Summary
מאמר זה מתאר שיטה להפיכת מדפסת תלת-ממד מסחרית בעלות נמוכה למדפסת תלת-ממדית חיידקית, היכולה להקל על הדפסה של מאפייני בדוגמת מילוי. כל ההיבטים הנחוצים של הכנת הביופלקטר והביו-דיו מתוארים, כמו גם שיטות אימות להערכת היווצרות ביואילאמים.
Abstract
ביוילאמים הם אגרגטים של חיידקים מוטבע בתוך מטריצה המיוצר בתבנית spatially-בדוגמת. חיידקים בתוך ביוilm לפתח עמידות לאנטיביוטיקה משופרת, אשר מהווה סכנות בריאותיות פוטנציאליות, אבל יכול גם להועיל ליישומים סביבתיים כגון טיהור של מי שתייה. ההתפתחות הנוספת של הtherapeutics אנטי בקטריאלי ויישומים השראה ביוilm ידרוש התפתחות של שיטות הנדסה, מהנדסים ליצירת ביוגרפיות. לאחרונה, התפתחה שיטה מקורית של הכנת ביוilm באמצעות מדפסת תלת-ממדית ששונתה (3D) עם דיו חיידקי. מאמר זה מתאר את השלבים הנחוצים לבניית הביוקטר היעיל והחסכוני הזה המציע מספר יישומים בעיבוד חומרים המושרה על ידי bacterially. הפרוטוקול מתחיל עם מדפסת תלת-ממד מותאם מותאמת מסחרית שבה החליף את הבלטת ממד עם מתקן ביו דיו המחובר למערכת משאבת מזרק המאפשרת זרימה מתמשכת ורציפה של ביו-דיו. לפיתוח ביו-דיו המתאים להדפסת ביוilm, בקטריה מהונדסים של חיידק האנציכיה הושעו בתמיסה של alginate, כך שהם לגבש במגע עם משטח המכיל סידן. הכללת כימיה מודפסת בתוך מצע ההדפסה כוננים ביטוי של חלבונים ביוilm בתוך הביו-דיו המודפס. שיטה זו מאפשרת הדפסה תלת ממדית של תבניות מרחבית שונות המורכבות משכבות בדידים של ביואמים מודפסים. כגון מערכות מבוקרת מסוג זה יכול לשמש כמערכות מודל והוא יכול למצוא יישומים בתחומים מרובים שיש להם השפעה רחבה על החברה, כולל מניעת עמידות לאנטיביוטיקה או שתיית מים לטיהור, בין היתר.
Introduction
כיום קיים צורך הולך וגובר לפיתוח פתרונות ידידותיים לסביבה, לייצור חומרים בדוגמת spatially, בשל הרחבת מספר השווקים לחומרים מסוג1. מאמר זה מציג באופן פשוט, שיטה חסכונית לייצור חומרים כאלה ולכן מציע ספקטרום גדול של יישומים עתידיים. השיטה המוצגת כאן מאפשרת תלת מימדי (3D) הדפסה של מבנים בדוגמת spatially באמצעות הביו-דיו המכיל חיידקים חיים. החיידק נשאר בר קיימא בתוך המבנים המודפסים במשך שבוע, ומאפשר לחיידק לבצע פעילויות מטבוליות טבעיות או מהונדסים. חיידקים מודפסים יכולים ובכך לייצר ולהפקיד את הרכיבים הרצויים בתוך המבנה המודפס, לדוגמה יצירת ביוilm מקושרות פונקציונלי2.
שיטות מסורתיות לייצור חומרים מתקדמים כוללות הוצאות אנרגיה גבוהה (למשל, טמפרטורות גבוהות ו/או לחצים) והוא יכול לייצר כמויות גדולות של פסולת כימית, לעתים קרובות חומרים רעילים הדורשים הוצאות מקיפות3 ,4. לעומת זאת, מינים חיידקיים רבים מסוגלים לייצר חומרים שניתן ליישום בקלות בתעשיות שונות. חומרים אלה כוללים פולימרים כגון פוליהידרוקסילאנוטים (PHA)5 או פולי (גליקולדה-co-lactide)6, בקטריות תאית7, חומרי בטון חיידקיים8, מרוכבים ביוציתים9, דבקים מבוססי עמילואיד10, או מתגי חשמל ביו מבוססי11, בין היתר. יתר על כן, ייצור חיידקי של חומרים יקרי ערך מתרחש בדרך כלל בטמפרטורות הסביבה הקרובה ולחצים ובסביבות מימית, ללא צורך או לייצר תרכובות רעילות. בזמן הפקת חומרים עם חיידקים כבר הפגינו בספרות וכמה יישומים תעשייתיים כבר התפתחה12,13, שיטה אמינה עבור הקפדה מרחבית של חומרים כאלה נשאר אתגר.
מאמר זה מדגים שיטה הישר קדימה להמרת מדפסת תלת-ממד מסחרית בעלות נמוכה למדפסת בקטריאלי תלת-ממדית. הפרוטוקול מראה כיצד להכין את הביו-דיו המכיל ולקיים את החיידק החי, כמו גם כיצד להכין מצעים שעליהם ניתן לבצע את ההדפסה התלת-ממדית. שיטה זו מתאימה לשימוש עם מגוון זנים חיידקיים טבעיים ומהונדסים מסוגל לייצר חומרים. חיידקים אלה יכולים להיות מופץ מרחב בתוך מבנה מודפס 3d ועדיין להמשיך את פעילות חילוף החומרים שלהם, אשר תגרום התפלגות מרחבית של החומרים הרצוי המיוצר על ידי החיידק.
