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Neuroscience

신경계 발달 중 축산 성장과 행동을 분석하는 3-D 콜라겐 기반 하이드로겔 생성

Published: June 25, 2019 doi: 10.3791/59481

Summary

여기서는 3D 매트릭스에서 축산이 자라는 동작을 분석하여 자연 발달을 모방하는 방법을 제공합니다.

Abstract

이 프로토콜은 자연타입 I 콜라겐을 사용하여 축산 성장을 모니터링하고 분석하기 위한 3차원(3-D) 하이드로겔을 생성합니다. 프로토콜은 쥐 꼬리 힘줄 유래 유형 I 콜라겐에 의해 형성된 3-D 하이드로겔 내부에 배아 또는 초기 산후 설치류 뇌의 작은 조각을 배양하는 데 중점을 두고 있다. 조직 조각은 하이드로겔 내부에서 배양되고 다공성 매트릭스 내부의 그라데이션을 생성하고 분자를 분비하기 위해 특정 뇌 단편 또는 유전자 변형 세포 응집체에 직면한다. 이 프로토콜의 단계는 간단하고 재현 가능하지만 개발 중에 신중하게 고려해야 할 중요한 단계를 포함합니다. 더욱이, 성장하는 축세포의 거동은 면역세포화학적 방법에 의한 고정 후 상 대비 현미경 또는 모노/다광자 형광 현미경을 사용하여 직접 모니터링하고 분석할 수 있다.

Introduction

축축액으로 끝나는 뉴런 축은 배아의 세포외 매트릭스(ECM)를 통해 장거리를 이동하여 특정 경로를 통해 적절한 목표에 도달합니다. 상기 성장원뿔은 축속액의 원위부분이며 세포1,2의물리적 및 분자환경을 감지하는 데 특화되어 있다. 분자 관점에서, 성장 콘은 적어도 네 개의 다른 분자 메커니즘에 의해 유도된다: 접촉 매력, 화학 매력, 접촉 반발, 및 다른 축색 유도 큐에 의해 트리거 된 chemorepulsion3,4 , 5개 , 6.접촉 매개 공정은 마이크로 패턴 기판에서 2차원(2D) 배양으로 부분적으로 모니터링할 수 있습니다(예: 줄무늬 7,8 또는 분자를 포함하는 스폿 9). 그러나, 축세포는 환경 4,5,10에서가이드포스트 세포로부터 여러 매력적이고 반발성 분자를 감지함으로써 비확산 방식으로 그들의 표적을 탐색할 수 있다. 여기에서, 우리는 분비된 분자가 축산 개발에 chemorepulsive 또는 chemo매력적인 효력을 유도하는지 검사하는 3-D 문화의 쉬운 방법을 기술합니다.

초기 연구는 3차원(3-D) 행렬에서 배양 배양을 이용한 축삭 유도 큐의 효과를 확인하기 위한 것으로, 생체 조건에서 시뮬레이션하는 그라데이션을 생성하기 위해11,12. 이 접근법은 생체 내 실험과 함께, 네가지 주요 가족인 네 가지 주요 가족인 네트린, 슬릿, 세마포린스 및 에프린4,5,6의식별을 허용하였다. 이러한 분자 큐 및 기타 인자(13)는 성장하는 축색에 의해 통합되어, 접착 복합체의 역학을 유발하고 세포골격14,15,16을통해 기계적 힘을 변환한다. 축삭 항법용 3-D 배양물에서 분자 그라데이션을 생성하기 위해, 선구적인 연구자들은 플라즈마 혈전 기판17을사용했으며, 이는 또한 organotypic 슬라이스 제제18에사용되었다. 그러나, 1958년, 3-D 콜라겐 하이드로겔을 생성하는 새로운 프로토콜은 Maximow의 장치19,배양 플랫폼으로 연구를 위해 보고되었으며, 현미경 관찰에 적합한 여러 연구에서 20. 또 다른 개척자 연구는 상처 치유 과정에서 섬유아세포의 분화를 연구하기 위한 인간 섬유아세포를 삽입하는 도구로서 콜라겐 겔을 보고했다21. 병행하여, Lumsden과 데이비스는 소 진피로부터 콜라겐을 적용하여 감각 신경 섬유22의유도에 대한 신경 성장 인자(NGF)의 가증효과를 분석하였다. 다른 회사 및 실험실에 의한 새로운 배양 플랫폼(예: 다중 웰 플레이트)의 개발로, 콜라겐배양은 이러한 새로운 장치 6,23,24,25에 적용되었다. ,26. 병행하여, 엥겔브레스-홀름-스웜 종양 세포주에서 유래된 ECM 물질의 추출물이 이들 연구를 확장하기 위해 시판되었다27.

최근에는 3D 하이드로겔(예: 콜라겐, 피브린 등)을 사용하여 축세포 유도에 가제적 역할을 하는 분자 구배를 생성하기 위한 여러 프로토콜이 개발되었습니다. 28.대안적으로, 후보 분자는 다공성 매트릭스(예를 들어, NGF29)에서상이한 농도로 고정화될 수 있거나 또는 3-D 하이드로겔 세포 응집체의 작은 영역에서 배양하여 생성된 분자를 분비하여 방사형을 생성할 수 있다. 그라데이션 4,23,24,25,26. 마지막 가능성은 이 프로토콜에 설명됩니다.

