Summary
ここでは、3Dマトリックスで軸を成長させる行動を分析し、その自然な発達を模倣する方法を提供する。
Abstract
このプロトコルは、自然なタイプIコラーゲンを使用して、軸生成長を監視および分析するための3次元(3D)ヒドロゲルを生成します。このプロトコルは、ラット尾腱由来I型コラーゲンによって形成された3Dヒドロゲル内の胚または早期産後げっ歯類の脳の小片を特定の多孔性を持つ培養に集中する。組織片はヒドロゲル内で培養され、特定の脳断片または遺伝子組み換え細胞凝集体に直面して、多孔質マトリックス内の勾配を作成するのに適した分子を生成し、分泌する。このプロトコルの手順はシンプルで再現可能ですが、開発中に慎重に検討する重要な手順が含まれています。さらに、成長軸子の挙動は、免疫細胞化学的方法による固定後の位相コントラスト顕微鏡またはモノ/マルチフォトン蛍光顕微鏡を使用して直接監視および分析することができる。
Introduction
軸次成長コーンで終わる神経軸子は、適切な標的に到達するために、特定の経路上の胚の細胞外マトリックス(ECM)を通して長い距離を移動する。成長コーンは軸の遠位部分であり、細胞1、2の物理的および分子環境を感知することに特化している。分子の観点から、成長コーンは少なくとも4つの異なる分子メカニズムによって導かれる:接触引力、化学的魅力、接触反発、および異なる軸方向ガイダンスキュー3、4によって引き起こされる化学脈動,5,6.接触媒介プロセスは、マイクロパターン基板上の2次元(2D)培養物(例えば、分子を含むストライプ7、8またはスポット9)で部分的に監視することができる。しかし、軸ゴンは、環境4、5、10のガイドポスト細胞からいくつかの魅力的で反発性の分子を感知することによって、非拡散的な方法で標的にナビゲートすることができます。ここでは、分泌分子が軸子の発達に化学的または化学的な効果を誘導するかどうかを確認するための3-D培養の簡単な方法について説明する。
軸次誘導キューの効果を決定することを目的とした最も初期の研究は、生体内条件11,12でシミュレートする勾配を生成するために3次元(3-D)行列に植生培養物を使用した。このアプローチは、生体内実験と共に、ネトリン、スリット、セマフォリン、およびエフリン4、5、6の4つの主要な家族の同定を可能にした。これらの分子キューおよび他の因子13は、成長する軸ソンによって統合され、接着複合体のダイナミクスを引き起こし、細胞骨格14、15、16を介して機械的力を伝達する。軸次ナビゲーションのための3D培養物中の分子勾配を生成するために、先駆的な研究者は、プラズマ血栓基板17を使用し、これはまた、組織性スライス製剤18に使用された。しかし、1958年に、3-Dコラーゲンヒドロゲルを生成する新しいプロトコルは、マキシモ・イズ・デバイス19、培養プラットフォーム、顕微鏡観察20に適したいくつかの研究で使用される研究のために報告された。別の先駆的研究は、創傷治癒プロセス21における筋線維芽細胞の分化を研究するためのヒト線維芽細胞を埋め込むためのツールとしてコラーゲンゲルを報告した。並行して、ラムズデンとデイヴィスはウシ真皮からコラーゲンを適用し、感覚神経線維22の誘導に対する神経成長因子(NGF)のプテプティブ効果を解析した。異なる企業や研究室による新しい培養プラットフォーム(例えば、マルチウェルプレート)の開発に伴い、コラーゲン培養はこれらの新しいデバイス6、23、24、25に適応しました。 、26.並行して、エンゲルブレス-ホルム-スウォーム腫瘍細胞株に由来するECM材料の抽出物は、これらの研究27を拡大するために市販された。
最近では、3Dヒドロゲル(例えば、コラーゲン、フィブリンなど)を用いた軸次ガイダンスにおいて、置き方の役割を有する分子勾配を生成するいくつかのプロトコルが開発されている。28.あるいは、候補分子は、多孔質マトリックス中の異なる濃度(例えば、NGF29)で固定化するか、分子を分泌する3-Dヒドロゲル細胞凝集体の小さな領域で培養することによって生成され、放射状を生成することができる。グラデーション4,23,24,25,26.最後の可能性は、このプロトコルで説明されます。
ここで提示される手順は、胚マウス脳の3-ヒドロゲル培養における軸生成長の分析に基づく、簡単で迅速かつ高い再現性の方法である。他の方法と比較して、プロトコルは、非訓練を受けた研究者に適しており、短いトレーニング(1-2週間)後に完全に開発することができます。このプロトコルでは、まず成ラットの尾からコラーゲンを分離し、遺伝子改変された細胞凝集体が胚性神経組織の前で培養される3Dマトリックスをさらに生成する。これらの細胞凝集体は、成長する軸子に対する応答を引き出す候補分子の放射状化学勾配を形成する。最後に、成長軸石に対する分子の効果の評価は、相コントラスト顕微鏡または、あるいは、あるいは、免疫細胞化学的方法を用いて容易に行うことができる。
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Protocol
