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Neuroscience

3-डी कोलेजन आधारित hydrogels की पीढ़ी तंत्रिका तंत्र के विकास के दौरान Axonal विकास और व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए

Published: June 25, 2019 doi: 10.3791/59481
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,2,3,4
1Molecular and Cellular Neurobiotechnology, Institute for Bioengineering of Catalonia (IBEC), The Barcelona Institute of Science and Technology (BIST), Parc Científic de Barcelona, 2Department of Cell Biology, Physiology, and Immunology, Universitat de Barcelona, 3Center for Networked Biomedical Research on Neurodegenerative Diseases (CIBERNED), 4Institute of Neuroscience, University of Barcelona

Summary

यहाँ, हम 3 डी matrices में बढ़ तेवरों के व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए एक विधि प्रदान करते हैं, उनके प्राकृतिक विकास की नकल करते हैं।

Abstract

इस प्रोटोकॉल की निगरानी और axonal विकास का विश्लेषण करने के लिए तीन आयामी (3-डी) hydrogel उत्पन्न करने के लिए प्राकृतिक प्रकार मैं कोलेजन का उपयोग करता है. प्रोटोकॉल एक 3-डी हाइड्रोजेल के अंदर भ्रूण या जल्दी प्रसवोत्तर कृंतक दिमाग के छोटे टुकड़े culturing पर केंद्रित है चूहे पूंछ कण्डरा व्युत्पन्न प्रकार मैं विशिष्ट porosity के साथ कोलेजन द्वारा गठित. ऊतक के टुकड़े hydrogel के अंदर सुसंस्कृत कर रहे हैं और विशिष्ट मस्तिष्क टुकड़े या आनुवंशिक रूप से संशोधित सेल समुच्चय का सामना करने के लिए उत्पादन और छिद्रमैट्रिक्स के अंदर एक ढाल बनाने के लिए उपयुक्त अणुओं स्रावित. इस प्रोटोकॉल के कदम सरल और reproduible हैं, लेकिन इसके विकास के दौरान ध्यान से विचार किया जा करने के लिए महत्वपूर्ण कदम शामिल हैं. इसके अलावा, बढ़ते एक्सॉन ्स्सकेशन के व्यवहार पर नजर रखी जा सकती है और प्रतिरक्षा-विक्षिप्त विधियों द्वारा निर्धारण के बाद एक चरण-विपरीत माइक्रोस्कोप या मोनो/मल्टीफोटोन फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करके सीधे विश्लेषण किया जा सकता है।

Introduction

न्यूरोनल एक्सॉन्स, एक्सॉनल विकास शंकु में समाप्त होने वाले, अपने उपयुक्त लक्ष्यों तक पहुंचने के लिए विशिष्ट रास्ते पर भ्रूण के एक्स्ट्राकोल्यूलर मैट्रिक्स (ईसीएम) के माध्यम से लंबी दूरी की दूरी तय करते हैं। वृद्धि शंकु एक्सॉन का दूरस्थ भाग होता है और कोशिका1,2के भौतिक और आण्विक वातावरण को समझना विशेष होता है . एक आणविक दृष्टिकोण से, विकास शंकु कम से कम चार अलग-अलग आणविक तंत्र द्वारा निर्देशित कर रहे हैं: संपर्क आकर्षण, chemoattraction, संपर्क प्रतिकर्षण, और chemorepulsion विभिन्न axonal मार्गदर्शन संकेतों3,4 द्वारा ट्रिगर , 5 , 6.संपर्क-मध्यस्थ प्रक्रियाओं को सूक्ष्म-पैटर्न वाले सबस्टरेटपर (जैसे, धारियोंकेसाथ 7,8 या धब्बे9 में अणुओं से युक्त) पर द्वि-आयामी (2D) संस्कृतियों में आंशिक रूप से निगरानी की जा सकती है। तथापि, पर्यावरण में गाइडपोस्ट कोशिकाओं से कई आकर्षक और प्रतिकर्षण अणुओं को संवेदनित करके एक्सॉन अपने लक्ष्य को गैर-विपरीत तरीके से प्राप्त कर सकते हैं4,5,10. यहाँ, हम 3-डी संस्कृति की एक आसान विधि का वर्णन करने के लिए जाँच करें कि क्या एक स्रावित अणु axons के विकास पर chemorepulsive या chemoattractive प्रभाव लाती है.

प्रारंभिक अध्ययन का उद्देश्य एक्सॉन मार्गदर्शन संकेतों के प्रभाव को निर्धारित करना था जो त्रि-आयामी (3-डी) मैट्रिक में एक्सप्लांट संस्कृतियों का उपयोग करते थे ताकि विवो स्थितियोंमेंअनुकरण करते हुए स्नातक उत्पन्न किया जा सके। इस दृष्टिकोण, एक साथ vivo प्रयोगों में, मार्गदर्शन संकेतों के चार प्रमुख परिवारों की पहचान के लिए अनुमति दी: Netrins, Slits, Semaphorins, और Ephrins4,5,6. इन आण्विक संकेतों और अन्य कारकों13 बढ़ते एक्सॉन द्वारा एकीकृत होते हैं , जिससे आसंजन परिसरों की गतिशीलता को ट्रिगर किया जाता है और साइटोस्केलेटन14,15,16के माध्यम से यांत्रिक बलों का रूपांतरण होता है . एक्सोनल नेविगेशन के लिए 3-डी संस्कृतियों में आणविक प्रवणता उत्पन्नकरने के लिए, अग्रणी शोधकर्ताओं ने प्लाज्मा थक्का 17 का उपयोग किया, जिसका उपयोग ऑर्गनॉटिपिक स्लाइस तैयारियों के लिए भी किया गया था 18 . तथापि, 1958 में, 3-डी कोलेजन हाइड्रोगेल्स उत्पन्न करने के लिए एक नए प्रोटोकॉल की सूचना मैक्सिमो के उपकरणोंकेसाथ अध्ययन करने के लिए की गई थी, जो एक संस्कृति मंच है, जिसका उपयोग सूक्ष्म प्रेक्षणों20के लिए उपयुक्त कई अध्ययनों में किया जाता है। एक अन्य अग्रणी अध्ययन ने घाव भरने की प्रक्रिया21में फाइब्रोब्लास्ट्स के मायओफाइब्रोब्लास्ट्स में फाइब्रोब्लास्ट के भेदभाव का अध्ययन करने के लिए मानव फाइब्रोब्लास्ट्स को एम्बेड करने के लिए एक उपकरण के रूप में कोलेजन जेल की सूचना दी . समानांतर में, Lumsden और Davies संवेदी तंत्रिका फाइबर22के मार्गदर्शन पर तंत्रिका विकास कारक (NGF) के putative प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए गोजातीय dermis से कोलेजन लागू किया. विभिन्न कंपनियों और प्रयोगशालाओं द्वारा नई संस्कृति प्लेटफार्मों (जैसे, बहु अच्छी प्लेटें) के विकास के साथ, कोलेजन संस्कृतियों इन नए उपकरणोंकेलिए अनुकूलित किया गया 6 ,23,24,25 ,26. समानांतर में, Engelbreth-Holm-Swarm ट्यूमर सेल लाइन से व्युत्पन्न ECM सामग्री का एक उद्धरण व्यावसायिक रूप से इन अध्ययनों का विस्तार करने के लिए उपलब्ध कराया गया था27.

