Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att effektivt kombinera Serial block Face och fokuserad Jon beam scanning elektronmikroskopi för att rikta ett område av intresse. Detta möjliggör effektiv sökning, i tre dimensioner, och lokalisering av ovanliga händelser i ett stort synfält.
Abstract
Detta protokoll möjliggör effektiv och effektiv avbildning av cell-eller vävnadsprover i tre dimensioner på upplösnings nivån för elektronmikroskopi. För många år har elektronmikroskopi (EM) varit en inneboende tvådimensionell teknik. Med intåget av seriell skanning elektronmikroskop Imaging Techniques (volym EM), med antingen en integrerad mikrotom eller fokuserad jonstråle till skiva sedan Visa inbäddade vävnader, den tredje dimensionen blir lättillgänglig. Serial block Face scanning elektronmikroskopi (SBF-SEM) använder en ultramicrotome innesluten i SEM kammaren. Den har förmågan att hantera stora prover (1 000 μm x 1 000 μm) och bild stora fält av syn på små X, Y pixelstorlek, men är begränsad i Z-dimensionen av diamantkniv. Fokuserad Ion beam SEM (FIB-SEM) är inte begränsad i 3D-upplösning, (isotrop voxels på ≤ 5 Nm är uppnåeliga), men synfältet är mycket mer begränsad. Detta protokoll visar ett arbetsflöde för att kombinera de två teknikerna för att möjliggöra att hitta enskilda regioner av intresse (ROIs) i ett stort fält och sedan avbilda den efterföljande riktade volymen vid hög isotrop Voxel upplösning. Förbereda fasta celler eller vävnader är mer krävande för volym EM-teknik på grund av den extra kontrasterande behövs för effektiv signal produktion i SEM Imaging. Sådana protokoll är tidskrävande och arbetsintensiva. Detta protokoll innehåller också mikrovågassisterad vävnad bearbetning underlättar penetration av reagenser, vilket minskar den tid som krävs för bearbetning protokollet från dagar till timmar.
Introduction
Detta protokoll beskriver ett arbetsflöde för effektiv inriktning av högupplöst, tredimensionell elektronmikroskopi (EM) till en specifik intresse region (ROI). Sedan starten på 1930-talet har EM varit en väsentligen tvådimensionell teknik. De första publicerade bilderna var av hela vävnader eller celler, men som snart gav vika för avsnitt som klipptes för hand med hjälp av en ultramicrotome och avbildas med hjälp av ett transmissionselektronmikroskop (TEM). TEM producerar mycket högupplösta mikrografer där även de minsta cellulära strukturerna är klart märkbara. Men den tunnhet av sektion som krävs för att vävnaden ska avbildas av elektronstrålen gjorde information i Z-dimensionen minimal. Eftersom celler är tredimensionella strukturer måste interaktioner mellan cellstrukturer och cellytor härledas från begränsade data. Detta tog upp potentialen för feltolkningar, särskilt i komplexa strukturer. Vissa microscopists lyckats få mer exakta 3D-strukturer genom seriell-snittning celler och vävnader och sedan omsorgsfullt rekonstruera dem från enskilda TEM bilder1. Detta var en mycket arbetsintensiv process och innan tillkomsten av digital bildbehandling och datorrendering resultaten var också svåra att visualisera. Under de senaste åren har två tekniker införts som har blivit kollektivt kallas Volume Electron microskopi (volym EM)2 som har gjort EM i tre dimensioner tillgängliga för fler laboratorier.
Idén att få en bunt bilder från ett inbäddat block inuti ett elektronmikroskop kan spåras tillbaka till 1981 när Steve Leighton och Alan Kuzirian byggde en miniatyr mikrotom och placerade den i kammaren av ett Scanningelektronmikroskop3 (SBF-SEM) . Denna prototyp kopierades så småningom och förbättrades 23 år senare av Denk och Horstmann4 och därefter kommersialiseras. Vid ungefär samma tid biologiska forskare blev medvetna om en annan teknik som används främst i materialvetenskap, den fokuserade jonstrålen. Denna teknik använder en jonstråle av något slag (gallium, plasma) för att ta bort en mycket liten mängd ytmaterial från ett prov (FIB-SEM)5. Båda teknikerna använder snittning följt av avbildning som ger en serie bilder som kan kombineras till en X, Y, Z, stack. Båda teknikerna ger 3D-information men med olika upplösning skalor. SBF-SEM begränsas av de fysikaliska egenskaperna hos diamantkniven till skivor inte tunnare än 50 Nm för långa seriella avbildning körningar; men den urvals blockstorlek som kan sektioneras är stor, upp till 1 mm x 1 mm x 1 mm. på grund av det stora digitala förvärvet format av ryggen spridda elektron detektor (32k x 32k pixlar) som tar emot en signal från blocket ansikte kan bild pixel storlekarna vara så små som 1 Nm. Detta resulterar i icke-isotropiska voxels där X, Y dimensionen är ofta mindre än Z. På grund av precisionen i jonstrålen, FIB-SEM har förmågan att samla in bilder med isotrop voxels ≤ 5 nm. Den totala arealen som kan avbildas är dock ganska liten. En sammanfattande tabell över olika prover och volymer avbildade med de två teknikerna har publicerats tidigare3.
