Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Generering av 3-D kollagen-baserte Hydrogeler å analysere axonal vekst og atferd under nervesystemet utvikling

Published: June 25, 2019 doi: 10.3791/59481
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,2,3,4
1Molecular and Cellular Neurobiotechnology, Institute for Bioengineering of Catalonia (IBEC), The Barcelona Institute of Science and Technology (BIST), Parc Científic de Barcelona, 2Department of Cell Biology, Physiology, and Immunology, Universitat de Barcelona, 3Center for Networked Biomedical Research on Neurodegenerative Diseases (CIBERNED), 4Institute of Neuroscience, University of Barcelona

Summary

Her gir vi en metode for å analysere atferden til voksende axons i 3D-matriser, etterligne deres naturlige utvikling.

Abstract

Denne protokollen bruker naturlig type I kollagen for å generere tredimensjonale (3-D) hydrogel for overvåking og analysering av axonal vekst. Protokollen er sentrert på dyrking små biter av embryonale eller tidlig postnatal gnager hjerner inne i en 3-D hydrogel dannet av rotte halen sene-avledet type I kollagen med spesifikke porøsitet. Tissue stykker er kultivert inne i hydrogel og konfrontert med bestemte hjerne fragmenter eller genetisk modifiserte celle aggregater for å produsere og skille ut molekyler som er egnet for å skape en gradient inne i den porøse matrisen. Trinnene i denne protokollen er enkle og reproduserbar, men inkluderer viktige trinn som skal vurderes nøye under utviklingen. Videre kan atferden til voksende axons overvåkes og analyseres direkte ved hjelp av en fase-kontrast mikroskop eller mono/multiphoton fluorescens mikroskop etter fiksering av immunocytochemical metoder.

Introduction

Neuronal axons, ender i axonal vekst kjegler, migrere lange avstander gjennom ekstracellulære matrise (ECM) av embryo over konkrete veier for å nå sine aktuelle mål. Veksten kjegle er det axon havn av det er en spesialisert å fornemme det fysisk og molekylær omgivelsene av cellen1,2. Fra et molekylær synspunkt, vekst kjegler styres av minst fire ulike molekylære mekanismer: kontakt attraksjon, kjemoattraksjon, kontakt frastøting, og chemorepulsion utløst av forskjellige axonal veiledning stikkordene3,4 , 5 andre priser , 6. kontakt-mediert prosesser kan delvis overvåkes i to-dimensjonale (2D) kulturer på mikro-mønstret underlag (f. eks, med striper7,8 eller flekker9 inneholder molekylene). Imidlertid kan axons navigere til deres mål i en ikke-diffusive måte ved sensing flere attraktive og frastøtende molekyler fra guidepost celler i miljøet4,5,10. Her beskriver vi en enkel metode for 3-D kultur for å sjekke om et utskilt molekyl induserer chemorepulsive eller chemoattractive effekter på å utvikle axons.

De tidligste studiene tok sikte på å bestemme virkningene av axon veiledning stikkordene brukes explant kulturer i tredimensjonale (3-D) matriser for å generere graderinger simulere in vivo forhold11,12. Denne tilnærmingen, sammen med in vivo eksperimenter, tillot identifisering av fire store familier med veiledning Stikkord: Netrins, splitt, Semaphorins, og Ephrins4,5,6. Disse molekylære stikkordene og andre faktorer13 er integrert av den voksende axons, utløser dynamikken i vedheft komplekser og transducing mekaniske krefter via cytoskeleton14,15,16. Å generere molekylære graderinger i 3-D kulturer for axonal navigasjon, banebrytende forskerne brukte plasma Clot underlag17, som også ble brukt for organotypic Slice forberedelser18. I 1958 ble imidlertid en ny protokoll for å generere 3-D kollagen hydrogeler rapportert for studier med Maximow ́s enheter19, en kultur plattform, brukt i flere studier egnet for mikroskopiske observasjoner20. En annen pioner studie rapporterte kollagen gel som et verktøy for å legge inn menneskelige fibroblaster for å studere differensiering av fibroblaster i myofibroblasts i såret healing prosesser21. Parallelt Lumsden og Davies anvendt kollagen fra storfe dermis å analysere antatte effekten av nerve vekstfaktor (NGF) på guiding av sensoriske nervefibre22. Med utviklingen av nye kultur plattformer (f. eks, multi-brønn plater) av ulike selskaper og laboratorier, kollagen kulturer ble tilpasset disse nye enheter6,23,24,25 ,26. Parallelt ble et utdrag av ECM-materiale avledet fra Engelbreth-Holm-Swarm-tumor cellelinje gjort kommersielt tilgjengelig for å utvide disse studiene27.

Nylig har flere protokoller blitt utviklet for å generere molekylære graderinger med antatte roller i axon veiledning ved hjelp av 3-D hydrogeler (f. eks kollagen, fibrin, etc.) 28. Alternativt kan kandidat molekylet bli immobilisert ved ulik konsentrasjon i en porøs matrise (f. eks NGF29) eller generert av dyrking i en liten region av 3-D hydrogel celle aggregater sekresjon molekylet å generere en radial gradient4,23,24,25,26. Den siste muligheten vil bli forklart i denne protokollen.