हाल ही में, 3-डी हाइड्रोगेल्स (उदा., कोलेजन, फाइब्रिन, आदि) का उपयोग करके एक्सॉन मार्गदर्शन में महत्वपूर्ण भूमिकाओं के साथ आणविक प्रवणता उत्पन्न करने के लिए कई प्रोटोकॉल विकसित किए गए हैं। 28. वैकल्पिक रूप से, उम्मीदवार अणु को छिद्रयुक्त मैट्रिक्स (उदा., NGF29) में विभिन्न सांद्रता में स्थिर किया जा सकता है या 3-डी हाइड्रोजेल सेल के एक छोटे से क्षेत्र में एक त्रिज्या उत्पन्न करने के लिए अणु को स्रावित करके उत्पन्न किया जा सकता है ढाल4,23,24,25,26. अंतिम संभावना इस प्रोटोकॉल में समझाया जाएगा.

यहाँ प्रस्तुत प्रक्रिया भ्रूण माउस मस्तिष्क के 3-डी hydrogel संस्कृतियों में axonal विकास के विश्लेषण के आधार पर एक आसान, तेज और अत्यधिक reproduible विधि है. अन्य तरीकों के साथ तुलना में, प्रोटोकॉल अच्छी तरह से गैर प्रशिक्षित शोधकर्ताओं के लिए अनुकूल है और पूरी तरह से एक छोटी प्रशिक्षण के बाद विकसित किया जा सकता है (1-2 सप्ताह). इस प्रोटोकॉल में, हम पहले वयस्क चूहे पूंछ से कोलेजन को अलग करने के लिए आगे उत्पन्न 3-डी matrices जिसमें आनुवंशिक रूप से संशोधित सेल समुच्चय भ्रूण न्यूरॉन ऊतक के सामने सुसंस्कृत कर रहे हैं. ये कोशिका समुच्चय किसी उम्मीदवार अणु की रेडियल रासायनिक प्रवणता का निर्माण करती हैं जो बढ़ते अक्षों के लिए अनुक्रिया प्राप्त करती है। अंत में, बढ़ते एक्सॉन पर अणु के प्रभाव का मूल्यांकन आसानी से एक चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी या, वैकल्पिक रूप से, इम्यूनोसाइटोकेमिकल तरीकों का उपयोग करके किया जा सकता है।

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Protocol

सभी पशु प्रयोगों के दिशा निर्देशों और बार्सिलोना विश्वविद्यालय के पशु प्रयोग (CEA) के लिए नैतिक समिति के प्रोटोकॉल के तहत प्रदर्शन किया गया, और इस अध्ययन में कृन्तकों के उपयोग के लिए प्रोटोकॉल की समीक्षा की और के CEEA द्वारा अनुमोदित किया गया था बार्सिलोना विश्वविद्यालय (सीईईए अनुमोदन #276/