Vävnads beredning för volym EM är svårare än för standard TEM eller SEM eftersom proverna måste färgas för att ge tillräcklig signal generering i SEM. ofta måste Infärgningar optimeras, inte bara för den specifika vävnads typen utan också för att kontrast till vissa cellulära strukturer för att göra identifiering och återuppbyggnad lättare. Det protokoll som används här baseras på NCMIR standard6. Ytterligare färgning innebär vanligtvis ytterligare protokoll steg. För volym EM måste därför standardprotokoll utökas för att säkerställa att reagenser får tillräckligt med tid för att penetrera provet. Mikrovågassisterad bearbetning kan minska den tid som behövs för färgning från timmar till minuter och gör volym EM provberedning effektivare7. Denna metod är tillämplig på alla cell-och vävnadstyper8 och på forskningsfrågor där vävnadens ohomogenitet gör provtagning av ett specifikt område viktigt9.
När en data stack erhålls det kan anpassas och strukturer av intresse segmenterade från resten av data och modelleras i 3D. Även om automatisering av avbildning många skivor av vävnad har gjort bild förvärv relativt enkelt, är processen att digitalt rekonstruera och visualisera data en tidskrävande uppgift. Programvara för detta ändamål är ännu inte integrerat eller helt automatiserad. Eftersom mycket av det tidiga arbetet med volym EM riktades mot neurovetenskap, är tekniken för färgning och digitalt segmentera strukturer såsom axoner ganska långt framskriden jämfört med andra celler och organeller. Medan litteraturen om andra icke-neuronala vävnader växer snabbt, ickelinjära eller oregelbundna strukturer kräver mer manuell inmatning.
Använda både SBF-SEM och FIB-SEM är ett användbart tillvägagångssätt för inriktning och avbildning specifika, icke homogena, vävnads strukturer med hög upplösning i 3D. Kombinera det med mikrovågassisterad vävnad bearbetning som avsevärt minskar den tid som behövs för provberedning. Tillsammans detta arbetsflöde kommer att skapa högupplösta isotrop Voxel bild datauppsättningar av fina strukturer en effektiv och snabbare process.
Protocol
1. provfixering och-bearbetning för elektronmikroskopi
- Fix plantor av Arabidopsis thaliana odlas på agar plattor i 0,5% paraformaldehyd, 2,5% glutaraldehyd i 0,1 M FOSFATBUFFERT (PB) pH 6,8 för 2 h vid rumstemperatur (RT).
FÖRSIKTIGHET: aldehyder är irriterande och frätande och har cancerframkallande, mutagena och teratogena potential. Alla lösningar måste hanteras med lämplig skyddsutrustning och i ett draghuv. - Cut root tips av växten odlas i steg 1,1 och sätta 2-3 tips i 0,5 mL rör som innehåller samma fixativ över natten vid 4 ° c.
Obs: volymen av detta och eventuella lösningar i de återstående stegen bestäms av provvolymen; ett minsta förhållande mellan prov och lösning är 10:1. Prover som är större än 1 mm i någon dimension kommer att vara svåra att färga, så att arbeta med större vävnads block är svårare. Inte alla vävnader har samma egenskaper; till exempel kan växtblad och stjälkar vara svåra att färga. Om större prover eller svåra vävnadstyper önskas, måste optimering av prov bearbetningen utföras innan man går vidare till datainsamlingen. - Förbered thiocarbohydrazid (TCH) lösning, behövs färsk och tillgänglig före steg 1,7. Tillsätt 0,1 g tiokarmalhydrazid till 10 mL dubbeldestillerat vatten (ddH2O) och lös upp genom upphettning till 60 ° c i ugnen under 1 h. Före användning, filtrera TCH-lösningen med ett 0,22 μm sprutfilter.
- Ta bort fixativ från rören och Ersätt med 0,1 M PB pH 6,8. Sätt rören på en omloppsbana skakbord vid 100 rpm och tvätta i 10 min. Upprepa tvätt med färsk PBS 5 gånger.
- Post Fix roten tips genom att ersätta PB med 2% osmium grundämnetetroxide (OsO4) och 0,2% rutenium röd i 0,1 M PB pH 6,8. Sätt rören i mikrovågsugnen med locken öppna och starta program 9 (tabell 1).
FÖRSIKTIGHET: osmium är extremt farligt vid förtäring, mycket farligt vid inandning, och farligt vid hudkontakt. Hantera alltid med lämplig skyddsutrustning och i ett draghuv.
Obs: under hela protokollet är locken på rören alltid öppna under mikrovågstegen. - Tvätta roten tips två gånger med ddH2O för 5 min vardera på bänkskiva. För tredje och fjärde ddH2O tvätta användningsprogram 15 på mikrovågsugnen (tabell 1). Efter den första 40 andra ddH2o Tvätta, ta prover ur mikrovågsugnen och ersätta bufferten med färska DDH2o. sätt prover tillbaka i mikrovågsugnen och fortsätta programmet.
Obs: mikrovågsugnen ljuder ett larm när bufferten behöver uppdateras. Se till att locket till vakuumkammaren byts ut på rätt sätt varje gång. - Inkubera prover i tidigare förberedd TCH-lösning vid RT i 2 min på bänken och för ytterligare inkubering Använd mikrovågsprogrammet 8 (tabell 1). Byt inte lösning mellan bänk och mikrovågsugn.