שיטת הדפסה זו מאפשרת ליצור מוספים של ביואמים, אגרגטים של חיידקים המוקפים במטריצה בעלת הפקה עצמית. ביואמים הם רשתות תלת-ממד הטרוגנית שבהן חלבונים, פולימרים, תאי בקטריאלי, חמצן וחומרים מזינים כולם מובנים ביותר14. בעוד בצורת ביוilm, החיידק מפגין עמידות לאנטיביוטיקה מוגברת וחוסן מבניים, מה שמקשה למגר ממשטחים כולל קטטרים ושתלים רפואיים. המפתח למאפייני ביוilm, וגם האתגר הגדול ביותר לחקר ביוilm, נראה כטרוגניות של ביוילאמים15,16,17. ייצור ביואילאמים של מודל מבוקר בשליטה מיוחדת הוא עניין מיוחד כפי שאפשר להתרבות או לכוונן את הדפוסים המרחביים של רכיבי הבייוilm, ולסייע להבנת התצהיר היציב של הביואמים כמעט בכל משטח ב טבע.
מאמר זה מציג שיטה לייצור ביויואמים באמצעות הידרו-מודפסים תלת-ממדיים המכילים חיידקים מהונדסים של E. coli המייצרים חלבונים של ביוilm בנוכחות סליל, כמו גם שיטות אימות של היווצרות ביוilm2 . מרכיבי מטריקס העיקריים של מטריצות של ביואמים אלה הם סיבי עמילואיד בסיבים18 המכילים חלבונים csga עצמית התאספו. כאשר מתוכננים חיידקים E. coli המושרה כדי לבטא חלבונים csga, הם יוצרים מודל יציב ביוilm המגן על התאים מפני שטף של משטח ההדפסה. כגון מודפס 3D המבנה יכול להיות נשלט על ידי שליטה והוא יכול לשמש כלי מחקר שימושי לחקירת מכניקה מבנה בקנה מידה רב של מבנים התפקוד או החומריות19. ביואמים אלה יסייעו להבנת עקרונות היווצרות הביוונים ותכונותיו המכאניות, המאפשרות מחקר נוסף למנגנונים של עמידות לאנטיביוטיקה בין יישומים אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. המרה של מדפסת תלת-ממדית מסחרית לביורימטר תלת-ממדי
- הסר את הבלטת ממד ואת החימום של מדפסת תלת-ממדית מסחרית (טבלת חומרים) ממסגרת המדפסת, ונתק את החיווט השולט ברכיבים אלה מלוח המעגלים הראשי (איור 1a). מאחר שהחיישן השולט בטמפרטורה התפעולית של המדפסת צריך להיות פונקציונלי לקיים תקשורת עם תוכנת המדפסת, הסר מתוכנת ההדפסה את האלגוריתם העכב את ההדפסה עד שתגיע לטמפרטורה המבצעית.
- לחבר טיפ פיפטה (200 μL) באמצעות אבובים סיליקון (קוטר פנימי של 1 מ"מ) ל-5 מזרק mL שנטען למשאבת מזרק. הקצה את עצת הפיפטה על הראש של מדפסת תלת-ממדית כתחליף לדגם1Bהמקורי.
- אם נעשה שימוש ביותר מסוג אחד של דיו ביולוגי, יש לטעון מערכות אבובים נוספות וקצות פיפטה למדפסת.
2. הכנת מצע להדפסת תלת מימד
- הוסף 4 מ ל של 5 M CaCl2 פתרון ל 400 mL של 1% w/v אגר מומס לוריא ברטני ציר (LB) בינונית, בתוספת עם אנטיביוטיקה המתאים השראות (כאן 34 μg/mL כלוראמנקול ו 0.5% rhamnose).
- לחלק 20 מ ל של הפתרון LB-אגר לתוך כל 150 mm x 15 מ"מ צלחת פטרי. יבש 30 דקות בטמפרטורת החדר עם המכסה חצי פתוח.
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול באמצעות אחסון מצעים אלה ב -4 ° c עד מספר ימים.
3. הכנה לביו-דיו
- להכין תמיסת נתרן קילוף פלסטיצידיות (3% w/v), וחום לנקודת רתיחה שלוש פעמים כדי לחטא את הפתרון. החנות ב-4 ° צ' עד לשימוש.
- לגדול E. COLI MG1655 PRO ΔcsgA ompR234 (e. coli ΔcsgA) חיידקים נושאים פלמידים pSB1C3-ירוק פלורסנט (gfp) (הביטוי gfp)2 או PSB1C3-gfp-csga (קונסטיטוטיב ביטוי gfp, Rhamnose-inducible csga ביטוי) לילה ב 37 ° צ' עם טלטול ב 250 סל ד ב 50 mL של LB בינונית המכילה 34 μg/mL כלוראמנול ו 0.5% rhamnose.
- צנטריפוגה את תרבות התא עבור 5 דקות ב 3,220 x g כדי גלולה החיידקים. . הסר את הסופרנטאנט
- מחדש להשעות את הגלולה בקטריה 10 מ ל של LB בינונית ולהוסיף 10 מ ל של נתרן קילוף פלסטיצידיות (3% w/v).
4. תהליך הדפסה תלת-ממדי
- התקן ופתח את תוכנת ההדפסה התלת-ממדית (טבלת חומרים) במחשב. חבר את המדפסת התלת-ממדית למחשב. הזז את ראש ההדפסה למיקומה הביתי על-ידי לחיצה על לחצן הבית עבור הצירים X, Y ו-Z.
- עבור כל הדפסה, הצב מצע הדפסה מוכן על מיקום מסוים במיטת ההדפסה.
- כיול הגובה של ראש ההדפסה בציר Z.
