Summary
Denne artikel beskriver en metode til at omdanne en lavpris-kommerciel 3D-printer til en bakteriel 3D-printer, der kan lette udskrivningen af mønstrede biofilm. Alle nødvendige aspekter af forberedelsen af bioprinter og bio-Ink er beskrevet, samt verifikation metoder til at vurdere dannelsen af biofilms.
Abstract
Biofilms er aggregater af bakterier indlejret i en selv produceret rumligt-mønstrede ekstracellulære matrix. Bakterier i en biofilm udvikle øget antibiotikaresistens, som udgør potentielle sundhedsmæssige farer, men kan også være gavnlig for miljømæssige anvendelser såsom rensning af drikkevand. Den videre udvikling af antibakteriel terapi og biofilm-inspirerede applikationer vil kræve udvikling af reproducerbare, engineerable metoder til biofilm skabelse. For nylig, en ny metode til biofilm forberedelse ved hjælp af en modificeret tredimensionel (3D) printer med en bakteriel blæk er blevet udviklet. I denne artikel beskrives de trin, der er nødvendige for at opbygge denne effektive, billige 3D-bioprinter, der tilbyder flere applikationer i bakterielt induceret materialebehandling. Protokollen begynder med en tilpasset kommerciel 3D-printer, hvor ekstruder er blevet erstattet med en bio-blæk dispenser tilsluttet en sprøjtepumpe system muliggør en kontrollerbar, kontinuerlig strøm af bio-blæk. For at udvikle en bio-blæk egnet til biofilm trykning, manipuleret Escherichia coli bakterier blev suspenderet i en opløsning af alginat, så de størkner i kontakt med en overflade, der indeholder calcium. Medtagelsen af et induktor kemikalie i tryk substratet driver ekspression af biofilm proteiner inden for det trykte bio-Ink. Denne metode muliggør 3D-printning af forskellige rummønstre bestående af diskrete lag af trykte biofilm. Sådanne rumlige-kontrollerede biofilm kan tjene som modelsystemer og kan finde applikationer i flere områder, der har en vidtrækkende indvirkning på samfundet, herunder antibiotikaresistens forebyggelse eller drikkevand rensning, blandt andre.
Introduction
Der er i øjeblikket et stigende behov for at udvikle miljøvenlige, bæredygtige løsninger til fremstilling af rumligt mønstrede materialer på grund af det voksende antal markeder for sådanne materialer1. Denne artikel præsenterer en enkel, økonomisk metode til produktion af sådanne materialer og tilbyder derfor et stort spektrum af fremtidige applikationer. Den metode, der præsenteres her tillader tredimensionel (3D) trykning af rumligt mønstrede strukturer ved hjælp af en bio-blæk, der indeholder levende bakterier. Bakterier forbliver levedygtige inden for de trykte strukturer i over en uge, så bakterierne til at udføre naturlige eller manipuleret metaboliske aktiviteter. Trykte bakterier kan derved producere og deponere ønskede komponenter inden for den trykte struktur, for eksempel at skabe en funktionel Cross-linked biofilm2.
Traditionelle metoder til fremstilling af avancerede materialer indebærer høje energiudgifter (f. eks. høje temperaturer og/eller belastninger) og kan producere store mængder kemisk affald, ofte giftige stoffer, der kræver omkostnings omfattende udnyttelse3 ,4. I modsætning hertil er flere bakteriearter i stand til at producere materialer, der let kan anvendes i forskellige brancher. Disse materialer omfatter polymerer såsom polyhydroxyalkanoates (PHA)5 eller poly (glycolid-Co-lactide) (pgla)6, bakteriel cellulose7, bakterielle beton materialer8, biomimetiske kompositter9, amyloid-baserede klæbemidler10, eller bio-baserede elektriske afbrydere11, blandt andre. Desuden, bakteriel produktion af værdifulde materialer typisk finder sted ved nær omgivende temperaturer og tryk og i vandige miljøer, uden at kræve eller producerer giftige forbindelser. Mens producere materialer med bakterier er blevet påvist i litteraturen og nogle industrielle anvendelser er allerede dukket12,13, en pålidelig metode til rumlig mønster af sådanne materialer er fortsat en udfordring.
Denne artikel demonstrerer en lineær metode til konvertering af en billig kommerciel 3D-printer til en 3D-bakteriel printer. Protokollen viser, hvordan man forbereder en bio-blæk, der indeholder og opretholder de levende bakterier, samt hvordan man forbereder substrater, som 3D-printning kan udføres. Denne metode er velegnet til brug med en række naturlige og konstruerede bakteriestammer i stand til at producere materialer. Disse bakterier kan fordeles rumligt inden for en 3D trykt struktur og stadig fortsætte deres metaboliske aktivitet, hvilket vil resultere i en rumlig fordeling af de ønskede materialer, der produceres af bakterierne.
