Summary
Bu makalede, düşük maliyetli bir ticari 3D yazıcıyı, desenli biyosilmların yazdırmayı kolaylaştıracak bir bakteriyel 3D yazıcıya dönüştürme yöntemi açıklanır. Bioprinter ve biyo-mürekkep hazırlama tüm gerekli yönleri, hem de biyolojiler oluşumunu değerlendirmek için doğrulama yöntemleri açıklanmıştır.
Abstract
Biyosilmler, kendi kendine üretilen bir uzamsal desenli ekstrellüler matriks içinde gömülü bakteri toplamları vardır. Bir biyofilm içindeki bakteriler, potansiyel sağlık tehlikeleri gösteren gelişmiş antibiyotik direnci geliştirir, ama aynı zamanda içme suyu arıtma gibi çevresel uygulamalar için yararlı olabilir. Anti-bakteriyel terapötik ve biyofilm esinlenerek uygulamaların daha da geliştirilmesi, biyofilm oluşturma için yeniden üretilebilen, mühendislere yönelik yöntemlerin geliştirilmesine ihtiyaç duyacaktır. Son zamanlarda, bir bakteriyel mürekkep ile değiştirilmiş bir üç boyutlu (3D) yazıcı kullanarak biyofilm hazırlama yeni bir yöntem geliştirilmiştir. Bu makalede, bakteriye bağlı malzeme işleme birden fazla uygulama sunan bu verimli, düşük maliyetli 3D bioprinter oluşturmak için gerekli adımları açıklar. Protokol, Ekstruder 'in, kontrol edilebilir ve sürekli biyo-mürekkep akışını sağlayan bir şırınga pompası sistemine bağlı bir biyo-mürekkep dispenseri ile değiştirildiği uyarlanmış bir ticari 3D yazıcıyla başlar. Biyofilm baskı için uygun bir biyo-mürekkep geliştirmek için, tasarlanan Escherichia coli bakteri alginat bir çözelti içinde askıya alındı, böylece kalsiyum içeren bir yüzey ile temas içinde katılaşma. Baskı substrat içinde bir indükleştirici kimyasal dahil edilen biyo-mürekkep içinde biyofilm proteinleri ifade sürücüler. Bu yöntem, yazdırılan biyosillerin ayrık katmanlarından oluşan çeşitli uzamsal desenler 3D baskı sağlar. Bu tür uzamsal kontrollü biyosiller model sistemleri olarak hizmet verebilir ve diğerleri arasında, antibiyotik direnci önleme veya içme suyu arıtma dahil olmak üzere toplum üzerinde geniş kapsamlı bir etkiye sahip birden fazla alanda uygulamaları bulabilirsiniz.
Introduction
Şu anda, bu tür malzemeler için pazarlar genişleyen sayısı nedeniyle, dağınık desenli malzemelerin üretimi için çevre dostu, sürdürülebilir çözümler geliştirmek için artan bir ihtiyaç vardır1. Bu makalede, bu tür malzemelerin üretimi için basit, ekonomik bir yöntem sunuyor ve bu nedenle gelecekteki uygulamaların büyük bir spektrum sunuyor. Burada sunulan yöntem üç boyutlu (3D) bir biyo-mürekkep yaşayan bakteri içeren kullanarak dağınık desenli yapıların baskı sağlar. Bakteriler, bir haftadan fazla bir süre için baskılı yapıların içinde uygun kalır, bakteri doğal veya mühendislik metabolik faaliyetleri gerçekleştirmek için olanaklı kılmak. Baskılı bakteri böylece üretmek ve basılı yapısı içinde istenilen bileşenleri yatırmak, örneğin işlevsel bir çapraz bağlantılı biyofilm oluşturma2.
Gelişmiş malzemelerin üretimi için geleneksel yöntemler yüksek enerji harcamalarını (örn. yüksek sıcaklıklar ve/veya baskılar) içerir ve büyük miktarlarda kimyasal atık üretebilir, genellikle maliyet kapsamlı kullanım gerektiren toksik maddeler3 ,4. Buna karşılık, birden fazla bakteriyel türler kolayca çeşitli sektörlerde uygulanabilir malzemeler üretebilir. Bu malzemeler arasında polyhydroxyalkanoates (PHA)5 veya Poly (glycolide-Co-lactide) (PGLA)6, bakteriyel selüloz7, bakteriyel beton malzemeleri8, biyomimetik kompozitler9, amiloid bazlı yapıştırıcılar10veya Bio tabanlı elektrik şalterleri11, diğerleri arasında. Dahası, değerli malzemelerin bakteriyel üretimi genellikle yakın ortam sıcaklıklarında ve basınçlarda ve sulu ortamlarda, toksik bileşikler gerektirmeden veya üreterek gerçekleşir. Literatürde bakterilere sahip malzemeler üretilirken, bazı endüstriyel uygulamalar zaten12,13, bu tür malzemelerin uzamsal deseni için güvenilir bir yöntem ortaya çıkmıştır.
Bu makalede, düşük maliyetli bir ticari 3B yazıcıyı 3B bakteriyel yazıcıya dönüştürmenin düz ileriye dönük bir yöntemi gösterilmektedir. Protokol, yaşam bakterilerini içeren ve sürdürmeye yarayan bir biyo-mürekkebin nasıl hazırlanacağı, hem de 3D baskının gerçekleştirilebilecek alt yüzeylerini nasıl hazırlamaktır. Bu yöntem, malzeme üretebilen çeşitli doğal ve mühendislik bakteriyel suşları ile kullanmak için uygundur. Bu bakteriler, bir 3D baskılı yapı içinde dağınık bir şekilde dağıtılır ve hala bakteri tarafından üretilen istenilen malzemelerin bir uzamsal dağılımı neden olacak metabolik aktivite, devam edebilir.
