressão 200 mm/min, e distância de trabalho 0,2 mm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: a largura da linha e a altura dos hidrogéis impressos contendo diferentes números de camadas impressas. As medições foram realizadas em amostras impressas com velocidade de bombeamento 0,3 mL/h, velocidade de movimento da cabeça de impressão 500 mm/min, e distância de trabalho de 0,2 mm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: um método de verificar se os componentes de biofilme foram produzidos por bactérias de E. coli dentro de estruturas impressas multicamada. A e. coli projetada foi impressa em hidrogéis de 1, 3 ou 5 camadas e incubadas por 6 dias. Quando a e. coli impressa continha um plasmídeo que não codificava para indução de cabelo, o padrão impresso foi completamente dissolvido pelo tratamento com citrato de sódio (a e B). Quando a e. coli impressa continha uma codificação plasmídica de proteínas de cabelo induzível, o biofilme impresso era resistente ao tratamento com citrato de sódio (C e D). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Comandos do código G Tarefas
G1 Z20 F9000 Levante o eixo Z para uma altura de 20 mm com uma velocidade de movimento de 9.000 mm/min.
G1 X95 Y65 F9000 Mova-se para o ponto de partida da primeira linha com uma velocidade de movimento de 9.000 mm/min.
G1 Z6 F9000 Mova para baixo na direção Z para uma distância de impressão adequada (aqui Z = 6 mm).
G1 X95 Y105 F300 Ponto final da primeira linha e ponto de partida da segunda linha.
G1 X135 Y105 Ponto final da segunda linha e ponto de partida da terceira linha.
G1 X135 Y65 Ponto final da terceira linha e ponto de partida da quarta linha.
G1 X95 Y65 Ponto final da quarta linha e ponto de partida da primeira linha; um quadrado é formado.
G1 Z20 F9000 Levante o eixo Z para uma altura de 20 mm a 9.000 mm/min.
G1 X55 Y40 F9000 Mova-se para uma coordenada (55, 40) fora da escala do prato de Petri.

Tabela 1: processo de programação e explicações do código G para impressão de um quadrado.

Velocidade da extrusão (mL/h) Velocidade movente da cabeça de impressão (milímetro/minuto) Largura do gel (milímetro)
0,1 100 1,6 ± 0,1
0,1 200 1,1 ± 0,1
0,1 300 1,0 ± 0,1
0,3 300 1,8 ± 0,1
0,3 400 1,2 ± 0,1
0,3 500 0,9 ± 0,1
0,5 200 2,2 ± 0,2
0,5 1.200 1,2 ± 0,2
0,7 200 2,8 ± 0,1
0,7 1.200 1,3 ± 0,1

Tabela 2: os parâmetros de impressão ideais para hidrogéis com alta resolução. Foram medidos cinco pontos para cada condição. O valor médio e o desvio padrão são mostrados na tabela.

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Discussion

O protocolo apresentado aqui para a impressão 3D de biofilmes projetados tem duas etapas críticas. Primeiro é a preparação da superfície de impressão em ágar, que é o fator mais crítico para a produção de uma resolução de impressão específica. É importante garantir que a superfície de impressão é plana e que a ponta da pipeta na cabeça de cabeça é posicionada na altura correta da superfície. Se a superfície não for plana, a distância de trabalho mudará durante o processo de impressão. Se a distância de trabalho for inferior a 0,1 mm, a solução de CaCl2 pode entrar dentro da ponta da pipeta e causar a formação de hidrogel, fazendo com que a ponta da pipeta fique entupida. Se a distância de trabalho for superior a 0,3 mm, o gel não pode ser impresso continuamente. A distância de trabalho ideal neste estudo é de 0,2 mm. boas abordagens para preparar superfícies de impressão em ágar plano são usar pratos de Petri de diâmetro maior (150 mm-diâmetro de placa de Petri em vez de uma chapa de 90 mm de diâmetro), coloque as placas em uma mesa plana, despeje o agar solução com velocidade rápida e até mesmo, e evite mover a placa de agar durante a sua solidificação.

A segunda etapa crítica é a seleção de parâmetros de impressão desejados, incluindo velocidade de bombeamento, viscosidade da biotinta usada e velocidade da cabeça de impressão, que determinam a resolução de impressão resultante. Para selecionar esses parâmetros de forma eficiente, o usuário pode amostrar vários valores extremos para a velocidade da cabeça de impressão com uma taxa de extrusão constante, observando a largura do hidrogel impresso para cada conjunto de condições. Em seguida, repita este experimento com 4 outras taxas de extrusão. Em seguida, pegue as cinco combinações que produziram a melhor resolução de impressão para a aplicação e varie os dois parâmetros de impressão (velocidades de bombeamento e cabeçote) em etapas menores e menores até que a resolução desejada seja obtida.

A espessura das linhas impressas tem um impacto sobre a capacidade das bactérias de engenharia impressa para formar biofilmes estáveis. condições de impressão ideais (velocidade de bombeamento 0,3 mL/h, velocidade da cabeça de impressão 300 mm/min, e distância de trabalho 0,2 mm), linhas impressas de bio-tinta produzirá biofilmes estáveis após 3-6 dias de incubação à temperatura ambiente. Se as linhas se tornarem mais grossas, como aumentando a velocidade de bombeamento, as regiões médias de cada linha podem não ser induzidas suficientemente para produzir biofilmes citrato-estáveis.