Denne udskrivningsmetode muliggør additiv fremstilling af biofilm, aggregater af bakterier omgivet af en selv produceret ekstracellulær matrix. Biofilms er heterogene 3D netværk, hvor proteiner, polymerer, bakterieceller, ilt, og næringsstoffer er alle rumligt struktureret14. Mens bakterier i form af en biofilm, udviser en øget antibiotikaresistens og strukturel robusthed, hvilket gør dem svære at udrydde fra overflader, herunder medicinske katetre og implantater. Nøglen til biofilm egenskaber, og også den største udfordring til biofilm forskning, synes at være heterogenitet biofilm15,16,17. Produktion af rumligt styrede biofilm er af særlig interesse, da den vil gøre det muligt enten at gengive eller justere de rumlige mønstre af biofilm komponenter, at bidrage til forståelsen af den stabile afsætning af biofilm på stort set alle overflader i Natur.
Denne artikel præsenterer en metode til produktion af biofilm ved hjælp af 3D-trykte hydrogel indeholdende konstruerede E. coli bakterier, der producerer biofilm proteiner i tilstedeværelse af en inducer, samt metoder til verifikation af biofilm dannelse2 . De store ekstracellulære matrixkomponenter i disse biofilm er curli amyloid fibre18 , der indeholder selv monterede csga-proteiner. Når manipuleret E. coli bakterier er induceret til at udtrykke csga proteiner, de danner en stabil model biofilm, der beskytter cellerne mod at blive vasket ud af trykning overflade. En sådan 3D trykt biofilm kan rummæssigt styres og kan tjene som et nyttigt forskningsværktøj til undersøgelse af multi skala biofilm struktur-funktion mekanik eller materiomics19. Disse skræddersyede biofilm vil støtte forståelsen af principperne for biofilm dannelse og deres mekaniske egenskaber, der muliggør yderligere forskning i mekanismerne for antibiotikaresistens blandt andre applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. omdannelse af en kommerciel 3D-printer til en 3D-bioprinter
- Fjern ekstruder og varmelegeme fra en kommerciel 3D-printer (Table of Materials) fra printerens ramme, og tag ledningen ud af disse elementer fra hoved kredsløbskortet (figur 1a). Da sensoren, der styrer printerens driftstemperatur, skal være funktionel til at kommunikere med printersoftwaren, skal den algoritme, der forsinker udskrivningen, indtil driftstemperaturen er nået, fjernes fra Udskrivningssoftwaren.
- Tilslut en pipettespids (200 μL spids) via silikone slange (indvendig diameter på 1 mm) til en 5 mL sprøjte, der er indlæst i en sprøjtepumpe. Monter pipettespidsen på 3D-printerens ekstruder hoved som erstatning for den oprindelige ekstruder (figur 1b).
- Hvis der anvendes mere end én type bio-Ink, monteres yderligere slangesystem (er) og pipettespids (r) på printeren.
2. substrat forberedelse til 3D-udskrivning
- Der tilsættes 4 mL 5 M CaCl2 opløsning til 400 ml 1% w/v agar opløst i Luria-bertani BOUILLON (lb) medium, suppleret med passende antibiotika og induktorer (her 34 μg/ml chloramphenicol og 0,5% rhamnose).
- 20 mL LB-agar-opløsningen dispenseres i hver 150 mm x 15 mm Petri skål. Tør 30 min ved stuetemperatur med låget halvt åbent.
Bemærk: protokollen kan sættes på pause her ved at opbevare disse udskrivnings substrater ved 4 °C i op til flere dage.
3. forberedelse af bio-Ink
- Der tilberedes en natriumalginat opløsning (3% w/v) og opvarmes til kogepunktet tre gange for at sterilisere opløsningen. Opbevares ved 4 °C, indtil det anvendes.
- Grow e. coli MG1655 Pro ΔcsgA ompR234 (E. coli δcsga) bakterier, der transporterer plasmider pSB1C3-grønt fluorescerende protein (gfp) (konstitutiv gfp-udtryk)2 eller PSB1C3-gfp-CSGA (konstitutiv gfp-udtryk, rhamnose-inducible csga ved 37 °C med omrystning ved 250 rpm i 50 mL LB-medium indeholdende 34 μg/mL chloramphenicol og 0,5% rhamnose.
- Centrifuger cellekulturen i 5 min ved 3.220 x g for at pille bakterierne. Fjern supernatanten.
- Bakterie pillen resuspenderes i 10 mL LB-substrat, og der tilsættes 10 mL natrium alginat (3% w/v).
4.3D-udskrivningsproces
- Installer og Åbn 3D-Udskrivningssoftwaren (tabellen med materialer) på en computer. 3D-printeren til computeren. Flyt skrivehovedet til sin startposition ved at klikke på knappen hjem for X-, Y-og Z-akserne.
- For hver udskrift anbringes et tilberedt tryk substrat på et bestemt sted på tryk sengen.
- Kalibrer højden af skrivehovedet i Z-aksen.
- Løft printhovedet til en højde af 22 mm under manuel kontrol, så det ikke kolliderer med kanten af Petri skålen, når du flytter til den ønskede position. Anbring printhovedet over toppen af pladen, og Flyt det ned, indtil pipettespidsen kontakter udskriftsoverfladen. Tildel denne Z-akse position som Z1 (højden af tryk overfladen).