Bu baskı yöntemi biyosilme katkı üretimi sağlar, kendi kendine üretilen bir ekstrellüler matris ile çevrili bakteri toplamları. Biofilms hangi proteinler, polimerler, bakteriyel hücreler, oksijen ve besin tüm uzamsal yapılandırılmış olan heterojen 3D ağlar14. Bir biyofilm şeklinde iken, bakterilerin artan bir antibiyotik direnci ve yapısal sağlamlık sergiler, onları zor tıbbi kateter ve implantlar dahil yüzeylerden ortadan kaldırmak için yapmak. Biyofilm özellikleri için anahtar ve aynı zamanda en büyük zorluk biyofilm araştırma, biyofilm heterojenliği gibi görünüyor15,16,17. Dağınık kontrollü model biyofilmlerinin üretimi, biyofilm bileşenlerinin uzamsal desenlerini yeniden üretmeye veya ayarlamaya izin verecek şekilde özel bir ilgidir, neredeyse her yüzeyde biofillerin istikrarlı bir şekilde birikmesini anlamakta Doğa.
Bu makalede, bir indükör varlığında biyofilm proteinleri üreten mühendislik E. coli bakterileri içeren 3D baskılı Hidrojeller kullanarak biyofilm üretimi için bir yöntem sunar, hem de biyolojik madde oluşumu doğrulama yöntemleri2 . Bu biyosillerin ana ekstrelüler matris bileşenleri, kendinden birleştirilmiş csga proteinlerini içeren18 ' lik kaydırma amiloid lifleridir. E. coli bakterileri csga proteinlerini ifade etmeye indüklenmiş olduğunda, hücreleri baskı yüzeyinin yıkanması karşı koruyan istikrarlı bir model biyofilm oluşturur. Böyle bir 3D baskılı biyofilm, uzamsal olarak kontrol edilebilir ve çok ölçekli biyofilm yapısı-fonksiyon mekaniği veya materomics19soruşturma için yararlı bir araştırma aracı olarak hizmet verebilir. Bu ısmarlama biyofilm diğer uygulamalar arasında antibiyotik direnci mekanizmaları içine daha fazla araştırma sağlayan, biyofilm oluşumu ve mekanik özellikleri ilkelerini anlayış yardımcı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ticari 3B yazıcının 3D bioprinter içine dönüştürülmesi
- Ekstruder ve ticari 3B yazıcının (malzeme tablosu) ısıtıcısını yazıcı çerçevesinden çıkarın ve bu elemanları ana devre kartından kontrol eden kablolamayı çıkarın (Şekil 1a). Yazıcının operasyonel sıcaklığını denetleyen sensör, yazıcı yazılımıyla iletişim kurmak için işlevsel olması gerektiğinden, yazdırma yazılımından çalışma sıcaklığına ulaşılana kadar yazdırmayı geciktiren algoritmayı kaldırın.
- Silikon boruları (1 mm iç çapı) ile bir şırınga pompasına yüklenen 5 mL şırıngaya Pipet ucunu (200 μL ucu) bağlayın. Pipet ucunu, orijinal ekstruder için (Şekil 1B) yerine 3D yazıcı ekstrüder kafası üzerine takın.
- Birden fazla biyo-mürekkep türü kullanılırsa, yazıcıya ek boru sistemi (ler) ve Pipet Ucu (ler) bağlayın.
2.3D baskı için substrat hazırlama
- 4 ml 5 M CAcl2 çözeltisi ekleyin 400 ml 1% w/v agar içinde çözülmüş Luria-Bertani suyu (lb) orta, uygun antibiyotik ve indükleyiciler ile tamamlayıcı (burada 34 μg/ml kloramfenikol ve 0,5% rhamnose).
- Her 150 mm x 15 mm Petri tabağı içine LB-agar çözeltisi 20 mL dispense. Yarım açık kapak ile Oda sıcaklığında 30 dakika kuru.
Not: protokol, bu baskı yüzeylerini birkaç güne kadar 4 °C ' de depolayarak burada duraklatılabilir.
3. biyo-mürekkep hazırlama
- Solüsyonu sterilize etmek için bir Sodyum Aljinat çözeltisi (% 3 w/v) ve kaynama noktasına üç defa ısı hazırlayın. 4 °C ' de kullanılıncaya kadar saklayın.
- Grow e. COLI MG1655 Pro Δcsga ompR234 (e. coli δcsga) bakteri taşıyan plazmids pSB1C3-yeşil floresan protein (Gfp) (kurucu Gfp Ifadesi)2 veya PSB1C3-Gfp-csga (kurucu Gfp ifadesi, Rhamnose-indüklenebilir csga ifade) bir gecede 37 °c ' de 250 rpm 'de, 34 μg/ml kloramfenikol ve 0,5% rhamnose içeren lb orta 50 ml 'de sallayarak.
- 3.220 x g 'de 5 dakika boyunca hücre kültürünü santrifüjle bakteriye bırakın. Süpernatant çıkarın.
- 10 mL LB orta bakteri peleti yeniden askıya alın ve 10 mL Sodyum Aljinat (3% w/v) ekleyin.
4.3D baskı süreci
- Bir bilgisayarda 3B Yazdırma yazılımını (malzeme tablosu) yükleyin ve açın. 3B yazıcıyı bilgisayara bağlayın. X, Y ve Z eksenleri için ana sayfa düğmesini tıklatarak Baskı kafasını ev konumuna taşıyın.
- Her baskı için, baskı yatağında belirli bir yere hazırlanmış bir baskı substrat yerleştirin.