Ao imprimir um Hydrogel da bio-tinta da multi-camada, cada camada impressa é solidificado em cima de contatar os íons do cálcio que se difundiam na camada impressa precedente. Uma vez que o CA2 + concentração no substrato de impressão é alta, CA2 + íons pode rapidamente difundir-se através das camadas inferiores. Portanto, as camadas superiores podem ser impressas imediatamente após as camadas anteriores terem sido impressas, simplesmente ajustando a altura de impressão no editor de código G. Adicionalmente, a distância de impressão da camada superior deve ser restringida a somente 0.1 − 0.2 milímetros mais altamente do que a distância da impressão da camada precedente. Se a distância de impressão adicionada for inferior a 0,1 mm, a ponta será arrastada pela primeira camada e reduzirá a resolução do hidrogel impresso. Se a distância de impressão adicionada for maior que 0,2 mm, a bio-tinta dará forma a gotas de líquido durante a extrusão, fazendo com que o hidrogel impresso se torne descontínuo.

A abordagem bioprinting atual permite a produção de biofilmes de engenharia reprodutíveis, espacialmente controlados, adequados para uso no estudo de propriedades mecânicas de biofilme ou resistência biológica de bactérias de biofilme a vários fatores, incluindo antibióticos, surfactantes, etc. Essa capacidade garante uma usabilidade direta do método proposto. O desenvolvimento de bioimpressoras de alta precisão do-it-yourself (DIY) provavelmente será possível, mantendo a distância de trabalho de impressão, mas reduzindo a velocidade de bombeamento e a velocidade de movimento da cabeça de impressão, ou por amostragem diferentes geometrias extrusoras e químicas de biotinta. Com melhorias futuras na resolução de impressão, aplicações adicionais podem ser ativadas, como engenharia de tecidos ou entrega de medicamentos. A abordagem de bioimpressão 3D descrita aqui também deve ser capaz de ser expandida para a impressão de tipos adicionais de espécies de bactérias que são biocompatíveis com a nossa bio-tinta baseada em alginato. O protocolo atual fornece a esterilidade suficiente por repetidamente ferver a bio-tinta durante a preparação, usando seringas estéreis e pontas da impressão, e utilizando antibióticos na bio-tinta e na placa de impressão. Experimentos futuros usando bactérias do tipo selvagem podem requerer medidas adicionais de esterilização, como substituir ou desinfectar o sistema de tubos entre as impressões.

Para o melhor conhecimento dos autores, o método apresentado (originalmente desenvolvido em Lehner et al.20) é o primeiro exemplo publicado de um estilo de manufatura aditiva para impressão 3D de bactérias. Na primeira parte deste protocolo, este método geral é descrito detalhadamente para a impressão 3D de bactérias, que é aplicada à produção de biofilmes projetados2. Várias aplicações futuras de biofilmes impressos em 3D são possíveis usando este método. Na natureza, os sistemas bacterianos múltiplos evoluíram que criam vários tipos de biofilmes, de que neste artigo um único sistema foi explorado. Vários outros sistemas podem ser facilmente examinados através da criação de biofilmes impressos em 3D com outros sistemas bacterianos, como Bacillus subtilis ou Acetobacter xylinum. Os métodos alternativos23,24 foram desenvolvidos igualmente para o padronização espacial das bactérias na alta resolução usando sinais óticos. Essas abordagens exigem equipamento mais caro e complicado para alcançá-los em comparação com esta impressora, e só são adequados para padronização de bactérias geneticamente projetadas.

A capacidade de padronizar espacialmente os biofilmes impressos em 3D com este método pode permitir a criação de biofilmes projetados que reproduzem a heterogeneidade espacial dos biofilmes naturais25. Por causa do arranjo altamente detalhado da proteína e das fibras poliméricos dentro de um biofilme, as bactérias em um estado do biofilme alcançam uma resistência muito mais elevada aos estímulos químicos e físicos, tais como uma resistência aumentada aos antibióticos em comparação ao mesmo bactérias em um estado planctônicos. Além disso, as bactérias dentro de um biofilme mostram uma resistência aumentada ao fluxo fluido, fazendo a manutenção e a esterilidade de dispositivos médicos implantáveis muito mais difíceis26. Os biofilmes de engenharia impressos que tentam reproduzir as distribuições espaciais específicas dos componentes do biofilme são ferramentas poderosas para estudar os mecanismos pelos quais as bactérias dentro de um biofilme conseguem fenótipos de resistência.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado por uma subvenção AOARD (no. FA2386-18-1-4059), a organização neerlandesa de investigação científica (NWO/OCW) como parte do programa fronteiras de Nanoscience, e o programa de materiais avançados NWO-NSFC (no. 729.001.016). Os autores reconhecem a assistência laboratorial de Ramon Van der Valk e Roland Kieffer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D printer CoLiDo 3D-P Kit
3D printing software CoLiDo Print-Rite ColiDo Repetier-Host v2.0.1
Agar Sigma-Aldrich 05040
CaCl2 dihydrate Sigma-Aldrich C7902
Centrifuge Eppendorf 5810 R
Chloramphenicol Sigma-Aldrich 3886.1
LB broth powder Sigma-Aldrich L3022
Orbital shaker VWR 89032-092 Model 3500
Petri dish VWR 25384-326 150 x 15 mm
Rhamnose Sigma-Aldrich 83650
Silicon tubing VWR  DENE 3100103/25
Syringe pump ProSense B.V.  NE-300
Sodium alginate Sigma-Aldrich W201502
Sodium citrate monobasic Sigma-Aldrich 71498
Sodium hydrooxide VWR 28244.295

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References

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Bioengenharia edição 147 impressão 3D de bactérias biofilmes biologia sintética bioimpressora 3D aplicações bacterianas materiais estruturados espacialmente impressão 3D manufatura aditiva bio-Ink
Padronização tridimensional de biofilmes projetados com uma Bioimpressora do-it-yourself
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