- הרם את ראש ההדפסה לגובה של 22 מ"מ תחת שליטה ידנית, כך שהוא לא יהיה מתנגש עם קצה של צלחת פטרי בעת המעבר למיקום הרצוי. הצב את ראש ההדפסה מעל הלוח והזז אותו למטה עד שתיאור הפיפטה ייצור קשר עם משטח ההדפסה. הקצה מיקום ציר Z זה כ-Z1 (הגובה של משטח ההדפסה).
- הרם את ראש ההדפסה והזז אותו מחוץ לאזור הלוח באמצעות שליטה ידנית בצירים של X, Y ו-Z. אם מרחק העבודה בין ראש ההדפסה לבין משטח הלוח מוגדר כ-Z2, הזן Z1 + Z2 לתוך תוכנית ההדפסה כערך Z במהלך ההדפסה.
- תכנת את צורת ההדפסה בשיטת קואורדינטות מפותחת של נקודה-אחר-נקודה בהתאם לנתיב הרצוי.
- אם הנתיב הרצוי הוא קו ישר, הגדר רק את נקודות ההתחלה והסיום. כלילת נקודות נוספות על קווים מעוקלים תגרום לעקומות חלקות יותר. הזז את ראש ההדפסה באופן ידני לכל נקודה ברציפות, והקלט את הקואורדינטות של נקודות אלה לפי הסדר. הזן את כל הקואורדינטות הללו וכן את מהירות הזזת ראש ההדפסה עבור כל פלח מודפס בעורך קוד ה-G.
- הן לפני והן אחרי ההדפסה, הרם את ראש ההדפסה למרחק גבוה יותר מקצה הלוח (20 מ"מ) ועבור ישירות אל מחוץ לאזור הלוח. שמור תוכנית זו כקובץ קוד G וטען ישירות לשימוש בהדפסות עוקבות, תוך מדידת מחדש של גובה ציר Z עבור כל מצע הדפסה חדש.
הערה: ראו טבלה 1 לדוגמה קוד G להדפסת ריבוע. - טען את הקובץ המתוכנת בקוד G שתוכנן מראש. פתח את עורך קוד ה-G בתוכנה, והתוכנית בפקודות להדפסת הצורה הרצויה. בכל שורת פקודה, ניתן לשנות את מיקומו של ראש ההדפסה בציר X, Y ו/Z. הקלט את ערך Z במהלך כל שלבי ההדפסה כ-Z1 + Z2 (גובה משטח ההדפסה + מרחק עבודה).
הערה: מהירות ההזזה מתכווננת גם היא; 9,000 mm/min הוא ערך מתאים לשיעורי הדפסה טיפוסיים. - טען את הדיו הביולוגי הנוזלי למזרק (ים), והבהר אותם במשאבת המזרק (ים) של הביורימטר התלת-ממדי.
- הדפס את הדיו הביולוגי על מצע ההדפסה על -ידי לחיצה על לחצן ההדפסה.
- במהלך ההדפסה, שלוט בתנועת ההדפסה במלואה על-ידי התוכנה. הפעל ידנית את משאבת המזרק לפני שראש ההדפסה יגיע למגע עם משטח הדפסה.
הערה: הקואורדינציה של משאבת המזרק והמדפסת נקבעת באופן אמפירי בהתאם למהירות ההבלטה, המהירות שבה ראש ההדפסה עובר לנקודת ההדפסה הראשונה, ולמיקום ההתחלתי של ההדפסה. אם מיקום ההדפסה הראשונית הוא 20 מ"מ, עם מהירות ההדפסה של 9,000 מ"מ/min ומהירות ההבלטה של 0.1 mL/h, להתחיל את משאבת המזרק מיד לאחר התחלת ההדפסה. אם מהירות ההבלטה משתנה מ-0.1 mL/h ל-0.3 mL/h, לאחר מכן המתן 2-3 להפעלת משאבת המזרק לאחר התחלת ההדפסה. - עצור את משאבת המזרק ברגע שראש ההדפסה יגיע בנקודה האחרונה של הדפסה. לעצור את משאבת המזרק לפני שראש ההדפסה מרים בסוף תהליך ההדפסה, אחרת עודף ביולוגי יהיה לרדת על מצע ההדפסה ולהקטין את רזולוציית ההדפסה.
- לבניית מבנים תלת ממדיים, לשלוט בכל התנועות של ראש ההדפסה בעורך קוד G. הקלד את גובה ההדפסה של השכבה הראשונה. הגדילו את ערך Z ב-G-code על-ידי 0.2 מילימטרים עבור השכבה השניה כדי להגדיל את גובה ההדפסה. לאחר מכן, הגדילו את ערך Z ב-0.1 מילימטרים כאשר עוברים לשכבה גבוהה יותר. אל תזיז את הצלחת במהלך תהליך ההדפסה.
- כדי למדוד את הרוחב והגובה של ההידרוג'ל המודפס, השתמש בסרגל פלדה הממוקם מתחת או לצד המדגם.
5. הגדלת ובדיקת האפקטיביות של ייצור ביוilm על ידי E. coli
- מודב את הדגימות המודפסות בטמפרטורת החדר במשך 3-6 ימים כדי לאפשר ייצור של רכיבי ביוilm (סיבי קורלי). צלמו את הצלחות בעזרת מצלמה או סורק פלורסנט.