- Yazıcı kafasının yüksekliğini Z ekseninde kalibre edin.
- Manuel kontrol altında 22 mm yüksekliğine Baskı kafasını kaldırın, böylece istenilen pozisyona hareket ederken Petri tabağı kenarı ile çarpışmak olmayacaktır. Plakanın Baskı kafasını üst kısmına yerleştirin ve Pipet Ucu baskı yüzeyine temas edene kadar aşağı doğru taşıyın. Bu Z ekseni konumunu Z1 (baskı yüzeyinin yüksekliği) olarak atayın.
- Baskı kafasını kaldırın ve X, Y ve Z eksenlerinde manuel kontrol ile plaka alanının dışına taşıyın. Yazıcı kafası ile plaka yüzeyi arasındaki çalışma mesafesi Z2 olarak tanımlanmışsa, yazdırma sırasında, yazdırma programına Z1 + Z2 girin ve baskı sırasında Z değeri olarak yazın.
- İstenilen yörüngeye göre otomatik olarak geliştirilen bir nokta-by-noktası koordinat yöntemi ile baskı şeklini programlamak.
- İstenilen yörünge düz bir çizgi ise, yalnızca başlangıç ve bitiş noktalarını tanımlayın. Eğri çizgilere ek noktalar dahil olmak üzere daha pürüzsüz eğrileri neden olur. Yazdırma kafasını her noktaya sırayla el ile taşıyın ve bu noktaların koordinatlarını sırayla kaydedin. Tüm bu koordinatlarının yanı sıra her yazdırılan segment için baskı kafası hareketli hızını G kodu düzenleyicisine girin.
- Baskıdan önce ve sonra, Baskı kafasını plaka kenarından (20 mm) daha yüksek bir mesafeye kaldırın ve doğrudan plaka bölgesinin dışına taşıyın. Bu programı bir G-Code dosyası olarak kaydedin ve sonraki baskılarda kullanmak için doğrudan yükleyin, her yeni baskı substrat için Z ekseni yüksekliğini yeniden ölçün.
Not: bir kare yazdırmak için örnek G-kodu için Tablo 1 ' e bakın. - Önceden programlanmış G-Code dosyasını yükleyin. Yazılımdaki G-Code düzenleyicisini açın ve istenen şekli yazdırmak için komutlarda program yapın. Her komut satırında, baskı kafasının konumu X, Y ve/veya Z ekseninde değişebilir. Tüm yazdırma adımları sırasında Z değerini Z1 + Z2 (baskı yüzeyi + çalışma mesafesi yüksekliği) olarak girin.
Not: hareketli hız da ayarlanabilir; 9.000 mm/dak, tipik baskı hızları için uygun bir değerdir. - Sıvı biyo-mürekkebi şırınga (ler) içine yükleyin ve 3D bioprinter şırınga pompası (lar) içine takın.
- Yazdır düğmesine tıklayarak biyo-mürekkebi baskı substratın üzerine yazdırın.
- Baskı sırasında, yazıcı kafası hareketini tamamen yazılım tarafından kontrol et. Yazıcı kafası baskı yüzeyi ile temas etmeden önce şırınga pompasını el ile başlatın.
Not: şırınga pompası ve yazıcı koordinasyonu ampirik ekstrüzyon hızına bağlı olarak belirlenir, hangi baskı kafası ilk baskı noktasına hareket hızı, ve baskı kafası başlangıç konumu. İlk baskı kafası konumu 20 mm, 9.000 mm/dak baskı kafası hızı ve 0,1 mL/h ekstrüzyon hızı ile, baskı başladıktan hemen sonra şırınga pompası başlatın. Ekstrüzyon hızı 0,1 mL/h 'den 0,3 mL/h 'ye değiştirilirse, baskı başladıktan sonra şırınga pompasını başlatmak için 2 − 3 s bekleyin. - Baskı kafası baskının son noktasına geldiğinde şırınga pompasını durdurun. Yazıcı kafası baskı sürecinin sonunda yukarı kaldırmadan önce şırınga pompası durdurun, aksi takdirde aşırı biyo-mürekkep baskı substrat üzerine düşecek ve baskı çözünürlüğü azaltmak.
- 3D yapıların inşası için, G-Code düzenleyicisinde baskı kafasının tüm hareketlerini kontrol et. İlk katmanın yazdırma yüksekliğini yazın. G-kodunun Z değerini, ikinci katman için 0,2 milimetre tarafından baskı yüksekliğini artırmak üzere artırın. Daha sonra, daha yüksek bir katmana taşındıktan sonra 0,1 milimetre ile Z değerini artırın. Baskı işlemi sırasında plakası hareket ettirmeyin.
- Yazdırılan hidrojelin genişliğini ve yüksekliğini ölçmek için, numunenin altına veya yanında yerleştirilen bir çelik cetvel kullanın.
5. E. coli tarafından biyofilm üretiminin etkinliğini yetiştirmek ve test etmek
- Biyofilm bileşenlerinin (curli liflerin) üretimine izin vermek için basılı numuneleri 3 − 6 gün boyunca oda sıcaklığında inküle etmek. Fotoğraf makinesi veya floresan tarayıcı kullanarak plakaları görüntü.