Prosedyren presenteres her er en enkel, rask og svært reproduserbar metode basert på analyse av axonal vekst i 3-D hydrogel kulturer av embryonale musen hjernen. I sammenligning med andre metoder, er protokollen velegnet for ikke-utdannede forskere og kan utvikles fullt ut etter en kort opplæring (1-2 uker). I denne protokollen, vi først isolere kollagen fra voksne rotte haler til ytterligere generere 3-D matriser der genetisk modifiserte celle aggregater er kultivert foran den embryonale neuronal vev. Disse celle aggregater danner radial kjemiske graderinger av en kandidat molekyl som utløser en respons for den voksende axons. Til slutt kan evalueringen av virkningene av molekylet på voksende axons enkelt utføres ved hjelp av en fase kontrast mikroskopi eller, alternativt, immunocytochemical metoder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyr eksperimenter ble utført under retningslinjer og protokoller av etisk komité for Animal eksperimentering (CEEA) ved Universitetet i Barcelona, og protokollen for bruk av gnagere i denne studien ble gjennomgått og godkjent av CEEA av Universitetet i Barcelona (CEEA godkjenning #276/16 og 141/15).

1. rensing av Rat tail kollagen

  1. Samle voksen Sprague-Dawley Rat haler (8-9 uker gammel) etter å ofre dyret følgende etiske retningslinjer og skyll i 95% etanol. Plasser 2-4 haler på is (4 ° c) og hold dem dekket med is under prosessen.
  2. For å få halen sener, fikse halen på den mest caudal ryggsøylen av halen ved hjelp av en hemostat og komprimere halen med en andre hemostat plassert rundt 5-7 mm fra den første. Bryt halen ved å vri den kraftig med begge hemostats. For å gjøre dette, fold/brette ryggsøylen flere ganger til den bryter.
  3. Trekk ryggsøylen langsomt med hemostat for å løsne sener fra kappen når den kommer ut. I dette øyeblikk, kuttet sener med liten saks. Hold disse sene brikkene i en steril 100 mm Petri parabolen på isen.
  4. Gjenta klemme og skli for resten av halen til sener er helt ekstrahert.
  5. Gjenta trinn 1.2-1.4 for alle de oppnådde haler.
  6. Observer sener under et mikroskop. Kast blodkar ved å kutte med liten saks og holde med rett fin tang for å forbedre senen er renhet og skyll sener 3 ganger med ultrarent vann.
  7. Samle 3-4 g våte sener. Løs opp sener i 150 mL 3% bre eddiksyre ved 4 ° c i en 200-250 mL glass konisk kolbe for 24-36 h, under skånsom omrøring.
  8. Sentrifuger på 20 000 x g for 1 t. Parallelt forbereder dialyse slange membranen ved å kutte et stykke på rundt 10-15 cm i lengde og kok den i ultrarent vann som inneholder 1 mM ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) i 15 min. Deretter forsiktig skylle dialyse membranen grundig med ultrarent vann.
  9. Etter sentrifugering, samle supernatanten i dialyse slange membranen ved dekantering. Pellet inneholder surt uløselig materiale (ikke-Collagenous proteiner) og supernatanten inneholder løselige kollagen proteiner.
  10. Dialyze supernatanten mot 2 liter steril 0,1 x minimum essensiell medium Eagle (MEM), pH 4,0 i et glass beger på 2-5 L. Dialyze i 3 dager. Endre 0.1 x MEM løsning minst to ganger om dagen sjekke pH ved hver endring før bruk. Hvis pH har blitt grunnleggende, modifiser den med noen få dråper 0,1 M eddiksyre til pH er 4,0.
  11. Etter dialyse, tilsett antibiotika (1,5 mL penicillin/Streptomycin (pen-strep)) til den dialyzed kollagen løsning. Lag 5 mL alikvoter av kollagen lager løsningen og oppbevar ved 4 ° c.
    Merk: Fra dette punktet må alle håndteringsprosedyrer utføres under sterile forhold i en laminær strømnings hette.
  12. Fortsett med gelation test av forberedt kollagen lager løsningen etter de neste trinnene.
    1. Siden aksjen kollagen er vanligvis for konsentrert, forberede 3 arbeider fortynninger (75%, 50%, og 25% kollagen løsning) ved å fortynne aksjen i 0.1 x MEM, pH 4,0. Det endelige volumet anbefales for hver fungerende fortynning er 5 mL. I hver tilstand, sjekk protein konsentrasjonen ved hjelp av et protein fargemetrisk analysen.
    2. Plasser flere tomme 1,5 mL koniske sentrifugerør (en for hver arbeider fortynning), 10x MEM rør, 7,5% natrium bikarbonat løsning og ulike arbeider fortynninger av kollagen på isen. Vent til disse er avkjølt.
    3. Tilsett 40-50 μL av 10x MEM til et kaldt (4 ° c) sentrifugerør. Deretter blandes det forsiktig med 7-8 μL av natrium bikarbonat løsning.
    4. Tilsett 310-330 μL av en av de ulike kollagen fortynninger til dette røret og bland det forsiktig med pipette unngå boble formasjon. Hold kollagen-MEM-sodium bikarbonat blanding på is (4 ° c) i minst 5 min.
    5. Pipetter 10-25 μL av blandingen i en 35 mm Petri parabolen.
    6. Plasser Petri parabolen i CO2 inkubator satt ved 37 ° c til gelation av hydrogel (± 15-20 min) er observert.
    7. Gjenta trinn 1.12.3-1.12.6 for de resterende kollagen fortynninger i forskjellige Petri retter.
    8. Velg kollagen som arbeider med fortynning som gir de beste resultatene.
      Merk: Den beste gelled hydrogel bør ha en ensartet gjennomskinnelig tekstur, grå farge og bør ikke være klumpete eller trevlet. I vår erfaring, en fortynning av 3:1 (kollagen: 0.1 x MEM) genererer de beste eksperimentelle resultater.