여기에 제시된 절차는 배아 마우스 뇌의 3-D 하이드로겔 배양에서 축색 성장의 분석을 기반으로 쉽고 빠르며 매우 재현 가능한 방법입니다. 다른 방법과 비교하여, 프로토콜은 훈련되지 않은 연구자에게 적합하며 짧은 훈련 (1-2 주) 후에 완전히 개발 될 수 있습니다. 이 프로토콜에서, 우리는 먼저 유전자 변형 세포 응집체가 배아 신경 조직 의 앞에 배양되는 3-D 행렬을 생성하기 위하여 성숙한 쥐 꼬리에서 교원을 격리합니다. 이 세포 응집체는 성장하는 축색에 대한 반응을 유도하는 후보 분자의 방사형 화학 구배를 형성합니다. 마지막으로, 성장하는 축색에 대한 분자의 효과에 대한 평가는 상 대비 현미경 또는 대안적으로 면역 세포화학적 방법을 사용하여 쉽게 수행될 수 있다.

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Protocol

모든 동물 실험은 바르셀로나 대학의 동물 실험 윤리위원회 (CEEA)의 지침과 프로토콜에 따라 수행되었으며,이 연구에서 설치류의 사용을위한 프로토콜은 CEEA에 의해 검토되고 승인되었습니다. 바르셀로나 대학 (CEEA 승인 #276/16 과 141/15).

1. 쥐 꼬리 콜라겐의 정화

  1. 윤리적 지침에 따라 동물을 희생한 후 성인 스프라그-Dawley 쥐 꼬리(8-9주)를 수집하고 95% 에탄올로 헹구십시오. 2-4 개의 꼬리를 얼음 (4 °C)에 놓고 그 과정에서 얼음으로 덮어 두십시오.
  2. 꼬리 힘줄을 얻으려면, 지혈을 사용하여 꼬리의 가장 꼬리 척추에 꼬리를 고정하고 첫 번째에서 5-7mm 주위에 배치 두 번째 지혈로 꼬리를 압축합니다. 두 개의 지혈로 날카롭게 비틀어 꼬리를 부러뜨리세요. 이렇게 하려면 척추가 부러지때까지 여러 번 접고 펼칩니다.
  3. 척추가 나올 때 힘줄을 칼집에서 분리하기 위해 지혈으로 천천히 당깁니다. 이 순간, 작은 가위로 힘줄을 잘라. 이 힘줄 조각을 멸균 100mm 페트리 접시에 얼음에 보관하십시오.
  4. 힘줄이 완전히 추출 될 때까지 꼬리의 나머지 부분에 대한 클램핑 및 슬라이딩을 반복합니다.
  5. 획득한 모든 꼬리에 대해 1.2-1.4 단계를 반복합니다.
  6. 현미경으로 힘줄을 관찰하십시오. 작은 가위로 자르고 직선 미세 집게로 잡고 힘줄의 순도를 개선하고 힘줄을 초순수로 3 회 헹구십시오.
  7. 젖은 힘줄 3-4g을 수집합니다. 200-250 mL 유리 원추형 플라스크에서 4 °C에서 3 % 빙하 아세트산의 150 mL에서 힘줄을 24-36 시간 동안 부드럽게 저어줍니다.
  8. 원심분리기 20,000 x g : 1 시간. 병렬로, 길이 약 10-15cm의 조각을 절단하여 투석 튜브 멤브레인을 준비하고 1mMM에 의해 1mM에 함유 된 초순수 (EDTA)에서 15 분 동안 끓입니다. 그 후, 초순수로 투석 막을 부드럽게 헹구십시오.
  9. 원심분리 후, 투석 튜브 막에서 상판액을 데인션으로 수집한다. 펠릿에는 산성 불용성 물질 (비 콜라겐 단백질)이 포함되어 있으며 상급 물질에는 수용성 콜라겐 단백질이 포함되어 있습니다.
  10. 2-5 L 유리 비커에서 멸균 0.1x 최소 필수 미디엄 이글(MEM), pH 4.0의 2L에 대해 상황을 투석합니다. 3 일 동안 투석하십시오. 사용하기 전에 하루에 두 번 0.1x MEM 솔루션을 변경하여 모든 변경 시 pH를 확인하십시오. pH가 기본으로 바뀌면 pH가 4.0이 될 때까지 0.1 M 아세트산 몇 방울로 수정하십시오.
  11. 투석 후, 투석 콜라겐 용액에 항생제 (페니실린 / 스트렙토 마이신 (Pen-Strep)의 1.5 mL)를 추가하십시오. 콜라겐 스톡 용액의 5 mL aliquots를 만들고 4 °C에 보관하십시오.
    참고: 이 시점부터 모든 취급 절차는 층류 후드의 멸균 조건하에서 수행되어야 합니다.
  12. 다음 단계에 따라 제조된 콜라겐 스톡 용액의 겔화 테스트를 진행한다.
    1. 스톡 콜라겐은 일반적으로 너무 농축되어 있기 때문에, 0.1x MEM, pH 4.0으로 주식을 희석시킴으로써 3가지 작업 희석(75%, 50%, 25% 콜라겐 용액)을 준비한다. 각 작업 희석에 권장되는 최종 부피는 5 mL입니다. 각 조건에서, 단백질 색색 분석법을 사용하여 단백질 농도를 확인한다.
    2. 빈 1.5 mL 원추형 원심분리튜브(각 작동 희석에 대해 하나씩), MEM 튜브 10x, 중탄산나트륨 용액 7.5%, 얼음위에 콜라겐의 다양한 작용 희석액을 놓습니다. 냉각될 때까지 기다립니다.
    3. 감기(4°C) 원심분리튜브에 40-50 μL의 10x MEM을 넣습니다. 다음으로, 중탄산나트륨 용액 7-8 μL과 부드럽게 섞으세요.
    4. 이 튜브에 다른 콜라겐 희석제 중 하나의 310-330 μL을 추가하고 거품 형성을 피피피펫과 부드럽게 섞습니다. 콜라겐-MEM-중탄산나트륨 혼합물을 얼음(4°C)에 적어도 5분 동안 보관하십시오.
    5. 35 mm 페트리 접시에 혼합물의 피펫 10-25 μL.
    6. 하이드로겔의 겔화가 관찰될 때까지 37°C로 설정된 CO2 인큐베이터에 페트리 접시를 놓는다(±15-20분).
    7. 다른 페트리 접시에 남아있는 콜라겐 희석에 대해 1.12.3-1.12.6 단계를 반복합니다.
    8. 최상의 결과를 렌더링하는 콜라겐 작업 희석을 선택합니다.
      참고: 가장 좋은 겔화 하이드로 겔은 균일 한 반투명 질감, 회색 색상을 가져야하며 울퉁불퉁하거나 끈적하지 않아야합니다. 우리의 경험에서, 3:1 (콜라겐: 0.1x MEM)의 희석은 최상의 실험 결과를 생성합니다.