- Alginat matrisini çözmek için, 20 mL 0,5 M sodyum sitrat çözeltisi ekleyin (pH = 7 NaOH ile ayarlanır) baskı yüzeylerde, ve 2 h için inkük 30 RPM oda sıcaklığında sallayarak. Sitrat tedavisinde önce plakaların görüntüleri ile karşılaştırmak için tekrar sıvı ve görüntü plakaları atın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Biyosilmların başarılı 3D baskı için ilk adım bir bioprinter içine ticari bir 3D yazıcı dönüştürüyor. Bu dönüşüm, yazıcının ekstruder ve ısıtıcısını kaldırarak, polimerik mürekkeple yazdırmak için tasarlanmış ve bunları yaşayan bakterileri içeren biyo-mürekkep yazdırmak için uygun bileşenlerle değiştirerek elde edilir (Şekil 1a). Bir şırınga pompasına bağlı bir boru sistemine bağlı olan ekstruder, bir pipet ucu (veya baskı sürecinde birden fazla biyo mürekkebi kullanılırsa ipuçları) ile değiştirilir (Şekil 1B). Ticari yazıcının bir bioprinter içine başarılı bir şekilde dönüştürülmesi, şırınga pompasından istenilen biyo-mürekkep (lar) ı boru sistemi ve Pipet Ucu (ler) üzerinden bir baskı yüzeyine sızdırma veya ısıtma olmadan aktarma yeteneğine göre değerlendirilebilir Biyo-mürekkep. Eğer boru baskı sırasında biyo-mürekkep akışını nedeniyle çıkıntı, daha kalın duvarlar ile tüp yerine olabilir. Bu baskı tekniği Hangi boru baskı kafası bağlı olabilir ticari 3D yazıcı herhangi bir tür ile çalışmak gerekir unutulmamalıdır.
3D bioprinter çeşitli iki boyutlu (2D) ve 3D şekiller (Şekil 2) bakteri Kapsülleyici Hidrojeller oluşturabilirsiniz. Baskı substrat kalsiyum iyonlarının (alginat karboksil grupları ile kalsiyum iyonları şelasyon) baskı üzerine biyo-mürekkep, sıvı biyo-mürekkep katı bir hidrojel dönüştürerek, katılaşma neden olur. Bioprinleme çözünürlüğü ekstrüzyon hızına, pipet ucunun boyutuna, yazıcı kafasının hızına, CaCl2 solüsyonun hacmi ve konsantrasyonuna, agar çözeltisi, baskı yüzeyinin düzlüğüne ve viskozitesine bağlı olacak kullanılan biyo-mürekkep. CaCl2 çözeltisi konsantrasyonu hidrojel netlik üzerinde büyük bir etkiye sahiptir. Dört farklı CaCl2 konsantrasyonları (0,1 m, 0,2 m, 1 m ve 5 m) örneklenmiş ve sadece 5 m CAcl2 çözeltisi, baskı sonrası bulanık olmayan hidrojel ile sonuçlandı. Bu nedenle, 5 M CaCl optimum konsantrasyon olarak seçildi2 çözüm.
Bu protokol önceki bir sürümünde, CaCl2 solüsyonu agar plaka yüzeyine yerine agar plaka dökme önce içine içine karıştırılmış olduğu için uygulanan. Bu sürümü kullanırken, CaCl2 çözümün hacmi baskı kalitesi ve çözünürlüğü üzerinde kritik bir etkiye sahiptir. 150 x 15 mm Petri tabağı kullanıldığında, 100 μL 'den (veya 90-mm Petri tabağı için 30 μL) Kalsiyum klorür çözeltisi hacmi uygulanırken, baskı yüzeyinde çok fazla sıvı kalmasıyla sonuçlanır. Bu sıvı, plaka taşındığında, çalışma mesafesini değiştirebilir ve pipet ucunun tıkanmasına neden olabilen, eşit olmayan şekilde yayılabilir. CaCl2 çok fazla hacim de float ve kayan hidrojel şeklini ve konumunu değiştirerek, çözüm boyunca slayt baskılı Hidrojeller neden olabilir. Kalsiyum klorür çözeltisi hacmi çok küçükse, plakanın bazı bölgeleri CaCl2 solüsyonu almayabilir ve düşük hidrojel katılaşma olacaktır. Bu geliştirilmiş protokolde, agar plakasını dökmeden önce doğrudan agar çözeltisi içine CaCl2 çözeltisi ekleme, yüzey uygulanan yönteme kıyasla baskı substrat yüzeyinde önemli ölçüde daha az nem sonuçlandı baskı çözünürlüğünü önemli ölçüde iyileştirmiştir.
Ekstrüzyon hızı ve baskı kafası hareketi birbiriyle bağımlıdır ve baskı çözünürlüğünü değiştirmek için koordine edilebilir bir şekilde ayarlanabilir. Örneğin, yazıcı 0,1 ml/h ile 0,5 ml/h arasında ekstrüzyon hızı ile çalıştırılırsa, 300 mm/dak 'lik sabit bir baskı kafası hareket hızı ile baskılı hidrojel çapı2,20artış ile artar. 0,5 mL/h üzerindeki ekstrüzyon hızlarında, hidrojel baskılı çizgilerinin dış kenarları düz, paralel çizgilerle dalgalı çizgilere değişir ve çizgi genişliği de artar. Yazıcı kafasının hızı da baskı çözünürlüğü üzerinde bir etkiye sahiptir. 0,3 mL/h sabit ekstrüzyon hızı ile, 300 mm/dk 'dan 500 mm/dak 'ye kadar baskı kafası hızını artırarak, baskılı hidrojel genişliği daha dar hale gelen, 1,8 mm 'den 0,9 mm 'ye düşürmektedir. Baskı kafası hareketli hız 500 mm/dak üzerinde ise, jel hattı kolayca kesintisiz hale gelir. Bir 200 μL pipet ucu ve mevcut çalışmada kullanılan biyo-mürekkep için, baskı çözünürlüğünün çeşitli kombinasyonları en uygun (Tablo 2) olarak kabul edilir. 0,3 mL/h pompa hızında, baskı kafası hareket hızı 500 mm/dak ve çalışma mesafesi 0,2 mm, baskılı hidrojel yaklaşık 0,9 mm genişliğiyle üretilir.