- Hæv skrivehovedet, og Flyt det uden for plade området ved manuel kontrol i X-, Y-og Z-akser. Hvis arbejdsafstanden mellem skrivehovedet og plade overfladen er defineret som Z2, skal du indtaste Z1 + Z2 i Udskrivningsprogrammet som Z-værdi under udskrivningen.
- Program mere print form ved en selv-udviklet punkt-for-punkt koordinat-bestemt metode i henhold til den ønskede bane.
- Hvis den ønskede bane er en lige linje, skal du kun definere start-og slutpunkterne. Hvis du medtager yderligere punkter på buede streger, vil det resultere i jævnere kurver. Flyt skrivehovedet manuelt til hvert punkt sekventielt, og Registrer koordinaterne for disse punkter i rækkefølge. Indtast alle disse koordinater samt udskriftshastigheden for hvert trykt segment i G-kodeeditoren.
- Før og efter udskrivningen skal du løfte skrivehovedet til en afstand, der er højere end plade kanten (20 mm), og flytte direkte ud af plade området. Gem dette program som en G-kodefil og Indlæs direkte til brug i efterfølgende udskrifter, mens re-måle Z-aksen højde for hvert nyt trykbærende substrat.
Bemærk: Se tabel 1 for eksempel G-kode til udskrivning af en firkant. - Indlæs den forprogrammerede G-Code-fil. Åbn G-kodeeditoren i softwaren, og program i kommandoerne til udskrivning af den ønskede form. På hver kommandolinje kan positionen af skrivehovedet ændres i X-, Y-og/eller Z-aksen. Indtast Z-værdien under alle udskrivningstrin som Z1 + Z2 (højde på udskrivnings overfladen + arbejdsafstand).
Bemærk: den bevægelige hastighed er også justerbar; 9.000 mm/min er en passende værdi for typiske udskrivningshastigheder. - Læg væsken bio-Ink i sprøjten (e), og monter dem i sprøjtepumpen (-erne) i 3D-bioprinter.
- Udskriv bioblækket på udskrivnings substratet ved at klikke på knappen Udskriv .
- Under udskrivningen skal du kontrollere printhovedet-bevægelsen udelukkende af softwaren. Start sprøjtepumpen manuelt, før skrivehovedet kommer i kontakt med tryk overfladen.
Bemærk: koordineringen af sprøjtepumpen og printeren bestemmes empirisk afhængigt af ekstruderinghastigheden, den hastighed, som printhovedet bevæger sig til det første udskrivnings punkt, og den oprindelige placering af skrivehovedet. Hvis den første stilling på skrivehovedet er 20 mm, med en printhastighed på 9.000 mm/min og en ekstruderingsehastighed på 0,1 mL/t, skal sprøjtepumpen startes umiddelbart efter, at udskrivningen er startet. Hvis ekstruderinghastigheden ændres fra 0,1 mL/h til 0,3 mL/t, skal du vente 2 − 3 s for at starte sprøjtepumpen, når udskrivningen er startet. - Stop sprøjtepumpen, så snart skrivehovedet ankommer til det sidste punkt i udskrivningen. Stop sprøjtepumpen, før skrivehovedet løftes op ved afslutningen af udskrivningsprocessen, ellers vil overskydende bio-Ink falde på tryk substratet og reducere udskrivningsopløsningen.
- Til opførelse af 3D-strukturer, kontrollere alle bevægelser af skrivehovedet i G-Kodeeditor. Indtast udskrivnings højden for det første lag. Forøg Z-værdien i G-koden med 0,2 millimeter for det andet lag for at øge udskrivnings højden. Øg derefter Z-værdien med 0,1 millimeter, når du flytter til et højere lag. Undlad at flytte pladen under udskrivningsprocessen.
- For at måle bredden og højden af den trykte hydrogel skal du bruge en stål lineal, der er placeret under eller ved siden af prøven.
5. dyrkning og afprøvning af effektiviteten af biofilm produktion ved E. coli
- De udskrevne prøver inkupereres ved stuetemperatur i 3 − 6 dage for at tillade produktion af biofilm komponenter (curli fibre). Billede pladerne ved hjælp af et kamera eller fluorescerende scanner.
- For at opløse alginatmatrixen tilsættes 20 mL 0,5 M natriumcitratopløsning (pH = 7 justeret med NaOH) til tryk substraterne, og der inkueres i 2 timer med 30 omdr. omrystning ved stuetemperatur. Kassér væsken og billede pladerne igen for at sammenligne med billederne af pladerne før citrat behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det første skridt for vellykket 3D-udskrivning af biofilm er at konvertere en kommerciel 3D-printer til en bioprinter. Denne konvertering opnås ved at fjerne den ekstruder og varmelegeme af printeren, der er designet til udskrivning med en polymere blæk, og erstatte disse med komponenter egnet til trykning bio-blæk, der indeholder levende bakterier (figur 1a). Ekstruderen erstattes af en pipettespids (eller spidser, hvis der vil blive anvendt flere bio-blæk i udskrivningsprocessen), der er fastgjort til et slangesystem, der er forbundet med en sprøjtepumpe (figur 1b). En vellykket omdannelse af trykkeriet til en bioprinter kan vurderes ud fra muligheden for at overføre ønskede bio-blæk (er) fra sprøjtepumpen gennem slangesystemet og pipettespidsen (e) på en Trykflade uden at lække eller opvarme Bio-blæk. Hvis slangen buler på grund af strømmen af bio-blæk under udskrivning, kan det erstattes af slanger med tykkere vægge. Det skal bemærkes, at denne trykning teknik bør være i stand til at arbejde med enhver form for kommerciel 3D-printer, som slanger kan fastgøres til skrivehovedet.