すべての動物実験は、バルセロナ大学の動物実験倫理委員会(CEEA)のガイドラインとプロトコルの下で行われ、この研究でげっ歯類を使用するためのプロトコルは、CEEAによってレビューされ、承認されました。バルセロナ大学(CEEAの承認#276/16と141/15)。
ラットテールコラーゲンの精製
- 倫理的なガイドラインに従って動物を犠牲にした後、成虫スプラーグドーリーラットの尾(8-9週間齢)を収集し、95%のエタノールですすいでください。氷(4°C)の上に2-4尾を置き、プロセス中に氷で覆われたままにしておきます。
- 尾腱を得るために、ヘモスタットを使用して尾の最も尾骨椎で尾を固定し、最初から約5〜7ミリメートルの位置に第二のヘモスタットで尾を圧縮します。両方のヘモスタットで鋭くねじって尻尾を壊します。これを行うには、椎骨が壊れるまで数回折り畳み/展開します。
- 椎骨を止め剤でゆっくりと引っ張り、腱を鞘から取り外します。この瞬間、小さなはさみで腱を切ります。これらの腱片を無菌の100mmペトリ皿に氷の上に保管してください。
- 腱が完全に抽出されるまで、尾の残りの部分のためにクランプとスライドを繰り返します。
- 取得したすべての尾について、手順 1.2~1.4 を繰り返します。
- 顕微鏡で腱を観察する。小さなはさみで切断し、腱の純度を向上させるためにストレート細かい鉗子で保持し、超純水で腱を3回すすいで、血管を廃棄します。
- 湿った腱の3-4グラムを収集します。200-250 mLガラス円錐フラスコで4°Cで3%氷河酢酸の150mLの150mLで腱を溶かし、穏やかな撹拌の下で。
- 1時間20,000 x gの遠心分離機。並行して、長さ約10〜15cmの部分を切断して透析チューブ膜を調製し、1mMエチレンディアミンテトラセチン酸(EDTA)を含む超純水で15分間沸騰させます。その後、透析膜を超純水で十分に洗い流します。
- 遠心分離後、デカンテーションにより透析チューブ膜に上清を採取する。ペレットには酸性不溶性物質(非コラーゲンタンパク質)が含まれており、上清には可溶性コラーゲンタンパク質が含まれています。
- 無菌0.1x最小必須ミディアムイーグル(MEM)の2Lに対して上清を透析し、2-5 LガラスビーカーでpH 4.0。透析を3日間。使用する前に、少なくとも1日2回、変更ごとにpHをチェックして0.1x MEM溶液を変更してください。pHが基本に変わった場合は、pHが4.0になるまで0.1M酢酸を数滴で修正します。
- 透析後、透析コラーゲン溶液に抗生物質(ペニシリン/ストレプトマイシン(ペンストレプ菌)の1.5mL)を加えます。コラーゲンストック溶液の5mLアリコットを作り、4°Cで保存します。
注:この点から、すべての取り扱い手順は、層流フード内の無菌条件下で行う必要があります。 -
次のステップに続いて調製したコラーゲンストック溶液のゲル化試験を進めます。
- ストックコラーゲンは通常濃縮されすぎるので、0.1x MEM、pH 4.0でストックを希釈することにより、3つの作動希釈(75%、50%、および25%コラーゲン溶液)を調記します。各作業希釈に推奨される最終容積は5 mLです。各条件で、タンパク質の色分計アッセイを使用してタンパク質濃度を確認します。
- いくつかの空の1.5 mL円錐遠心管チューブ(各作業希釈のための1つ)、10x MEMチューブ、7.5%重炭酸ナトリウム溶液と氷上のコラーゲンの異なる働き物希釈を配置します。これらが冷却されるまで待ちます。
- 寒い(4 °C)遠心管に10x MEMの40-50 μLを加える。次に、重炭酸ナトリウム溶液の7-8 μLと穏やかに混ぜます。
- このチューブに異なるコラーゲン希釈剤の310-330 μLを追加し、任意の気泡形成を避けるピペットと穏やかに混合します。コラーゲン-MEM-重炭酸ナトリウム混合物を氷(4°C)に少なくとも5分間保管してください。
- 35mmペトリ皿に混合物のピペット10-25 μL。
- ヒドロゲルのゲル化(±15~20分)が観察されるまで、37°Cに設定したCO2インキュベーターにペトリ皿を置きます。
- 異なるペトリ皿の残りのコラーゲン希釈については、手順1.12.3-1.12.6を繰り返します。
- 最良の結果をレンダリングするコラーゲン作業希釈を選択します。
注:最高のゲル化ヒドロゲルは、均一な半透明のテクスチャ、灰色を持っている必要があり、塊状またはストリンシーであってはならない。私たちの経験では、3:1(コラーゲン:0.1x MEM)の希釈は、最良の実験結果を生成します。
2. 細胞の調製(COS1)遺伝子組み換え3-Dコラーゲンヒドロゲル中の候補分子を分泌するために遺伝子組み換え
- プレート 2 x 106 COS1 細胞を 35 mm ペトリ皿に入れ、10% (vol/vol) 熱不活性化胎児ウシ血清、0.5%(wt/vol)グルタミンおよび1%(wt/vol)ペン/ストレップを含むD-MEMの100mLで構成された完全培養培地でインキュベート一晩で70-80%の合流に達するために、インキュベーター。トランスフェクション手順ごとにペトリ皿を1つ準備します。