- Tvätta proverna enligt beskrivningen i steg 1,6.
- Placera proverna i 1% OsO4 i DDH2O för mikrovågsprogram 9 (tabell 1).
- Tvätta proverna enligt beskrivningen i steg 1,6.
- Inkubera proverna i 1% uranylacetat i ddH2O med hjälp av mikrovågsprogrammet 16 (tabell 1).
FÖRSIKTIGHET: uranyl acetat är giftigt, irriterande och har cancerframkallande, mutagena och teratogena potential. Hantera alltid med lämplig skyddsutrustning. - Tvätta proverna enligt beskrivningen i steg 1,6.
- Förbered Waltons bly lösning för användning i steg 1,14. Först göra en stamlösning av L-asparaginsyra genom att tillsätta 0,998 g L-asparaginsyra till 250 mL ddH2O och justera pH till 3,8 med 1 M Koh. Lös sedan 0,066 g blynitrat i 10 mL L-asparaginsyra stamlösning och justera pH till 5,5. Lämna lösningen i ugnen vid 60 ° c i 30 min.
Anmärkning: inga fällor bildas. - Inkubera prover i Waltons bly lösning i 30 min i ugnen vid 60 ° c.
- Tvätta proverna enligt beskrivningen i steg 1,6.
- Dehydrate prover i EtOH i graderade steg på 50%, 70%, 90% i ddH2O, och sedan 2x i 100% EtOH. Använd Microwave program 10 (tabell 1) och mikrovågsugnen kommer att uppmana användare varje 40 s att ersätta lösningen med nästa EtOH steg. Detta är det sista steget som görs i mikrovågsugnen.
- Ytterligare torka i 100% propylenoxid 2x för 10 min vardera vid RT på bänken, ersätter lösningen mellan steg.
Anmärkning: propylenoxid kan lösa upp vissa plaster som polystyrener; antingen använda glasflaskor för detta steg eller pre-test plast för resistens.
FÖRSIKTIGHET: propylenoxid är mycket brandfarlig. Hantera alltid med lämplig skyddsutrustning och i ett draghuv. - Börja infiltration av root tips genom inkuberande i 50% Spurr harts i propylenoxid (min 2 h).
FÖRSIKTIGHET: Spurr s harts komponenter är irriterande. Hantera alltid med lämplig skyddsutrustning och i ett draghuv. - Ersätt lösningen med 100% Spurr ' s och lämna över natten vid RT.
- Byt till färsk 100% Spurr ' s Resin 2 gånger (min 2 h inkuberingar).
- Placera prover i en inbäddning mögel, igen som innehåller färska 100% Spurr harts och polymerisera i en ugn vid 65 ° c för 36 − 48 h.
Obs: den inbäddning mögel som används beror på vilken typ av vävnad och den metod som används för avbildning. Här, en platt silikon inbäddning mögel användes (figur 1a).
2. Förbered inbäddade prover för avbildning
- Ta bort prover från ugnen, ta bort harts från inbäddnings formen (figur 1b).
- Använd ett rakblad och trimma provet grovt till ett block av högst 0,5 mm x 0,5 mm x 0,5 mm (figur 1c).
Anmärkning: för att förhindra laddning i SBF-SEM, är det viktigt att trimma bort så mycket kala harts som möjligt och göra provet så platt/tunt som möjligt. Helst alla sidor av blocket innehåller vävnad redan, men viktigast av allt den sida som kommer att fästas på metall stift (se steg 2,3) måste innehålla exponerad vävnad så att vävnaden är i direkt kontakt med ledande metall. - Ta bort provet från främmande harts och bifoga den till en metall stift (figur 1d) med ledande epoxiharts, se till att en del av vävnaden vidrör metallnålen. Låt epoxin bota över natten i ugnen vid 65 ° c.
Obs: se till att provet är placerad i mitten av stiftet, eftersom förflyttning av scenen i SB-SEM är begränsad. Ta bort mycket små harts inneslutna provet från extra harts kan vara svårt eftersom det lilla provet kommer att ha en tendens att flyga iväg när de lossnar. En enkel och effektiv lösning på detta är att täcka provet med ett blad av paraffin film som visas i den kompletterande filmen av referens1. - Spänn fast hållaren i hållaren för ultramicrotomen. Använd ett rakblad för att ta bort överflödig epoxi och använda ultramicrotome och en diamantkniv för att släta ansiktet och sidorna av blocket, bildar en pyramid. Se till att åtminstone en del av vävnaden är redan exponerad på blocket-ansikte.
Obs: det extra steget att använda en diamantkniv är frivilligt men det gör det resulterande blocket lättare att närma sig i SBF-SEM eftersom skuggan av kniven på blocket ansiktet är tydligare vilket gör att uppskatta avståndet mellan kniv och blockera ansiktet lättare att bestämma. - Placera det trimmade prov blocket i spotta bestrykare och täck provet med ett tunt lager (2 − 5 nm) platina (PT).