3D bioprinter kan skabe bakterier-indkapstende silicagelrogeler i en række to-dimensionelle (2D) og 3D-former (figur 2). Calciumioner i tryk substratet inducerer solidificering (chelering af calciumioner med alginat carboxylgrupper) af bio-blækket ved trykning, omdannelse af flydende bio-blæk til en massiv hydrogel. Opløsningen af bioprinting vil afhænge af ekstruderinghastigheden, størrelsen af pipettespidsen, hastigheden af printhovedet, volumen og koncentration af CaCl2 -opløsning tilsat til agar-opløsningen, fladhed af tryk overfladen og viskositeten af anvendte bio-blæk. Koncentrationen af CaCl2 opløsning har stor indflydelse på hydrogel skarphed. Der blev udtaget fire forskellige koncentrationer af CaCl2 (0,1 m, 0,2 m, 1 m og 5 m), og kun 5 m CaCl2 -opløsning resulterede i hydrogel, som ikke blev sløret efter udskrivningen. Derfor blev 5 M valgt som den optimale koncentration af CaCl2 opløsning.
I en tidligere version af denne protokol blev CaCl2 -opløsningen påført på overfladen af agar-pladen i stedet for blandet i agar-opløsningen, før agar-pladen hældes. Når du bruger denne version, volumen af CaCl2 løsning har en kritisk indflydelse på trykning kvalitet og opløsning. Ved brug af en 150 x 15 mm petriskål medfører anvendelse af en mængde calciumchloridopløsning på mere end 100 μL (eller 30 μL for en 90 mm petriskål), at der er for meget væske tilbage på tryk overfladen. Denne væske kan spredes ujævnt, når pladen flyttes, hvilket kan ændre arbejdsafstanden og forårsage blokering af pipettespidsen. For meget volumen af CaCl2 kan også forårsage trykte silicagelrogeler at flyde og glide på tværs af opløsningen, ændre formen og placeringen af den trykte hydrogel. Hvis mængden af calciumklorid opløsning er for lille, kan nogle områder af pladen ikke modtage CaCl2 opløsning og vil have dårlig hydrogel solidificering. I denne forbedrede protokol resulterede tilsætning af CaCl2 -opløsningen direkte i agar-opløsningen, før agar-pladen blev hældt, i betydeligt mindre fugt på overfladen af tryk substratet sammenlignet med den overflade anvendte metode, hvilket resulterede i dramatisk forbedret udskrivning opløsning.
Ekstruderinghastigheden og printhovedet er indbyrdes afhængige og kan justeres på en koordineret måde for at ændre udskrivningsopløsningen. For eksempel, hvis printeren drives med ekstruderinghastighed mellem 0,1 ml/h og 0,5 ml/h med en konstant printhovedets bevægelseshastighed på 300 mm/min, øges diameteren af den trykte hydrogel med stigningen af ekstruderinghastighed2,20. Ved ekstruderinghastigheder over 0,5 mL/h ændres de udvendige kanter på de udskrevne linjer af hydrogel fra lige parallelle linjer til bølgede linjer, og linjebredden øges også. Hastigheden af printhovedet har også indflydelse på udskrivningsopløsningen. Med en konstant ekstruderinghastighed på 0,3 mL/t øges hastigheden af skrivehovedet fra 300 mm/min til 500 mm/min. i bredden af den trykte hydrogel bliver smallere, faldende fra 1,8 mm til 0,9 mm. Hvis den bevægelige hastighed på skrivehovedet er over 500 mm/min, vil gellinien let blive diskontinuerlig. For en 200 μL pipettespids og den bio-blæk, der anvendes i det aktuelle studie, anses flere kombinationer af udskrivningsopløsningen for at være optimale (tabel 2). Ved pumpehastighed 0,3 mL/t, printhastighed 500 mm/min, og arbejdsafstand 0,2 mm, trykt hydrogel er produceret med en bredde på ca. 0,9 mm.