1. चूहा पूंछ कोलेजन की शुद्धि

  1. वयस्क Sprague-Dawley चूहा पूंछ (8-9 सप्ताह पुराने) ले लीजिए नैतिक दिशा निर्देशों का पालन पशु त्याग और 95% इथेनॉल में कुल्ला के बाद. बर्फ (4 डिग्री सेल्सियस) पर 2-4 पूंछ रखें और उन्हें इस प्रक्रिया के दौरान बर्फ के साथ कवर रखें।
  2. पूंछ tendons प्राप्त करने के लिए, एक hemostat का उपयोग कर पूंछ के सबसे पुच्छ कशेरुकी पर पूंछ को ठीक करने और पहले से 5-7 मिमी के आसपास तैनात एक दूसरे hemostat के साथ पूंछ सेक। दोनों hemostats के साथ तेजी से घुमा द्वारा पूंछ तोड़ो. ऐसा करने के लिए, कशेरुकी को कई बार मोड़ना/प्रकट करना जब तक कि यह टूट न जाए।
  3. यह बाहर आता है के रूप में उनके म्यान से tendons अलग करने के लिए hemostat के साथ धीरे धीरे कशेरुकी खींचो. इस समय, छोटे कैंची के साथ tendons में कटौती. बर्फ पर एक बाँझ 100 मिमी पेट्री पकवान में इन कण्डरा टुकड़े रखें.
  4. clamping दोहराएँ और पूंछ के बाकी के लिए फिसलने जब तक tendons पूरी तरह से निकाले जाते हैं.
  5. सभी प्राप्त पूंछ के लिए चरण 1-2-1.4 दोहराएँ।
  6. सूक्ष्मदर्शी के नीचे कण्डरा का प्रेक्षण कीजिए। छोटे कैंची से काटने और कण्डरा की शुद्धता में सुधार लाने के लिए सीधे ठीक बल के साथ पकड़े हुए रक्त वाहिकाओं को त्यागें और अल्ट्राप्योर पानी के साथ 3 बार कुल्ला करें।
  7. गीले टेंडन के 3-4 ग्राम लीजिए। कोमल सरगर्मी के तहत 24-36 ज के लिए 200-250 एमएल कांच शंकु फ्लास्क में 4 डिग्री सेल्सियस पर 3% हिमनदीय ऐसीटिक एसिड के 150 एमएल में कण्डरा को भंग करें।
  8. 1 ज के लिए 20,000 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज। समानांतर में, लगभग 10-15 सेमी लंबाई में डायलिसिस ट्यूबिंग झिल्ली तैयार करें और इसे 15 मिनट के लिए 1 मीटर एथिलीनडायमिनेटेट्राएसेटिक एसिड (EDTA) युक्त अल्ट्राप्यूर पानी में उबालें। इसके बाद, धीरे अल्ट्राप्यूर पानी के साथ डायलिसिस झिल्ली को अच्छी तरह से कुल्ला।
  9. अपकेंद्रण के बाद, अपकेंद्रण द्वारा डायलिसिस ट्यूबिंग झिल्ली में सुपरनेंट एकत्र करें। गोली अम्लीय अघुलनशील सामग्री (गैर-कोलेजन प्रोटीन) होता है और supernatant घुलनशील कोलेजन प्रोटीन होता है।
  10. एक 2-5 एल ग्लास बीकर में 2 एल बाँझ 0.1x न्यूनतम आवश्यक मध्यम ईगल (एमईएम), पीएच 4.0 के खिलाफ supernatant dialyze. 3 दिनों के लिए Dialyze. 0.1x एमईएम समाधान को दिन में कम से कम दो बार बदलें, उपयोग करने से पहले हर परिवर्तन पर पीएच की जाँच करें। यदि चह मूल हो गया है, तो इसे 0ण्1 एम एसिटिक अम्ल की कुछ बूंदों के साथ तब तक संशोधित करें जब तक कि pH 4.0 न हो जाए।
  11. डायलिसिस के बाद, डायलीज़्ड कोलेजन समाधान में एंटीबायोटिक्स (1.5 एमएल पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन (पेन-स्ट्रेप)) जोड़ें। कोलेजन स्टॉक समाधान के 5 एमएल एलिकोट्स बनाएं और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: इस बिंदु से, सभी हैंडलिंग प्रक्रियाओं एक laminar प्रवाह हुड में बाँझ शर्तों के तहत किया जाना चाहिए.
  12. अगले चरणों के बाद तैयार कोलेजन स्टॉक समाधान के जेलेशन परीक्षण के साथ आगे बढ़ें।
    1. चूंकि शेयर कोलेजन आमतौर पर भी ध्यान केंद्रित किया जाता है, 0.1x एमईएम, पीएच 4.0 में शेयर को कम करके 3 काम करने वाले कमजोर पड़ने (75%, 50%, और 25% कोलेजन समाधान) तैयार करें। अंतिम मात्रा प्रत्येक काम कमजोर पड़ने के लिए सिफारिश की 5 एमएल है. प्रत्येक स्थिति में, एक प्रोटीन colorimetric परख का उपयोग कर प्रोटीन एकाग्रता की जाँच करें.
    2. कई खाली 1.5 एमएल शंकु अपकेंद्रित्र ट्यूब रखें (प्रत्येक काम कमजोर पड़ने के लिए एक), 10x एमईएम ट्यूब, 7.5% सोडियम बाइकार्बोनेट समाधान और बर्फ पर कोलेजन के विभिन्न काम कमजोर पड़ने। रुको जब तक इन ठंडा कर रहे हैं.
    3. 10x एमईएम के 40-50 डिग्री सेल्सियस को ठंडे (4 डिग्री सेल्सियस) अपकेंद्रित्र ट्यूब में जोड़ें। इसके बाद इसे सोडियम बाइकार्बोनेट विलयन के 7-8 डिग्री सेल्सियस के साथ धीरे-धीरे मिला लें।
    4. इस ट्यूब के लिए अलग कोलेजन कमजोर पड़ने में से एक के 310-330 $L जोड़ें और किसी भी बुलबुला गठन से बचने पिपेट के साथ धीरे से मिश्रण. कोलेजन-एमईएम-सोडियम बाइकार्बोनेट मिश्रण को कम से कम 5 मिनट के लिए बर्फ (4 डिग्री सेल्सियस) पर रखें।
    5. एक 35 मिमी पेट्री डिश में मिश्रण के Pipette 10-25 डिग्री सेल्सियस.
    6. सीओ2 इनक्यूबेटर में पेट्री डिश को 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट रखें जब तक कि हाइड्रोजेल ($ 15-20 मिनट) का जेलेशन नहीं मनाया जाता है।
    7. विभिन्न पेट्री व्यंजनों में शेष कोलेजन कमजोर पड़ने के लिए चरण 1.12.3-1.12.6 दोहराएँ।
    8. कोलेजन काम कमजोर पड़ने कि सबसे अच्छा परिणाम renders का चयन करें.
      नोट: सबसे अच्छा gelled hydrogel एक समान पारदर्शी बनावट, ग्रे रंग होना चाहिए और lumpy या stringy नहीं होना चाहिए. हमारे अनुभव में, 3:1 के कमजोर पड़ने (Collagen: 0.1x एमईएम) सबसे अच्छा प्रयोगात्मक परिणाम उत्पन्न करता है.

2. सेल की तैयारी (COS1) समग्र आनुवंशिक रूप से संशोधित 3-डी कोलेजन hydrogels में एक उम्मीदवार अणु गुप्त करने के लिए

  1. प्लेट 2 x 106 COS1 कोशिकाओं में एक 35 मिमी पेट्री व्यंजन और पूरी संस्कृति माध्यम के साथ इनक्यूबेट 10% युक्त डी-एमईएम के 100 एमएल से बना (vol/vol) गर्मी-इनएक्टिवभ्रूण गोजातीय सीरम, 0.5% (wt/vol) glutamine और 1% (wt/vol) पेन / इनक्यूबेटर, आदेश में रात भर 70-80% संगम तक पहुँचने के लिए। प्रत्येक transfection प्रक्रिया के लिए एक पेट्री पकवान तैयार करें।
  2. अगले दिन डीएनए के साथ transfect COS1 कोशिकाओं उम्मीदवार अणु एन्कोडिंग (Netrin-1 या Sema3E) निर्माता के निर्देशों का पालन liposome आधारित transfection विधि का उपयोग कर.
    1. ऐसा करने के लिए, सीरम मुक्त मध्यम और डीएनए के 250 डिग्री सेल्सियस मिश्रण (1-2 शर्त प्रति ग्राम) एक 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब (डीएनए ट्यूब) और मिश्रण करने के लिए। कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट (आरटी) 5 मिनट के लिए एक दूसरी ट्यूब (liposomal ट्यूब) सीरम मुक्त मध्यम के 240 डिग्री सेल्सियस और liposomal ट्रांसफेक्शन अभिक्रियक के 10 डिग्री सेल्सियस जोड़कर तैयार करें। 5 मिनट के लिए आरटी में इनक्यूबेट।
    2. ऊष्मायन के बाद, liposomal ट्यूब के लिए डीएनए ट्यूब की सामग्री जोड़ने और धीरे मिश्रण. अब 15 मिनट के लिए आरटी में इनक्यूबेट करें। सुसंस्कृत कोशिकाओं पर माध्यम को सीरम-मुक्त माध्यम के 1.5 एमएल से बदलें और पेट्री डिश में डीएनए-लिपोसोम मिश्रण को धीरे-धीरे धीरे ड्रॉपवार जोड़ें। सीओ2 सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में 3 एच के लिए इनक्यूबेट।
  3. ट्रांसफेक्शन इनक्यूबेशन के 3 एच के बाद, माध्यम को पूरी संस्कृति माध्यम के साथ बदलें और इनक्यूबेटर में रात भर इनक्यूबेट करें।
  4. अगले दिन, 0.1 एम Dulbecco के फॉस्फेट बफर नमकीन (डी-पीबीएस) के साथ कोशिकाओं कुल्ला, Trypsin-EDTA के साथ संस्कृतियों का इलाज (800 $L सीओ2 इनक्यूबेटर में 5-15 मिनट के लिए प्रत्येक डिश के लिए) और पूरी संस्कृति मध्यम के 15 एमएल के साथ अलग कोशिकाओं को इकट्ठा.
  5. 5 मिनट के लिए 130 x ग्राम पर 4 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें। अपकेंद्रण के बाद, मीडिया को हटा दें और बर्फ पर COS1 कोशिकाओं युक्त गोली की रक्षा.
  6. कोलेजन काम मिश्रण तैयार करने के लिए कदम 1.12.3-1.12.6 दोहराएँ.
  7. ट्रांसफेक्टेड कोशिकाओं की गोली के लिए कोलेजन मिश्रण के 100-150 डिग्री सेल्सियस जोड़ें और धीरे से ऊपर और नीचे pipeting द्वारा मिश्रण और एक पेट्री डिश (35 मिमी व्यास) पर इस मिश्रण के 45-50 डिग्री सेल्सियस फैला लगभग लंबाई में 1-1.5 सेमी की कोलेजन कोशिकाओं की एक समान बैंड के रूप में. इस व्यंजन को 37 डिग्री सेल्सियस (5% ब्व्2) में तब तक रखें जब तक कि जेलेशन ($ 15-20 मिनट) मनाया न जाए।
  8. एक दूसरी संस्कृति पकवान में नियंत्रण कोशिकाओं (मॉक ट्रांसफेक्शन) युक्त एक दूसरी पट्टी तैयार करें और इसे इनक्यूबेटर में प्लेट करें ($ 15-20 मिनट) और जब जेलेशन पूरा हो जाता है तो 3-4 एमएल गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) COS1 पूरी संस्कृति मध्यम को जेलेड युक्त प्रत्येक डिश में जोड़ें कोलेजन कोशिकाओं स्ट्रिप्स और उन्हें सीओ2 सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में रहते हैं। इसके बाद, एक ठीक स्केलपेल या एक ऊतक हेलिकॉप्टर का उपयोग करके छोटे चौकोर टुकड़े (400 से 500 डिग्री मी) उत्पन्न करने के लिए कोलेजन-सेल्स स्ट्रिप्स को काट दें।
  9. एक ही transfection हालत से न्यूरोनल संस्कृति मीडिया (NCM) के 3-3.5 एमएल युक्त एक पेट्री डिश के लिए सभी वर्गों स्थानांतरण और टुकड़े की गुणवत्ता एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत की जाँच करें। फिर, उन्हें सीओ2 सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में रखें।
    नोट: तंत्रिका संवर्धन माध्यम में न्यूरोबेसल माध्यम होता है जिसमें 1-5% (vol/vol) हीट-इनएक्टिव्ड हॉर्स सीरम, 2 एमएम ग्लूटामाइन, 0.5% (wt/vol) ग्लूकोज, 1% (wt/vol) पेन-स्ट्रेप समाधान और 0.044% (wt/vol) NaHCO3. सुनिश्चित करें कि पीएच 7-2-7.3 के बीच है।