2. 세포 (COS1)의 준비는 3-D 콜라겐 하이드로 겔에서 후보 분자를 분비하기 위해 유전자 변형 응집체

  1. 플레이트 2 x 106 COS1 세포를 35 mm 페트리 접시에 넣고 100 mL의 D-MEM으로 구성된 완전한 배양 배지로 배양하여 열불활성화 된 태아 소 혈청, 0.5 % (wt / vol) 글루타민 및 1 % (wt / vol) 펜 / 스트렙 세포 배양 하룻밤 사이에 70-80 %의 합의에 도달하기 위해 인큐베이터. 각 형질 전환 절차에 대해 페트리 접시 를 준비합니다.
  2. 다음날 COS1 세포를 제조사의 지시에 따라 리포솜 계 형질전환 방법을 사용하여 후보 분자(Netrin-1 또는 Sema3E)를 코딩하는 DNA를 가진 트랜스펙트.
    1. 이렇게 하려면 250 μL의 무혈청 배지와 DNA(조건당 1-2 μg)를 1.5 mL 원심분리기 튜브(DNA 튜브)에 혼합하고 혼합합니다. 5분 동안 실온(RT)에서 배양. 240 μL의 혈청 프리 배지 및 10 μL의 리포좀 형혈 시약에 첨가하여 제2 튜브(리포좀 튜브)를 준비한다. RT에서 5분 동안 배양합니다.
    2. 배양 후, DNA-튜브의 함량을 리포좀 튜브에 넣고 부드럽게 섞는다. 이제 RT에서 15 분 동안 배양. 배양 된 세포의 배지를 혈청이없는 배지의 1.5 mL로 교체하고 DNA -리포솜 혼합물을 페트리 접시에 천천히 떨어 뜨립니다. CO2 세포 배양 인큐베이터에서 3시간 동안 배양한다.
  3. 3h의 형질전환 배양 후, 배지를 완전한 배양 배지로 대체하고 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양한다.
  4. 다음날, 0.1 M 덜베코의 인산 완충 식염수(D-PBS)로 세포를 헹구고, 트립신-EDTA(CO2 인큐베이터에서 5-15분 동안 각 접시당 800 μL)로 배양을 치료하고, 완전한 배양 배지 15 mL로 분리된 세포를 수집합니다.
  5. 세포를 130 x g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 원심 분리 후, 매체를 제거하고 얼음에 COS1 세포를 포함하는 펠릿을 보존.
  6. 1.12.3-1.12.6 단계를 반복하여 콜라겐 작동 혼합물을 준비한다.
  7. 형질감염된 세포의 펠릿에 콜라겐 혼합물100-150 μL을 넣고 이 혼합물을 위아래로 파이프팅하여 부드럽게 혼합하고 페트리 접시(직경 35 mm)에 45-50 μL을 퍼뜨리고 길이 약 1-1.5 cm의 콜라겐 세포 밴드를 형성합니다. 겔화(±15-20분)가 관찰될 때까지접시를 37°C(5% CO2)에서 인큐베이터에 놓습니다.
  8. 제2 배양접시에 대조세포(모의형형질)를 함유하고 인큐베이터(±15-20분)에 플레이트를 넣고 겔화시 3-4 mL의 온난화(37°C) COS1 완전 배양배지를 겔화한 각 접시에 첨가하여 준비한다. 콜라겐-세포 스트립을 CO2 세포 배양 인큐베이터에 보관한다. 그 후, 콜라겐 세포 스트립을 잘라 미세한 메스 또는 조직 다기를 사용하여 작은 정사각형 조각(길이 400 내지 500 μm)을 생성한다.
  9. 동일한 형질전환 상태에서 뉴런 배양 배지(NCM)의 3-3.5 mL를 함유하는 페트리 접시로 모든 절편을 옮기고 해부 현미경으로 조각의 품질을 확인한다. 다시, CO2 세포 배양 인큐베이터에 보관한다.
    참고: 신경 배양 배지는 1-5%(vol/vol) 열 불활성화 말 혈청, 2 mM 글루타민, 0.5% (wt/vol) 포도당, 1% (wt/vol) 펜-스트렙 용액 및 0.044%(wt/vol) NaHCO3를포함하는 신경기저 배지로 구성된다. pH가 7.2-7.3 사이인지 확인합니다.