2. utarbeidelse av Cell (COS1) aggregater genetisk-modifisert til å skille ut en kandidat molekyl i 3-D kollagen Hydrogeler

  1. Plate 2 x 106 COS1 celler til en 35 mm Petri retter og ruge med komplett kultur medium bestående av 100 ml D-mem som inneholder 10% (Vol/Vol) varme-deaktivert fosterets storfe serum, 0,5% (WT/Vol) glutamin og 1% (WT/Vol) pen/strep i en cellekultur inkubator, for å nå 70-80% confluency over natten. Forbered en Petri parabolen for hver transfeksjoner prosedyre.
  2. Dagen etter transfect COS1 celler med DNA-kodingen kandidat molekylet (Netrin-1 eller Sema3E) ved hjelp av liposome-basert transfeksjoner metode etter produsentens instruksjoner.
    1. For å gjøre dette, bland 250 μL av serum fritt medium og DNA (1-2 μg per tilstand) til et 1,5 mL sentrifugerør (DNA tube) og bland. Ruge ved romtemperatur (RT) i 5 min. klargjør et ekstra rør (liposomal rør) ved å tilsette 240 μL av serum fritt medium og 10 μL av liposomal transfeksjoner reagens. Ruge ved RT for 5 min.
    2. Etter inkubasjons, tilsett innholdet av DNA-rør til liposomal røret og bland forsiktig. Nå ruge på RT i 15 min. Erstatt mediet på de dyrkede cellene med 1,5 mL av serum fritt medium og tilsett DNA-liposomer blandingen til Petri parabolen langsomt dråpevis. Ruge for 3 t i CO2 Cell kultur inkubator.
  3. Etter 3 h av transfeksjoner inkubasjons, erstatte mediet med den komplette kulturen medium og ruge over natten i inkubator.
  4. Neste dag, skyll cellene med 0,1 M Dulbecco ' s fosfat bufret saltvann (D-PBS), behandle kulturer med Trypsin-EDTA (800 μL per hver tallerken for 5-15 min i CO2 inkubator) og samle frittliggende celler med 15 ml komplett kultur medium.
  5. Sentrifuger cellene ved 4 ° c ved 130 x g i 5 min. Etter sentrifugering, fjerne Media og bevare pellet inneholder COS1 celler på isen.
  6. Gjenta trinn 1.12.3-1.12.6 for å forberede kollagen arbeids blandingen.
  7. Tilsett 100-150 μL av kollagen blandingen til pellet av de transfekterte cellene og bland forsiktig ved å pipettering opp og ned og spre 45-50 μL av denne blandingen på en Petri parabol (35 mm diameter) for å danne et ensartet band av kollagen-celler på rundt 1-1,5 cm i lengde. Plasser parabolen i inkubator ved 37 ° c (5% CO2) til gelation (± 15-20 min) er observert.
  8. Forbered en ny stripe som inneholder kontroll celler (mock transfeksjoner) i en annen kultur parabol og tallerken den i inkubator (± 15-20 min) og når gelation er fullført tilsett 3-4 mL av varmet (37 ° c) COS1 komplett kultur medium til hver tallerken som inneholder gelled kollagen-celler strimler og holde dem i CO2 cellekultur inkubator. Deretter kuttet kollagen-celler strimler å generere små firkantede brikker (400 til 500 μm i lengde) ved hjelp av en fin skalpell eller et vev helikopter.
  9. Overfør alle delene fra samme transfeksjoner tilstand til en Petri parabol inneholdende 3-3.5 mL neuronal kultur Media (NCM) og sjekk under et disseksjon mikroskop kvaliteten på brikkene. Igjen, holde dem i CO2 Cell kultur inkubator.
    Merk: Neuronal kultur medium består av Neurobasal medium som inneholder 1-5% (Vol/Vol) varme-deaktivert heste serum, 2 mM glutamin, 0,5% (WT/Vol) glukose, 1% (WT/Vol) pen-strep løsning og 0,044% (WT/Vol) NaHCO3. Kontroller at pH-verdien er mellom 7,2-7.3.