3. संस्कृति के लिए भ्रूण एक पौधा की पीढ़ी

  1. नियमित नसबंदी दिशानिर्देशों का पालन करते हुए ऑटोक्लेविंग द्वारा सर्जिकल उपकरण (स्किपर, स्केलपेल ब्लेड हैंडल, सीधे और घुमावदार संदंश) को स्टरलाइज़ करें। समानांतर में है हांक संतुलित नमक समाधान-ग्लूकोज बफर और 4-5 पेट्री व्यंजन (100 मिमी व्यास) HBSS-जी के 10 एमएल युक्त 500 एमएल तैयार करते हैं। इन प्लेटों को बर्फ (4 डिग्री सेल्सियस) पर रखें।
  2. गर्भवती महिला चूहा बलिदान (भ्रूण दिन 16.5) बाँझ क्षेत्र के बाहर, अनुमोदित नैतिक प्रक्रियाओं का पालन. भ्रूण सींग को पेट की गुहा से कैंची से काटें और इसे एक बड़े पेट्री डिश में रखें जिसमें ठंड HBSS-G है।
  3. लैमिनर प्रवाह हुड में पकवान प्लेस और सीधे forceps के साथ भ्रूण निकालने. उन्हें ठंडे HBSS-जी युक्त एक नए पकवान में रखें। इसके बाद, छोटे संदंश का उपयोग करके भ्रूण की त्वचा को हटा दें और घुमावदार और सीधे संदंश का उपयोग करके मस्तिष्क को सावधानीपूर्वक विभाजित करें। उन्हें ठंडे HBSS-जी युक्त एक डिश में रखें।
  4. विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, मिडलाइन के साथ मस्तिष्क को आधे में काट लें ताकि दोनों गोलार्द्धों को स्केलपेल या ठीक कैंची से अलग किया जा सके और मस्तिष्क के टुकड़ों से डाइएन्सेफेलन, मेनिंग्स और रक्त वाहिकाओं को ठीक संदगों के साथ हटा दिया जाए।
  5. बाकी भ्रूणों के साथ 3-3-3-4 के चरण दोहराएँ। ऊतक की गुणवत्ता को बनाए रखने के लिए 2 से अधिक ज के विच्छेदन में देरी न करें।
  6. 100% इथेनॉल (विशेष रूप से polytetrafluoroethylene (PTFE) काटने प्लेट और उस्तरा ब्लेड के साथ ऊतक हेलिकॉप्टर के सभी भागों को साफ करें। 15 मिनट के लिए यूवी रोशनी के तहत स्तरीय फ्लक्स हुड में ऊतक हेलिकॉप्टर रखें।
  7. प्रत्येक ऊतक टुकड़ा स्थानांतरण (उदा., हिप्पोकैम्पस के साथ प्रांतस्था) ऊतक हेलिकॉप्टर के काटने की थाली के लिए. हिप्पोकैम्पस के लिए, यह रेजर ब्लेड के सीधा जगह है और मोटाई में 450-500 डिग्री मीटर के ऊतक वर्गों प्राप्त करते हैं।
  8. पूरा NCM के 3-4 एमएल के साथ कई 35 मिमी पेट्री व्यंजन तैयार है और पेट्री व्यंजन के लिए ऊतक हेलिकॉप्टर प्लेट से ऊतक टुकड़े हस्तांतरण। कई व्यंजन की जरूरत हो सकती है के रूप में ब्याज के क्षेत्रों को विभाजित कर रहे हैं.
  9. ठीक टंगस्टन सुइयों का उपयोग कर पूरा NCM में ऊतक विच्छेदन समाप्त करें। विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत प्राप्त स्लाइस की गुणवत्ता की जाँच करें. सुनिश्चित करें कि परतों अंधेरे क्षेत्र प्रकाशिकी में स्पष्ट रूप से पहचाने जाने योग्य हैं और ब्याज के क्षेत्र विच्छेदन (जैसे, हिप्पोकैम्पस के सीए क्षेत्र) टंगस्टन सुइयों के साथ. क्षतिग्रस्त स्लाइस छोड़ें. सीओ2 इनक्यूबेटर में पूर्ण NCM माध्यम में हिप्पोकैम्पस एक्सप्लांट रखें।