Obs: platina på blocket-ansikte kommer att klippas bort under tillvägagångssättet i SBF-SEM (se nedan), men platina på sidorna av pyramiden kommer att ge ytterligare ledningsförmåga. I detta exempel var provet belagd med platina, men guld, eller guld/Palladium är också effektiv; men beläggning med guld resulterade i ökat skräp på blocket-ansikte under en avbildning springa.
3. avbildning i SBF-SEM
- Sätt i hållaren i SBF-SEM-mikroskopet och placera kniven nära prov ytan. Använd diamantkniv trim från den övre delen av provet så att PT-skiktet redan har avlägsnats och åtminstone en del av vävnaden exponeras.
Obs: eftersom denna process är olika för varje SBF-SEM Mikroskop, inte varje steg specificeras här. Så länge prov ytan är fri från PT och klar för avbildning, kommer nästa steg att vara möjligt. - Starta Imaging med låg upplösning och korta uppehållstider för att få en överblick över provet och lokalisera en intresse region (figur 1e).
Obs: här, 512 x 512 pixlar och 1 μs Dwell tid användes för snabb skanning och positionering av scenen och 2 000 x 2 000 pixlar med 1 μs Dwell tid användes för att optimera bildfönstret och justera fokus. - Med hjälp av en accelererande spänning på 1,5-2,0 kV vid en ström av 80 − 100 pA, fånga en bild av vävnaden.
Anmärkning: det exempel som visas här var avbildad på ett högt vakuumsystem där strålen ström behöver justeras för att minimera laddningen, vilket är mycket prov beroende. Vanligtvis är elektronstrålen inställd på 1,5 − 2,0 kV men detta kommer att vara prov beroende. Vid högre förstoringar (vanligtvis > 10.000 x) är kådan för mycket påverkad av balken för att garantera smidig snittning, så typiskt pixel-storlek är inställd på 8 − 20 Nm vid en bildstorlek på 8000 − 10000 x 8000 − 10000 pixlar med en motsvarande magnifikationer på 430 – 1, 400x och fältstorlekarna 64 X 64 mm respektive 200 x 200 mm. - Bestäm en intresse region och Bestäm hur många avsnitt som behövs för att täcka volymen av intresse och starta avbildnings körningen med hjälp av den bakre spridda elektron detektorn.
Anmärkning: i det exempel som presenteras här, 500 avsnitt av 80 Nm var avbildas vid 10 nm pixlar och 10 000 x 10 000 pixel bilder (Dwell tid 1 μs). Mikroskopet var satt till 1,6 kV och 100 pA. I allmänhet är antalet sektioner beroende av prov och storlek på ROI och kan variera från 100 s till 1 000 s i följd avsnitt. Den resulterande datauppsättningen består av enstaka avbildningar av varje avsnitt. Dessa bilder måste konverteras till en 3D-stack.
4. SBF-SEM databehandling
- Använd Fiji, Välj Arkiv-import-bildsekvens och leta upp bildstapeln för att läsa in bilderna. Beroende på storleken på datauppsättningen, markerar du rutan "Använd virtuell stack".
Om datauppsättningen är riktigt stor konverterar du den först till 8 bitar (om den samlas in vid 16 bitar) och om det behövs bin informationen tills den har en fungerande storlek. - Med hjälp av uppspelningsknappen längst ned på bilden bläddrar du igenom datamängden för att se om avbildnings körningen lyckades. Sök efter typiska bildartefakter för SBF-SEM, såsom sektioner som faller av kniven på block-Face, laddning i områden med kala kåda, skärande artefakter av kniven (horisontella linjer på bilden).
- Med kommandot image-Properties justerar du pixelstorleken och Voxel-djupet (dvs. avsnitts tjock lek) som används under körningen. Om uppgifterna redan är binned, ta hänsyn till detta.
- Använda kommandot plugins-Registration-linjär stack justering med SIFT för att registrera data.
Obs: registrering av SBF-SEM-data behövs eftersom det kan finnas små prov rörelser under bildtagning på grund av laddning eller drift av provet. Eftersom detta bara är en minimal rörelse i XY behövs bara översättning. - Kontrollera justeringen genom att bläddra igenom datauppsättningen och om OK Använd kommandot Spara under Arkiv-menyn för att spara den justerade datauppsättningen som en 3D-TIF-fil.
- Analysera datauppsättningen noggrant för att se om ROI ingår och innehåller den information som behövs för den biologiska frågan. På den sista bilden av stacken (= det aktuella blocket-Face), Välj en ny ROI för FIB-SEM Imaging.
Obs: om det inte finns någon bra region för FIB-SEM Imaging närvarande på den nuvarande block-Face, fler sektioner kan klippas från blocket (som fortfarande är i SBF-SEM) tills en ROI visas. Det finns en gräns för den volym som kan avbildas med FIB. AVKASTNINGEN på SBF-SEM-bilden kan vara max i X, Y på 30-40 μm X 15-20 μm.
5. avbildning i FIB-SEM
- Ta översiktsbilder av provet i SBF-SEM, helst inklusive en eller flera kanter av provet som sedan känns igen i FIB-SEM (figur 2A, C).