3. generering av embryonale Explant for kultur

  1. Sterilisere kirurgiske verktøy (saks, skalpell blad håndtak, rett og buet tang) ved autoklavering etter rutinemessig sterilisering retningslinjer. I parallell forberede 500 mL av Hank ' s balansert saltløsning-glukose buffer og 4-5 Petri retter (100 mm diameter) som inneholder 10 mL av HBSS-G. Plasser disse platene på is (4 ° c).
  2. Ofre den gravide kvinnelige rotte (embryonale dag 16,5) utenfor det sterile området, etter godkjente etiske prosedyrer. Skjær embryo horn med saks fra bukhulen og plasser den i en stor Petri parabolen inneholder kaldt HBSS-G.
  3. Plasser parabolen i laminær Flow panseret og trekke ut embryo med rett tang. Plasser dem i en ny rett som inneholder kaldt HBSS-G. Deretter fjerner huden på fosteret ved hjelp av små tang og nøye analysere hjernen ved hjelp av buede og rettetang. Plasser dem i en rett som inneholder kaldt HBSS-G.
  4. Under et dissekere mikroskop, kutt hjernen i to langs midtlinjen å skille både halvkuler med skalpell eller fine saks og fjerne Diencephalon, hjernehinnene og blodkar fra hjernen stykker med fine tang.
  5. Gjenta trinn 3.3-3.4 med resten av embryo. Ikke utsett disseksjon for mer enn 2 timer for å bevare vevs kvaliteten.
  6. Rengjør alle deler av vevet helikopteret med 100% etanol (spesielt polytetrafluoretylen (PTFE) skjære platen og barberbladet). Hold vevet helikopteret i laminær Flux hette under UV-belysning i 15 min.
  7. Overfør hvert vev stykke (f. eks, cortex med hippocampus) til skjære platen av vevet helikopter. For hippocampus, plasser den vinkelrett på barberbladet og få vevs deler på 450-500 μm i tykkelse.
  8. Forbered flere 35 mm Petri-retter med 3-4 mL komplett NCM og Overfør vevs brikker fra vevs helikopter platen til Petri-rettene. Mange retter kan være nødvendig som regioner av interesse er dissekert.
  9. Fullfør vevet disseksjon i den komplette NCM ved hjelp av fine tungsten nåler. Kontroller kvaliteten på de oppnådde sektorene under dissekere mikroskopet. Sikre det lagene er klare som kan identifiseres inne det darkfield optisk og analysere det område av begrave (e.g., CA område av det hippocampus) med tungsten nål. Kast skadede skiver. Hold hippocampus explants i komplett NCM medium i CO2 inkubator.

4. utarbeidelse av 3-D co-kulturer i kollagen Hydrogeler

  1. Plasser flere sterile 4-brønn kultur plater i laminær Flow hette og utarbeide en kollagen arbeider blanding som tidligere angitt i trinn 1.12.2-1.12.6.
  2. Plasser 15-20 μL av hydrogel blandingen i bunnen av en brønn for å produsere en sirkulær kollagen base. Gjenta dette trinnet for resten av brønnene. Ikke Forbered mer enn fem plater på samme tid for å unngå overdreven væske fordampning fra hydrogel base.
  3. Hold rettene i inkubator til hele gelation (± 15-20 min) er observert og ta platene ut av inkubator bare når gelation er fullført. Sjekk kvaliteten på gelled kollagen.
  4. Overfør et lite stykke COS1 celle aggregat med en pipette. Plasser den på hydrogel basen og Legg et vev stykke på samme base med en pipette nær den delen av cellene samlet på en explant størrelse.
  5. Forbered en ny arbeidsgruppe kollagen blanding på isen som i trinn 1.12.2-1.12.6.
  6. Pipetter med en forsiktig 15-20 av denne nye blandingen og dekk til explant og celle aggregat. En sandwich-lignende hydrogel kultur vil bli observert. I dette øyeblikk, re-orientere explant med en fin tungsten nål (ikke berøre COS1 celle aggregat!), så det står overfor cellen aggregat ved ± 500-600 μm.
  7. Returner platen til inkubator til gelation er observert (± 10-15 min), og 0,5 mL komplett NCM supplert med 2% B27 supplement og holde kulturer for 36 til 48 h i inkubator (37 ° c, 5% CO2).

5. fiksering av Explant-Cell aggregat co-kulturer og Immunocytochemical prosedyre

  1. Etter 36-48 h av inkubasjons, Fjern mediet og skyll med 0,1 M fosfat bufret saltvann (PBS), pH 7,3. Deretter reparerer du kulturene for 1 time med 4% paraformaldehyde i 0,1 M fosfat buffer (PB), pH 7,3, ved 4 ° c.
  2. Fjern bindemiddel og skyll kulturene forsiktig 3-4 ganger (10-15 min hver) i 0,1 M PB, pH 7,3.
  3. Løsne hydrogel sandwich fra bunnen av brønnen med slikkepott eller tang. Overfør kollagen blokken med en fin pensel til en 6-brønn kultur plate som inneholder 0,1 M PBS med 0,5% ikke-ioniske vaskemiddel.
  4. Ruge frittflytende hydrogeler i blokkerings løsningen (10% serum, 0,5% ikke-ioniske overflateaktivt middel, og 0,2% gelatin i 0,1 M PBS) for 2-3 h ved RT med skånsom agitasjon.
  5. Skyll 3 ganger (10-15 min hver) med 0,1 M PBS inneholder 0,5% ikke-ioniske overflateaktivt middel.
  6. Ruge med primært antistoff fortynnet i PBS inneholder 5% serum, 0,5% ikke-ioniske overflateaktivt middel, 0,2% gelatin, og 0,02% natrium Natriumazid. Ruge med det primære antistoff for 36-48 h ved 4 ° c på en shaker.
    Merk: Vanligvis et antistoff mot klasse III β-tubulin (α-TUJ-1) (fortynnet 1:2000) brukes til å definere axonal vekst i 3-D hydrogel kulturer.
  7. Etter inkubasjons, skyll som i trinn 5,5.
  8. Ruge med sekundært antistoff for 4 h ved RT (eller 6-7 h ved 4 ° c) på en shaker fortynnet i 5% serum, 0,5% ikke-ioniske overflateaktivt middel, og 0,2% gelatin. En hest anti-mus biotinylated antistoff (fortynnet 1:200) brukes i dette eksperimentet.
  9. Skyll kulturer som i 5,5.
  10. Ruge kulturene i 2 dager ved 4 ° c med avidin-biotin kompleks (ABC) løsning 1:100 fortynnet i PBS inneholder 5% serum, 0,5% ikke-ioniske overflateaktivt middel, og 0,2% gelatin. Alternativt, bruk pepperrot peroksidase (HRP)-merket streptavidin (fortynnet 1:300-400) i samme buffer.
  11. Skyll kulturene som beskrevet i 5,5.
  12. Skyll kulturene flere ganger med 0,1 M Tris-HCl buffer, pH 7,6 for 1 time.
  13. Ruge kulturene med 0,03% av 3, 3 ′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) løsning i 0,1 M Tris-HCl, pH 7,6.
  14. Tilsett 5-8 μL av 1% H2O2 og vent 10-15 min. Overvåk utviklingen av DAB under et mikroskop ved bruk av et 4-10x mål.
  15. Stopp reaksjonen ved å fjerne DAB-løsningen med 0,1 M Tris-HCl buffer, pH 7,6.
  16. Skyll kulturene i PBS i 30 min (flere endringer).
  17. Monter hydrogeler på glass lysbilder ved hjelp av vandig-baserte monterings medier.
  18. Analysere lengden og fordelingen av axons inne i hydrogel ved hjelp av Sholl analyse plug-in eller med NeuriteJ plug-in for ImageJ programvare30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Her presenterer vi en allment tilgjengelig metodikk for å studere axonal vekst i 3-D hydrogel kollagen kulturer av embryonale mus nervesystemet. For å gjøre dette, isolerte vi kollagen fra voksne rotte haler å generere 3-D matriser der vi kultivert genetisk modifisert celle aggregater uttrykker Netrin-1 eller Sema3E konfrontert med embryonale neuronal vev (f. eks, CA-regionen på hippocampus). Disse celle aggregater dannet en radielt fordelt gradient av kandidaten molekylet inne i kollagen matrise. Til slutt, for å evaluere neuronal respons på forskjellige molekyler, merket vi kulturene ved hjelp av immunocytochemical metoder (f. eks α-TUJ-1) og ved å bruke en enkel og lett kvantifisering metode, fikk vi nok data til å fastslå effekten av antatte kandidat på axonal oppførsel.