4. कोलेजन हाइड्रोगेल्स में 3-डी सह-संस्कृति की तैयारी

  1. परतीय प्रवाह हुड में कई बाँझ 4-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटें प्लेस और एक कोलेजन काम मिश्रण तैयार के रूप में पहले कदम 1.12.2-1.12.6 में संकेत दिया.
  2. एक परिपत्र कोलेजन आधार का उत्पादन करने के लिए एक अच्छी तरह से नीचे में hydrogel मिश्रण के 15-20 डिग्री सेल्सियस रखें। शेष कुओं के लिए इस चरण को दोहराएँ। हाइड्रोजेल बेस से अत्यधिक तरल वाष्पीकरण से बचने के लिए एक ही समय में पांच से अधिक प्लेटें तैयार न करें।
  3. इनक्यूबेटर में व्यंजन को तब तक रखें जब तक कि पूरा जेलेशन ($ 15-20 मिनट) मनाया जाता है और प्लेटों को इनक्यूबेटर से बाहर ले जाते हैं, केवल जेलेशन पूरा होने पर। gelled कोलेजन की गुणवत्ता की जाँच करें.
  4. एक पिपेट के साथ COS1 सेल समुच्चय का एक छोटा सा टुकड़ा स्थानांतरण। इसे हाइड्रोजेल बेस पर रखें और एक एक पौधा-आकार पर कुल कोशिकाओं के टुकड़े के करीब एक पिपेट के साथ एक ही आधार पर एक ऊतक टुकड़ा रखें।
  5. 1.12.2-1.12.6 के चरणों में बर्फ पर एक नया कार्य कोलेजन मिश्रण तैयार करें।
  6. इस नए मिश्रण के 15-20 डिग्री सेल्सियस पिपेट को धीरे-धीरे कवर करें और एक्सप्लांट और सेल समुच्चय को कवर करें। सैंडविच की तरह हाइड्रोजेल संस्कृति मनाया जाएगा। इस समय, एक ठीक टंगस्टन सुई के साथ explant फिर से उन्मुख (COS1 सेल कुल स्पर्श नहीं!), तो यह $ 500-600 m पर सेल कुल चेहरे.
  7. जब तक जेलेशन मनाया जाता है इनक्यूबेटर को प्लेट वापस करें ($ 10-15 मिनट), और 0.5 एमएल पूर्ण NCM 2% B27 पूरक के साथ पूरक और इनक्यूबेटर में 36 से 48 एच के लिए संस्कृतियों रखने के लिए (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2)।

5. एक्सप्लांट-सेल सकल सह-संस्कृति और इम्यूनोसाइटोकेमिकल प्रक्रिया का निर्धारण

  1. 36-48 एच ऊष्मायन के बाद, मध्यम निकालें और 0.1 एम फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस), पीएच 7.3 के साथ कुल्ला। इसके बाद, 0.1 एम फॉस्फेट बफर (पीबी), पीएच 7.3, 4 डिग्री सेल्सियस में 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड के साथ 1 एच के लिए संस्कृतियों को ठीक करें।
  2. fixative निकालें और धीरे संस्कृतियों कुल्ला 3-4 बार (10-15 मिनट प्रत्येक) 0.1 एम पंजाब में, पीएच 7.3.
  3. स्पैचुला या संदंश के साथ कुएं के नीचे से हाइड्रोजेल सैंडविच को अलग करें। 0.5% गैर-आयनिक डिटर्जेंट के साथ 0.1 एम पीबीएस युक्त एक 6-वेल संस्कृति प्लेट के लिए एक ठीक तूलिका के साथ कोलेजन ब्लॉक स्थानांतरण।
  4. अवरुद्ध समाधान में इनक्यूबेट मुक्त चल hydrogels (10% सीरम, 0.5% गैर-आयनिक सर्फैक्टेंट, और 0.1 एम पीबीएस में 0.2% जिलेटिन) के लिए 2-3 एच के लिए आरटी में कोमल आंदोलन के साथ.
  5. कुल्ला 3 बार (10-15 मिनट प्रत्येक) 0.1 एम पीबीएस 0.5% गैर-आयनिक सर्फैक्टेंट युक्त के साथ।
  6. पीबीएस में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट जिसमें 5% सीरम, 0.5% गैर-आयनिक सर्फैक्टेंट, 0.2% जिलेटिन, और 0.02% सोडियम अज़ीदे होते हैं। एक शेकर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 36-48 एच के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट।
    नोट: आमतौर पर वर्ग III के विरुद्ध एक एंटीबॉडी (जेड-TUJ-1) (कम 1:2,000) का उपयोग 3-डी हाइड्रोगेल संस्कृतियों में एक्सोनल वृद्धि को परिभाषित करने के लिए किया जाता है।
  7. ऊष्मायन के बाद, चरण 5.5 में कुल्ला करें।
  8. आरटी में 4 एच के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट (या 6-7 एच 4 डिग्री सेल्सियस पर) 5% सीरम में पतला एक शेकर पर, 0.5% गैर-आयनिक सर्फैक्टेंट, और 0.2% जिलेटिन। इस प्रयोग में एक घोड़ा एंटी-माउस बायोटिनलेट्ड एंटीबॉडी (पतला 1:200) का उपयोग किया जाता है।
  9. 5.5 में के रूप में कुल्ला संस्कृतियों.
  10. avidin-बायोटिन परिसर (एबीसी) समाधान 1:100 5% सीरम, 0.5% गैर-आयनिक सर्फैक्टेंट, और 0.2% जिलेटिन युक्त पीबीएस में पतला 1:100 के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 दिनों के लिए संस्कृतियों इनक्यूबेट। वैकल्पिक रूप से, एक ही बफर में हॉर्सराडिश peroxidase (एचआरपी)-टैग किए गए स्ट्रेप्टाविडिन (कम 1:300-400) का उपयोग करें।
  11. कुल्ला संस्कृतियों के रूप में 5.5 में वर्णित है.
  12. 0.1 एम Tris-HCl बफर, पीएच 7.6 के साथ संस्कृतियों कई बार कुल्ला 1 एच के लिए.
  13. 0.1 एम ट्राइस-एचसीएल, पीएच 7.6 में 3,3-डायमिनोबेन्जिन टेट्राहाइड्रोक्लोराइड (डीएबी) समाधान के 0.03% के साथ संस्कृतियों को इनक्यूबेट करें।
  14. 1% एच2ओ2 के 5-8 $L जोड़ें और 10-15 मिनट प्रतीक्षा करें। 4-10x उद्देश्य का उपयोग करके माइक्रोस्कोप के तहत DAB के विकास की निगरानी करें।
  15. 0.1 M Tris-HCl बफर, पीएच 7.6 के साथ DAB समाधान को हटाने के द्वारा प्रतिक्रिया बंद करो.
  16. 30 मिनट (कई परिवर्तन) के लिए पीबीएस में संस्कृतियों कुल्ला.
  17. जलीय आधारित बढ़ते मीडिया का उपयोग कर कांच स्लाइड पर hydrogels माउंट.
  18. की लंबाई और hydrogel के अंदर axons के वितरण का विश्लेषण शोल विश्लेषण प्लग में या ImageJ सॉफ्टवेयर30के लिए NeuriteJ प्लग के साथ का उपयोग कर.