-
翌日、製造業者の指示に従ってリポソームベースのトランスフェクション法を用いて候補分子(Netrin-1またはSema3E)をコードするDNAを用いてCOS1細胞をトランスフェクトする。
- これを行うには、250 μL の無血清培地とDNA(条件当たり1-2 μg)を1.5mL遠心管(DNAチューブ)に混合し、混合します。室温(RT)で5分間インキュベートし、無血清培地の240μLとリポソームトランスフェクション試薬の10μLを加えて第2管(リポソームチューブ)を調製する。RTで5分間インキュベートします。
- インキュベーション後、リポソームチューブにDNAチューブの含有量を加え、穏やかに混合する。RTで15分間インキュベートし、培養細胞上の培地を無血清培地の1.5mLで置き換え、DNAリポソーム混合物をペトリ皿にゆっくりと滴下します。CO2細胞培養インキュベーターで3時間インキュベートする。
- トランスフェクションインキュベーションの3時間後、培地を完全な培養培地に置き換え、インキュベーターで一晩インキュベートする。
- 翌日、0.1Mダルベッコのリン酸緩衝生理食生(D-PBS)で細胞をすすいで、トリプシン-EDTA(CO2インキュベーターで5〜15分間1皿あたり800μL)で培養物を処理し、完全培養培地の15mLで剥離した細胞を集める。
- 細胞を4°Cで130 x gで5分間遠心分離します。遠心分離後、培地を取り出し、COS1細胞を含むペレットを氷上に保存します。
- 手順1.12.3-1.12.6を繰り返し、コラーゲン作業混合物を調製します。
- トランスフェクト細胞のペレットにコラーゲン混合物の100-150 μLを加え、この混合物の45-50 μLを上下にパイプで穏やかに混合し、ペトリ皿(直径35mm)に広げ、長さ約1〜1.5cmのコラーゲン細胞の均一なバンドを形成します。ゲル化(±15-20分)が観察されるまで、37°C(5%CO2)で皿をインキュベーターに入れます。
- 第2の培養皿に対照細胞(模擬トランスフェクション)を含む第2のストリップを準備し、インキュベーター(±15〜20分)にプレートし、ゲル化が完了すると、ゲル化した(37°C)COS1完全培養培地をゲル化した各皿に3-4mLを加えるコラーゲン細胞は剥離し、CO2細胞培養インキュベーターに保持します。その後、コラーゲン細胞ストリップを切断し、細かいメスまたは組織チョッパーを使用して小さな正方形の部分(長さ400〜500μm)を生成します。
- 同じトランスフェクション条件から3-3.5 mLのニューロン培養培養剤(NCM)を含むペトリ皿にすべてのセクションを移し、解剖顕微鏡下で断片の品質を確認します。繰り返しますが、CO2細胞培養インキュベーターに保管してください。
注:神経培養培地は、1-5%(vol/vol)熱不活性化馬血清、2mMグルタミン、0.5%(wt/vol)グルコース、1%(wt/vol)ペンストレップ溶液および0.044%(wt/vol)NaHCO3を含有する神経基剤培地から成り立っている。pH が 7.2 ~ 7.3 の間にあることを確認します。
3. 培養用胚性移植の生成
- 定期的な滅菌ガイドラインに従ってオートクレーブによって外科用具(はさみ、メスの刃のハンドル、まっすぐおよび曲げられた鉗子)を殺菌する。並行して、ハンクのバランス塩溶液-グルコースバッファーの500 mLとHBSS-Gの10 mLを含む4-5ペトリ皿(直径100mm)を準備します。これらのプレートを氷(4°C)の上に置きます。
- 承認された倫理的手順に従って、無菌領域の外で妊娠中の雌ラット(胚性16.5)を犠牲にする。腹腔からはさみで胚の角を切り、冷たいHBSS-Gを含む大きなペトリ皿に入れます。
- 皿を層流フードに入れ、まっすぐな鉗子で胚を抽出する。冷たいHBSS-Gを含む新しい皿にそれらを置きます。次に、小さな鉗子を使用して胚の皮膚を取り除き、湾曲した直進鉗子を使用して慎重に脳を解剖する。冷たいHBSS-Gを含む皿に入れます。
- 解剖顕微鏡の下で、メスまたは細かいはさみで両方の半球を分離し、細かい鉗子で脳片からジエンセファロン、髄膜および血管を除去するために、中間線に沿って半分に脳を切断します。
- 残りの胚と共に手順 3.3-3.4 を繰り返します。組織の質を維持するために2時間以上解剖を遅らせないで下さい。
- 100%エタノール(特にポリテトラフルオロエチレン(PTFE)切断プレートとカミソリブレード)で組織チョッパーのすべての部分をきれいにします。ティッシュチョッパーをUV照明の下で層流束フードに15分間保管してください。
- 各組織片(例えば、海馬を含む皮質)を組織チョッパーの切断板に移す。海馬の場合は、カミソリの刃に垂直に配置し、厚さ450〜500μmの組織切片を得る。
- 完全なNCMの3-4 mLといくつかの35ミリメートルペトリ皿を準備し、ティッシュチョッパープレートからペトリ皿にティッシュピースを転送します。関心のある地域が解剖されるにつれて、多くの料理が必要になる場合があります。
- 細かいタングステン針を使用して完全なNCMで組織解剖を終了します。解剖顕微鏡下で得られたスライスの品質を確認してください。層が暗視野光学で明確に識別できることを確認し、タングステン針で対象領域(例えば海馬のCA領域)を解剖する。破損したスライスを破棄します。海馬の移植片をCO2インキュベーターで完全なNCM培地に保管してください。
4. コラーゲンヒドロゲルにおける3D共培養物の調製
- 層流フードにいくつかの滅菌4ウェル培養プレートを配置し、手順1.12.2-1.12.6で前述のようにコラーゲン作業混合物を調製します。
- ヒドロゲル混合物の15〜20 μLをウェルの底部に入れ、円形コラーゲンベースを作製する。残りの井戸に対してこの手順を繰り返します。ヒドロゲルベースからの過度の液体蒸発を避けるために、同時に5枚以上のプレートを準備しないでください。
- 完全なゲル化(±15-20分)が観察されるまでインキュベーターで皿を保ち、ゲル化が完了したときにのみインキュベーターからプレートを取り出します。ゲル化したコラーゲンの品質を確認してください。
- 小さなCOS1セル凝集体をピペットで転送します。ヒドロゲルベースの上に置き、1つの植生サイズで凝集する細胞の部分に近いピペットで同じベースにティッシュピースを置きます。
- ステップ1.12.2-1.12.6のように氷の上に新しい働くコラーゲン混合物を準備します。
- この新しい混合物の15-20 μLを穏やかにピペットし、植物および細胞凝集体をカバーする。サンドイッチ状のヒドロゲル培養が観察されます。この瞬間、微細なタングステン針で植生を再配向し(COS1細胞凝集体に触れないでください!)、±500-600 μmで細胞凝集体に直面します。
- ゲル化が観察されるまでプレートをインキュベーターに戻し(±10-15分)、完全なNCMの0.5 mLを2%B27サプリメントで補充し、インキュベーターで36~48時間培養を保ちます(37°C、5%CO2)。
5. 移植細胞凝集共培養物の固定化と免疫細胞化学的手順
- 36-48時間のインキュベーション後、培地を取り出し、0.1Mリン酸緩衝生理食生(PBS)、pH 7.3ですすいですすいだ。その後、0.1Mリン酸バッファー(PB)、pH 7.3、4°Cで4%パラホルムアルデヒドで1時間培養物を固定する。
- 固定性を取り除き、0.1 M PB、pH 7.3で培養物を3~4回(各10~15分)軽くすすいで下します。
- ヘラまたは鉗子で井戸の底からヒドロゲルサンドイッチを取り外します。細かいペイントブラシでコラーゲンブロックを0.5%の非イオン洗剤で0.1M PBSを含む6ウェル培養プレートに移します。
- ブロッキング溶液中の自由浮遊ヒドロゲル(10%血清、0.5%非イオン界面活性剤、0.1M PBSで0.2%ゼラチン)を穏やかな攪拌でRTで2-3時間インキュベートします。
- 0.5%の非イオン界面活性剤を含む0.1 M PBSで3回(各10〜15分)すすいでいます。
- 5%の血清、0.5%の非イオン界面活性剤、0.2%ゼラチン、および0.02%のアジドナトリウムを含むPBSで希釈した一次抗体を含むインキュベートする。シェーカー上の4°Cで36-48hの一次抗体でインキュベートします。
注:通常、クラスIIIβ-チューブリン(α-TUJ-1)に対する抗体(希釈1:2,000)は、3-ヒドロゲル培養における軸上成長を定義するために使用される。 - インキュベーション後、ステップ5.5のようにすすいで下す。
- 5%の血清、0.5%の非イオン界面活性剤、および0.2%ゼラチンで希釈したシェーカー上でRT(または4°Cで6-7h)の二次抗体でインキュベートします。この実験では、馬の抗マウスビオチン化抗体(希釈1:200)を用いた。
- 5.5のように文化をすすいで。
- 5%の血清、0.5%の非イオン界面活性剤、および0.2%のゼラチンを含むPBSで1:100希釈したアビジンビオチン複合体(ABC)溶液で4°Cで2日間培養する。あるいは、同じバッファー内にワサビペオキシドペルオキシダーゼ(HRP)タグ付きストレプトアビジン(希釈1:300-400)を使用する。
- 5.5に記載されている培養物をすすいでくる。
- 0.1 M Tris-HCl バッファーで培養物を数回すすいで、pH 7.6 を 1 時間使用します。
- 0.1 Mトリス-HCl、pH 7.6で3,3'-ダイアミノベンジジンテトラ塩酸塩(DAB)溶液の0.03%で培養をインキュベートします。
- 1%H2 O2の5-8 μLを追加し、4-10倍の目的を使用して顕微鏡下でDABの開発を監視し、10-15分待ちます。
- 0.1 M Tris-HCl バッファー pH 7.6 で DAB 溶液を除去して反応を停止します。
- PBSの培養物を30分間すすいで(いくつかの変更)。
- 水性ベースの取り付け媒体を使用して、ヒドロゲルをガラススライドに取り付けます。
- Sholl分析プラグインを使用して、またはImageJソフトウェア30用NeuriteJプラグインを使用して、ヒドロゲル内の軸ゴンの長さと分布を分析します。
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Representative Results
ここでは、胚性マウス神経系の3Dヒドロゲルコラーゲン培養における軸上成長を研究するために広くアクセス可能な方法論を提示する。この目的のために、成体ラットの尾からコラーゲンを単離し、ネトリン-1またはSema3Eを発現する遺伝子組み換え細胞凝集体を培養した3Dマトリックスを生成し、胚性神経組織(例えば、海馬のCA領域)と対峙した。これらの細胞凝集体は、コラーゲンマトリックス内の候補分子の放射状に分布する勾配を形成した。最後に、異なる分子に対する神経応答を評価するために、免疫サイト化学的方法(例えば、α-TUJ-1)を用いて培養物を標識し、簡潔で簡単な定量法を適用することにより、プタギュレーションの効果を決定するのに十分なデータを得た。軸上の行動の候補。
我々の実験では、海馬軸がNetrin-1に直面したとき、これらの軸がNetrin-1の供給源に向かって優先的に成長し、Netrin-1がこれらの軸子の化学魅力的な分子として作用することを示す(図1B)。対照的に、Sema3E分泌細胞と対峙した海馬軸基は、Sema3Eが血球体分子であることを示す細胞凝集体とは反対に成長した(図1C)。制御条件(模擬トランスフェクション)では、すべての軸が方向優先なしで放射状に成長しました(図1A)。図 1D-Eは、軸応答および定量法の概略表現である。画像取得後、近位/遠位比(P/D比)を算出するために、近位(細胞凝集体に近い)と遠位(細胞凝集体に近い)象限を区切る先植えの真ん中に線を描いた。制御条件では、軸子は、比率 P/D = 1 (図 1D)を示す両方の象限(放射状の外伸)に均等に分布しました。遠位(化学的興奮を示す)と比較して近位象限における軸索の数が増加したことを示した場合、比率はP/D > 1 (図1E)であり、遠位象限の数が遠位象限の数がそれよりも高かった場合近位1(chemorepulsionを示す)の比率はP/D<1(図1F)であった。
この技術で優れた結果を達成するためには、コラーゲン重合が均質であり、細胞透過が効率的であり、組織移植と細胞凝集体との間の距離が適切であることを確認する必要があります(議論参照)。
結論として、3-コラーゲンベースのヒドロゲルの生成は、軸次移動中に重要な役割を果たすことができる候補ガイダンス分子に対する軸上の成長および行動応答を評価するための有用な技術であることを確認できる。神経系の発達。
図 1: 対立実験および定量法における3-Dヒドロゲル中に成長する移植の例。(A-C)E14.5で海馬領域から外来を得て、インビトロで48時間培養し、免疫染色によりβIII-チューブリン(α-TUJ-1)を標識した。軸の成長の違いは、視覚的に観察することができます。(A)と(B-C)を比較してください。(D-E)軸応答および定量法の概略表現。点線は、P/D比P/D =1の比率を計算するために、近位(P)と遠位(D)象限の両方を区切り、成長の放射状パターンを表します(D)。P/D > 1 は化学反応(E) を示し、P/D < 1 は化学脈的効果 (F) を示します。略語: CA = CA1-3 海馬領域;D = 遠位象限;P = 近位象限。スケールバー = 200 μm (A-C)。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
アクソンの開発の成長は主に侵襲的であり、ECMの劣化および改造を含む。ここで提示される手順を使用して、研究者は、軸質(または細胞)が生体内で行うように遺伝子組み換え細胞によって分泌される化学勾配に応答することができる天然タイプIコラーゲンによって形成された均質な3Dマトリックスを得ることができます。魅力的または阻害性の手がかり(タンパク質、脂質など)の勾配に対する異なる軸応答は、特定の対照(模擬トランスフェクト細胞)と容易に比較することができる。利点として、腱は分離しやすく、実際に動物実験の残骸となりうることを言及する必要があります。また、腱は、皮膚や肺31などの他の組織と比較して濃縮された高いコラーゲンである。