En afgørende præstation af bakteriel 3D print metode er dens evne til at skabe konstruerede biofilms. For at skabe en manipuleret og rumligt-kontrolleret biofilm, bør bakterierne ikke kun overleve 3D-udskrivningsprocessen, men bør også producere biofilm komponenter, mens de forbliver inden for det trykte mønster. De konstruerede e. coli bakterier, der anvendes i denne protokol, e. coli δcsga bakterier transporterer PLASMID pSB1C3-gfp-csga, muliggør kontrollerbar udtryk for curli proteiner. Brugen af csga-knockout-stammen sikrer, at csga-proteinet kun udtrykkes, når det induceres fra et plasmid med rhamnose. Bakterierne eksporterer de inducerede CsgA-protein-under enheder, som derefter selv samler21 på CSGB-proteiner på den bakterielle ydre membran22 for at danne curli-fibre. Disse amyloid-lignende fibre er de vigtigste proteinholdige komponenter i biofilm ekstracellulære matrix: et tilsluttet netværk af proteiner og polymerer, hvor bakterierne er indlejret. Den trykte alginat matrix af 3D-printing bio-Ink giver fysisk støtte og struktur til bakterierne under curli fremstillingsprocessen. Brugen af konstitutiv GFP udtryk giver mulighed for visualisering og kvantificering af trykte celler via fluorescens Imaging.
For at vurdere, om dannelsen af biofilm var vellykket, blev alginatmatrixen opløst ved hjælp af en natriumcitrat opløsning, og formen på den trykte bio-Ink blev vurderet efter citrat behandlingen (figur 3). I tilfælde af bio-Ink uden inducerbar curli produktion plasmid, det trykte mønster blev fuldstændig opløst efter natriumcitrat behandling, hvilket betyder, at ingen biofilm curli netværk havde dannet (figur 3a, B). I tilfælde af bakterier, der indeholder den inducerbare curli Production plasmid, blev gelen ikke opløst efter behandling med natriumcitrat (figur 3c, D). Dette resultat indikerer, at de trykte bakterier var i stand til at danne et curli netværk omfattende nok til at stabilisere det trykte mønster af bakterier2.
For at konstruere strukturer med flere lag blev der udskrevet ekstra lag (figur 4) ved at justere udskrifts højden og udskrifts forløbet i G-kodeeditoren. En forøgelse af antallet af udskrevne lag i en stikprøve medførte, at bredden og højden af de udskrevne strukturer steg trinvist (figur 5)2,20, men selv 5-lags trykte strukturer kunne oprettes med en opløsning af millimeter til sub-millimeter. Da e. coli konstrueret til inducibelt fremstilling af curli-proteiner blev trykt i flerlags strukturer, opløse behandlingen af natriumcitrat ikke prøverne, hvorimod flerlags konstruktioner, der indeholdt ikke-curli-producerende E. coli , var opløst i natriumcitrat opløsning (figur 6). Dette eksperiment viser, at konstruerede biofilm kan laves i flerlags, tredimensionale trykte strukturer, såvel som i enkeltlags trykte strukturer.
Figur 1: billeder, der viser omdannelsen af en kommerciel 3D-printer til en 3D-bioprinter. (A) komponenterne i 3D-bioprinter efter konvertering fra en kommerciel 3D-printer. B) ekstruder af bio-blæk, der dannes af et slangesystem, der er fastgjort til en pipettespids. Yderligere print tips kan tilføjes i det andet printhovedet hul eller ved at tilføje yderligere huller til printhovedet, til brug i udskrivning af flere typer af bio-blæk. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: eksempler på 3D-bioprinted-mønstre, der indeholder E. coli pSB1C3-Gfp-csga. Disse billeder blev taget to dage efter udskrivningen. Denne udskrivningsopløsning blev opnået med pumpehastighed 0,3 mL/h, printhovedet bevægelseshastighed 300 mm/min, og arbejdsafstand 0,2 mm. G-koderne til udskrivning af disse figurer kan findes i de supplerende filer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: en metode til kontrol af, om biofilm komponenter er fremstillet af E. coli -bakterier inden for et trykt mønster. Ved trykt E. coli indeholdt en plasmid, der ikke indkode til curli induktion, blev det trykte mønster helt opløst ved natriumcitrat behandling (a og B). Da der blev anvendt E. coli indeholdende et plasmid-kodnings-inducerbart curli-protein, var den trykte biofilm resistent over for natriumcitrat behandling (C og D). Programmeringsprocessen og forklaringerne til G-koden til udskrivning af dette firkantede mønster findes i tabel 1. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: øverste visning (A) og sidevisning (B) af flerlags trykte strukturer, der indeholder E. coli pSB1C3-Gfp-csga. Denne prøve blev trykt med pumpehastighed 0,3 mL/h, printhovedet bevægelseshastighed 200 mm/min, og arbejdsafstand 0,2 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: linjebredde og-højde for trykte hydrogeler, der indeholder forskellige antal udskrevne lag. Målingerne blev udført på prøver trykt med pumpehastighed 0,3 mL/t, tryk hastighed 500 mm/min., og arbejdsafstand 0,2 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: en metode til kontrol af, om biofilm komponenter er fremstillet af E. coli -bakterier i flerlags trykte strukturer. Fremstillet E. coli blev trykt i 1-, 3-eller 5-lags silicagelrogeler og inkueret i 6 dage. Når den trykte E. coli indeholdt en plasmid, der ikke indkode til curli induktion, blev det trykte mønster helt opløst ved natriumcitrat behandling (a og B). Når den trykte E. coli indeholdt en plasmid kodning inducerbare curli proteiner, den trykte biofilm var resistent over for natriumcitrat behandling (C og D). Klik her for at se en større version af dette tal.