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Representative Results

यहाँ, हम भ्रूण माउस तंत्रिका तंत्र के 3-डी हाइड्रोजेल कोलेजन संस्कृतियों में axonal विकास का अध्ययन करने के लिए एक व्यापक रूप से सुलभ पद्धति प्रस्तुत करते हैं। यह अंत करने के लिए, हम वयस्क चूहे पूंछ से कोलेजन अलग 3-डी matrices जिसमें हम आनुवंशिक रूप से संशोधित सेल समुच्चय व्यक्त Netrin-1 या Sema3E भ्रूण न्यूरॉन ऊतक के साथ सामना (जैसे, हिप्पोकैम्पस के सीए क्षेत्र) को सुसंस्कृत. इन कोशिका समुच्चयों ने कोलेजन मैट्रिक्स के अंदर उम्मीदवार अणु की एक त्रियी रूप से वितरित प्रवणता का निर्माण किया। अंत में, विभिन्न अणुओं के लिए न्यूरोनल प्रतिक्रिया का मूल्यांकन करने के लिए, हम इम्यूनोसाइटोकेमिकल विधियों का उपयोग कर संस्कृतियों लेबल (उदाहरण के लिए, जेड-TUJ-1) और एक सरल और आसान परिमाणीकरण विधि लागू करने से, हम पर्याप्त डेटा प्राप्त करने के लिए putative के प्रभाव का निर्धारण axonal व्यवहार पर उम्मीदवार.

हमारे प्रयोग में, जब हिप्पोकैम्पस एक्सॉन्स का सामना नेट्रिन-1 से होता था, तो ये एक्सॉनने नेट्रिन-1 के स्रोत की ओर वरीयता से वृद्धि की जो यह इंगित करती है कि नेट्रिन-1 इन एक्सॉन्स के लिए एक रसोआकर्षक अणु के रूप में कार्य करता है (चित्र 1बी)। इसके विपरीत, जब हिप्पोकैम्पस एक्सॉन्स जहां सेमा3ई-स्रावी कोशिकाओं का सामना करते हैं, तो उनमें से अधिकांश सेल समुच्चय के विपरीत हो गए जो यह दर्शाता है कि सेमा3ई उनके लिए एक रसायनात्मक अणु है (चित्र1ब्)। नियंत्रण स्थिति (मोक ट्रांसफेक्शन) में, सभी एक्सॉन किसी दिशात्मक वरीयता के बिना रेडियल रूप से बढ़े (चित्र 1ए)। चित्र 1 डी-ई एक्सोनल अनुक्रिया और परिमाणीकरण विधि के योजनाबद्ध निरूपण हैं। छवि प्राप्ति के बाद, हमने एक्सप्लांट के मध्य में एक रेखा खींची जो समीपस्थ (सेल समुच्चय के निकट) और वितल (सेल समुच्चय के विपरीत) समीपस्थ अनुपात (P/D अनुपात) की गणना करने के लिए विघटित (सेल समुच्चय के विपरीत) को सीमित करती है। नियंत्रण स्थितियों में अक्षों को दोनों वृत्ताकारों (विकिरण वृद्धि) में समान रूप से वितरित किया जाता था, जो एक अनुपात चध ध 1 ( चित्र 1 ड)कासंकेत देते थे। जब एक्सप्लांट्स ने डिस्टल (संकेत केमोर्टेन्ट) की तुलना में समीपस्थ वृत्त का चतुर्थ भाग में एक्सॉनों की संख्या में वृद्धि दिखाई तो यह अनुपात चध एवं 1 (चित्र 1ई) था और जब एक्सॉनों की संख्या में की तुलना में दूरस्थ वृत्तका में अधिक थी समीपस्थ एक (केमोरपुलेशन का संकेत) अनुपातपी/

आदेश में इस तकनीक के साथ उत्कृष्ट परिणाम प्राप्त करने के लिए, हमें यकीन है कि कोलेजन बहुलकीकरण समरूप है बनाना चाहिए, सेल transfection कुशल है, और ऊतक explant और सेल कुल के बीच की दूरी उपयुक्त है (चर्चा देखें).

अंत में, हम पुष्टि कर सकते हैं कि 3-डी कोलेजन आधारित hydrogels की पीढ़ी के क्रम में उम्मीदवार मार्गदर्शन अणुओं जो axonal प्रवास में आवश्यक भूमिका निभा सकता है के लिए axonal विकास और व्यवहार प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन करने के लिए एक उपयोगी तकनीक है तंत्रिका तंत्र के विकास.

Figure 1
चित्र 1 : टकराव प्रयोगों और परिमाणीकरण विधियों में 3-डी हाइड्रोगेल्स में बढ़ने वाले एक्सप्लांट्सके उदाहरण . (ए-सी) एक्सप्लांट्स E14.5 में हिप्पोकैम्पस क्षेत्र से प्राप्त किए गए थे, जो इन विट्रो में 48 एच के लिए सुसंस्कृत थे, और इम्यूनोस्टेनिंग द्वारा $III-टूबुलिन (जेड-टीयूजे-1) के साथ लेबल किए गए थे। अक्षीय वृद्धि में अंतर को दृष्टिसे में देखा जा सकता है। कृपया तुलना करें (ए) (बी -सी) (डी-ई) अक्षीय अनुक्रिया और परिमाणीकरण विधि के योजनाबद्ध निरूपण। डॉटेड रेखा समीपस्थ (च) तथा वितल (D) वृत्तपाद दोनों को सीमांकित करती है, ताकि अनुपात P/D. अनुपात चध े 1 वृद्धि के एक रेडियल पैटर्न का प्रतिनिधित्व करता है (D); P/D gt; 1 एक रसायनात्मक प्रतिक्रिया को इंगित करता है (ई) और P/ संक्षिप्त नाम: CA ] CA1-3 हिप्पोकैम्पस क्षेत्रों; D ] जिला वृत्त का चतुर्थ भाग; पी जेड आसन्न वृत्त का चतुर्थ भाग। स्केल बार्स ] 200 डिग्री मी (ए-सी)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

Axons के विकास मुख्य रूप से आक्रामक है और ECM गिरावट और remodeling भी शामिल है. यहाँ प्रस्तुत प्रक्रिया का उपयोग करते हुए, शोधकर्ताओं ने एक समरूप 3-डी मैट्रिक्स प्राप्त कर सकते हैं जो प्राकृतिक प्रकार मैं कोलेजन द्वारा गठित है जिसमें एक्सॉन (या कोशिकाओं) आनुवंशिक रूप से संशोधित कोशिकाओं द्वारा स्रावित एक रासायनिक ढाल के लिए प्रतिक्रिया कर सकते हैं के रूप में वे विवो में करते हैं. आकर्षक या निरोधात्मक संकेतों (प्रोटीन, लिपिड, आदि) के प्रवणताओं के लिए विभिन्न अक्षीय प्रतिक्रियाओं की तुलना विशिष्ट नियंत्रण (मॉक ट्रांसफेक्टेड कोशिकाओं) से आसानी से की जा सकती है। लाभ के रूप में, हम उल्लेख करना चाहिए कि tendons को अलग करने के लिए आसान कर रहे हैं और वास्तव में वे पशु प्रयोग के अवशेष हो सकता है. इसके अलावा, tendons अत्यधिक कोलेजन मैं इस तरह की त्वचा या फेफड़ों31के रूप में अन्य ऊतकों की तुलना में ध्यान केंद्रित कर रहे हैं.

हालांकि यहाँ प्रस्तुत पद्धति प्रदर्शन करने के लिए सरल है, वहाँ कुछ कदम है कि इस प्रक्रिया के दौरान विशेष ध्यान देने की जरूरत है. कोलेजन निष्कर्षण के बारे में, यह अवांछित रक्त वाहिकाओं और पूंछ tendons से त्वचा के मलबे को दूर करने के क्रम में कोलेजन शुद्धता और जेलेशन की गुणवत्ता में सुधार करने के लिए आवश्यक है. इसके अलावा, यह एक बाँझ लेमिनर प्रवाह हुड के तहत कुछ कदम प्रदर्शन और उपयोग करने से पहले शल्य चिकित्सा उपकरण बाँझ द्वारा बाँझ शर्तों को बनाए रखने के लिए अनिवार्य है। इसके अलावा, यह समाधान के उपयुक्त पीएच और तापमान की स्थिति को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, यदि एमईएम 10x और बाइकार्बोनेट समाधान इष्टतम नहीं हैं, तो कोलेजन मैट्रिक्स सजातीय रूप से बहुलक नहीं होगा, और इसके परिणामस्वरूप, एक्सोनल विकास और परिणाम नकारात्मक रूप से प्रभावित होंगे। इसके अलावा, अगर कोलेजन शेयर समाधान भी ध्यान केंद्रित या बहुत पतला है, matrices ठीक से जेल नहीं होगा. हमारे अनुभव में, सबसे अच्छा कोलेजन स्टॉक एकाग्रता लगभग है 5-5.5 प्रोटीन की मिलीग्राम /एमएल (एक colorimetric प्रोटीन परख किट द्वारा निर्धारित) और हम एक का उपयोग करें 3:1 कमजोर पड़ने (Collagen: 0.1x एमईएम) सही hydrogel matrices प्राप्त करने के लिए. सेल ट्रांसफेक्शन और सेल समुच्चय गठन के बारे में, बाँझ स्थितियों को बनाए रखना और संभावित संदूषण से बचने के लिए महत्वपूर्ण है, उदाहरण के लिए, एंडोटॉक्सिन मुक्त प्लाज्मिड डीएनए शोधन किट के साथ प्लास्मिड वेक्टरकोश करना अनिवार्य है। इसके अलावा, हम पर जोर देना चाहिए कि transfection शर्तों सेल प्रकार के आधार पर बदलती हैं, मार्ग संख्या, और प्लाज्मिड विशेषताओं. यहाँ, हम अपने हाथों में इष्टतम और नियमित स्थितियों की सूचना दी है. इसलिए, शोधकर्ताओं को निर्माता द्वारा इंगित की गई अनुशंसित सांद्रता का परीक्षण करना चाहिए या उन्हें अपने इष्टतम स्थितियों का निर्धारण करने के लिए समायोजित करना चाहिए।

इस तकनीक के साथ उत्पन्न होने वाली समस्याओं के बारे में, हमें विचार करना चाहिए कि कभी-कभी 3-डी मैट्रिक्स अपेक्षित सजातीय जेल जैसी संरचना प्रस्तुत नहीं करते हैं। इस मामले में, समाधान के तापमान और पीएच स्थिति की जांच करना और गलत होने की स्थिति में उन्हें त्यागना महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, कोलेजन स्टॉक तैयारी की शुद्धता को मान्य करने के लिए शर्तों को कम करने के तहत पॉलीऐक्रिलमाइड जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस (एसडीएस-पेज) जैसे गुणवत्ता नियंत्रण परीक्षण करने की सिफारिश की जाती है। इस दृष्टिकोण के साथ, शुद्ध और अहानिकर प्रकार I कोलेजन एक विशिष्ट प्रवास पैटर्न दिखाता है जिसमें 2 मोनोमेरिक जेड शृंखला ($1 और $2), 3 डिमेरिक जेड चेन ($11, $12, भिन्न $11), और 1 त्रिएरिक ] शृंखला32,33शामिल हैं। यदि प्राप्त कोलेजन इस पैटर्न फिट नहीं है, यह इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए. अंत में, इम्यूनोस्टेनिंग के बाद, एक्सॉन रेडियल रूप से वितरित दिखाई दे सकते हैं जब एक रसायनात्मक या रसायनात्मक अणु स्रावित कोशिकाओं के साथ सामना किया जाता है। इस स्थिति में, transfection की दक्षता उचित सह संस्कृति प्रणाली पर एक डॉट blotting तकनीक प्रदर्शन करके जाँच की जानी चाहिए (यदि डीएनए प्लाज्मिड क्षारीय फॉस्फेट-टैग कर रहे हैं) या पश्चिमी द्वारा transfection के बाद संस्कृति मीडिया प्रसंस्करण द्वारा सोख्ता. एक सीमा पर विचार करने के लिए है कि सेल कुल और ऊतक explant के बीच की दूरी महत्वपूर्ण है. यदि वे बहुत दूर हैं, हम ऊतक explant पर स्रावित अणु के किसी भी स्पष्ट प्रभाव को देखने में सक्षम नहीं होगा, लेकिन अगर वे बहुत एक दूसरे के करीब हैं, प्रभाव भी एक अच्छा परिणाम के रूप में माना जा मजबूत हो जाएगा. हमारे अनुभव से, उपयुक्त दूरी एक एक्सप्लांट-आकार (400-500 उ) के आस-पास होती है क्योंकि कोशिका कुल द्वारा उत्पन्न आण्विक प्रवणता संस्कृति में 24 ज के बाद 400-500 उ के साथ विकिरणी रूप से विस्तृत होगी।