Anmärkning: i detta exempel SBF-SEM översiktsbilder togs vid 10 nm pixelstorlek, 8 000 x 8 000 pixlar vid 1 μs Dwell tid. Mikroskopet var fortfarande inställt på 1,6 kV och 100 pA. - Ta bort provet från SBF-SEM och placera i spotta coater. Täck provet med ≥ 20 nm Platinum för FIB-SEM Imaging.
- Lasta provet i FIB-SEM och Använd sekundär elektron detektor vid 15 kV, 1 nA lokalisera avkastningen som identifierats i SBF-SEM på block-Face (figur 2b, D).
Anmärkning: avbildning vid 15 kV krävs för att se genom platina beläggningen. - Ta ROI på provet i slump punkten av FIB och SEM balkar, genom att flytta och luta scenen (figur 3a).
Obs: FIB-kolonnen monteras vanligen under en vinkel (figur 3a). Detta innebär att varje prov måste lutas på ett sådant sätt att den yta som skall avbildas och sektioneras är placerad parallellt med FIB balken. Den yta som skall avbildas nu lutas med avseende på SEM balken och en diket av vävnad måste avlägsnas innan SEM kan bilden ROI (figur 3E) - Med hjälp av FIB balk och gas insprutningssystem, deponera ett 1 mm skyddande lager av platina på ytan ovanför ROI (figur 3c). Nästa, med hjälp av en låg fräs ström (50-100 pA), kvarn fina linjer i Platinum deposition för autofokus och 3D-spårning under Imaging Run (figur 3D). Använda FIB kolonn och kol gas injektor, täcka dessa linjer med kol deposition.
Obs: storleken på ROI här motsvarar storleken på ROI på SBF-SEM bild och den maximala storleken kan därmed vara 30-40 μm x 15-20 μm. I detta exempel avbildades en ROI på 17 μm x 8 μm. Kol deposition behövs för att skydda linjerna och för att skapa en svart-vit kontrast mellan kol och platina som är idealisk för automatisk fokusering. De fräs strömmar som används för varje steg finns i tabell 2. - Med en hög fräs ström, kvarn en dike av 30 μm framför ROI, skapa Imaging ytan för SEM beam (figur 3E).
Obs: den FIB strålen är till sin natur destruktiva, ännu mer på höga strömmar. Se till att hålla Imaging vid höga strömmar till ett minimum och bild vid låg förstoring och snabba skannings hastigheter för att undvika smältning av harts på ROI. - Jämna ut bild ytan med en fräs ström närmare den ström som används under avbildnings körningen. Stoppa polering när alla autofokus och 3D-spårningsmarkeringar är tydligt synliga på bild ytan (figur 3F). Utvecklingen av FIB kan följas av avbildning av ytan med EM (med hjälp av en tillbaka spridda elektron detektor) medan polering.
- Bestäm vilket område som ska avbildas på den nyskapade ytan och Ställ in avbildnings parametrarna. Se till att elektronstrålen är fokuserad på ytan, Ställ in ljusstyrka och kontrast och Ställ in pixelstorlek och snittjocklek. Håll bild tiden under 1 minut genom att justera dröjtid och linje medelvärde.
Anmärkning: det är viktigt att använda en lågspänning för avbildning med elektronstrålen för att säkerställa att endast ytan av blocket är avbildad (dvs. att inga elektroner djupare in i provet avbildas). Detta görs genom att hålla spänningen under 2 kV och med hjälp av en tillbaka spridda elektron detektor med en nätspänning, vilket gör att endast hög energi elektroner att avbildas. I detta exempel var elektronstrålen inställd på 1,5 kV och 1 nA med en nätspänning på 1,2 kV på baksidan spridda elektron detektor. Även här, en pixel-storlek på 5 NM användes med 5nm sektioner för att resultera i en DataSet med isotrop voxels. En yta på 17 μm x 10 μm var avbildad vid 6,5 μs uppehållstid och ett linje genomsnitt på 1,0. - Ställ in Windows för automatisk justering och 3D-spårning, med samma pixelstorlek, uppehållstid och linje medelvärde som används för avbildning.
Obs: denna process kommer att variera för olika system, därför bara steget nämns utan att specificera de olika åtgärderna. - Starta avbildnings körningen och övervaka processens stabilitet under de första 50 − 100-avsnitten. När systemet är igång smidigt, lämna rummet och se till att det finns så lite störningar i rummet som möjligt.
Obs: varaktigheten av körningen och antalet sektioner beror på storleken på ROI och snittjockleken. I FIB-SEM är Z-axeln faktiskt höjden på ROI-boxen på SBF-SEM-bilden (max 15 − 20 μm; Figur 3E). - Registrera FIB-SEM data på samma sätt som beskrivits ovan för SBF-SEM data.
Representative Results
Bilder från SBF-SEM ger en överblick av vävnaden, vilket ger insikt i rumslig orientering av celler och intercellulära anslutningar (figur 4a). Den efterföljande FIB-SEM Imaging på en ny region, som vanligtvis är en region av intresse bestäms efter inspektion av SBF-SEM Run, tillför högupplöst detalj av specifika celler och/eller strukturer (figur 4b).