3. 배아배전의 생성

  1. 일상적인 멸균 지침에 따라 오토클레이브를 사용하여 수술 도구(가위, 메스 블레이드 손잡이, 직선 및 곡선 집게)를 살균합니다. 행적으로 행적으로 행크의 균형 소금 용액 - 포도당 버퍼의 500 mL와 HBSS-G의 10mL를 포함하는 4-5 페트리 접시 (100mm 직경)를 준비합니다. 이 판을 얼음(4°C)에 놓습니다.
  2. 승인된 윤리적 절차에 따라 멸균 부위 밖에서 임신한 암컷 쥐(배아일 16.5)를 희생한다. 복강에서 가위로 배아 뿔을 자르고 차가운 HBSS-G가 들어있는 큰 페트리 접시에 넣습니다.
  3. 접시를 층류 후드에 놓고 직선 집게로 배아를 추출합니다. 차가운 HBSS-G가 들어있는 새로운 접시에 넣습니다. 다음으로, 작은 집게를 사용하여 배아의 피부를 제거하고 조심스럽게 곡선 및 직선 집게를 사용하여 뇌를 해부. 차가운 HBSS-G가 들어있는 접시에 넣습니다.
  4. 해부 현미경으로, 메스 또는 미세 가위로 두 반구를 분리하고 미세 한 집게로 뇌 조각에서 뇌, 수막 및 혈관을 제거하기 위해 중간선을 따라 반으로 뇌를 잘라냅니다.
  5. 3.3-3.4단계를 나머지 배아와 함께 반복한다. 조직의 품질을 보존하기 위해 2 시간 이상 해부를 지연시키지 마십시오.
  6. 100 % 에탄올 (특히 폴리테트라 플루오로에틸렌 (PTFE) 절단 판과 면도날)으로 조직 헬기의 모든 부분을 청소하십시오. 티슈 헬기를 UV 조명 아래에 있는 라미나 플럭스 후드에 15분 동안 보관하십시오.
  7. 각 조직 조각 (예를 들어, 해마피질)을 조직 헬기의 절단 판으로 옮긴다. 해마의 경우 면도날에 수직으로 놓고 두께가 450-500 μm의 조직 절편을 얻습니다.
  8. 완전한 NCM 3-4 mL로 35mm 페트리 접시를 준비하고 티슈 헬기 접시에서 페트리 접시로 티슈 조각을 옮김을 옮김을 옮김을 준비합니다. 관심 지역이 해부되기 때문에 많은 요리가 필요할 수 있습니다.
  9. 미세 텅스텐 바늘을 사용하여 전체 NCM에서 조직 해부를 완료합니다. 해부 현미경에서 얻은 조각의 품질을 확인합니다. 층이 암흑 시야 광학에서 명확하게 식별 가능한지 확인하고 텅스텐 바늘로 관심 영역 (예 : 해마의 CA 영역)을 해부하십시오. 손상된 조각을 버리십시오. CO2 인큐베이터에서 완전한 NCM 배지에 해마 박자를 유지한다.

4. 콜라겐 하이드로겔3D 공동배양준비

  1. 여러 개의 멸균 된 4 웰 배양 플레이트를 층류 후드에 놓고 1.12.2-1.12.6 단계에서 이전에 표시된 바와 같이 콜라겐 작업 혼합물을 준비합니다.
  2. 하이드로겔 혼합물의 15-20 μL을 웰 의 바닥에 놓고 원형 콜라겐 베이스를 생성합니다. 나머지 웰에 대해 이 단계를 반복합니다. 하이드로겔 염기에서 과도한 액체 증발을 방지하기 위해 5 개 이상의 플레이트를 동시에 준비하지 마십시오.
  3. 완전한 겔화 (± 15-20 분)가 관찰 될 때까지 인큐베이터에 접시를 보관하고 겔화가 완료 된 경우에만 인큐베이터에서 접시를 꺼냅니다. 겔화 된 콜라겐의 품질을 확인하십시오.
  4. 작은 COS1 셀 골재조각을 파이펫으로 옮김으로 옮김을 옮겼습니다. 하이드로겔 베이스에 놓고 하나의 배전 크기로 세포 골재에 가까운 피펫으로 조직 조각을 동일한 베이스에 놓습니다.
  5. 1.12.2-1.12.6 단계에서와 같이 얼음에 새로운 작동 콜라겐 혼합물을 준비하십시오.
  6. 이 새로운 혼합물의 15-20 μL을 부드럽게 피펫하고 배전 및 세포 골재를 덮는다. 샌드위치 와 같은 하이드로 겔 배양이 관찰됩니다. 이 순간, 미세 텅스텐 바늘로 이식을 다시 배향 (COS1 세포 골재를 만지지 마십시오!), 그래서 ± 500-600 μm에서 세포 집계에 직면.
  7. 겔화가 관찰될 때까지 플레이트를 인큐베이터로 되돌려(±10-15 분), 완전한 NCM의 0.5 mL을 2% B27 보충제로 보충하고 인큐베이터에서 36 내지48시간 동안 배양을 유지한다(37°C, 5% CO2).