वैकल्पिक रूप से, एक चूहे पूंछ कोलेजन के बजाय वाणिज्यिक ट्यूमर व्युत्पन्न ECM निकालने का उपयोग कर सकते हैं. उस मामले में, सभी प्रक्रियाओं के बीच में प्रदर्शन किया जाना चाहिए 4 और 10 डिग्री सेल्सियस, वाणिज्यिक ECM निकालने के gelation के बाद से तापमान पर निर्भर है. इस प्रकार, सभी संस्कृति व्यंजन, पिपेट टिप्स, संस्कृति मीडिया, और समाधान 4 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा जाता है सुनिश्चित करने के लिए विशेष ध्यान रखा जाना चाहिए।

अंत में, हालांकि विधि यहाँ प्रस्तुत मुख्य रूप से इस तरह के axonal विकास या न्यूरॉन प्रवास के रूप में न्यूरॉन कार्यों के विश्लेषण के साथ जुड़ा हुआ है, यह भी औषधीय स्क्रीनिंग, आसंजन परख, इन विट्रो फाइब्रिलेशन के लिए एक उपयोगी तकनीक बन जाता है प्रयोगों और ऊतक इंजीनियरिंग रणनीतियों34,35,36.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

लेखकों ने तकनीकी सहायता के लिए संपादकीय सलाह और एम सेगुरा-Feliu के लिए टॉम Yohannan धन्यवाद. इस कार्य को CERCA कार्यक्रम द्वारा वित्त पोषित किया गया था और विश्वविद्यालयों और नवाचार विभाग, विश्वविद्यालयों, और जनरलिट डे Catalunya (SGR2017-648) के उद्यम के अनुसंधान के लिए आयोग द्वारा. इस काम को स्पेन के अनुसंधान, नवाचार और विश्वविद्यालय (MEICO) द्वारा BFU2015-67777-R और RTI2018-099773-B-100, स्पेनिश Prion नेटवर्क (Prionet स्पेन AGL2017-90665-REDT) के माध्यम से वित्त पोषित किया गया था, और कार्लोस संस्थान कार्लोस III, CIED () PRY-2018-2).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets (DAB) Sigma D5905
Adult Sprague-Dawley rats (8 to 9 weeks old)  Criffa-Credo, Lyon, France
Avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) Vector Labs PK-4000
B27 serum-free supplement 50x  Invitrogen 17504-044
Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit Pierce 23225
cDNA plasmid vectors
COS1 cell lines ATTC CRL-1570
D-(+)-Glucose Sigma 16325
D-(+)-glucose (45% solution in water) for complete Neurobasal medium Sigma G8769
D-MEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium 1x ) for COS1 culture medium Invitrogen 41966-029
Dulbecco’s phosphate buffered saline 10x (without Ca2+ and Mg2++) (D-PBS) for cultures Invitrogen 14200
Ethanol  merck 108543
Ethylenediaminetetraacetic acid dihydrate disodium salt (EDTA) Sigma E5134
Fluorescence mounting media (e.g., Fluoromount-G or similar) Electron Microscopy Sciences (EMS) 17984-25
Gelatin powder  Sigma G1890
Glacial acetic acid (Panreac, cat. no. 211008) Panreac 211008
Hank’s balanced salt solution  Invitrogen 24020083
Heat-inactivated foetal bovine serum  Invitrogen 10108-165
Heat-inactivated horse serum  Invitrogen 26050-088
Hydrogen peroxide (H2O2, 32 to 33% in water) Sigma 316989
L-glutamine 200 mM solution (100x) for complete Neurobasal and COS1 medium Invitrogen 25030-024
Lipofectamine 2000 Reagent Invitrogen 11668-019
Mice pregnant female (embryonic day 12.5 to 16.5; E12.5-16.5)  Criffa-Credo, Lyon, France
Modified Minimum Essential Medium Eagle (MEM) Invitrogen 11012-044
Monoclonal antibody against class III β-tubulin (clone TUJ-1) Biolegend 801201
N-2 supplement 100x  Invitrogen 17502-048
Neurobasal medium  Invitrogen 21103049
Paraformaldehyde Merck 1,040,051,000
Penicillin/streptomycin solution 100x  Invitrogen 15140-22
Phosphate buffered saline 10x (PBS) for immunocytochemistry Invitrogen AM9624
Secondary antibody: biotinylated horse anti-mouse  Vector Labs BA-2000
Serum-free medium (Opti-MEM) Invitrogen 11058-021
Sodium azide  Panreac 162712
Sodium bicarbonate solution 7.5%  Invitrogen 25080-094
Sterile culture grade H2O  Sigma W3500
TritonTM X-100  Sigma X100
Trizma base  Sigma T1503
Trypsin-EDTA (Trypsin (0.05% (wt/vol) with EDTA (1x) Invitrogen 25300-054
Equipment
1 large and 1 small curved scissors for dissection  Fine tools Instruments or similar
1.5 mL conical centrifuge tubes  Eppendorf or similar
15 mL conical centrifuge tubes  Corning or similar
2 haemostats   Fine tools Instruments or similar
2 small straight dissecting scissors Fine tools Instruments or similar
200 mL centrifuge tubes for centrifugation Nalgene or similar
200 mL sterile glass conical flasks
2 L glass beaker
4- and 6-well culture plates  Nunc 176740 and 140675
Automatic pipette pumps and disposable 10 mL and 25 mL filter-containing sterile plastic pipettes. Gilson, Brand, Eppendorf or similar 
Automatic pipettes, sterile filter tips and current sterile tips  Gilson, Eppendorf or similar
Bench top microcentrifuge with angle fixed rotor  Eppendorf, Beckman Coulter or similar
Bench top refrigerated centrifuge with swing-bucket rotor (with 1.5, 15 and 50 mL tube adaptors) Eppendorf, Beckman Coulter or similar
Cell culture incubator at 37 °C, 5% CO2 and 95% air
Dialysis tubing cellulose membrane Sigma D9402
Dialysis tubing closures  Sigma Z37101-7
Disposable glass pipettes
Dissecting microscope with dark field optics  Olympus SZ51 or similar 
High-speed refrigerated Beckman Coulter centrifuge or similar with angle fixed rotor
Laminar flow hood
Large 100 mm, 60 mm and small 35 mm Ø cell culture dishes  Nunc  150679 , 150288 and 150318, respectively
Magnetic stirrer and magnetic spin bars IKA or similar
McIlwain tissue chopper Mickle Laboratory Engineering
One pair of fine straight forceps and one pair of curved forceps  Fine tools Instruments or similar
Razor blades for the tissue chopper
Scalpels (number 15 and 11)
Two pairs of fine spatulas for transferring collagen and tissue pieces Fine tools Instruments or similar

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References

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Gil, V., Del Río, J. A. Generation of 3-D Collagen-based Hydrogels to Analyze Axonal Growth and Behavior During Nervous System Development. J. Vis. Exp. (148), e59481, doi:10.3791/59481 (2019).

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