| G-kode-kommandoer | Opgaver |
| G1 Z20 F9000 | Løft Z-aksen til en højde på 20 mm med en 9.000 mm/min bevægelseshastighed. |
| G1 X95 Y65 F9000 | Flyt til startpunktet for den første linje med en 9.000 mm/min bevægelseshastighed. |
| G1 Z6 F9000 | Flyt nedad i Z-retningen til en korrekt (her Z = 6 mm) udskrivnings afstand. |
| G1 X95 Y105 F300 | Slutpunktet for den første linje og startpunktet for den anden linje. |
| G1 X135 Y105 | Slutpunktet for den anden linje og udgangspunktet for den tredje linje. |
| G1 X135 Y65 | Slutpunkt for tredje linje og udgangspunkt for den fjerde linje. |
| G1 X95 Y65 | Slutpunkt for den fjerde linje og udgangspunktet for den første linje; der dannes en firkant. |
| G1 Z20 F9000 | Z-aksen løftes til en højde af 20 mm ved 9.000 mm/min. |
| G1 X55 Y40 F9000 | Flyt til en koordinat (55, 40) uden for Petri skålen rækkevidde. |
Tabel 1: programmeringsproces og forklaringer på G-kode til udskrivning af et kvadrat.
| Ekstruderinghastighed (mL/h) | Printhovedet bevægelige hastighed (mm/min) | Gel bredde (mm) |
| 0,1 af | 100 af | 1,6 ± 0,1 |
| 0,1 af | 200 af | 1,1 ± 0,1 |
| 0,1 af | 300 af | 1,0 ± 0,1 |
| 0,3 af | 300 af | 1,8 ± 0,1 |
| 0,3 af | 400 af | 1,2 ± 0,1 |
| 0,3 af | 500 af | 0,9 ± 0,1 |
| 0,5 af | 200 af | 2,2 ± 0,2 |
| 0,5 af | 1.200 af | 1,2 ± 0,2 |
| 0,7 af | 200 af | 2,8 ± 0,1 |
| 0,7 af | 1.200 af | 1,3 ± 0,1 |
Tabel 2: de optimale udskrivningsparametre for silicagelrogeler med høj opløsning. Fem point blev målt for hver betingelse. Gennemsnitsværdien og standardafvigelsen vises i tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den protokol, der her præsenteres for 3D-printning af konstruerede biofilm, har to kritiske trin. Først er forberedelsen af agar trykning overflade, som er den mest kritiske faktor til at producere en bestemt trykning opløsning. Det er vigtigt at sikre, at tryk overfladen er flad, og at pipettespidsen på skrivehovedet er placeret i den korrekte højde fra overfladen. Hvis overfladen ikke er flad, vil arbejds distancen ændre under udskrivningsprocessen. Hvis arbejdsafstanden er mindre end 0,1 mm, kan CaCl2 -opløsningen trænge ind i pipettespidsen og forårsage hydrogel dannelse, hvilket får pipettespidsen til at blive tilstoppet. Hvis arbejdsafstanden er mere end 0,3 mm, kan gelen ikke trykkes kontinuerligt. Den optimale arbejdsafstand i denne undersøgelse er 0,2 mm. gode tilgange til at forberede flade agar trykning overflader er at bruge større diameter petriskåle (150-mm-diameter petriskål snarere end en 90-mm-diameter plade), placere pladerne på et fladt bord, hæld agar opløsning med hurtig og jævn hastighed, og undgå at flytte agar-pladen under størkning.
Det andet kritiske trin er udvælgelsen af de ønskede udskrivningsparametre, herunder pumpehastigheden, viskositeten af den anvendte bio-Ink og printhovedet hastighed, som afgør den resulterende udskrivningsopløsning. For at vælge disse parametre på en effektiv måde, kan brugeren prøve flere ekstreme værdier for printhovedet hastighed med en konstant ekstrudering sats, der noterer bredden af den trykte hydrogel for hvert sæt af betingelser. Gentag derefter dette eksperiment med 4 andre ekstruderingstal. Derefter skal du tage de fem kombinationer, der har produceret den bedste udskriftsopløsning til programmet, og variere både udskrivnings parametrene (pumpe-og printhastighed) i mindre og mindre trin, indtil den ønskede opløsning er opnået.
Tykkelsen af de trykte linjer har en indvirkning på de trykte manipulerede bakteriers evne til at danne stabile biofilm. Under optimale udskrivnings forhold (pumpehastighed 0,3 mL/t, printhastighed 300 mm/min. og arbejdsafstand 0,2 mm) vil trykte linjer med bio-Ink producere stabile biofilm efter 3-6 dages inkubation ved stuetemperatur. Hvis linjerne bliver tykkere, såsom ved at øge pumpehastigheden, kan de midterste regioner i hver linje ikke induceres tilstrækkeligt til at producere citrat-stabile biofilm.
Ved udskrivning af en multilags bio-Ink-hydrogel størkner hvert trykt lag ved kontakt med de calciumioner, der er spredt ind i det tidligere trykte lag. Da ca2 + koncentrationen i tryk substratet er høj, kan ca2 + ioner hurtigt spredes op gennem de lavere lag. Derfor kan de øverste lag udskrives umiddelbart efter, at de tidligere lag er blevet udskrevet, blot ved at justere udskrifts højden i G-kodeeditoren. Desuden bør udskrivnings afstanden for det øverste lag være begrænset til kun 0,1 − 0,2 mm højere end det foregående lags udskrivnings afstand. Hvis den tilføjede udskrivnings afstand er mindre end 0,1 mm, vil spidsen trække hen over det første lag og reducere opløsningen af den trykte hydrogel. Hvis den tilføjede udskrivnings afstand er større end 0,2 mm, vil bio-blækket danne dråber væske under ekstrudering, hvilket får den trykte hydrogel til at blive diskontinuerlig.
Den nuværende bioprinting tilgang gør det muligt at producere reproducerbare, rumligt styrede biofilm, egnet til brug i studiet af biofilm mekaniske egenskaber eller biologisk resistens af biofilm bakterier til forskellige faktorer, herunder antibiotika, overfladeaktive stoffer osv. Denne funktion sikrer en direkte anvendelighed af den foreslåede metode. Udvikling af højere præcision gør-det-selv (DIY) bioprinterne vil sandsynligvis være muligt ved at opretholde trykning arbejdsafstand, men sænke pumpehastigheden og bevægelige hastighed af printhovedet, eller ved at udtage prøver forskellige ekstruder geometrier og Bio-Ink kemi. Med fremtidige forbedringer af udskrivningsopløsningen kan yderligere programmer aktiveres, såsom vævs-eller lægemiddel levering. Den 3D-bioprinting-tilgang, der beskrives her, bør også kunne udvides til at udskrive yderligere typer af bakteriearter, der er biokompatible med vores alginat-baserede bio-Ink. Den nuværende protokol giver tilstrækkelig sterilitet ved gentagne gange at koge bioblækket under tilberedningen, ved hjælp af sterile sprøjter og udskrivnings tips og ved at anvende antibiotika i både bio-blæk og trykplade. Fremtidige eksperimenter med vildtype-bakterier kan kræve yderligere steriliserings foranstaltninger såsom udskiftning eller desinficering af slangesystemet mellem udskrifter.
Til forfatternes bedste viden, den præsenterede metode (oprindeligt udviklet i Lehner et al.20) er det første udgivne eksempel på en additiv fremstilling stil til 3D-udskrivning af bakterier. I den første del af denne protokol, er denne generelle metode beskrevet i detaljer for 3D-printning af bakterier, som anvendes til produktion af konstruerede biofilm2. Flere fremtidige anvendelser af 3D-trykte biofilm er muligt ved hjælp af denne metode. I naturen har flere bakterielle systemer udviklet sig, der skaber forskellige typer af biofilm, hvoraf i denne artikel et enkelt system blev udforsket. Flere andre systemer kan let undersøges ved at skabe 3D-trykte biofilm med andre bakterielle systemer, såsom Bacillus subtilis eller Acetobacter xylinum. Alternative metoder23,24 er også blevet udviklet til rumlige mønster af bakterier ved høj opløsning ved hjælp af optiske signaler. Disse tilgange kræver dyrere, kompliceret udstyr til at opnå dem i forhold til denne printer, og er kun egnet til mønter af genetisk manipulerede bakterier.
Evnen til rumligt mønster 3D-trykte biofilm med denne metode kan gøre det muligt at skabe fremstillet biofilm, der gengiver den rumlige heterogenitet af naturlig biofilm25. På grund af den meget detaljerede arrangement af protein og polymere fibre i en biofilm, at bakterier i en biofilm tilstand opnå en langt højere modstandsdygtighed over for kemiske og fysiske stimuli, såsom en øget resistens over for antibiotika i forhold til den samme bakterier i en plankton tilstand. Desuden udviser bakterier i en biofilm en øget modstandsdygtighed over for væske strømme, hvilket gør vedligeholdelsen og steriliteten af implantable medicinske anordninger langt vanskeligere26. Trykte biofilm, der forsøger at reproducere de specifikke rumlige distributioner af biofilm komponenter er effektive værktøjer til at studere de mekanismer, som bakterier i en biofilm opnå resistens fænotyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af et AOARD-tilskud (nr. FA2386-18-1-4059), den nederlandske organisation for videnskabelig forskning (NWO/OCW) som en del af grænserne for Nanoscience-programmet, og Advanced Materials NWO-NSFC-programmet (nr. 729.001.016). Forfatterne anerkender den laboratorie hjælp, som Ramon van der Valk og Roland Kieffer har.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printer | CoLiDo | 3D-P Kit | |
| 3D printing software | CoLiDo | Print-Rite ColiDo Repetier-Host v2.0.1 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 05040 | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | 3886.1 | |
| LB broth powder | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-092 | Model 3500 |
| Petri dish | VWR | 25384-326 | 150 x 15 mm |
| Rhamnose | Sigma-Aldrich | 83650 | |
| Silicon tubing | VWR | DENE 3100103/25 | |
| Syringe pump | ProSense B.V. | NE-300 | |
| Sodium alginate | Sigma-Aldrich | W201502 | |
| Sodium citrate monobasic | Sigma-Aldrich | 71498 | |
| Sodium hydrooxide | VWR | 28244.295 |
References
- Tibbitt, M. W., Rodell, C. B., Burdick, J. A., Anseth, K. S. Progress in material design for biomedical applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (47), 14444-14451 (2015).