5. 이식 세포 골재 공동 배양 및 면역 세포 화학 절차의 고정

  1. 36-48시간 의 배양 후, 배지를 제거하고 0.1 M 인산완충식염수(PBS), pH 7.3으로 헹구었다. 그 후, 4°C에서 0.1 M 인산완충(PB), pH 7.3에서 4% 파라포름알데히드로 1시간 동안 배양체를 고정한다.
  2. 고정제를 제거하고 0.1 M PB, pH 7.3에서 배양액을 3-4회(각 10-15분)로 부드럽게 헹구십시오.
  3. 하이드로겔 샌드위치를 주걱이나 집게로 우물 바닥에서 분리합니다. 0.1 M PBS를 함유한 6웰 배양 플레이트에 0.5% 비이온성 세제를 함유한 미세 페인트브러시로 콜라겐 블록을 옮김을 옮김.
  4. 완만한 교반을 가진 RT에서 2-3시간 동안 차단 용액에 자유 부유 하이드로겔(10% 혈청, 0.5% 비이온 계면활성제, 0.2% 젤라틴 0.2% 0.2% +0.1 M PBS)을 배양하였다.
  5. 0.1 M PBS로 3회(각각 10-15분)를 헹구고 0.5% 비이온계면활성제를 함유하였다.
  6. 5% 혈청, 0.5% 비이온 계면활성제, 0.2% 젤라틴 및 0.02% 아지드 나트륨을 함유하는 PBS에서 희석된 원발성 항체와 배양한다. 쉐이커상에서 4°C에서 36-48시간 동안 1차 항체와 배양한다.
    참고: 일반적으로 III β-tubulin 클래스(α-TUJ-1)(희석된 1:2,000)에 대하여 항체는 3-D 하이드로겔 배양물에서 축산 성장을 정의하기 위하여 이용된다.
  7. 배양 후 5.5 단계에서와 같이 헹네하십시오.
  8. RT에서 4 시간 동안 이차 항체와 배양 (또는 6-7 h 에서 4 °C) 쉐이커에 5 % 혈청, 0.5 % 비 이온 계면 활성제 및 0.2 % 젤라틴을 희석시켰다. 이 실험에서 말 항마우스 생체항체(희석1:200)가 사용된다.
  9. 5.5에서와 같이 헹위합니다.
  10. 아비딘-비오틴 복합체(ABC) 용액1:100을 5% 혈청, 0.5% 비이온 계면활성제 및 0.2% 젤라틴을 함유하는 PBS에서 희석하여 4°C에서 2일 동안 배양하였다. 또는 고추냉이 과산화아제(HRP)-태그가 붙은 스트렙타비딘(희석 1:300-400)을 동일한 완충액으로 사용하십시오.
  11. 5.5에 기재된 바와 같이 헹위합니다.
  12. 0.1 M 트리스-HCl 버퍼, pH 7.6 을 1시간 동안 배양액을 여러 번 헹급한다.
  13. 0.1 M 트리스-HCl, pH 7.6에서 3,3′-디아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드(DAB) 용액의 0.03%로 배양한다.
  14. 1% H2O2의 5-8 μL을 추가하고 10-15 분 기다립니다. 4-10x 목표를 사용하여 현미경으로 DAB의 발달을 모니터링하십시오.
  15. 0.1 M Tris-HCl 버퍼, pH 7.6으로 DAB 용액을 제거하여 반응을 멈춥시다.
  16. 30분 동안 PBS에서 배양을 헹구고(여러 가지 변경).
  17. 하이드로겔을 수성 기반 마운팅 매체를 사용하여 유리 슬라이드에 장착합니다.
  18. Sholl 분석 플러그인 또는 ImageJ 소프트웨어(30)에 대한 NeuriteJ 플러그인을 사용하여 하이드로겔내부의 축산의 길이 및 분포를 분석한다.

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Representative Results

여기에서, 우리는 배아 마우스 신경계의 3-D 하이드로겔 콜라겐 배양에서 축색 성장을 연구하기 위하여 널리 접근가능한 방법론을 제시합니다. 이를 위해, 우리는 괴수의 쥐 꼬리로부터 콜라겐을 분리하여 배아 뉴런 조직(예를 들어, 해마의 CA 영역)과 대면한 Netrin-1 또는 Sema3E를 발현하는 유전자 변형 세포 응집체를 배양하는 3-D 매트릭스를 생성하였다. 이들 세포 응집체는 콜라겐 매트릭스 내부에 후보 분자의 방사형 분포구배를 형성하였다. 마지막으로, 상이한 분자에 대한 뉴런 반응을 평가하기 위해, 우리는 면역세포화학적 방법(예를 들어, α-TUJ-1)을 사용하여 배양을 표지하고 간단하고 쉬운 정량화 방법을 적용하여, 퍼팅의 효과를 결정하기에 충분한 데이터를 획득하였다. 축색 행동에 후보자.

우리의 실험에서, 해마 축색이 Netrin-1에 직면했을 때, 이 축색은 Netrin-1의 근원을 향해 우선적으로 성장했는데, 이는 네트린-1이 이 축산에 대한 화학적 매력적인 분자역할을 한다는 것을 나타낸다(그림1B). 대조적으로, Sema3E 분비 세포에 직면 해마 축사 때, 그들의 대부분은 Sema3E가 그들을 위한 chemorepulsive 분자이다는 것을 나타내는 세포 집계에 반대 증가했습니다 (그림1C). 제어 조건(모의 변형)에서 모든 축색은 방향 성 기호 없이 방사형으로 성장했습니다(그림1A). 그림 1 D-E는 축색 반응 및 정량화 방법의 개략적 표현이다. 이미지 수집 후 근위/원위 비율(P/D 비율)을 계산하기 위해 근위(셀 집계에 가까운) 및 말단(세포 집계반대)을 구분하는 이식의 중간에 선을 그렸습니다. 제어 조건에서 축산은 비율 P/D = 1(도1D)을 나타내는 두 사분면(방사형 자성장)에 균등하게 분포되었다. 이식후 근위사분면에서 축삭의 수가 증가하여 말단(화학적 매력을 나타내는)에 비해 비율은 P/D> 1(도1E)이었고, 축삭의 수가 말단 사분면에서 보다 높았을 때 근접 1(치모풀을 나타내는) 비율은 P/D & lt; 1(그림1F)이었다.

이 기술로 우수한 결과를 얻으려면 콜라겐 중합이 균일하고, 세포 형질 감염이 효율적이며, 조직 이식과 세포 골재 사이의 거리가 적절한지 확인해야합니다 (토론 참조).

결론적으로, 우리는 3-D 콜라겐 기반 하이드로겔의 생성이 축색 이동 중에 필수적인 역할을 할 수 있는 후보 지도 분자에 대한 축축성장 및 행동 반응을 평가하기 위한 유용한 기술임을 확인할 수 있다. 신경계 발달.

Figure 1
그림 1 : 대립 실험 및 정량화 방법에서 3-D 하이드로겔에서 성장하는이식의 예. (A-C) 이전은 E14.5에서 해마 부위로부터 수득되었고, 시험관내에서 48시간 동안 배양하고, 면역염색에 의해 βIII-tubulin(α-TUJ-1)으로 표지하였다. 축축성장의 차이는 시각적으로 관찰할 수 있다. (A)와 비교해 주세요 (B-C). (D-E) 축색 반응 및 정량화 방법의 개략적 표현. 점선은 비율을 계산하기 위해 근위(P)와 원위(D) 사분면을 모두 구분하여 P/D 비율을 계산합니다. P/D > 1은 화학반응(E)을 나타내고, P/D<&1은 화학작용효과(F)를 나타낸다. 약어: CA = CA1-3 해마 영역; D = 말단 사분면; P = 근위 사분면. 배율 막대 = 200 μm (A-C). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

개발 축색의 성장은 주로 침략적이며 ECM 분해 및 리모델링을 포함합니다. 여기에 제시된 절차를 사용하여, 연구원은 축세포 (또는 세포)가 생체 내에서와 같이 유전자 변형 세포에 의해 분비되는 화학 구배에 반응할 수 있는 천연 유형 I 콜라겐에 의해 형성된 균질한 3-D 매트릭스를 얻을 수 있다. 매력적이거나 억제 큐(단백질, 지질 등)의 구배에 대한 상이한 축삭 반응은 특정 대조군(모의 형질감염 세포)과 쉽게 비교될 수 있다. 장점으로, 우리는 힘줄을 분리하기 쉽고 실제로 그들은 동물 실험의 잔재가 될 수 있음을 언급해야합니다. 또한, 힘줄은 피부 나 폐(31)와같은 다른 조직에 비해 고농도의 콜라겐이다.