I eksperimentet, da hippocampus axons ble konfrontert med Netrin-1, vokste disse axons fortrinnsvis mot kilden til Netrin-1, som indikerer at Netrin-1 fungerer som et chemoattractive molekyl for disse axons (figur 1B). I kontrast, når hippocampus axons der konfrontert med Sema3E-sekresjon celler, de fleste av dem vokste motsatt av celle mengde indikerer at Sema3E er et chemorepulsive molekyl for dem (figur 1C). I kontroll tilstand (mock transfeksjoner), alle axons vokste radielt uten retningsbestemt preferanse (figur 1A). Figur 1 D-E er skjematisk representasjon av det axonal svaret og kvantifisering metoden. Etter image oppkjøpet, trakk vi en linje i midten av explant som avgrenset proksimale (nær celle aggregat) og den som er motsatt av celle aggregat) kvadranter for å beregne proksimale/avstand forholdet (P/D ratio). I kontroll forhold ble axons jevnt fordelt i begge kvadranter (radial utvekst) som indikerte et forhold P/D = 1 (figur 1D). Da explants viste økt antall axons i proksimale-kvadrant i forhold til den som ble den opp (indikerer kjemoattraksjon) var forholdet P/D > 1 (figur 1E) og når antallet axons var høyere i den proksimale en (som indikerer chemorepulsion) forholdet var P/D < 1 (figur 1F).

For å oppnå gode resultater med denne teknikken, må vi sørge for at kollagen polymerisering er homogen, celle transfeksjoner er effektiv, og avstanden mellom vevet explant og celle aggregat er hensiktsmessig (se diskusjon).

Som konklusjon, kan vi bekrefte at generering av 3-D kollagen-baserte hydrogeler er en nyttig teknikk for å evaluere axonal vekst og atferd svar på kandidat veiledning molekyler som kan spille viktige roller i axonal migrasjon under nervesystemet utvikling.

Figure 1
Figur 1 : Eksempler på explants som vokser i 3-D hydrogeler i konfrontasjon eksperimenter og kvantifisering metoder. (A-C) Explants ble Hentet fra hippocampus regionen på E 14.5, kultivert for 48 h in vitro, og merket med βIII-tubulin (α-TUJ-1) av immunostaining. Forskjeller i axonal vekst kan observeres visuelt. Vennligst Sammenlign (A) med (B-C). (D-E) Skjematisk fremstilling av axonal respons og kvantifisering metode. Prikket linje avgrenser både proksimale (P) og den høyre (D) kvadrant for å beregne forholdet P/D. forhold P/D = 1 representerer et radial mønster av vekst (d); P/D > 1 angir en chemoattractive respons (E), og p/d < 1 indikerer en chemorepulsive effekt (F). Forkortelser: CA = CA1-3 hippocampus regioner; D = ikke i kvadrant; P = proksimale kvadrant. Skala stolper = 200 μm (A-C). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Veksten av å utvikle axons er hovedsakelig invasiv og inkluderer ECM degradering og remodeling. Ved hjelp av prosedyren som presenteres her, kan forskerne få en homogen 3-D matrise dannet av den naturlige typen jeg kollagen der axons (eller celler) kan svare på en kjemisk gradient skilles ut av genetisk modifiserte celler som de gjør i vivo. Ulike axonal svar på graderinger av attraktive eller hemmende signaler (protein, lipider, etc.) kan lett sammenlignes med bestemte kontroll (mock transfekterte celler). Som fordeler, må vi nevne at sener er lett å isolere og faktisk de kan være rester av dyr eksperimentering. I tillegg er sener svært kollagen jeg konsentrert i forhold til andre vev som hud eller lunge31.