ここで説明する方法は簡単に実行できますが、プロセス中に特別な注意が必要な手順がいくつかあります。コラーゲン抽出に関しては、コラーゲンの純度とゲル化の質を向上させるために、尾腱から不要な血管や皮膚の破片を除去することが不可欠です。また、無菌層流フードの下でいくつかのステップを実行し、使用前に手術用具を殺菌することにより、滅菌条件を維持することが必須です。また、溶液の適切なpHおよび温度条件を維持することが重要である。例えば、MEM 10xおよび重炭酸塩溶液が最適でない場合、コラーゲンマトリックスは均質に重合せず、その結果、軸の成長と結果は悪影響を受けます。また、コラーゲンストック溶液が濃縮されすぎたり希釈しすぎたりすると、マトリックスが適切にゲル化しません。私たちの経験では、最高のコラーゲンストック濃度は約5-5.5mg/mLのタンパク質(着色タンパク質アッセイキットで定量)であり、我々は完璧なヒドロゲルマトリックスを得るために3:1希釈(コラーゲン:0.1x MEM)を使用しています。細胞トランスフェクションおよび細胞凝集体形成に関しては、滅菌条件を維持し、可能な汚染を避けるために重要であり、例えば、エンドトキシンフリープラスミドDNA精製キットを用いたプラスミドベクターの精製は必須である。また、トランスフェクション条件は細胞の種類、通過数、プラスミド特性によって異なることです。ここでは、最適で日常的な条件を私たちの手の中で報告しました。したがって、研究者は、メーカーによって示された推奨濃度をテストするか、独自の最適な条件を決定するためにそれらを調整する必要があります。
この技術で発生する可能性のある問題に関しては、3-D行列が期待される均質なゲル状構造を示さない場合があることを考慮する必要があります。この場合、溶液の温度とpH状態を確認し、それが間違っている場合にそれらを廃棄することが重要です。また、コラーゲンストック調製の純度を検証する条件下で、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)を脱失などの品質管理試験を行うことをお勧めします。このアプローチでは、純粋で損傷のないタイプIコラーゲンは、2つの単量体α鎖(α1およびα2)、3つの薄暗いβ鎖(β11、β12、変異型β11)、および1トリメリックγ鎖32、33からなる典型的な遊発パターンを示す。得られたコラーゲンがこのパターンに適合しない場合は使用しないでください。最後に、免疫染色後、軸が血球体または化学魅力的な分子を分泌する細胞に直面すると放射状に分布して現れることがある。このような状況では、適切な共培養システム(DNAプラスミドがアルカリホスファターゼタグである場合)にドットブロッティング技術を実行するか、または西洋によるトランスフェクション後の培養培地を処理することによって、トランスフェクションの効率をチェックする必要があります。あぶら とり。考慮すべき制限は、細胞凝集体と組織の植生との間の距離が重要である。それらが非常に離れている場合、我々は組織の植生に分泌された分子の明確な効果を見ることができないだろうが、それらが互いに非常に近い場合、効果は良い結果として考えられません。私たちの経験から、細胞凝集体によって生成された分子勾配は培養中24時間後に400-500 μmに沿って放射状に伸びるので、適切な距離は約1つの最適サイズ(400-500 μm)です。
あるいは、ラットテールコラーゲンの代わりに市販の腫瘍由来ECM抽出物を用いることができる。その場合、市販のECM抽出物のゲル化は温度依存であるため、すべての手順は4~10°Cの間で行わなければならない。したがって、すべての培養料理、ピペットの先端、培養媒体、および溶液が4°Cで維持されるように特別な注意を払う必要があります。
最後に、ここで提示される方法は、主に軸線増殖や神経移動などの神経機能の分析に関連しているが、それはまた、薬理学的スクリーニング、接着アッセイ、インビトロ線維化のための有用な技術となる実験と組織工学戦略34,35,36.
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
著者は、編集上のアドバイスのためのトム・ヨハンナンと技術的な援助のためのM.セグラ・フェリウに感謝します。この研究は、CERCAプログラムとイノベーション学科、大学、およびカタルーニャ総局の企業の大学と研究委員会(SGR2017-648)によって資金提供されました。この研究は、BFU2015-67777-RとRTI2018-099773-B-100、スペインプリオンネットワーク(プリオネットスペインAGL2017-90665-REDT)、および研究所カルロIII(CIBERN)を通じてスペインの研究イノベーション大学(MEICO)によって資金提供されました。PRY-2018-2)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| 3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets (DAB) | Sigma | D5905 | |
| Adult Sprague-Dawley rats (8 to 9 weeks old) | Criffa-Credo, Lyon, France | ||
| Avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) | Vector Labs | PK-4000 | |
| B27 serum-free supplement 50x | Invitrogen | 17504-044 | |
| Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| cDNA plasmid vectors | |||
| COS1 cell lines | ATTC | CRL-1570 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | 16325 | |
| D-(+)-glucose (45% solution in water) for complete Neurobasal medium | Sigma | G8769 | |
| D-MEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium 1x ) for COS1 culture medium | Invitrogen | 41966-029 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline 10x (without Ca2+ and Mg2++) (D-PBS) for cultures | Invitrogen | 14200 | |
| Ethanol | merck | 108543 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid dihydrate disodium salt (EDTA) | Sigma | E5134 | |
| Fluorescence mounting media (e.g., Fluoromount-G or similar) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 17984-25 | |
| Gelatin powder | Sigma | G1890 | |
| Glacial acetic acid (Panreac, cat. no. 211008) | Panreac | 211008 | |
| Hank’s balanced salt solution | Invitrogen | 24020083 | |
| Heat-inactivated foetal bovine serum | Invitrogen | 10108-165 | |
| Heat-inactivated horse serum | Invitrogen | 26050-088 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2, 32 to 33% in water) | Sigma | 316989 | |
| L-glutamine 200 mM solution (100x) for complete Neurobasal and COS1 medium | Invitrogen | 25030-024 | |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Invitrogen | 11668-019 | |
| Mice pregnant female (embryonic day 12.5 to 16.5; E12.5-16.5) | Criffa-Credo, Lyon, France | ||
| Modified Minimum Essential Medium Eagle (MEM) | Invitrogen | 11012-044 | |
| Monoclonal antibody against class III β-tubulin (clone TUJ-1) | Biolegend | 801201 | |
| N-2 supplement 100x | Invitrogen | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 1,040,051,000 | |
| Penicillin/streptomycin solution 100x | Invitrogen | 15140-22 | |
| Phosphate buffered saline 10x (PBS) for immunocytochemistry | Invitrogen | AM9624 | |
| Secondary antibody: biotinylated horse anti-mouse | Vector Labs | BA-2000 | |
| Serum-free medium (Opti-MEM) | Invitrogen | 11058-021 | |
| Sodium azide | Panreac | 162712 | |
| Sodium bicarbonate solution 7.5% | Invitrogen | 25080-094 | |
| Sterile culture grade H2O | Sigma | W3500 | |
| TritonTM X-100 | Sigma | X100 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Trypsin-EDTA (Trypsin (0.05% (wt/vol) with EDTA (1x) | Invitrogen | 25300-054 | |
| Equipment | |||
| 1 large and 1 small curved scissors for dissection | Fine tools Instruments or similar | ||
| 1.5 mL conical centrifuge tubes | Eppendorf or similar | ||
| 15 mL conical centrifuge tubes | Corning or similar | ||
| 2 haemostats | Fine tools Instruments or similar | ||
| 2 small straight dissecting scissors | Fine tools Instruments or similar | ||
| 200 mL centrifuge tubes for centrifugation | Nalgene or similar | ||
| 200 mL sterile glass conical flasks | |||
| 2 L glass beaker | |||
| 4- and 6-well culture plates | Nunc | 176740 and 140675 | |
| Automatic pipette pumps and disposable 10 mL and 25 mL filter-containing sterile plastic pipettes. | Gilson, Brand, Eppendorf or similar | ||
| Automatic pipettes, sterile filter tips and current sterile tips | Gilson, Eppendorf or similar | ||
| Bench top microcentrifuge with angle fixed rotor | Eppendorf, Beckman Coulter or similar | ||
| Bench top refrigerated centrifuge with swing-bucket rotor (with 1.5, 15 and 50 mL tube adaptors) | Eppendorf, Beckman Coulter or similar | ||
| Cell culture incubator at 37 °C, 5% CO2 and 95% air | |||
| Dialysis tubing cellulose membrane | Sigma | D9402 | |
| Dialysis tubing closures | Sigma | Z37101-7 | |
| Disposable glass pipettes | |||
| Dissecting microscope with dark field optics | Olympus SZ51 or similar | ||
| High-speed refrigerated Beckman Coulter centrifuge or similar with angle fixed rotor | |||
| Laminar flow hood | |||
| Large 100 mm, 60 mm and small 35 mm Ø cell culture dishes | Nunc | 150679 , 150288 and 150318, respectively | |
| Magnetic stirrer and magnetic spin bars | IKA or similar | ||
| McIlwain tissue chopper | Mickle Laboratory Engineering | ||
| One pair of fine straight forceps and one pair of curved forceps | Fine tools Instruments or similar | ||
| Razor blades for the tissue chopper | |||
| Scalpels (number 15 and 11) | |||
| Two pairs of fine spatulas for transferring collagen and tissue pieces | Fine tools Instruments or similar |
References
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