여기에 제시된 방법론은 수행하기가 간단하지만 프로세스 중에 특별한 주의가 필요한 몇 가지 단계가 있습니다. 콜라겐 추출과 관련하여, 콜라겐 순도와 겔화의 질을 향상시키기 위해 꼬리 힘줄에서 원치 않는 혈관과 피부 이물질을 제거하는 것이 필수적입니다. 또한 멸균 라미나 흐름 후드 하에서 몇 가지 단계를 수행하고 사용하기 전에 수술 도구를 살균하여 멸균 상태를 유지하는 것이 필수적입니다. 또한, 솔루션의 적절한 pH 및 온도 조건을 유지하는 것이 중요하다. 예를 들어, MEM 10x 및 중탄산염 용액이 최적이 아닌 경우 콜라겐 매트릭스는 균질하게 중합되지 않으며 결과적으로 축축한 성장과 결과가 부정적인 영향을 받습니다. 또한 콜라겐 스톡 용액이 너무 농축되어 있거나 너무 희석되면 매트릭스가 제대로 겔화되지 않습니다. 우리의 경험에서, 최고의 콜라겐 재고 농도는 단백질의 약 5-5.5 mg/mL (색색 단백질 분석 키트에 의해 정량화) 그리고 우리는 3:1 희석을 사용 하 여 (콜라겐: 0.1 x MEM) 완벽 한 하이드로 겔 매트릭스를 얻기 위해. 세포 형질감염 및 세포 응집 형성에 관해서는, 멸균 상태를 유지하고 가능한 오염을 피하는 것이 중요하다, 예를 들어, 내독소가없는 플라스미드 DNA 정제 키트로 플라스미드 벡터를 정화하는 것은 필수적이다. 또한, 우리는 형질감염 조건이 세포 유형, 통로 수 및 플라스미드 특성에 따라 달라한다는 것을 강조해야합니다. 여기, 우리는 우리의 손에 최적의 일상적인 조건을 보고 했습니다. 따라서, 연구원은 제조 업체에 의해 표시 하는 권장된 농도 테스트 하거나 그들의 자신의 최적의 조건을 결정 하기 위해 그들을 조정 해야.

이 기술로 발생할 수 있는 문제에 관해서는, 우리는 때때로 3-D 행렬이 예상되는 균일한 겔형 구조를 제시하지 않는다는 것을 고려해야 한다. 이 경우, 솔루션의 온도 및 pH 상태를 확인하고 올바르지 않은 경우 폐기하는 것이 중요합니다. 또한, 콜라겐 스톡 제제의 순도를 검증하기 위해 환원 조건하에서 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE) 변성 등의 품질 관리 테스트를 수행하는 것이 좋습니다. 이러한 접근법을 통해, 순수및 손상되지 않은 타입 I 콜라겐은 2개의 단모체 α 사슬(α1 및 α2), 3개의 디메릭 β 사슬(β11, β12, 변이체 β11) 및 1 트리메릭 γ사슬(32,33)으로구성된 전형적인 이동 패턴을 나타낸다. 얻어진 콜라겐이 이 패턴에 맞지 않는 경우, 사용하지 않아야 한다. 마지막으로, 면역 염색 후, 축세포는 화학적 또는 화학적 매력적인 분자를 분비하는 세포와 마주치면 방사형으로 분포된 것처럼 보일 수 있습니다. 이 경우, 적절한 공동 배양 시스템에서 도트 블로팅 기술을 수행하거나(DNA 플라스미드가 알칼리성 인산염 태그가 붙은 경우) 또는 서양에 의한 형질전환 후 배양 배지를 처리하여 형질전환의 효율을 확인해야 합니다. 더 럽 히기. 고려해야 할 한계는 세포 골재와 조직 이식 사이의 거리가 중요하다는 것입니다. 그(것)들이 아주 멀리 떨어져 있는 경우에, 우리는 조직 이식에 분비된 분자의 어떤 명확한 효력을 볼 수 없을 것입니다, 그러나 그(것)들이 서로 아주 가깝으면, 효력은 좋은 결과로 고려되기 위하여 너무 강할 것입니다. 우리의 경험에서, 적절한 거리는 약 1 개의 배식물 크기 (400-500 μm)이며, 세포 골재에 의해 생성 된 분자 구배는 배양에서 24 시간 후에 400-500 μm을 따라 방사형으로 연장됩니다.

대안적으로, 래트 테일 콜라겐 대신에 상업적종양 유래 ECM 추출물을 사용할 수 있다. 이 경우 상업용 ECM 추출물의 겔화는 온도에 의존하기 때문에 모든 절차는 4 ~10 °C 에서 수행되어야합니다. 따라서 모든 배양 요리, 파이펫 팁, 배양 배지 및 솔루션이 4 °C에서 유지되도록 특별한주의를 기울여야합니다.

마지막으로, 여기에 제시된 방법은 주로 축축성장이나 뉴런 이동과 같은 뉴런 기능의 분석과 관련이 있지만, 약리학적 스크리닝, 유착 분석, 체외 세동에 유용한 기술이 되기도 합니다. 실험 및 조직 공학 전략34,35,36.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgments

저자는 편집 조언과 기술 지원에 대한 M. 세구라 펠리우에 대한 톰 요한난 에게 감사드립니다. 이 작품은 CERCA 프로그램과 혁신의 학과의 대학 및 연구위원회에 의해 투자되었다, 대학, 일반 카탈루냐의 기업 (SGR2017-648). 이 작품은 연구의 스페인 정부에 의해 투자되었다, 혁신과 대학 (MEICO) BFU2015-67777-R 및 RTI2018-099773-B-100, 스페인 프리온 네트워크 (프리오네트 스페인 AGL2017-90665-REDT), 그리고 연구소 카를로스 III, CIBERNED ( PRY-2018-2).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets (DAB) Sigma D5905
Adult Sprague-Dawley rats (8 to 9 weeks old)  Criffa-Credo, Lyon, France
Avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) Vector Labs PK-4000
B27 serum-free supplement 50x  Invitrogen 17504-044
Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit Pierce 23225
cDNA plasmid vectors
COS1 cell lines ATTC CRL-1570
D-(+)-Glucose Sigma 16325
D-(+)-glucose (45% solution in water) for complete Neurobasal medium Sigma G8769
D-MEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium 1x ) for COS1 culture medium Invitrogen 41966-029
Dulbecco’s phosphate buffered saline 10x (without Ca2+ and Mg2++) (D-PBS) for cultures Invitrogen 14200
Ethanol  merck 108543
Ethylenediaminetetraacetic acid dihydrate disodium salt (EDTA) Sigma E5134
Fluorescence mounting media (e.g., Fluoromount-G or similar) Electron Microscopy Sciences (EMS) 17984-25
Gelatin powder  Sigma G1890
Glacial acetic acid (Panreac, cat. no. 211008) Panreac 211008
Hank’s balanced salt solution  Invitrogen 24020083
Heat-inactivated foetal bovine serum  Invitrogen 10108-165
Heat-inactivated horse serum  Invitrogen 26050-088
Hydrogen peroxide (H2O2, 32 to 33% in water) Sigma 316989
L-glutamine 200 mM solution (100x) for complete Neurobasal and COS1 medium Invitrogen 25030-024
Lipofectamine 2000 Reagent Invitrogen 11668-019
Mice pregnant female (embryonic day 12.5 to 16.5; E12.5-16.5)  Criffa-Credo, Lyon, France
Modified Minimum Essential Medium Eagle (MEM) Invitrogen 11012-044
Monoclonal antibody against class III β-tubulin (clone TUJ-1) Biolegend 801201
N-2 supplement 100x  Invitrogen 17502-048
Neurobasal medium  Invitrogen 21103049
Paraformaldehyde Merck 1,040,051,000
Penicillin/streptomycin solution 100x  Invitrogen 15140-22
Phosphate buffered saline 10x (PBS) for immunocytochemistry Invitrogen AM9624
Secondary antibody: biotinylated horse anti-mouse  Vector Labs BA-2000
Serum-free medium (Opti-MEM) Invitrogen 11058-021
Sodium azide  Panreac 162712
Sodium bicarbonate solution 7.5%  Invitrogen 25080-094
Sterile culture grade H2 Sigma W3500
TritonTM X-100  Sigma X100
Trizma base  Sigma T1503
Trypsin-EDTA (Trypsin (0.05% (wt/vol) with EDTA (1x) Invitrogen 25300-054
Equipment
1 large and 1 small curved scissors for dissection  Fine tools Instruments or similar
1.5 mL conical centrifuge tubes  Eppendorf or similar
15 mL conical centrifuge tubes  Corning or similar
2 haemostats   Fine tools Instruments or similar
2 small straight dissecting scissors Fine tools Instruments or similar
200 mL centrifuge tubes for centrifugation Nalgene or similar
200 mL sterile glass conical flasks
2 L glass beaker
4- and 6-well culture plates  Nunc 176740 and 140675
Automatic pipette pumps and disposable 10 mL and 25 mL filter-containing sterile plastic pipettes. Gilson, Brand, Eppendorf or similar 
Automatic pipettes, sterile filter tips and current sterile tips  Gilson, Eppendorf or similar
Bench top microcentrifuge with angle fixed rotor  Eppendorf, Beckman Coulter or similar
Bench top refrigerated centrifuge with swing-bucket rotor (with 1.5, 15 and 50 mL tube adaptors) Eppendorf, Beckman Coulter or similar
Cell culture incubator at 37 °C, 5% CO2 and 95% air
Dialysis tubing cellulose membrane Sigma D9402
Dialysis tubing closures  Sigma Z37101-7
Disposable glass pipettes
Dissecting microscope with dark field optics  Olympus SZ51 or similar 
High-speed refrigerated Beckman Coulter centrifuge or similar with angle fixed rotor
Laminar flow hood
Large 100 mm, 60 mm and small 35 mm Ø cell culture dishes  Nunc  150679 , 150288 and 150318, respectively
Magnetic stirrer and magnetic spin bars IKA or similar
McIlwain tissue chopper Mickle Laboratory Engineering
One pair of fine straight forceps and one pair of curved forceps  Fine tools Instruments or similar
Razor blades for the tissue chopper
Scalpels (number 15 and 11)
Two pairs of fine spatulas for transferring collagen and tissue pieces Fine tools Instruments or similar

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References

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신경과학 문제 148 3-D 하이드로겔 배양 축삭 성장 조직 이식 배아 신경계 세포 형질전환 화학흡착 케모모풀
신경계 발달 중 축산 성장과 행동을 분석하는 3-D 콜라겐 기반 하이드로겔 생성
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Gil, V., Del Río, J. A. Generation of 3-D Collagen-based Hydrogels to Analyze Axonal Growth and Behavior During Nervous System Development. J. Vis. Exp. (148), e59481, doi:10.3791/59481 (2019).

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