Selv om metodikken som presenteres her er enkel å utføre, er det noen skritt som trenger spesiell oppmerksomhet i løpet av prosessen. Når det gjelder kollagen utvinning, er det viktig å fjerne uønskede blodkar og huden rusk fra halen sener for å forbedre kollagen renhet og kvaliteten på gelation. Det er også obligatorisk å opprettholde sterile tilstander ved å utføre noen trinn under en steril laminær Flow hette og sterilisering kirurgiske verktøy før bruk. I tillegg er det viktig å opprettholde de riktige pH og temperaturforhold av løsningene. For eksempel, hvis MEM 10x og bikarbonat løsninger ikke er optimale, vil kollagen matrise ikke polymeres homogent, og følgelig vil axonal vekst og resultat bli negativt påvirket. Videre, hvis kollagen lager løsningen er for konsentrert eller for fortynnet, vil matriser ikke gel riktig. I vår erfaring, den beste kollagen lager konsentrasjonen er ca 5-5.5 mg/mL protein (kvantifisert av et fargemetrisk protein analysen Kit) og vi bruker en 3:1 fortynning (kollagen: 0.1 x MEM) for å få perfekt hydrogel matriser. Når det gjelder celle transfeksjoner og celle aggregat formasjon, er det viktig å opprettholde sterile forhold og unngå mulig forurensning, for eksempel, rensende plasmider vektorer med endotoksin-fri plasmider DNA rensing kits er obligatorisk. Vi må også understreke at transfeksjoner forholdene varierer avhengig av celle type, passasje nummer og plasmider egenskaper. Her har vi rapportert de optimale og rutinemessige forhold i våre hender. Derfor bør forskerne teste de anbefalte konsentrasjonene som er angitt av produsenten, eller justere dem for å bestemme sine egne optimale forhold.

Når det gjelder problemer som kan oppstå med denne teknikken, må vi vurdere at noen ganger 3-D matriser ikke presentere forventet homogen gel-lignende struktur. I dette tilfellet er det viktig å sjekke temperaturen og pH-tilstanden til løsningene og forkaste dem i tilfelle det er feil. Det anbefales også å utføre en kvalitetskontrolltest som denaturering polyakrylamid gel elektroforese (SDS-side) under redusere forholdene for å validere renheten av kollagen lager forberedelse. Med denne tilnærmingen, ren og uskadet type I kollagen viser en typisk migrasjon mønster bestående av 2 monomere α kjeder (α1 og α2), 3 dimeric β kjeder (β11, β12, variant β11), og 1 trimeric γ kjeden32,33. Hvis det oppnådde kollagen ikke passer dette mønsteret, bør det ikke brukes. Endelig, etter immunostaining, kan axons vises radielt distribueres når konfrontert med celler sekresjon en chemorepulsive eller chemoattractive molekyl. I denne situasjonen, må effektiviteten av transfeksjoner kontrolleres ved å utføre en prikk blotting teknikk på riktig co-kultur system (hvis DNA-plasmider er alkalisk fosfatase-merket) eller ved å behandle kultur Media etter transfeksjoner av vestlige Blotting. En begrensning å vurdere er at avstanden mellom celle aggregat og vev explant er avgjørende. Hvis de er veldig langt fra hverandre, vil vi ikke kunne se noen klar effekt av utskilt molekyl på vevet explant, men hvis de er svært nær hverandre, vil effekten bli for sterk til å bli vurdert som et godt resultat. Fra vår erfaring, er den riktige avstanden rundt en explant-størrelse (400-500 μm) fordi molekyl gradient generert av celle aggregat vil forlenge radielt fra langs 400-500 μm etter 24 h i kulturen.

Alternativt kan man bruke kommersielle tumor-avledet ECM-ekstrakt i stedet for rotte tail kollagen. I så fall må alle prosedyrene utføres ved mellom 4 og 10 ° c, siden gelation av kommersiell ECM-ekstrakt er temperatur avhengig. Derfor bør det utvises spesiell forsiktighet for å sikre at alle kultur retter, pipette tips, kultur medier og løsninger opprettholdes ved 4 ° c.