Bakteriyel 3D baskı yönteminin önemli bir başarısı, mühendislik biyosilm oluşturma yeteneğidir. Bir mühendislik ve dağınık kontrollü biyofilm oluşturmak için, bakteri sadece 3D baskı sürecinde hayatta değil, aynı zamanda yazdırılan desen içinde kaldığında biyofilm bileşenleri üretmelidir. Bu protokolde kullanılan mühendislik e. coli bakteriler, Plasmid pSB1C3-Gfp-csga taşıyan e. coli δcsga bakteriler, kaydırma proteinleri kontrol edilebilir ifade sağlar. Bir csga-nakavt gerinim kullanımı csga protein sadece rhamnose ile bir Plasmid indüklenen zaman ifade edilir sağlar. Bakteriler indüklenen csga protein alt paketleri ihracat, daha sonra Self-birleştirmek21 mikrop dış membran üzerinde csgb proteinleri üzerine22 kaydırma lifleri oluşturmak için. Bu amiloid benzeri lifler, biyofilm dışı matrisin önemli proteinasöz bileşenleridir: bakterilerin gömülür proteinler ve polimerler bağlı bir ağ. 3D baskı biyo-mürekkep baskılı aljinat matris kaydırma üretim sürecinde bakterilere fiziksel destek ve yapı ödünç. Kurucu GFP ifadesinin kullanımı, floresan görüntüleme yoluyla yazdırılan hücrelerin görselleştirilmesine ve ölçülmesine olanak sağlar.
Biyofilm oluşumunun başarılı olup olmadığını değerlendirmek için, alginat matrisinin sodyum sitrat çözeltisi kullanılarak çözülür ve yazdırılan biyo-mürekkebin şekli sitrat tedavisi sonrasında değerlendirildi (Şekil 3). İndüklenebilir kaydırma üretim plazmid olmadan biyo-mürekkep durumunda, yazdırılan desen tamamen sodyum sitrat tedavisi sonra çözünmüş, hiçbir biyofilm kaydırma ağ oluşturduğu anlamına gelir (Şekil 3A, B). İndüklenebilir kaydırma üretim plazmid içeren bakteriler durumunda, jel sodyum sitrat tedavi sonra çözünmüş değildi (Şekil 3c, D). Bu sonuç, yazdırılan bakterilerin, bakteri baskılı desenini stabilize etmek için yeterince geniş bir kaydırma ağ oluşturabildiğini gösterir2.
Çok katmanlı yapıları oluşturmak için, G kodu düzenleyicisinde baskı yüksekliğini ve yazdırma yörüngesini ayarlayarak ek katmanlar yazdırılır (Şekil 4). Bir örnekteki yazdırılan katmanların sayısının artırılması, yazdırılan yapıların genişliğine ve yüksekliğine artımlı olarak artmasına neden oldu (Şekil 5)2,20, ancak hatta 5 katmanlı baskılı yapılar bir çözünürlüğe sahip oluşturulabilir milimetre alt milimetre. Kaydırma proteinlerin indükibly üretilmesi için tasarlanan e. coli çok katmanlı yapılara basıldığında, sodyum sitrat tedavisi numuneleri çözülmez, ancak kaydırma olmayan üreten e. coli içeren çok katmanlı yapılar Sodyum sitrat çözeltisi içinde çözünür (Şekil 6). Bu deney, çok katmanlı, üç boyutlu baskılı yapıların yanı sıra tek katmanlı baskılı yapılarda tasarlanan biyosilme oluşturabileceğinizi gösterir.
Şekil 1: ticari 3B yazıcının 3B bioprinter içine dönüştürülmesi gösteren fotoğraflar. (A) ticari 3D yazıcıdan dönüşümden sonra 3D bioprinter bileşenleri. (B) pipet ucuna bağlı bir boru sistemi tarafından oluşturulan biyo-mürekkep ekstruder. Ek baskı ipuçları ikinci baskı kafası deliğe eklenebilir veya baskı kafası ek delikler ekleyerek, biyo-mürekkep birden fazla türde yazdırma kullanmak için. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: E. coli pSB1C3-Gfp-csga içeren 3D bioprinted desenleri örnekleri. Bu görüntüler yazdırdıktan iki gün sonra çekildi. Bu baskı çözünürlüğü 0,3 mL/h pompa hızı, baskı kafası hareket hızı 300 mm/dak ve çalışma mesafesi 0,2 mm ile elde edilmiştir. Bu şekilleri yazdırmak için G-kodları ek dosyalardabulunabilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: biyofilm bileşenlerinin baskılı bir desen içinde E. coli bakterileri tarafından üretilip üretmediğini doğrulama yöntemi. Baskılı E. coli kaydırma indüksiyon için kodlamak vermedi bir Plasmid içerdiğinde, yazdırılan desen tamamen sodyum sitrat tedavisi ile çözülür (a ve B). Plazmid kodlama indüklenebilir kaydırma proteinleri kullanılan E. coli kullanıldığında, yazdırılan biyofilm sodyum sitrat tedavisine (C ve D) dayanıklıdır. Bu kare desenini yazdırmak için G-kodunun programlama süreci ve açıklamaları Tablo 1' de sağlanmıştır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4: E. coli pSB1C3-Gfp-csga içeren çok katmanlı baskılı yapıların üst görünümü (A) ve yan görünümü (B). Bu numune pompa hızı 0,3 mL/h, baskı kafası hareket hızı 200 mm/dak ve çalışma mesafesi 0,2 mm ile basılmıştır. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .
Şekil 5: farklı sayıda yazdırılan katman içeren baskılı hidrojlerin çizgi genişliği ve yüksekliği. Ölçümler, pompa hızı 0,3 mL/h, baskı kafası hareket hızı 500 mm/dak ve çalışma mesafesi 0,2 mm ile baskılı örneklerde yapılmıştır. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .
Şekil 6: biyofilm bileşenlerinin çok katmanlı baskılı yapıların içinde E. coli bakterileri tarafından üretilip üretmediğini doğrulama yöntemi. Tasarlanan E. coli 1, 3-veya 5 katmanlı hydrojels içine basıldı ve 6 gün boyunca inkübe edildi. Baskılı E. coli , kaydırma indüksiyon için kodlamayarak bir Plasmid içerdiğinde, yazdırılan desen tamamen sodyum sitrat tedavisi (a ve B) ile çözülür. Baskılı E. coli bir plazmid kodlama indüklenebilir kaydırma proteinleri içeriyorsa, baskılı biyofilm sodyum sitrat tedavisine (C ve D) dayanıklıdır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
| G-kod komutları | Görev |
| G1 Z20 F9000 | Z eksenini 9.000 mm/dak hareketli hızda 20 mm yüksekliğe kaldırın. |
| G1 X95 Y65 F9000 | 9.000 mm/dak hareketli hız ile ilk satırın başlangıç noktasına gidin. |
| G1 Z6 F9000 | Z yönünde aşağı doğru hareket ettirin (burada Z = 6 mm) baskı mesafesi. |
| G1 X95 Y105 F300 | İkinci satırın ilk satırının ve başlangıç noktasının bitiş noktası. |
| G1 X135 Y105 | İkinci satırın bitiş noktası ve üçüncü satırın başlangıç noktası. |
| G1 X135 Y65 | Üçüncü satırın bitiş noktası ve dördüncü satırın başlangıç noktası. |
| G1 X95 Y65 | Dördüncü satırın bitiş noktası ve ilk satırın başlangıç noktası; bir kare oluşur. |
| G1 Z20 F9000 | Z eksenini 9.000 mm/dak 'da 20 mm yüksekliğe kaldırın. |
| G1 X55 Y40 F9000 | Petri tabak aralığının dışında bir koordinata (55, 40) gidin. |
Tablo 1: programlama süreci ve G-kodu açıklamaları bir kare yazdırmak için.
| Ekstrüzyon hızı (mL/h) | Baskı kafası hareketli hız (mm/dak) | Jel genişliği (mm) |
| 0,1 | 100 | 1,6 ± 0,1 |
| 0,1 | 200 | 1,1 ± 0,1 |
| 0,1 | 300 | 1,0 ± 0,1 |
| 0,3 | 300 | 1,8 ± 0,1 |
| 0,3 | 400 | 1,2 ± 0,1 |
| 0,3 | 500 | 0,9 ± 0,1 |
| 0,5 | 200 | 2,2 ± 0,2 |
| 0,5 | 1.200 | 1,2 ± 0,2 |
| 0,7 | 200 | 2,8 ± 0,1 |
| 0,7 | 1.200 | 1,3 ± 0,1 |
Tablo 2: yüksek çözünürlüklü Hidrojeller için optimum baskı parametreleri. Her koşul için beş puan ölçülmüştür. Ortalama değer ve standart sapma tabloda gösterilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mühendislik biyosilmlarının 3D baskı için burada sunulan protokol iki kritik adımlara sahiptir. Öncelikle, özel bir baskı çözünürlüğü üreten en kritik faktör olan agar baskı yüzeyinin hazırlanması. Baskı yüzeyinin düz olduğundan ve yazıcı kafasının üzerindeki pipet ucunun yüzeyden doğru yükseklikte konumlandırıldığından emin olmak önemlidir. Yüzey düz değilse, çalışma mesafesi yazdırma işlemi sırasında değişecek. Çalışma mesafesi 0,1 mm 'den az ise, CaCl2 çözeltisi pipet ucunun içine girebilir ve hidrojel oluşumuna neden olabilir, pipet ucunun tıkanmış olmasına neden olur. Çalışma mesafesi 0,3 mm 'den fazladır, jel sürekli olarak basılamaz. Bu çalışmada en uygun çalışma mesafesi 0,2 mm 'dir. düz agar baskı yüzeyleri hazırlamak için Iyi yaklaşımlar daha büyük çaplı Petri yemekleri (150-mm-çapı Petri tabak yerine bir 90-mm-çapı plaka) kullanmak için, düz bir masaya plakalar yer, agar pour hızlı ve hatta hız ile çözüm ve onun katılaştırma sırasında agar plaka hareket kaçının.
İkinci kritik adım, pompa hızı, kullanılan biyo-mürekkebin viskozitesi ve elde edilen baskı çözünürlüğünü belirleyen baskı kafası hızı dahil olmak üzere istenen yazdırma parametrelerinin seçimidir. Bu parametreleri verimli bir şekilde seçmek için, Kullanıcı her koşul kümesi için yazdırılan hidrojel genişliğini belirterek, sabit ekstrüzyon hızına sahip baskı kafası hızı için birkaç aşırı değeri örnek alabilir. Ardından, bu deneyi 4 diğer ekstrüzyon oranıyla tekrarlayın. Ardından, uygulama için en iyi baskı çözünürlüğünü üreten beş kombinasyonunu alın ve istenen çözünürlük elde edilinceye kadar hem yazdırma parametrelerini (pompalama ve baskı kafası hızları) daha küçük ve küçük adımlarla değişir.
Yazdırılan çizgiler kalınlığı istikrarlı biyosilm oluşturmak için baskılı mühendislik bakterilerin yeteneği üzerinde bir etkiye sahiptir. Optimum baskı koşullarında (pompa hızı 0,3 mL/h, baskı kafası hızı 300 mm/dak ve çalışma mesafesi 0,2 mm), biyo-mürekkep baskılı hatları, oda sıcaklığında% 3-6 ' i inkübasyon yapıldıktan sonra istikrarlı biofillar üretecektir. Çizgiler daha kalın olursa, örneğin pompa hızını artırarak, her çizginin orta bölgeleri sitrat-istikrarlı biyosilm üretmek için yeterince indüklenmiş olmayabilir.
Çok katmanlı biyo-mürekkep hidrojel yazdırırken, her baskılı tabaka önceki baskılı tabakaya yayılmış kalsiyum iyonlarının temas üzerine katılaştırılır. Baskı substrat CA2 + konsantrasyonu yüksek olduğundan, CA2 + iyonları hızla alt katmanları aracılığıyla diffize olabilir. Bu nedenle, üst katmanlar, yalnızca G kodu düzenleyicisinde yazdırma yüksekliğini ayarlayarak, önceki katmanlar yazdırıldıktan hemen sonra yazdırılabilir. Ayrıca, üst katmanın yazdırma mesafesi, önceki katmanın yazdırma mesafesine göre yalnızca 0.1 − 0.2 mm daha yüksek olmalıdır. Eklenen baskı mesafesi 0,1 mm 'den küçüksa, uç ilk katmanda sürükleyecektir ve yazdırılan hidrojel çözünürlüğünü azaltır. Eklenen baskı mesafesi 0,2 mm 'den büyükse, biyo-mürekkep ekstrüzyon sırasında sıvının damlalarını oluşturur ve yazdırılan hidrojelin kesintisiz hale gelmesine neden olur.
Mevcut bioprinting yaklaşımı, biyofilm mekanik özelliklerinin çalışması veya biyofilm bakterilerinin biyolojik direnci gibi çeşitli etkenlere uygun olarak yeniden üretilebilen, dağınık olarak kontrollü tasarlanan biyofilmlerin üretimini sağlar. antibiyotikler, surfactants, vb. Bu özellik, önerilen yöntemin doğrudan kullanılabilirliğini sağlar. Yüksek hassasiyetli do-it-yourself (DIY) bioprintermların geliştirilmesi, baskı çalışma mesafesini koruyarak Ancak pompa hızını ve baskı kafasının hareketli hızını düşürerek veya farklı ekstruder geometrileri örnekleme ve Biyo-mürekkep chemistries. Baskı çözünürlüğünde gelecekteki iyileştirmeler ile, doku mühendisliği veya ilaç teslimi gibi ek uygulamalar etkinleştirilebilir. Burada açıklanan 3D bioprinting yaklaşımı da bizim Alginate tabanlı biyo-mürekkep ile biyouyumlu olan bakteri türlerinin ek tip baskı için Genişletilebilir olması gerekir. Mevcut protokol, steril şırınga ve baskı ipuçlarını kullanarak ve hem biyo-mürekkep hem de baskı plakasında antibiyotik kullanan, hazırlık sırasında biyo-mürekkebi sürekli olarak kaynatarak yeterli sterilite sağlar. Vahşi tip bakterileri kullanan gelecekteki deneyler, boru sisteminin baskılar arasında değiştirilmesi veya dezenfekte edilmesi gibi ek sterilizasyon önlemleri gerektirebilir.
Yazarların en iyi bilgisine göre, sunulan Yöntem (aslında Lehner ve al.20' de geliştirilen), bakteri 3D baskı için bir katkı üretim tarzı ilk yayımlanan örneğidir. Bu protokolün ilk bölümünde, bu genel yöntem, mühendislik biyofilm2üretiminde uygulanan bakterilerin 3D baskı için ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Bu yöntem kullanılarak 3D baskılı biyosilmların birden fazla gelecekteki uygulamaları mümkündür. Doğada, birden fazla bakteriyel sistem bu makalede tek bir sistem keşfedildi biyosilm, çeşitli oluşturmak evrimleşmiş. Bacillus subtilis veya Acetobacter xylinumgibi diğer bakteriyel sistemlerle 3D baskılı biyoilm oluşturarak birden fazla sistem kolayca incelenebilir. Alternatif yöntemler23,24 de optik sinyalleri kullanarak yüksek çözünürlükte bakterilerin uzamsal deseni için geliştirilmiştir. Bu yaklaşımlar, bu yazıcıya kıyasla onları elde etmek için daha pahalı, karmaşık ekipman gerektirir ve sadece genetiği üretilmiş bakterilerin deseni için uygundur.
Bu yöntem ile yüzeysel desen 3D-baskılı biyosilme yeteneği doğal biyomilms25uzamsal heterojenliği çoğaltmak mühendislik biyosilm oluşturulması için izin verebilir. Bir biyofilm içinde protein ve polimerik liflerin son derece ayrıntılı düzenlenmesi nedeniyle, bir biyofilm durumunda bakteri aynı karşılaştırıldığında antibiyotiklere artan direnç gibi kimyasal ve fiziksel uyaranlara çok daha yüksek direnç elde bir planktonik durumda bakteri. Dahası, bir biyofilm içindeki bakteriler sıvı akışına artan bir direnç göstermektedir, implanta edilmiş tıbbi cihazların bakım ve sterilitesini çok daha zor hale getirmek26. Biyofilm bileşenlerinin belirli uzamsal dağılımlarını yeniden oluşturmaya çalışılan baskılı mühendislik biyofilleri, biyofilm içindeki bakterilerin direnç fenotiplerinin elde edildiği mekanizmaları incelemek için güçlü araçlardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışma bir AOARD Grant tarafından destekleniyordu (No. FA2386-18-1-4059), Hollanda bilimsel araştırma organizasyonu (NWO/OCW) nanoscience programının Frontiers ve gelişmiş malzemeler NWO-NSFC programı (No. 729.001.016) bir parçası olarak. Yazarlar, Ramon Van der Valk ve Roland Kieffer 'in laboratuar yardımını kabul ediyor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printer | CoLiDo | 3D-P Kit | |
| 3D printing software | CoLiDo | Print-Rite ColiDo Repetier-Host v2.0.1 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 05040 | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | 3886.1 | |
| LB broth powder | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-092 | Model 3500 |
| Petri dish | VWR | 25384-326 | 150 x 15 mm |
| Rhamnose | Sigma-Aldrich | 83650 | |
| Silicon tubing | VWR | DENE 3100103/25 | |
| Syringe pump | ProSense B.V. | NE-300 | |
| Sodium alginate | Sigma-Aldrich | W201502 | |
| Sodium citrate monobasic | Sigma-Aldrich | 71498 | |
| Sodium hydrooxide | VWR | 28244.295 |
References
- Tibbitt, M. W., Rodell, C. B., Burdick, J. A., Anseth, K. S. Progress in material design for biomedical applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (47), 14444-14451 (2015).
- Schmieden, D. T., et al. Printing of Patterned, Engineered E. coli Biofilms with a Low-Cost 3D Printer. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1328-1337 (2018).
- Mao, L. B., et al. Synthetic nacre by predesigned matrix-directed mineralization. Science. 354 (6308), 107-110 (2016).
- Gao, H. L., et al. Mass production of bulk artificial nacre with excellent mechanical properties. Nature Communications. 8 (1), 287 (2017).
- Poirier, Y., Nawrath, C., Somerville, C. Production of Polyhydroxyalkanoates, a Family of Biodegradable Plastics and Elastomers, in Bacteria and Plants. Nature Biotechnology. 13, 142-150 (1995).
- Choi, S. Y., et al. One-step fermentative production of poly(lactate-co-glycolate) from carbohydrates in Escherichia coli. Nature Biotechnology. 34 (4), 435-440 (2016).
- Mohammadi, P., Toivonen, M. S., Ikkala, O., Wagermaier, W., Linder, M. B. Aligning cellulose nanofibril dispersions for tougher fibers. Scientific Reports. 7 (1), 11860 (2017).
- Jonkers, H. M. Bacteria-based self-healing concrete. Heron. 56 (1/2), (2011).
- Schmieden, D. T., Meyer, A. S., Aubin-Tam, M. E. Using bacteria to make improved, nacre-inspired materials. MRS Advances. 1 (8), 559-564 (2016).
- Zhong, C., et al. Strong underwater adhesives made by self-assembling multi-protein nanofibres. Nature Nanotechnology. 9 (10), 858-866 (2014).
- Chen, A. Y., et al. Synthesis and patterning of tunable multiscale materials with engineered cells. Nature Materials. 13 (5), 515-523 (2014).
- Gatenholm, P., Klemm, D. Bacterial Nanocellulose as a Renewable Material for Biomedical Applications. MRS Bulletin. 35, 208-213 (2010).
- Rodriguez-Carmona, E., Villaverde, A. Nanostructured bacterial materials for innovative medicines. Trends in Microbiology. 18 (9), 423-430 (2010).
- Hung, C., et al. Escherichia coli biofilms have an organized and complex extracellular matrix structure. MBio. 4 (5), (2013).
- Donlan, R. M., Costerton, J. W. Biofilms: Survival Mechanisms of Clinically Relevant Microorganisms. Clinical Microbiology Reviews. 15 (2), 167-193 (2002).
- Wu, H., Moser, C., Wang, H. Z., Hoiby, N., Song, Z. J. Strategies for combating bacterial biofilm infections. International Journal of Oral Science. 7 (1), 1-7 (2015).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).
- Kikuchi, T., Mizunoe, Y., Takade, A., Naito, S., Yoshida, S. Curli Fibers Are Required for Development of Biofilm Architecture in Escherichia coli K-12 and Enhance Bacterial Adherence to Human Uroepithelial Cells. Microbiology and Immunology. 49 (9), 875-884 (2005).
- Cranford, S., Buehler, M. J. Materiomics: biological protein materials, from nano to macro. Nanotechnology, Science and Applications. 3, 127-148 (2010).
- Lehner, B. A. E., Schmieden, D. T., Meyer, A. S. A Straightforward Approach for 3D Bacterial Printing. ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1124-1130 (2017).
- Wang, X., Smith, D. R., Jones, J. W., Chapman, M. R. In vitro polymerization of a functional Escherichia coli amyloid protein. Journal of Biological Chemistry. 282 (6), 3713-3719 (2007).
- Hammar, M., Bian, Z., Normark, S. Nucleator-dependent intercellular assembly of adhesive curli organelles in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (13), 6562-6566 (1996).
- Huang, Y. J., Xia, A. G., Yang, G., Jin, F. Bioprinting Living Biofilms through Optogenetic Manipulation. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1195-1200 (2018).
- Jin, X. F., Riedel-Kruse, I. H. Biofilm Lithography enables high-resolution cell patterning via optogenetic adhesin expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (14), 3698-3703 (2018).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).
- Percival, S. L., Suleman, L., Vuotto, C., Donelli, G. Healthcare-associated infections, medical devices and biofilms: risk, tolerance and control. Journal of Medical Microbiology. 64, 323-334 (2015).