- Schmieden, D. T., et al. Printing of Patterned, Engineered E. coli Biofilms with a Low-Cost 3D Printer. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1328-1337 (2018).
- Mao, L. B., et al. Synthetic nacre by predesigned matrix-directed mineralization. Science. 354 (6308), 107-110 (2016).
- Gao, H. L., et al. Mass production of bulk artificial nacre with excellent mechanical properties. Nature Communications. 8 (1), 287 (2017).
- Poirier, Y., Nawrath, C., Somerville, C. Production of Polyhydroxyalkanoates, a Family of Biodegradable Plastics and Elastomers, in Bacteria and Plants. Nature Biotechnology. 13, 142-150 (1995).
- Choi, S. Y., et al. One-step fermentative production of poly(lactate-co-glycolate) from carbohydrates in Escherichia coli. Nature Biotechnology. 34 (4), 435-440 (2016).
- Mohammadi, P., Toivonen, M. S., Ikkala, O., Wagermaier, W., Linder, M. B. Aligning cellulose nanofibril dispersions for tougher fibers. Scientific Reports. 7 (1), 11860 (2017).
- Jonkers, H. M. Bacteria-based self-healing concrete. Heron. 56 (1/2), (2011).
- Schmieden, D. T., Meyer, A. S., Aubin-Tam, M. E. Using bacteria to make improved, nacre-inspired materials. MRS Advances. 1 (8), 559-564 (2016).
- Zhong, C., et al. Strong underwater adhesives made by self-assembling multi-protein nanofibres. Nature Nanotechnology. 9 (10), 858-866 (2014).
- Chen, A. Y., et al. Synthesis and patterning of tunable multiscale materials with engineered cells. Nature Materials. 13 (5), 515-523 (2014).
- Gatenholm, P., Klemm, D. Bacterial Nanocellulose as a Renewable Material for Biomedical Applications. MRS Bulletin. 35, 208-213 (2010).
- Rodriguez-Carmona, E., Villaverde, A. Nanostructured bacterial materials for innovative medicines. Trends in Microbiology. 18 (9), 423-430 (2010).
- Hung, C., et al. Escherichia coli biofilms have an organized and complex extracellular matrix structure. MBio. 4 (5), (2013).
- Donlan, R. M., Costerton, J. W. Biofilms: Survival Mechanisms of Clinically Relevant Microorganisms. Clinical Microbiology Reviews. 15 (2), 167-193 (2002).
- Wu, H., Moser, C., Wang, H. Z., Hoiby, N., Song, Z. J. Strategies for combating bacterial biofilm infections. International Journal of Oral Science. 7 (1), 1-7 (2015).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).
- Kikuchi, T., Mizunoe, Y., Takade, A., Naito, S., Yoshida, S. Curli Fibers Are Required for Development of Biofilm Architecture in Escherichia coli K-12 and Enhance Bacterial Adherence to Human Uroepithelial Cells. Microbiology and Immunology. 49 (9), 875-884 (2005).
- Cranford, S., Buehler, M. J. Materiomics: biological protein materials, from nano to macro. Nanotechnology, Science and Applications. 3, 127-148 (2010).
- Lehner, B. A. E., Schmieden, D. T., Meyer, A. S. A Straightforward Approach for 3D Bacterial Printing. ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1124-1130 (2017).
- Wang, X., Smith, D. R., Jones, J. W., Chapman, M. R. In vitro polymerization of a functional Escherichia coli amyloid protein. Journal of Biological Chemistry. 282 (6), 3713-3719 (2007).
- Hammar, M., Bian, Z., Normark, S. Nucleator-dependent intercellular assembly of adhesive curli organelles in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (13), 6562-6566 (1996).
- Huang, Y. J., Xia, A. G., Yang, G., Jin, F. Bioprinting Living Biofilms through Optogenetic Manipulation. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1195-1200 (2018).
- Jin, X. F., Riedel-Kruse, I. H. Biofilm Lithography enables high-resolution cell patterning via optogenetic adhesin expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (14), 3698-3703 (2018).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).
- Percival, S. L., Suleman, L., Vuotto, C., Donelli, G. Healthcare-associated infections, medical devices and biofilms: risk, tolerance and control. Journal of Medical Microbiology. 64, 323-334 (2015).