Til slutt, selv om metoden som presenteres her er i hovedsak knyttet til analyse av neuronal funksjoner som axonal vekst eller neuronal migrasjon, blir det også en nyttig teknikk for farmakologisk screening, vedheft analyser, in vitro atrieflimmer eksperimenter og vevs tekniske strategier34,35,36.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker Tom Yohannan for den redaksjonelle råd og M. Segura-Feliu for teknisk assistanse. Dette arbeidet ble finansiert av CERCA programmet og av Kommisjonen for universiteter og forskning ved Institutt for innovasjon, universiteter og Enterprise av Generalitat de Catalunya (SGR2017-648). Dette arbeidet ble finansiert av det spanske departementet for forskning, innovasjon og universitet (MEICO) gjennom BFU2015-67777-R og og RTI2018-099773-B-100, den spanske Prion Network (Prionet Spania AGL2017-90665-kone), og instituttet Carlos III, CIBERNED ( SNUSE-2018-2).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets (DAB) Sigma D5905
Adult Sprague-Dawley rats (8 to 9 weeks old)  Criffa-Credo, Lyon, France
Avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) Vector Labs PK-4000
B27 serum-free supplement 50x  Invitrogen 17504-044
Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit Pierce 23225
cDNA plasmid vectors
COS1 cell lines ATTC CRL-1570
D-(+)-Glucose Sigma 16325
D-(+)-glucose (45% solution in water) for complete Neurobasal medium Sigma G8769
D-MEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium 1x ) for COS1 culture medium Invitrogen 41966-029
Dulbecco’s phosphate buffered saline 10x (without Ca2+ and Mg2++) (D-PBS) for cultures Invitrogen 14200
Ethanol  merck 108543
Ethylenediaminetetraacetic acid dihydrate disodium salt (EDTA) Sigma E5134
Fluorescence mounting media (e.g., Fluoromount-G or similar) Electron Microscopy Sciences (EMS) 17984-25
Gelatin powder  Sigma G1890
Glacial acetic acid (Panreac, cat. no. 211008) Panreac 211008
Hank’s balanced salt solution  Invitrogen 24020083
Heat-inactivated foetal bovine serum  Invitrogen 10108-165
Heat-inactivated horse serum  Invitrogen 26050-088
Hydrogen peroxide (H2O2, 32 to 33% in water) Sigma 316989
L-glutamine 200 mM solution (100x) for complete Neurobasal and COS1 medium Invitrogen 25030-024
Lipofectamine 2000 Reagent Invitrogen 11668-019
Mice pregnant female (embryonic day 12.5 to 16.5; E12.5-16.5)  Criffa-Credo, Lyon, France
Modified Minimum Essential Medium Eagle (MEM) Invitrogen 11012-044
Monoclonal antibody against class III β-tubulin (clone TUJ-1) Biolegend 801201
N-2 supplement 100x  Invitrogen 17502-048
Neurobasal medium  Invitrogen 21103049
Paraformaldehyde Merck 1,040,051,000
Penicillin/streptomycin solution 100x  Invitrogen 15140-22
Phosphate buffered saline 10x (PBS) for immunocytochemistry Invitrogen AM9624
Secondary antibody: biotinylated horse anti-mouse  Vector Labs BA-2000
Serum-free medium (Opti-MEM) Invitrogen 11058-021
Sodium azide  Panreac 162712
Sodium bicarbonate solution 7.5%  Invitrogen 25080-094
Sterile culture grade H2O  Sigma W3500
TritonTM X-100  Sigma X100
Trizma base  Sigma T1503
Trypsin-EDTA (Trypsin (0.05% (wt/vol) with EDTA (1x) Invitrogen 25300-054
Equipment
1 large and 1 small curved scissors for dissection  Fine tools Instruments or similar
1.5 mL conical centrifuge tubes  Eppendorf or similar
15 mL conical centrifuge tubes  Corning or similar
2 haemostats   Fine tools Instruments or similar
2 small straight dissecting scissors Fine tools Instruments or similar
200 mL centrifuge tubes for centrifugation Nalgene or similar
200 mL sterile glass conical flasks
2 L glass beaker
4- and 6-well culture plates  Nunc 176740 and 140675
Automatic pipette pumps and disposable 10 mL and 25 mL filter-containing sterile plastic pipettes. Gilson, Brand, Eppendorf or similar 
Automatic pipettes, sterile filter tips and current sterile tips  Gilson, Eppendorf or similar
Bench top microcentrifuge with angle fixed rotor  Eppendorf, Beckman Coulter or similar
Bench top refrigerated centrifuge with swing-bucket rotor (with 1.5, 15 and 50 mL tube adaptors) Eppendorf, Beckman Coulter or similar
Cell culture incubator at 37 °C, 5% CO2 and 95% air
Dialysis tubing cellulose membrane Sigma D9402
Dialysis tubing closures  Sigma Z37101-7
Disposable glass pipettes
Dissecting microscope with dark field optics  Olympus SZ51 or similar 
High-speed refrigerated Beckman Coulter centrifuge or similar with angle fixed rotor
Laminar flow hood
Large 100 mm, 60 mm and small 35 mm Ø cell culture dishes  Nunc  150679 , 150288 and 150318, respectively
Magnetic stirrer and magnetic spin bars IKA or similar
McIlwain tissue chopper Mickle Laboratory Engineering
One pair of fine straight forceps and one pair of curved forceps  Fine tools Instruments or similar
Razor blades for the tissue chopper
Scalpels (number 15 and 11)
Two pairs of fine spatulas for transferring collagen and tissue pieces Fine tools Instruments or similar