Figur 4c , D Visa skillnaden i rendering av icke-isotropiska voxels av SBF-SEM data (figur 4c) och ISOTROPISKT Voxel FIB-SEM data (figur 4D). Z-tjocklek som används i SBF-SEM innebär att rendering tydligt visar avsnitten, vilket resulterar i en "trappa" effekt på ytan. I FIB-SEM data de 5 NM avsnitten se till att rendering verkar mycket smidigare och enskilda sektioner smälter in i ytan helt.
Figur 1: skapandet av blocket ansikte från ett harts inbäddade provet. A) enrot spets som är inbäddad i harts. (B) med hjälp av ett rakblad trimmas överskotts kådan bort tills ett block på 0,5 mm2 återstår. (C, D) Den trimmade blocket är limmade på en metall stift och efter en natt i ugnen, är sidorna av blocket trimmas och ytan jämnas med en diamantkniv med en ultramicrotome. (E) i SBF-SEM är provet orienterat så att BLOCKYTAN och ROI kan kännas igen, skala bar = 20 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: korrelation mellan SBF-SEM och FIB-SEM. Översiktsbilder av blocket-Face med hjälp av SBF-SEM (a) och FIB-SEM (B), skala bar = 5 μm. (C, D) Zooma på ROI. Red Box avgränar regionen för att avbildas med FIB-SEM, Scale bar = 5 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: FIB-SEM-system och förberedelsesteg. A) system som visar riktningen för FIB-strålen, SEM-strålen och provet. Provet måste placeras till slump punkten av FIB och SEM balkar för att kunna kvarn och bild på samma region. BSchematisk ritning av den diket som behövs för SEM-avbildning av de sektioner som tagits bort av FIB. (C) bild tagen med FIB beam som visar platina deposition på ROI, Scale bar 5 μm. (D) bild tagen med FIB beam som visar de linjer som används för autofokus och 3D-spårning. Linjerna i mitten används för autofokus och de yttre linjerna ger 3D-spårning. Kol deposition ovanpå linjerna ger den nödvändiga kontrasten (platina vs Carbon) för att utföra dessa uppgifter, scalebar 5 μm. (E) bild tagen med FIB-strålen efter fräsning av diket, scalebar 5 μm. (F) bild tagen med SEM-strålen som visar region av intresse avbildas under FIB-SEM Run, Scale bar 2 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: SBF-SEM och FIB-SEM resultat före och efter segmentering. (A) 3D-vy av SBF-SEM dataset (100 x 100 x 40 μm, skalstapel = 10 μm), (B) 3D-vy av FIB-SEM dataset (17 x 10 x 5,4 μm, skalbar = 2 μm), (C) utförda VAKUOLER segmenterade från SBF-SEM-data genom Thresholding, skalstapel = 2 μm D. utsmält granulat seg från FIB-SEM-data genom Thresholding, Scale bar = 2 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Protokoll för Mikrovågsbearbetning | |||||||||
| Program # | Beskrivning | Användarprompt (på/av) | Tid (HR: min: SEC) | Effekt (watt) | Temp (° c) | Laddnings kylare (av/Auto/på) | Vakuum/Bubbler pump (off/bubb/VAC cykel/VAC på/VAP) | Stadig Temp | |
| Pump (på/av) | Temp (° c) | ||||||||
| 8 | Tch | Av | 0:01:00 | 150 | 50 | Av | VAKUUM CYKEL | På | 30 |
| Av | 0:01:00 | 0 | 50 | Av | VAKUUM CYKEL | På | 30 | ||
| Av | 0:01:00 | 150 | 50 | Av | VAKUUM CYKEL | På | 30 | ||
| 9 | Osmium | Av | 0:02:00 | 100 | 50 | Av | VAKUUM CYKEL | På | 30 |
| Av | 0:02:00 | 0 | 50 | Av | VAKUUM CYKEL | På | 30 | ||
| Av | 0:02:00 | 100 | 50 | Av | VAKUUM CYKEL | På | 30 | ||
| Av | 0:02:00 | 0 | 50 | Av | VAKUUM CYKEL | På | 30 | ||
| Av | 0:02:00 | 100 | 50 | Av | VAKUUM CYKEL | På | 30 | ||
| 10 | 50% EtOH | På | 0:00:40 | 150 | 50 | Av | Av | På | 30 |
| 70% EtOH | På | 0:00:40 | 150 | 50 | Av | Av | På | 30 | |
| 90% EtOH | På | 0:00:40 | 150 | 50 | Av | Av | På | 30 | |
| 100% EtOH | På | 0:00:40 | 150 | 50 | Av | Av | På | 30 | |
| 100% EtOH | På | 0:00:40 | 150 | 50 | Av | Av | På | 30 | |
| 15 | 0,1 M CACODYLATE | På | 0:00:40 | 250 | 50 | Av | VAKUUM CYKEL | På | 30 |
| 0,1 M CACODYLATE | På | 0:00:40 | 250 | 50 | Av | VAKUUM CYKEL | På | 30 | |
| 15 | ddH2O | På | 0:00:40 | 250 | 50 | Av | VAKUUM CYKEL | På | 30 |
| ddH2O | På | 0:00:40 | 250 | 50 | Av | VAKUUM CYKEL | På | 30 | |
| 16 | Uranylacetat | Av | 0:01:00 | 150 | 50 | Av | VAKUUM CYKEL | På | 30 |
| Av | 0:01:00 | 0 | 50 | Av | VAKUUM CYKEL | På | 30 | ||
| Av | 0:01:00 | 150 | 50 | Av | VAKUUM CYKEL | På | 30 | ||
| Av | 0:01:00 | 0 | 50 | Av | VAKUUM CYKEL | På | 30 | ||
| Av | 0:01:00 | 150 | 50 | Av | VAKUUM CYKEL | På | 30 | ||
| Av | 0:01:00 | 0 | 50 | Av | VAKUUM CYKEL | På | 30 | ||
| Av | 0:01:00 | 150 | 50 | Av | VAKUUM CYKEL | På | 30 | ||
Tabell 1. Detaljerat protokoll för mikrovågsbearbetning.
| Steg | Nuvarande | Beräknad tid |
| Deposition platina | 3N A | 10-15 minuter |
| Fräsning Autotune och spårnings markeringar | 50-100 pA | 4-6 minuter |
| Deposition kol | 3 nA | 5-10 minuter |
| Fräsning grov Trench | 15-30 nA | 30-50 minuter |
| Polering yta | 1.5-3 nA | 15-20 minuter |
| Imaging Run | 700 pA-1,5 nA | Timmar-dagar |
Tabell 2. FIB-fräs strömmar som används för provberedning och avbildnings körning
Discussion
Volymelektronmikroskopi är mer utmanande och tidskrävande än konventionell SEM eller TEM. På grund av behovet av att färga vävnader eller celler en Bloc, måste bearbetningssteg vara tillräckligt lång för att säkerställa penetration av reagenser i hela provet. Använda mikrovågenergi för att underlätta penetration gör för kortare, effektivare bearbetning och förbättrar färgning. Eftersom förberedelser för EM är mycket strängare än för ljusmikroskop alla lösningar och reagenser måste vara kvalitetskontrollerade strikt. Förändringar i pH, tonicitet, användning av oren reagens, och införandet av föroreningar på grund av dålig teknik kan alla ha skadliga effekter på den slutliga bilden.
Volym EM kräver också individuellt anpassade protokoll för varje typ av prov. Däggdjursvävnader av olika typer: växter, enstaka celler som jäst, trypanosomes, C. elegans, etc., alla behöver sina egna variationer för att uppnå optimala resultat. Fixering och färgning skall utformas så att den strukturella integriteten bevaras och provet hålls så nära dess in vivo-morfologi som möjligt. Fixering av vävnader vid fysiologisk temperatur, pH och tonicitet är avgörande för att göra provet som livs-liknande som det kan vara. Högtrycks frysning (HPF) av prover kan bidra till att bevara en mer verklighetstrogsliknande situation, (eller kanske bara ge olika artefakter), men för andra än celler och mycket tunna vävnader HPF kommer att misslyckas som glaskroppen isen kan endast genereras i små volymer. Därför för många ifrågasätter kemisk fixering är det enda alternativet. Oavsett om fixeringen är HPF eller kemisk, i alla EM experiment de strukturella resultaten måste noga jämföras med liknande resultat från levande cell eller vävnad Imaging för att se om de är konsekventa. Färgning måste också optimeras med tanke på den specifika fråga som måste besvaras och det protokoll som kommer att användas för visualisering av digitala bilder.
Att ha både ett SBF-SEM-och FIB-system i närheten är en stor fördel i många experiment. Det stora synfält och hög X, Y upplösning av SBF-SEM gör att hitta enskilda strukturer/celler/händelser okomplicerad och ger en övergripande rumslig orientering av celler i vävnader. Dessutom är dess förmåga att tillåta avbildning genom ett prov i Z mycket kraftfull; dock kan rekonstruktioner som kräver fin geometrisk detalj misslyckas eller producera artefakter med hjälp av denna teknik på grund av icke-isotropiska voxels det genererar. FIB begränsas av fysiken i processen till ett mindre bildområde men dess 3D-upplösning är tillräcklig för mycket noggranna rekonstruktioner. Kombinera de två teknikerna är enkelt som prover kan flytta från SBF-SEM till FIB utan vidare bearbetning eller beredning. Vi erkänner att använda SBF-SEM för att söka igenom ett prov för att hitta ett visst område är en mycket dyr användning av en mycket mer kapabel verktyg. Men möjligheten att omedelbart se den nya blockface och avgöra om ROI har uppnåtts är en stor fördel. Dessutom kan alternativen att använda Serial semi-Thin (0,5 μm) LM sektioner ta bort små strukturer innan de upptäcks, och inspektera ett block med hjälp av enskilda TEM sektioner som måste skäras, sätta på ett rutnät och sedan ses i en lika dyr TEM är inte lika effektiv som den presenterade metoden.
Eftersom många program finns för att segmentera och återge data, och behoven hos en viss struktur kanske inte bäst betjänas av ett enda program, kan inget standardarbetsflöde föreslås. Vissa enkla strukturer kan segmenteras med en tröskelvärdes algoritm om de faller inom mycket smala gråskalevärden. Neuronala strukturer kan semi-automatiskt segmenteras med hjälp av ett program som Ilastik11 men det kommer att vara mindre användbar på mer slumpmässiga eller komplexa formade ORGANELLER som er. Microscopy bild beter är en mycket böjlig program så pass kanna rikta, avsnitten, och återge volym EM datan, utom behöver betydande förbrukaren växelverkan12. Som en allmän regel den tid som behövs för att digitalt visualisera resultaten kommer att kraftigt överstiga tiden för att förbereda provet och avbildning.
Volym EM-tekniker har öppnat den tredje dimensionen till ultrastrukturella analyser. Andra metoder för att få 3D EM har begränsningar i deras volym (TEM tomografi), eller deras effektivitet (seriell sektion TEM). Även om volym EM-teknikerna för det mesta är för komplicerade och kostsamma att genomföra i enskilda laboratorier, har antalet gemensamma kärn anläggningar som erbjuder dem ökat och antalet provtyper har vuxit snabbt. För dem med en specifik fråga och en viss vävnad är det troligt att någon kommer att kunna erbjuda råd och instruktioner om dess beredning och avbildning. Volym EM utrustning kan förbättras för att inkludera kapacitet att hantera större prover i SBF-SEM och förmågan att fräsning större ROIs med FIB. Programvara som kan segmentera ut strukturer av intresse på ett mer automatiserat sätt kommer att avsevärt förenkla processen för att analysera data och förbättringar i datorhastighet kommer att minska den tid som behövs för att göra det. Trots sina nuvarande begränsningar, är volym EM fortfarande ett användbart verktyg och kombinera SBF-SEM och FIB-SEM ger ett effektivt arbetsflöde för att identifiera sällsynta händelser och Imaging dem med hög upplösning.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Utrustningen för volym EM tillhandahölls av ett generöst bidrag från regeringen i Flandern.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3View 2XP | Gatan | NA | In chamber ultramicrotome for SBFI |
| Cacodylate buffer 0.2M solution | EM Sciences | 11652 | |
| Conductive epoxy resin (circuit works) | RS components | 496-265 | |
| Diatome Histo 4.0mm diamond knife | EM Sciences | 40-HIS | |
| Digitizing tablet | Wacom | DTV-1200W | No longer available |
| Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 120.094 | |
| Flat Embedding Mold | EM Sciences | 70900 | |
| Gluteraldehyde 25% solution | EM Sciences | 16220 | |
| High MW Weight Tannic Acid | EM Sciences | 21700 | |
| Lead Citrate | Sigma-Aldrich | 22861 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 746398 | |
| Osmium Tetroxide 4% solution | EM Sciences | 19170 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Pelco Biowave Pro + | Ted Pella | 36700 | |
| Potassium Ferrocyanide | Sigma-Aldrich | P3289 | |
| Quorum Q150T ES sputter coater | Quorum Technologies | 27645 | |
| Reichert-Jung Ultracut ultramicrotome | NA | NA | No longer available |
| Sodium Cacodylate 0.2M | EM Sciences | 11653 | |
| Spurrs Resin kit | EM Sciences | 14300 | |
| Uranyl Acetate | EM Sciences | 22400 |
References
- Linberg, K. A., Fisher, S. K. An ultrastructural study of interplexiform cell synapses in the human retina. Journal of Comparative Neurology. 243, 561-576 (1986).
- Peddie, C. J., Collinson, L. M. Exploring the third dimension: volume electron microscopy comes of age. Micron. 61, 9-19 (2014).
- Leighton, S. SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM – A technical note. Scanning Electron Microscopy. (pt 2), 71-76 (1981).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three dimensional tissue nanostructure. PLoS Biology. 11, 329 (2004).
- Heymann, J. A., Hayles, M., Gestmann, I., Giannuzzi, L. A., Lich, B., Subramaniam, S. Site specific 3D imaging of cells and tissues with a dual beam microscope. Journal of Structural Biology. 155 (1), 63-73 (2006).
- Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. NCMIR Methods for 3D EM: A new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. V7_01_10. , Available from: https://ncmir.ucsd.edu/sbem-protocol (2019).
- Giberson, R. T., Austin, R. L., Charlesworth, J., Adamson, G., Herrera, G. A. Microwave and digital imaging technology reduce turnaround times for diagnostic electron microscopy. Ultrastructural Pathology. 27 (3), 187-196 (2003).
- Kremer, A., et al. Developing 3D EM in a broad biological context. Journal of Microscopy. 259 (2), 80-96 (2015).
- Vanslembrouck, B., Kremer, A., Pavie, B., van Roy, F., Lippens, S., van Hengel, J. Three-dimensional reconstruction of the intercalated disc including the intercellular junctions by applying volume scanning electron microscopy. Journal of Histochemistry and Cell Biology. 149, 479-490 (2018).
- Russel, M. R., et al. 3D correlative light and electron microscopy of cultured cells using serial blockface scanning electron microscopy. Journal of Cell Science. 130 (1), 278-291 (2017).
- Sommer, C., Strähle, C., Köthe, U., Hamprecht, F. A. ilastik: Interactive Learning and Segmentation Toolkit. Eighth IEEE International Symposium on Biomedical Imaging (ISBI). Proceedings. , 230-233 (2011).
- Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy Image Browser: A Platform for Segmentation and Analysis of Multidimensional Datasets. PLoS Biology. 14 (1), e1002340 (2016).