- כדי לפזר את מטריצת קילוף פלסטיצידיות, להוסיף 20 מ ל של 0.5 M נתרן ציטראט הפתרון (pH = 7 מותאם עם naoh) הדפסה מצעים, ו דגירה עבור 2 h עם 30 סל ד רועד בטמפרטורת החדר. להשליך את הנוזל ואת התמונה לוחיות שוב כדי להשוות עם תמונות של לוחיות לפני טיפול ציטראט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הצעד הראשון להדפסה תלת-ממדית מוצלחת של ביויואמים הוא המרת מדפסת תלת-ממדית מסחרית לתוך ביוריקטר. המרה זו מושגת על ידי הסרת מכבש הדפוס והחימום של המדפסת, המיועדים להדפסה עם דיו פולימרי, והחלפת אלה עם רכיבים המתאימים להדפסת ביו-דיו המכיל חיידקים חיים (איור 1A). הבלטת ממד מוחלפת בעצת פיפטה (או בטיפים, אם נעשה שימוש בסוגי דיו מרובים בתהליך ההדפסה) המחובר למערכת אבובים המחוברת למשאבת מזרק (איור 1B). ההמרה מוצלחת של המדפיס המסחרי לתוך ביופוטטר יכול להיות מוערך על בסיס היכולת להעביר ביו-דיו הרצוי (s) מן המשאבה משאבת דרך מערכת אבובים ו פיפטה עצה (s) על משטח ההדפסה בלי דולף או לחמם את ה ביו-דיו. אם אבובים בליטות בשל הזרימה של ביו דיו במהלך ההדפסה, זה יכול להיות מוחלף על ידי אבובים עם קירות עבים. יצוין כי טכניקת ההדפסה הזו צריכה להיות מסוגלת לעבוד עם כל סוג של מדפסת תלת-ממדית מסחרית שעבורה ניתן לצרף אבובים לראש ההדפסה.
הביוריקטר התלת-ממדי יכול ליצור חיידקים-encapsulating הידרוג'לים במגוון צורות דו-ממדיות (2D) ותלת-ממד (איור 2). יוני סידן במצע ההדפסה לגרום מיצוק (הכלתה של יוני סידן עם קבוצות קרבוקסילי קרקסיל) של הביו-דיו בעת הדפסה, המרת הדיו ביולוגי נוזלי לתוך הידרוג'ל מוצק. הרזולוציה של הביולוטינג תלויה במהירות ההבלטה, בגודל של קצה הפיפטה, במהירות של ראש ההדפסה, בעוצמת הקול ובריכוז התמיסה של CaCl2 , שנוספה לפתרון אגר, השטצות של משטח ההדפסה, וצמיגות של הביו-דיו שבשימוש. הריכוז של הפתרון CaCl2 יש השפעה רבה על חדות הידרוג'ל. ארבעה ריכוזים שונים של CaCl2 (0.1 m, 0.2 m, 1 m, ו 5 m) נדגמו, ורק 5 m cacl2 פתרון הביא הידרוג'ל כי לא הפכה מטושטשת לאחר ההדפסה. לפיכך, 5 מ' נבחר כריכוז אופטימלי של פתרון CaCl2 .
בגירסה קודמת של פרוטוקול זה, הפתרון CaCl2 הוחל על פני השטח של הצלחת אגר במקום מעורבב לתוך הפתרון אגר לפני לשפוך את הצלחת אגר. בעת שימוש בגירסה זו, לאמצעי האחסון של הפתרון CaCl2 יש השפעה קריטית על איכות ההדפסה והרזולוציה. בעת שימוש ב-150 x 15 מ"מ צלחת פטרי, החלת נפח של פתרון סידן כלוריד של יותר מ 100 μL (או 30 μL לצלחת פטרי 90-mm) תוצאות יותר מדי נוזלי נשאר על משטח ההדפסה. נוזל זה עשוי להתפשט באופן בלתי אחיד כאשר הצלחת מועברת, אשר יכולה לשנות את מרחק העבודה ולגרום לחסימה של קצה הפיפטה. נפח גדול מדי של CaCl2 יכול גם לגרום הידרוג'לים מודפסים לצוף ולהחליק על פני הפתרון, שינוי הצורה והמיקום של ההידרוג'ל המודפס. אם נפח של פתרון סידן כלוריד הוא קטן מדי, אזורים מסוימים של הלוח עשויים לא לקבל הפתרון CaCl2 ויהיה מיצוק הידרוג'ל המסכן. בפרוטוקול משופר זה, הוספת הפתרון CaCl2 ישירות לתוך הפתרון אגר לפני שפיכת לוחית אגר הביא באופן משמעותי פחות לחות על פני השטח של מצע ההדפסה בהשוואה לשיטה המוחלת על פני השטח, וכתוצאה מכך רזולוציית הדפסה משופרת באופן דרמטי.
מהירות ההבלטה ותנועת ראש ההדפסה הינם תלויים וניתן לכוונן אותם באופן מתואם כדי לשנות את רזולוציית ההדפסה. לדוגמה, אם המדפסת מופעלת עם מהירות שחול בין 0.1 ml/h ו-0.5 mL/h עם מהירות תנועה של הדפסה קבועה של 300 mm/min, קוטרו של ההידרוג'ל המודפס גדל עם הגידול של מהירות ההבלטה2,20. במהירויות שחול מעל 0.5 mL/h, הקצוות החיצוניים של הקווים המודפסים של הידרוג'ל לשנות מן ישר, קווים מקבילים קווים גליים, ואת רוחב הקו גם גדל. למהירות של ראש ההדפסה יש גם השפעה על רזולוציית ההדפסה. עם מהירות שחול קבוע של 0.3 mL/h, הגדלת מהירות של ראש ההדפסה מ 300 mm/min כדי 500 mm/min תוצאות ברוחב של הידרוג'ל המודפס להיות צר, הפחתת מ-1.8 מ"מ עד 0.9 מ"מ. אם מהירות הזזת ראש ההדפסה היא מעל 500 מ"מ/מזערי, קו הג יהיה בקלות בלתי רציף. לקבלת תיאור מ200 μL, והביו-דיו המשמש במחקר הנוכחי, מספר צירופים של רזולוציית ההדפסה נחשבים לאופטימליים (טבלה 2). במהירות שאיבה 0.3 mL/h, מהירות התנועה של ההדפסה במהירות 500 mm/min, ומרחק העבודה 0.2 mm, הידרוג'ל מודפס מופק עם רוחב של כ 0.9 מ"מ.
הישג מכריע אחד של שיטת ההדפסה 3D חיידקי היא היכולת ליצור ביואילאמים מהונדסים. כדי ליצור מהונדס ומבוקר מבוקרת, החיידקים צריכים לא רק לשרוד את תהליך ההדפסה תלת-ממד, אלא גם לייצר רכיבי ביוilm תוך שמירה על הדפוס המודפס. מהונדסים e. coli חיידקים בשימוש בפרוטוקול זה, e. coli ΔcsgA בקטריה נושאת את הפלבמיד pSB1C3-Gfp-csga, לאפשר ביטוי לשליטה של חלבונים curli. השימוש של זן csga-הסתרה מבטיח כי חלבון csga מתבטא רק כאשר הוא המושרה מתוך פלמיד עם rhamnose. החיידקים לייצא את המושרה CsgA חלבון היחידות, אשר לאחר מכן להרכיב את עצמי21 אל csga חלבונים על הקרום החיצוני חיידקי22 לטופס סיבי curli. סיבי עמילואיד אלה הם מרכיבי פרוטטינואאוס העיקריים של מטריצת המכפלה: רשת מחוברת של חלבונים ופולימרים שבהם החיידק מוטבע. מטריצת קילוף פלסטיצידיות המודפס של 3d הדפסה ביו דיו משאיל תמיכה פיזית מבנה לחיידקים במהלך תהליך הייצור curli. השימוש בביטוי מכונן GFP מאפשר הדמיה וכימות של תאים מודפסים באמצעות הדמיה פלואורסצנטית.
על מנת להעריך אם היווצרות המבנה היה מוצלח, המטריצה האלגיטית התפרקה באמצעות תמיסה של נתרן ציטראט, וצורתו של הביו-דיו המודפס הוערך לאחר הטיפול הציטראט (איור 3). במקרה של ביו-דיו ללא הייצור הinducible curli, הדפוס המודפס היה מומס לחלוטין לאחר הטיפול הנתרן ציטראט, המציין כי לא הרשת curli ביולוגי נוצר (איור 3A, B). במקרה של חיידקים המכילים את inducible curli הייצור פלמיד, ג'ל לא התפרקה לאחר טיפול נתרן ציטראט (איור 3C, D). תוצאה זו עולה כי החיידקים המודפסים הצליחו ליצור רשת curli נרחב מספיק כדי לייצב את דפוס המודפס של חיידקים2.
כדי לבנות מבנים רב שכבתית, הודפסו שכבות נוספות (איור 4) על-ידי התאמת גובה ההדפסה ומסלול ההדפסה בעורך קוד ה-G. הגדלת מספר השכבות המודפסות במדגם גרמה לרוחב ולגובה של המבנים המודפסים להגדיל בהפרש קבוע (איור 5)2,20, אך אפילו ניתן ליצור מבנים מודפסים של 5 שכבות ברזולוציה של מילימטרים לתתי-מילימטרים. כאשר e. coli הנדסה כדי לייצר חלבונים curli הודפסו לתוך מבנים רב שכבתית, הטיפול נתרן ציטראט לא לפזר את הדגימות, ואילו מבנים רב שכבתית המכילים שאינם curli-הפקת E. coli היו מומס בתמיסה נתרן ציטראט (איור 6). ניסוי זה ממחיש כי ניתן ליצור ביואילאמים מהונדסים במבנים מודפסים תלת-ממדיים מרובי שכבות, כמו גם במבנים מודפסים בשכבה אחת.
איור 1: תמונות המציגות את ההמרה של מדפסת תלת-ממדית מסחרית לביורימטר תלת-ממדי. (א) רכיבי הביוריקטר של תלת-ממד לאחר ההמרה ממדפסת תלת-ממדית מסחרית. (ב) המבנה הביו-דיו שנוצר על-ידי מערכת אבובים המצורפת לעצת פיפטה. ניתן להוסיף עצות הדפסה נוספות בחור ראש ההדפסה השני או על-ידי הוספת חורים נוספים לראש ההדפסה, לשימוש בהדפסת סוגים מרובים של ביוגרפיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: דוגמאות לדפוסי ביויותיים תלת-ממדיים המכילים את E. coli pSB1C3-Gfp-csga. תמונות אלה נלקחו יומיים לאחר הדפסה. רזולוציית הדפסה זו הושגה עם מהירות שאיבה 0.3 mL/h, מהירות התנועה של ההדפסה 300 mm/min, ומרחק עבודה 0.2 mm. קודי ה-G להדפסת צורות אלה עשויים להימצא בקבצים המשלימים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: שיטה לאימות האם רכיבי ביוilm הופקו על ידי חיידק E. coli בתבנית מודפסת. כאשר מודפס E. coli הכיל פלבין כי לא לקודד עבור האינדוקציה, דפוס מודפס היה מומס לחלוטין על ידי נתרן ציטראט הטיפול (a ו- B). כאשר החיידק המכיל את הקידוד inducible curli החלבונים השתמשו, היואוilm המודפס היה עמיד בפני טיפול נתרן ציטראט (C ו -D). תהליך התיכנות וההסברים של קוד-G להדפסת תבנית מרובעת זו ניתנים בטבלה 1. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: התצוגה העליונה (A) ותצוגת הצד (ב) של מבנים מודפסים מרובי שכבות המכילים E. coli pSB1C3-Gfp-csga. מדגם זה הודפס עם מהירות שאיבה 0.3 mL/h, מהירות התנועה של ההדפסה 200 mm/min, ואת מרחק העבודה 0.2 mm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: רוחב וגובה הקו של הידרוג'לים מודפסים המכילים מספרים שונים של שכבות מודפסות. המידות בוצעו על דגימות מודפס עם מהירות שאיבה 0.3 mL/h, מהירות תנועה ההדפסה 500 mm/min, ומרחק עבודה 0.2 mm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: שיטה לאימות האם רכיבי ביוilm הופקו על-ידי חיידקים של E. coli בתוך מבנים מודפסים מרובי שכבות. E. coli מהונדס הודפס לתוך 1-, 3, או 5-שכבה הידרוג'לים ו מודלים עבור 6 ימים. כאשר E. coli המודפס הכיל פלבין כי לא לקודד עבור האינדוקציה, דפוס מודפס היה מומס לחלוטין על ידי נתרן ציטראט הטיפול (a ו- B). כאשר E. coli המודפס הכיל פלזמה קידוד inducible curli, החיידק המודפס היה עמיד בפני טיפול נתרן ציטראט (C ו -D). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| פקודות קוד-G | פעילויות |
| G1 Z20 F9000 | הרם את ציר Z לגובה של 20 מ"מ עם מהירות הנעה של 9,000 מ"מ/דקה. |
| G1 X95 Y65 F9000 | מעבר לנקודת ההתחלה של השורה הראשונה עם מהירות נעה של 9,000 מ"מ/דקה. |
| G1 Z6 F9000 | הזז כלפי מטה בכיוון Z למרחק הדפסה מתאים (כאן Z = 6 מ"מ). |
| G1 X95 Y105 F300 | נקודת סיום של השורה הראשונה ונקודת ההתחלה של השורה השניה. |
| G1 X135 Y105 | נקודת סיום של השורה השניה ונקודת ההתחלה של השורה השלישית. |
| G1 X135 Y65 | נקודת הסיום של השורה השלישית ונקודת ההתחלה של השורה הרביעית. |
| G1 X95 Y65 | נקודת סיום של השורה הרביעית ונקודת ההתחלה של השורה הראשונה; משבצת נוצרת. |
| G1 Z20 F9000 | הרם את ציר Z לגובה של 20 מ"מ ב 9,000 מ"מ/min. |
| G1 X55 Y40 F9000 | מעבר לקואורדינטות (55, 40) מחוץ לטווח הצלחת פטרי. |
טבלה 1: תהליך תכנות והסברים של קוד G להדפסת ריבוע.
| מהירות הבלטה (mL/h) | מהירות הזזה של ראש ההדפסה (mm/min) | רוחב ג'ל (mm) |
| 0.1 | 100 | 1.6 ± 0.1 |
| 0.1 | 200 | 1.1 ± 0.1 |
| 0.1 | 300 | 1.0 ± 0.1 |
| 0.3 | 300 | 1.8 ± 0.1 |
| 0.3 | 400 | 1.2 ± 0.1 |
| 0.3 | 500 | 0.9 ± 0.1 |
| 0.5 | 200 | 2.2 ± 0.2 |
| 0.5 | 1,200 | 1.2 ± 0.2 |
| 0.7 | 200 | 2.8 ± 0.1 |
| 0.7 | 1,200 | 1.3 ± 0.1 |
טבלה 2: הפרמטרים האופטימליים להדפסה עבור הידרו-ג'לים עם רזולוציה גבוהה. חמש נקודות נמדדו עבור כל תנאי. הערך הממוצע וסטיית התקן מוצגים בטבלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול המוצג כאן עבור הדפסה תלת-ממדית של ביואיאמים מהונדסים מכיל שני שלבים קריטיים. ראשית הוא הכנת משטח ההדפסה אגר, שהוא הגורם הקריטי ביותר להפקת רזולוציית הדפסה ספציפית. חשוב לוודא שמשטח ההדפסה שטוח ושתיאור הפיפטה בראש ההדפסה ממוקם בגובה הנכון מהמשטח. אם המשטח אינו שטוח, מרחק העבודה ישתנה במהלך תהליך ההדפסה. אם מרחק העבודה הוא פחות מ 0.1 מ"מ, הפתרון CaCl2 יכול להיכנס בתוך הקצה של הפיפטה ולגרום להיווצרות הידרוג'ל, הגורמת לתיאור הפיפטה להיות סתום. אם מרחק העבודה הוא יותר מ 0.3 מ"מ, לא ניתן להדפיס את ה-gel ברציפות. מרחק העבודה האופטימלי במחקר זה הוא 0.2 מ"מ. גישות טובות להכנת משטחי דפוס שטוחים אגר הם להשתמש מנות פטרי בקוטר גדול יותר (150-mm-בקוטר צלחת פטרי במקום לוחית 90-mm-קוטר), מניחים את לוחיות על שולחן שטוח, יוצקים את אגר פתרון עם מהירות מהירה ואפילו, ולהימנע מהזזת צלחת אגר במהלך מיצוק שלה.
השלב הקריטי השני הוא הבחירה של פרמטרי ההדפסה הרצויים, כולל מהירות שאיבה, צמיגות של הביו-דיו ומהירות ההדפסה, הקובעות את רזולוציית ההדפסה המתקבלת. כדי לבחור פרמטרים אלה באופן יעיל, המשתמש יכול לדגום מספר ערכים קיצוניים למהירות ההדפסה עם קצב שחול קבוע, ולציין את רוחב ההידרוג'ל המודפס עבור כל ערכת תנאים. לאחר מכן, חזור על ניסוי זה עם 4 קצבי שחול אחרים. לאחר מכן, קח את חמשת השילובים שיצרו את רזולוציית ההדפסה הטובה ביותר עבור היישום, ושנה את שני פרמטרי ההדפסה (מהירויות שאיבה ושאיבת ראש) בשלבים קטנים וקטנים יותר עד להשגת הרזולוציה הרצויה.
עובי הקווים המודפסים משפיע על יכולתם של חיידקים מהונדסים מודפס ליצור ביואילאמים יציבים. תחת תנאי הדפסה אופטימליים (שאיבת מהירות 0.3 mL/h, מהירות ההדפסה ההדפסה 300 mm/min, ומרחק עבודה 0.2 מ"מ), קווים מודפסים של ביו דיו יפיק ביואילאמים יציבים לאחר 3-6 ימים של דגירה בטמפרטורת החדר. אם הקווים הופכים לעבים יותר, כגון על-ידי הגברת מהירות השאיבה, האזורים האמצעיים של כל שורה לא עשויים להיגרם מספיק כדי לייצר ביואמים בעלי יציבות ציטראט.
בשעת הדפסת הידרוג'ל ביולוגי מרובה שכבות, כל שכבה מודפסת מתבססת על יצירת קשר עם יוני הסידן שנמצאים בשכבה הקודמת של ההדפסה. מאז Ca2 + ריכוז במצע ההדפסה הוא גבוה, ca2 + יונים יכול במהירות לפזר את השכבות התחתונות. לכן, ניתן להדפיס את השכבות העליונות מיד לאחר הדפסת השכבות הקודמות, פשוט על-ידי התאמת גובה ההדפסה בעורך קוד ה-G. בנוסף, יש להגביל את מרחק ההדפסה של השכבה העליונה רק כ-0.1-0.2 מ"מ גבוה יותר מאשר מרחק ההדפסה של השכבה הקודמת. אם מרחק ההדפסה המוסף קטן מ-0.1 מ"מ, העצה תגרור לאורך השכבה הראשונה ותקטין את הרזולוציה של ההידרוג'ל המודפס. אם מרחק ההדפסה המוסף גדול מ-0.2 מ"מ, הביו-דיו יוצר טיפות של נוזל במהלך ההבלטה, וגורמות להידרוג'ל המודפס להיות מקוטע.
הגישה הביונורית הנוכחית מאפשרת ייצור של ביואמים, מבוקרים מהונדסים, מתאים לשימוש בחקר התכונות המכאניות של ביוilm או עמידות ביולוגית של חיידקים ביולוגי לגורמים שונים, כולל אנטיביוטיקה, מפעילי חומרים וכו '. יכולת זו מבטיחה שימושיות ישירה של השיטה המוצעת. התפתחות של דיוק גבוה יותר עשה זאת בעצמך (DIY) הביוריטרים צפויים להיות אפשריים על ידי שמירה על מרחק עבודה ההדפסה אך הפחתת מהירות השאיבה ואת מהירות ההזזה של ראש ההדפסה, או על ידי דגימת הבלטת משקולות שונים ו ביו-דיו chemistries. עם שיפורים עתידיים ברזולוציית ההדפסה, ניתן להפעיל יישומים נוספים כגון הנדסת רקמות או העברת תרופות. גישה ביוטריטינג 3D המתואר כאן צריך גם להיות מסוגל להתרחב כדי להדפיס סוגים נוספים של חיידקים מינים, כי הם ביולוגי תואם alginate שלנו מבוססי-דיו ביולוגי. הפרוטוקול הנוכחי מספק עקרות מספיק על ידי הרתיחה שוב ושוב הביו-דיו במהלך ההכנה, באמצעות מזרקים סטרילי וטיפים הדפסה, וניצול אנטיביוטיקה הן בביו דיו ולוחית ההדפסה. ניסויים עתידיים המשתמשים בחיידקים מסוג פראי עשויים לדרוש אמצעי עיקור נוספים כגון החלפה או חיטוי של מערכת הצינורות בין הדפסים.
לידע הטוב ביותר של המחברים, השיטה המוצגת (שפותחה במקור ב לדנר ואח '20) היא הדוגמה הראשונה שפורסמה בסגנון ייצור מוספים להדפסה תלת ממדית של חיידקים. בחלק הראשון של פרוטוקול זה, שיטה כללית זו מתוארת בפירוט עבור הדפסת תלת-ממד של חיידקים, אשר מוחל על ייצור של ביוילאמים מהונדסים2. יישומים עתידיים מרובים של ביואילאמים מודפסים תלת-ממדיים אפשריים בשיטה זו. בטבע, מערכות בקטריאלי מרובות התפתחו כי ליצור סוגים שונים של ביואילאמים, אשר במאמר זה מערכת אחת נחקרו. מערכות אחרות מרובות ניתן לבחון בקלות על ידי יצירת 3D-מודפס ביואילאמים עם מערכות אחרות בקטריאלי, כגון subtilis באקלוס או אספxylinum ter. שיטות חלופיות23,24 יש גם פותחו עבור הפרדה מרחבית של חיידקים ברזולוציה גבוהה באמצעות אותות אופטיים. גישות אלה דורשות יותר ציוד יקר, מסובך כדי להשיג אותם בהשוואה למדפסת זו, והם מתאימים רק לדפוס של חיידקים מהונדסים גנטית.
היכולת ליצור תבנית מרחבית תלת-ממדית מודפסת באמצעות שיטה זו יכולה לאפשר יצירת ביואמים מהונדסים המתרבים הטרוגניות המרחבי של ביוילאמים טבעיים25. בגלל ההסדר המפורט ביותר של סיבי חלבון ופולימר בתוך ביוilm, בקטריה במדינה ביואלוilm משיגים התנגדות גבוהה יותר לגירויים כימיים ופיזיים, כגון עמידות מוגברת לאנטיביוטיקה לעומת אותו חיידקים במדינת מפלקקלס. יתר על כן, חיידקים בתוך ביוilm להראות עמידות מוגברת לזרימת נוזלים, מה שהופך את התחזוקה ועקרות של מכשירים רפואיים ההשתלות הרבה יותר קשה26. ביואמים מהונדסים מודפסים המנסים לשכפל את הפצות המרחבי הספציפיות של רכיבי הארגון הם כלים רבי-עוצמה ללימוד המנגנונים שבהם חיידקים בתוך ביויוונים משיגים פנוטיפים להתנגדות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי מענק AOARD (לא. FA2386-18-1-4059), הארגון ההולנדי למחקר מדעי (NWO/OCW) במסגרת הגבולות של תוכנית ננו מדעים, ואת החומרים המתקדמים NWO-NSFC תוכנית (No. 729.001.016). המחברים מכירים בסיוע מעבדה של רמון ואן דר ואלק ורולנד קיפר.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printer | CoLiDo | 3D-P Kit | |
| 3D printing software | CoLiDo | Print-Rite ColiDo Repetier-Host v2.0.1 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 05040 | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | 3886.1 | |
| LB broth powder | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-092 | Model 3500 |
| Petri dish | VWR | 25384-326 | 150 x 15 mm |
| Rhamnose | Sigma-Aldrich | 83650 | |
| Silicon tubing | VWR | DENE 3100103/25 | |
| Syringe pump | ProSense B.V. | NE-300 | |
| Sodium alginate | Sigma-Aldrich | W201502 | |
| Sodium citrate monobasic | Sigma-Aldrich | 71498 | |
| Sodium hydrooxide | VWR | 28244.295 |
References
- Tibbitt, M. W., Rodell, C. B., Burdick, J. A., Anseth, K. S. Progress in material design for biomedical applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (47), 14444-14451 (2015).
- Schmieden, D. T., et al. Printing of Patterned, Engineered E. coli Biofilms with a Low-Cost 3D Printer. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1328-1337 (2018).
- Mao, L. B., et al. Synthetic nacre by predesigned matrix-directed mineralization. Science. 354 (6308), 107-110 (2016).
- Gao, H. L., et al. Mass production of bulk artificial nacre with excellent mechanical properties. Nature Communications. 8 (1), 287 (2017).
- Poirier, Y., Nawrath, C., Somerville, C. Production of Polyhydroxyalkanoates, a Family of Biodegradable Plastics and Elastomers, in Bacteria and Plants. Nature Biotechnology. 13, 142-150 (1995).
- Choi, S. Y., et al. One-step fermentative production of poly(lactate-co-glycolate) from carbohydrates in Escherichia coli. Nature Biotechnology. 34 (4), 435-440 (2016).
- Mohammadi, P., Toivonen, M. S., Ikkala, O., Wagermaier, W., Linder, M. B. Aligning cellulose nanofibril dispersions for tougher fibers. Scientific Reports. 7 (1), 11860 (2017).
- Jonkers, H. M. Bacteria-based self-healing concrete. Heron. 56 (1/2), (2011).
- Schmieden, D. T., Meyer, A. S., Aubin-Tam, M. E. Using bacteria to make improved, nacre-inspired materials. MRS Advances. 1 (8), 559-564 (2016).
- Zhong, C., et al. Strong underwater adhesives made by self-assembling multi-protein nanofibres. Nature Nanotechnology. 9 (10), 858-866 (2014).
- Chen, A. Y., et al. Synthesis and patterning of tunable multiscale materials with engineered cells. Nature Materials. 13 (5), 515-523 (2014).
- Gatenholm, P., Klemm, D. Bacterial Nanocellulose as a Renewable Material for Biomedical Applications. MRS Bulletin. 35, 208-213 (2010).
- Rodriguez-Carmona, E., Villaverde, A. Nanostructured bacterial materials for innovative medicines. Trends in Microbiology. 18 (9), 423-430 (2010).
- Hung, C., et al. Escherichia coli biofilms have an organized and complex extracellular matrix structure. MBio. 4 (5), (2013).
- Donlan, R. M., Costerton, J. W. Biofilms: Survival Mechanisms of Clinically Relevant Microorganisms. Clinical Microbiology Reviews. 15 (2), 167-193 (2002).
- Wu, H., Moser, C., Wang, H. Z., Hoiby, N., Song, Z. J. Strategies for combating bacterial biofilm infections. International Journal of Oral Science. 7 (1), 1-7 (2015).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).
- Kikuchi, T., Mizunoe, Y., Takade, A., Naito, S., Yoshida, S. Curli Fibers Are Required for Development of Biofilm Architecture in Escherichia coli K-12 and Enhance Bacterial Adherence to Human Uroepithelial Cells. Microbiology and Immunology. 49 (9), 875-884 (2005).
- Cranford, S., Buehler, M. J. Materiomics: biological protein materials, from nano to macro. Nanotechnology, Science and Applications. 3, 127-148 (2010).
- Lehner, B. A. E., Schmieden, D. T., Meyer, A. S. A Straightforward Approach for 3D Bacterial Printing. ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1124-1130 (2017).
- Wang, X., Smith, D. R., Jones, J. W., Chapman, M. R. In vitro polymerization of a functional Escherichia coli amyloid protein. Journal of Biological Chemistry. 282 (6), 3713-3719 (2007).
- Hammar, M., Bian, Z., Normark, S. Nucleator-dependent intercellular assembly of adhesive curli organelles in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (13), 6562-6566 (1996).
- Huang, Y. J., Xia, A. G., Yang, G., Jin, F. Bioprinting Living Biofilms through Optogenetic Manipulation. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1195-1200 (2018).
- Jin, X. F., Riedel-Kruse, I. H. Biofilm Lithography enables high-resolution cell patterning via optogenetic adhesin expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (14), 3698-3703 (2018).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).
- Percival, S. L., Suleman, L., Vuotto, C., Donelli, G. Healthcare-associated infections, medical devices and biofilms: risk, tolerance and control. Journal of Medical Microbiology. 64, 323-334 (2015).