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ramón y Cajal, S. Les nouvelles idées sur la structure du système nerveux chez l'homme et chez les vertébrés. , (1894).
  2. Ramón y Cajal, S. Nuevo concepto de la histología de los centros nerviosos. , (1893).
  3. Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Tsai, L. H. Guiding neuronal cell migrations. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (2), 001834 (2010).
  4. Tessier-Lavigne, M., Goodman, C. S. The molecular biology of axon guidance. Science. 274 (5290), 1123-1133 (1996).
  5. Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).
  6. Kolodkin, A. L., Tessier-Lavigne, M. Mechanisms and molecules of neuronal wiring: a primer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (6), 001727 (2011).
  7. Rosentreter, S. M., et al. Response of retinal ganglion cell axons to striped linear gradients of repellent guidance molecules. Journal of Neurobiology. 37 (4), 541-562 (1998).
  8. Knoll, B., Weinl, C., Nordheim, A., Bonhoeffer, F. Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration. Nature Protocols. 2 (5), 1216-1224 (2007).
  9. von Philipsborn, A. C., et al. Growth cone navigation in substrate-bound ephrin gradients. Development. 133 (13), 2487-2495 (2006).
  10. Chen, H., He, Z., Tessier-Lavigne, M. Axon guidance mechanisms: semaphorins as simultaneous repellents and anti-repellents. Nature Neuroscience. 1 (6), 436-439 (1998).
  11. Jessell, T. M., Sanes, J. R. Development. The decade of the developing brain. Current Opinion in Neurobiology. 10 (5), 599-611 (2000).
  12. Serafini, T., et al. The netrins define a family of axon outgrowth-promoting proteins homologous to C. elegans UNC-6. Cell. 78 (3), 409-424 (1994).
  13. Charron, F., Tessier-Lavigne, M. Novel brain wiring functions for classical morphogens: a role as graded positional cues in axon guidance. Development. 132 (10), 2251-2262 (2005).
  14. Fournier, M. F., Sauser, R., Ambrosi, D., Meister, J. J., Verkhovsky, A. B. Force transmission in migrating cells. Journal of Cell Biology. 188 (2), 287-297 (2010).
  15. Dent, E. W., Gertler, F. B. Cytoskeletal dynamics and transport in growth cone motility and axon guidance. Neuron. 40 (2), 209-227 (2003).
  16. Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (5), 332-343 (2009).
  17. Castellani, V. B. Protocols for Neuronal Cell Culture. , Humana Press Inc. (2001).
  18. Gahwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
  19. Bornstein, M. B. Reconstituted rattail collagen used as substrate for tissue cultures on coverslips in Maximow slides and roller tubes. Laboratory Investigation. 7 (2), 134-137 (1958).
  20. Billings-Gagliardi, S., Wolf, M. K. A simple method for examining organotypic CNS cultures with Nomarski optics. In Vitro. 13 (6), 371-377 (1977).
  21. Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proceedings of the National Academy of Science. 76 (3), 1274-1278 (1979).
  22. Lumsden, A. G., Davies, A. M. Earliest sensory nerve fibres are guided to peripheral targets by attractants other than nerve growth factor. Nature. 306 (5945), 786-788 (1983).
  23. Chedotal, A., et al. Semaphorins III and IV repel hippocampal axons via two distinct receptors. Development. 125 (21), 4313-4323 (1998).
  24. Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78 (3), 425-435 (1994).
  25. Klein, R. Eph/ephrin signaling in morphogenesis, neural development and plasticity. Current Opinion in Cell Biology. 16 (5), 580-589 (2004).
  26. Wang, K. H., et al. Biochemical purification of a mammalian slit protein as a positive regulator of sensory axon elongation and branching. Cell. 96 (6), 771-784 (1999).
  27. Emonard, H., Grimaud, J. A., Nusgens, B., Lapiere, C. M., Foidart, J. M. Reconstituted basement-membrane matrix modulates fibroblast activities in vitro. Journal of Cell Physiology. 133 (1), 95-102 (1987).
  28. Knapp, D. M., Helou, E. F., Tranquillo, R. T. A fibrin or collagen gel assay for tissue cell chemotaxis: assessment of fibroblast chemotaxis to GRGDSP. Experimental Cell Research. 247 (2), 543-553 (1999).
  29. Kapur, T. A., Shoichet, M. S. Immobilized concentration gradients of nerve growth factor guide neurite outgrowth. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 68 (2), 235-243 (2004).
  30. Torres-Espin, A., Santos, D., Gonzalez-Perez, F., del Valle, J., Navarro, X. Neurite-J: an image-J plug-in for axonal growth analysis in organotypic cultures. Journal of Neuroscience Methods. 236, 26-39 (2014).
  31. Balestrini, J. L., et al. Comparative biology of decellularized lung matrix: Implications of species mismatch in regenerative medicine. Biomaterials. 102, 220-230 (2016).
  32. Qian, J., et al. Kinetic Analysis of the Digestion of Bovine Type I Collagen Telopeptides with Porcine Pepsin. Journal of Food Science. 81 (1), 27-34 (2016).
  33. Eyre, D. R., Weis, M., Hudson, D. M., Wu, J. J., Kim, L. A novel 3-hydroxyproline (3Hyp)-rich motif marks the triple-helical C terminus of tendon type I collagen. Journal of Biological Chemistry. 286 (10), 7732-7736 (2011).
  34. Garnotel, R., et al. Human blood monocytes interact with type I collagen through alpha x beta 2 integrin (CD11c-CD18, gp150-95). Journal of Immunology. 164 (11), 5928-5934 (2000).
  35. Montolio, M., et al. A semaphorin 3A inhibitor blocks axonal chemorepulsion and enhances axon regeneration. Chemistry and Biology. 16 (7), 691-701 (2009).
  36. Garcia-Gareta, E. Collagen gels and the 'Bornstein legacy': from a substrate for tissue culture to cell culture systems and biomaterials for tissue regeneration. Experimental Dermatology. 23 (7), 473-474 (2014).

Tags

Nevrovitenskap 3-D hydrogel kulturer axonal vekst vev explants embryonale nervesystemet celle transfeksjoner kjemoattraksjon chemorepulsion
Generering av 3-D kollagen-baserte Hydrogeler å analysere axonal vekst og atferd under nervesystemet utvikling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gil, V., Del Río, J. A.… More

Gil, V., Del Río, J. A. Generation of 3-D Collagen-based Hydrogels to Analyze Axonal Growth and Behavior During Nervous System Development. J. Vis. Exp. (148), e59481, doi:10.3791/59481 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter