Summary
Здесь мы предоставляем метод анализа поведения растущих аксонов в 3D матрицах, имитирующих их естественное развитие.
Abstract
Этот протокол использует естественный коллаген i типа для того чтобы произвести трехмерный (3-D) гидрогель для контролировать и анализировать рост аксонального. Протокол сосредоточен на культивировании небольших кусочков эмбрионального или раннего послеродового мозга грызунов внутри 3-D гидрогеля, образованного коллагеном типа I, полученным от хвоста крысы. Части тканей культивируются внутри гидрогеля и сталкиваются с конкретными фрагментами мозга или генетически модифицированными клеточными агрегатами для производства и выделения молекул, пригодных для создания градиента внутри пористой матрицы. Шаги этого протокола просты и воспроизводимы, но включают критические шаги, которые необходимо тщательно рассмотреть при его разработке. Кроме того, поведение растущих аксонов можно контролировать и анализировать непосредственно с помощью фазово-контрастного микроскопа или моно/мультифотонного флуоресцентного микроскопа после фиксации иммуноцитохимическими методами.
Introduction
Нейронные аксоны, заканчивающиеся аксоновыми конусами роста, мигрируют на большие расстояния через внеклеточную матрицу (ECM) эмбриона по определенным путям для достижения соответствующих целей. Конус роста дистальная часть аксона и специализируется на чувстве физической и молекулярной среды клетки1,2. С молекулярной точки зрения, рост конусов руководствуются по крайней мере четыре различных молекулярных механизмов: контакт притяжения, химиоаттракцион, контактное отталкивание, и chemorepulsion вызвано различными аксональных сигналов руководства3,4 , 5 , 6. Контактные процессы могут быть частично контролироваться в двухмерных (2D) культурах на микроузорчатых субстратах (например, с полосами7,8 или пятнами9, содержащими молекулы). Тем не менее, аксоны могут перемещаться к своей цели в недиффузной манере, чувствуянесколько привлекательных и отталкивающих молекул из клеток направляющего столба в окружающей среде 4,5,10. Здесь мы описываем простой метод трех-D культуры, чтобы проверить, является ли секретная молекула вызывает chemorepulsive или химиопривлекательные эффекты на развивающихся аксонов.
Самые ранние исследования, направленные на определение эффектов аксон руководства сигналы использовали explant культур в трехмерных (3-D) матрицы для создания градиентов, имитирующих в условиях vivo11,12. Этот подход, наряду с экспериментами in vivo, позволил выявить четыре основных семейства наведения сигналов: Netrins, Slits, Semaphorins, и Ephrins4,5,6. Эти молекулярные сигналы и другие факторы13 интегрированы растущими аксономи, запуская динамику адгезионных комплексов и преобразуя механические силы через цитоскелет14,15,16. Для генерации молекулярных градиентов в трех-D культур для аксональной навигации, новаторские исследователи использовали плазменный сгусток субстратов17, который также был использован для органотипических срез препаратов18. Тем не менее, в 1958 году, новый протокол для создания 3-D коллагена гидрогели было сообщено для изучения с устройствами Максимова19, культурная платформа, используемая в нескольких исследованиях, пригодных для микроскопических наблюдений20. Другое исследование пионера сообщили коллагена гель в качестве инструмента для встраивания человека фибробластов для изучения дифференциации фибробластов в миофибробласты в процессах заживления ран21. Параллельно, Ламсден и Дэвис применяется коллаген из бычьей дермы для анализа преображаемого влияния фактора роста нерва (NGF) на руководящих сенсорных нервных волокон22. С развитием новых культурных платформ (например, многоколодцных пластин) различными компаниями и лабораториями, коллагеновые культуры были адаптированы к этим новым устройствам6,23,24,25 ,26. Параллельно, экстракт материала ECM, полученных из Линии опухолевых клеток Энгельбрета-Хольма-Срой, был коммерчески доступен для расширения этих исследований27.
Недавно было разработано несколько протоколов для генерации молекулярных градиентов с исходными ролями в аксоне, используя 3-D гидрогели (например, коллаген, фибрин и т.д.) 28. Кроме того, молекула-кандидат может быть обездвижена в разной концентрации в пористой матрице (например, NGF29) или порождена путем культивирования в небольшой области 3-D гидрогелевной клетки агрегатов, выделяющих молекулу для генерации радиальной градиент4,23,24,25,26. Последняя возможность будет объяснена в этом протоколе.
Процедура, представленная здесь, является простым, быстрым и высоко воспроизводимым методом, основанным на анализе аксонального роста в трехмерных гидрогелевы химкультурэмбрионных культурах эмбрионального мозга мыши. По сравнению с другими методами, протокол хорошо подходит для неподготовленных исследователей и может быть полностью разработан после короткого обучения (1-2 недели). В этом протоколе мы сначала изолируем коллаген от взрослых крысиных хвостов для дальнейшего создания 3-D матриц, в которых генетически модифицированные клеточные агрегаты культивируются перед эмбриональной нейронной тканью. Эти клеточные агрегаты образуют радиальные химические градиенты молекулы-кандидата, которые вызывают реакцию на растущие аксоны. Наконец, оценка влияния молекулы на растущие аксоны может быть легко выполнена с помощью фазовой контрастной микроскопии или, в качестве альтернативы, иммуноцитохимических методов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на животных проводились в соответствии с руководящими принципами и протоколами Комитета по этике для экспериментов на животных (CEEA) Университета Барселоны, и протокол об использовании грызунов в данном исследовании был рассмотрен и одобрен CEEA Университет Барселоны (CEEA утверждение #276/16 и 141/15).
1. Очистка крысиного хвоста коллагена
- Соберите взрослых хвостов Крысы Sprague-Dawley (8-9 недель) после жертвоприношения животного в соответствии с этическими нормами и промыть 95% этанола. Поместите 2-4 хвоста на лед (4 градуса По Цельсию) и держите их покрытыми льдом во время процесса.
- Чтобы получить хвостовые сухожилия, закрепите хвост на самых хвостовых позвонках хвоста с помощью гемостата и сжигивите хвост вторым гемостатом, расположенным примерно на 5-7 мм от первого. Разбейте хвост, резко скручивая его обоими гемостатами. Для этого сложите/разверните позвонки несколько раз, пока он не сломается.
- Потяните позвонки медленно с hemostat, чтобы отделить сухожилия от их оболочки, как он выходит. В этот момент вырежьте сухожилия мелкими ножницами. Держите эти кусочки сухожилия в стерильной 100 мм чашку Петри на льду.
- Повторите зажим и скольжения для остальной части хвоста, пока сухожилия полностью извлечены.
- Повторите шаги 1.2-1.4 для всех полученных хвостов.
- Наблюдайте сухожилия под микроскопом. Откажитесь от кровеносных сосудов, разрезая мелкими ножницами и держа с прямыми тонкими щипками, чтобы улучшить чистоту сухожилия и промыть сухожилия 3 раза ультрачистой водой.
- Соберите 3-4 г влажных сухожилий. Растворите сухожилия в 150 мл 3% ледниковой уксусной кислоты при 4 градусах Цельсия в стеклянной конной колбе 200-250 мл на 24-36 л, под нежным перемешиванием.
- Центрифуга при 20 000 х г на 1 ч. Параллельно, подготовить диализ трубме мембраны, разрезая кусок около 10-15 см в длину и варить его в ультрачистой воде, содержащей 1 мМ этиленденедиаминететраацетической кислоты (ЭДТА) в течение 15 мин. После этого аккуратно промыть мембрану диализа тщательно с ультрачистой водой.
- После центрифугации, собирать супернатант в диализе трубной мембраны путем декантации. Гранулы содержат кислый нерастворимый материал (неколлагеновые белки), а супернатант содержит растворимые коллагеновые белки.
- Диализ супернатант против 2 л стерильных 0,1x Минимальный основной средний орел (MEM), рН 4.0 в 2-5 L стеклянный стакан. Диализ в течение 3 дней. Изменение решения 0.1x MEM по крайней мере два раза в день проверяя рН при каждом изменении перед использованием. Если рН стал базовым, измените его с помощью нескольких капель уксусной кислоты 0,1 М до 4,0.
- После диализа добавьте антибиотики (1,5 мл пенициллина/стрептомицина (Pen-Strep)) в диализированный коллагеновый раствор. Сделать 5 мл aliquots коллагена бульона раствора и хранить при 4 градусах Цельсия.
ПРИМЕЧАНИЕ: С этого момента все процедуры обработки должны выполняться в стерильных условиях в ламинарном капоте потока. -
Продолжить геляционный тест подготовленного раствора коллагена после следующих шагов.
- Так как бульонный коллаген обычно слишком концентрирован, подготовьте 3 рабочих разбавления (75%, 50% и 25% коллагенового раствора) путем разбавления бульона в 0,1x MEM, pH 4.0. Окончательный объем, рекомендованный для каждого рабочего разбавления, составляет 5 мл. В каждом условии, проверить концентрацию белка с помощью белка colorimetric анализ.
- Поместите несколько пустых 1,5 мл конических центрифуговых труб (по одному на каждое работающее разбавление), 10-x мем-трубки, 7,5% раствор бикарбоната натрия и различные рабочие разбавления коллагена на льду. Подождите, пока они охлаждаются.
- Добавьте 40-50 л 10x MEM в холодную (4 к ВК) центрифугу трубку. Далее, смешайте его осторожно с 7-8 л раствора бикарбоната натрия.
- Добавьте в эту трубку 310-330 л одного из различных разбавлений коллагена и аккуратно перемешайте ее с пипеткой, избегающей образования пузырьков. Держите смесь бикарбоната коллагена-МЕм-натрия на льду (4 градуса По Цельсию) в течение не менее 5 мин.
- Пипетка 10-25 л смеси в 35 мм чашку Петри.
- Поместите чашку Петри в инкубатор CO 2, установленный при 37 градусах По Цельсию, до тех пор, пока не будет наблюдаться гелевание гидрогеля (15-20 мин).
- Повторите шаги 1.12.3-1.12.6 для остальных разбавления коллагена в различных блюдах Петри.
- Выберите коллаген амракии, который делает лучшие результаты.
ПРИМЕЧАНИЕ: Лучший гелеобразный гидрогель должен иметь однородную полупрозрачную текстуру, серый цвет и не должен быть кусковым или тягучим. По нашему опыту, разбавление 3:1 (Коллаген: 0.1x MEM) генерирует лучшие экспериментальные результаты.
2. Подготовка клеток (COS1) Агрегаты генетически модифицированных, чтобы секретировать молекулу кандидата в 3-D коллагенгидрогели
- Плита 2 х 106 COS1 клеток в 35 мм Петри блюда и инкубировать с полной среде культуры состоит из 100 мл D-MEM, содержащий 10% (vol/vol) тепло-инактивированной плода крупного рогатого скота сыворотки, 0,5% (WT/vol) глутамин и 1% (Wt/vol) Pen /Strep в клеточной культуре инкубатор, для того, чтобы достичь 70-80% выпуклости в одночасье. Приготовьте одно блюдо Петри для каждой процедуры трансфекции.
-
На следующий день трансфектные клетки COS1 с ДНК, кодирующей молекулу-кандидата (Netrin-1 или Sema3E) с использованием метода трансфекции на основе липосомы в соответствии с инструкциями производителя.
- Для этого смешайте 250 л сыворотки среды и ДНК (1-2 мкг на состояние) в 1,5 мл центрифуги трубки (ДНК трубки) и перемешать. Инкубировать при комнатной температуре (RT) в течение 5 мин. Подготовьте вторую трубку (липосомальная трубка), добавив 240 л/с среды, свободной от сыворотки, и 10 л липосомального трансфекционного реагента. Инкубировать на RT в течение 5 мин.
- После инкубации добавьте содержимое ДНК-трубки в липосомальную трубку и аккуратно перемешайте. Теперь инкубировать на RT в течение 15 мин. Замените среду на культивированных клетках с 1,5 мл сыворотки свободной среде и добавить ДНК-липосомы смесь в чашку Петри медленно dropwise. Инкубировать 3 ч в инкубаторе культуры CO 2.
- После 3 ч трансфекционной инкубации замените среду полной культурой среды и инкубировать на ночь в инкубаторе.
- На следующий день, промыть клетки с 0,1 М Dulbecco в фосфат буферных солен (D-PBS), лечить культуры с трипсин-EDTA (800 л на каждое блюдо в течение 5-15 минут в CO2 инкубатора) и собирать отдельные клетки с 15 мл полной среде культуры.
- Центрифуги клетки при 4 градусах по Цельсию при 130 х г в течение 5 мин. После центрифугирования удалите носители и сохраните гранулы, содержащие клетки COS1, на льду.
- Повторите шаги 1.12.3-1.12.6 для подготовки коллагеновой рабочей смеси.
- Добавьте 100-150 л коллагеновой смеси в гранулы трансинфицированных клеток и аккуратно перемешайте, прокладывая вверх и вниз, и распространяйте 45-50 л этой смеси на блюдо Петри (диаметр 35 мм) для формирования единой полосы коллагеновых клеток длиной около 1-1,5 см. Поместите блюдо в инкубатор при состоянии 37градусов по Цельсию (5% CO 2) до гелирования (15-20 мин).
- Приготовьте вторую полоску, содержащую контрольные клетки (mock transfection) во второй культуре блюдо и наплитуйте ее в инкубаторе (15-20 мин) и когда гелевание завершится, добавьте 3-4 мл подогретого (37 кВ) COS1 полной культуры среды к каждому блюду, содержащему гелеобразную коллаген-клетки раздевают и держат их в инкубаторе культуры CO 2. После этого вырежьте полоски коллагеновых клеток для генерации небольших квадратных кусочков (от 400 до 500 мкм в длину) с помощью мелкого скальпеля или тканевого измельчителя.
- Перенесите все секции из одного и того же трансфекционного состояния в чашку Петри, содержащую 3-3,5 мл нейронной культуры носителей (NCM) и проверьте под микроскопом вскрытия качество деталей. Опять же, держать их в ИНкубатор культуры CO 2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Нейрональная среда культуры состоит из нейробазальной среды, содержащей 1-5% (vol/vol) тепло-инактивированной сыворотки лошади, 2 мМ глутамина, 0,5% (wt/vol) глюкозы, 1% (wt/vol) Pen-Strep решение и 0.044% (wt/vol) NaHCO3. Убедитесь, что рН находится между 7.2-7.3.
3. Поколение эмбрионального Explant для культуры
- Стерилизовать хирургические инструменты (ножницы, ручка лезвия скальпеля, прямые и изогнутые щипцы) путем автоматического автоматического следования обычным правилам стерилизации. Параллельно готовят 500 мл сбалансированного солевого раствора - глюкозного буфера И 4-5 блюд Петри (диаметр 100 мм), содержащего 10 мл HBSS-G. Поместите эти пластины на лед (4 градуса по Цельсию).
- Пожертвуйте беременной самкой крысы (эмбриональный день 16.5) за пределами стерильной области, следуя утвержденным этическим процедурам. Вырежьте рога эмбриона ножницами из брюшной полости и поместите его в большое блюдо Петри, содержащее холодный HBSS-G.
- Поместите блюдо в ламинарный капот потока и извлечь эмбрионы с прямыми щипками. Поместите их в новое блюдо, содержащее холодный HBSS-G. Далее, удалить кожу эмбриона с помощью небольших щипков и тщательно вскрыть мозг с помощью изогнутых и прямых щипков. Поместите их в блюдо, содержащее холодный HBSS-G.
- Под рассекающим микроскопом разрежьте мозг пополам вдоль средней линии, чтобы отделить оба полушария скальпелем или тонкими ножницами и удалить диенцефалон, обезвреживание и кровеносные сосуды из кусочков мозга тонкими щипками.
- Повторите шаги 3.3-3.4 с остальными эмбрионами. Не откладывайте вскрытие более чем на 2 ч, чтобы сохранить качество ткани.
- Очистите все части тканевого измельчителя 100% этанолом (особенно тритетрафторэтилен (ПТФЕ) режущей пластины и лезвия бритвы). Держите тканевой вертолет в ламинарном пуховом капоте под ультрафиолетовым освещением в течение 15 минут.
- Перенесите каждую часть ткани (например, кору с гиппокампом) на режущей пластине тканевого измельчителя. Для гиппокампа, поместите его перпендикулярно лезвию бритвы и получить ткани разделов 450-500 мкм в толщину.
- Приготовьте несколько 35 мм посуды Петри с 3-4 мл полного NCM и перенесите кусочки ткани из тарелки тканевого измельчителя в посуду Петри. Многие блюда могут быть необходимы, как регионы, представляющие интерес вскрыты.
- Закончите рассечение ткани в полном NCM с помощью тонких вольфрамовых игл. Проверьте качество полученных ломтиков под рассекающимся микроскопом. Убедитесь, что слои четко идентифицируются в оптике темного поля и вскрыть область интереса (например, CA области гиппокампа) с вольфрамовых игл. Отбросьте поврежденные ломтики. Держите гиппокампа explants в полной среде NCM в CO2 инкубатора.
4. Подготовка трехмерных кокультур в коллагеновых гидрогелях
- Поместите несколько стерильных 4-колодцев культуры пластин в ламинарный капот потока и подготовить коллагенрабочей смеси, как ранее указывалось в шагах 1.12.2-1.12.6.
- Поместите 15-20 л гидрогелевой смеси в дно скважины для получения круглого коллагена. Повторите этот шаг для остальных скважин. Не подготовьте более пяти пластин одновременно, чтобы избежать чрезмерного жидкого испарения из основания гидрогеля.
- Храните посуду в инкубаторе до полного гелирования (15-20 мин) и вынимайте тарелки из инкубатора только после завершения гелирования. Проверьте качество гелеобразного коллагена.
- Перенесите небольшой кусочек агрегата coS1 с помощью пипетки. Поместите его на основание гидрогеля и поместите кусок ткани на той же основе с пипеткой близко к куску клеток агрегата на один explant размера.
- Подготовьте новую рабочую смесь коллагена на льду, как в шагах 1.12.2-1.12.6.
- Аккуратно пипетка 15-20 л этой новой смеси и покрыть explant и совокупности клеток. Будет наблюдаться сэндвич-подобная гидрогельная культура. В этот момент, переориентировать explant с тонкой иглой вольфрама (не прикасайтесь к агрегату ячейки COS1!), Так что он сталкивается с совокупностью ячейки на 500-600 мкм.
- Вернуть пластину в инкубатор до тех пор, пока не будет наблюдаться гелирование (10-15 мин) и 0,5 мл полного NCM, дополненного дополнением 2% B27и сохраняйте культуры в течение 36-48 ч в инкубаторе (37 градусов по Цельсию, 5% CO 2).
5. Фиксация эксплант-клеточных агрегатных кокультур и иммуноцитохимических процедур
- После 36-48 ч инкубации, удалить среду и промыть с 0,1 М фосфат буферного соления (PBS), рН 7.3. После этого, исправить культур ы для 1 ч с 4% параформальдегида в 0,1 М фосфатбуфер (Pb), рН 7,3, при 4 градусах Цельсия.
- Удалить фиксатор и аккуратно промыть культуры 3-4 раза (10-15 мин каждый) в 0,1 М ПБ, рН 7,3.
- Отсоедините сэндвич с гидрогелем со дна колодца шпателем или щипками. Перенесите коллагеновый блок тонкой кистью в 6-колодую культурную пластину, содержащую 0,1 М ПБС с 0,5% неионическим моющим средством.
- Инкубировать свободно плавающие гидрогели в блокирующем растворе (10% сыворотки, 0,5% неионического сурфактанта и 0,2% желатина в 0,1 М ПБС) на 2-3 ч при РТ с нежным возбуждением.
- Промыть 3 раза (10-15 мин каждый) с 0,1 М PBS, содержащий 0,5% неионического сурфактанта.
- Инкубировать первичными антителами, разбавленными в PBS, содержащей 5% сыворотки, 0,5% неионического сурфактанта, 0,2% желатина и 0,02% азида натрия. Инкубировать с основным антителом для 36-48 ч при 4 градусах по Цельсию на шейкере.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно антитела против класса III з-тубулин (З-ТУД-1) (разбавленный 1:2,000) используется для определения аксонального роста в 3-D гидрогелькультур культур. - После инкубации промыть как в шаге 5.5.
- Инкубировать вторичными антителами в течение 4 ч при РТ (или 6-7 ч при 4 градусах Цельсия) на шейкере, разбавленном 5% сыворотки, 0,5% неионического сурфактанта и 0,2% желатина. Лошадь анти-мышь биоинтинилатированных антител (разбавленных 1:200) используется в этом эксперименте.
- Промыть культуры, как в 5,5.
- Инкубировать культуры в течение 2 дней при 4 градусах Цельсия раствором авидин-биотина (ABC) 1:100, разбавленным в PBS, содержащим 5% сыворотки, 0,5% неионического сурфактанта и 0,2% желатина. Кроме того, используйте хрен peroxidase (HRP) помечены стрептавидин (разбавленный 1:300-400) в том же буфере.
- Промыть культуры, описанные в 5.5.
- Промыть культуры несколько раз с 0,1 M Tris-HCl буфер, рН 7,6 для 1 ч.
- Инкубировать культуры с 0,03% от 3,3 "-Диаминобензидин тетрагидрохлорид (DAB) раствор в 0,1 М Tris-HCl, рН 7,6.
- Добавьте 5-8 л 1% H2O2 и подождите 10-15 мин. Мониторинг развития DAB под микроскопом с помощью 4-10x цели.
- Остановите реакцию, удалив раствор DAB с буфером 0.1 M Tris-HCl, pH 7.6.
- Промыть культуры в PBS в течение 30 минут (несколько изменений).
- Установите гидрогели на стеклянные горки с помощью водной основе монтажных носителей.
- Проанализируйте длину и распределение аксонов внутри гидрогеля с помощью плагина анализа Sholl или с помощью плагина NeuriteJ для программного обеспечения ImageJ30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Здесь мы представляем широко доступную методологию для изучения аксонального роста в 3-D гидрогель коллагеновых культурах эмбриональной нервной системы мыши. С этой целью мы выделили коллаген из хвостов взрослых крыс для генерации 3-D матриц, в которых мы культивировали генетически модифицированные клеточные агрегаты, выражающие Netrin-1 или Sema3E, столкнувшиеся с эмбриональной нейрональной тканью (например, областью CA гиппокампа). Эти клеточные агрегаты сформировали радиально распределенный градиент молекулы-кандидата внутри коллагеновой матрицы. Наконец, для оценки реакции нейронов на различные молекулы, мы назвали культуры с помощью иммуноцитохимических методов (например, З-ТУД-1) и, применяя простой и простой метод количественной оценки, мы получили достаточно данных, чтобы определить влияние предполагаемых кандидата на аксональное поведение.
В нашем эксперименте, когда гиппокампа аксоны столкнулись с Netrin-1, эти аксоны выросли преимущественно к источнику Netrin-1, который указывает, что Netrin-1 действует как химиопривлекательная молекула для этих аксонов (Рисунок 1B). В отличие от этого, когда гиппокампа аксоны, где сталкиваются с Sema3E-секретирования клеток, большинство из них вырос напротив совокупности клеток, указывая, что Sema3E является chemorepulsive молекулы для них (Рисунок 1C). В состоянии управления (макет трансфекции), все аксоны росли радиально без каких-либо направлений предпочтений(рисунок 1A). Рисунок 1 D-E представляют схемные представления метода аксонального ответа и количественной оценки. После приобретения изображения мы нарисовали линию в середине explant, которая делимитировала проксимальные (близко к совокупности клеток) и дистальные (напротив агрегата ячейки) квадранты для того, чтобы вычислить проксимального/дистального соотношения (соотношение P/D). В условиях контроля аксоны были равномерно распределены в обоих квадрантах (радиальный рост), которые указывали на соотношение P/D - 1(рисунок 1D). Когда экспланты показали увеличение числа аксонов в проксимальном квадранте по сравнению с дистальным(с указанием химиотерапии) соотношение составляло P/D проксимальной один (с указанием chemorepulsion) соотношение было P / D злт; 1(Рисунок 1F).
Для того, чтобы достичь отличных результатов с помощью этого метода, мы должны убедиться, что полимеризация коллагена однородна, трансфекция клеток эффективна, и расстояние между высадкой тканей и клеточным агрегатом является целесообразным (см. Обсуждение).
В заключение, мы можем подтвердить, что генерация 3-D коллагена на основе гидрогелей является полезным методом для того, чтобы оценить аксональный рост и реакции поведения на молекулы указания кандидата, которые могут играть важную роль в аксональной миграции во время аксональной миграции развитие нервной системы.
Рисунок 1 : Примеры эксплансов, растущих в 3-D гидрогелях в конфронтационных экспериментах и методах количественной оценки. (A-C) Экспланты были получены из гиппокампа области на E14.5, культивируется для 48 ч в пробирке, и помечены с III-тубулин (З-TUJ-1) иммуно-1) путем иммуно-стения. Различия в росте аксонал можно наблюдать визуально. Пожалуйста, сравните (A) с (B-C). (D-E) Схематические представления метода аксонального ответа и количественной оценки. Пунктирная линия разграбляет как проксимальный (P), так и дистальный (D) квадрант для расчета соотношения P/D. Коэффициент P/D No 1 представляет собой радиальную картину роста ( D); P / D No gt; 1 указывает на химиопривлекательный ответ (E), и P / D lt; 1 указывает на хеморепульсивный эффект (F). Аббревиаты: CA - CA1-3 гиппокампа регионов; D - дистальный квадрант; P и проксимальный квадрант. Шкала баров 200 мкм (A-C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Рост развивающихся аксонов в основном инвазивный и включает в себя деградацию и ремоделирование ECM. Используя представленную здесь процедуру, исследователи могут получить однородную трехмерную матрицу, образованную коллагеном природного типа I, в котором аксоны (или клетки) могут реагировать на химический градиент, выделяемый генетически модифицированными клетками, как они делают in vivo. Различные аксональные реакции на градиенты привлекательных или ингибирующих сигналов (белок, липиды и т.д.) можно легко сравнить с конкретным контролем (макет трансинфицированных клеток). В качестве преимуществ следует отметить, что сухожилия легко изолировать и действительно они могут быть остатками экспериментов на животных. Кроме того, сухожилия высоко коллагена я концентрировал по сравнению с другими тканями, такими как кожа или легких31.
Хотя представленная здесь методология проста в выполнении, есть некоторые шаги, которые требуют особого внимания в процессе. Что касается извлечения коллагена, необходимо удалить нежелательные кровеносные сосуды и обломки кожи из хвостовых сухожилий, с тем чтобы улучшить чистоту коллагена и качество гелирования. Кроме того, необходимо поддерживать стерильные условия, выполняя некоторые шаги под стерильным ламинарным капотом потока и стерилизации хирургических инструментов перед использованием. Кроме того, важно поддерживать соответствующие рН и температурные условия растворов. Например, если решения MEM 10x и бикарбоната не являются оптимальными, то коллагеновая матрица не будет полимеризироваться однородно, а следовательно, аксональный рост и результат будут негативно затронуты. Кроме того, если раствор коллагена бульон слишком концентрирован или слишком разбавлен, матрицы не гель должным образом. По нашему опыту, лучшая концентрация коллагена составляет примерно 5-5,5 мг/мл белка (количественно по набору анализов колориметрического белка), и мы используем 3:1 разбавления (Коллаген: 0,1x MEM) для получения идеальной гидрогеля матрицы. Что касается трансфекции клеток и формирования клеточного агрегата, важно поддерживать стерильные условия и избегать возможного загрязнения, например, очистка плазмидных векторов с эндотоксин-свободной плазмидной очистки ДНК комплекты является обязательным. Кроме того, мы должны подчеркнуть, что условия трансфекции варьируются в зависимости от типа клетки, числа прохода и плазмидных характеристик. Здесь мы сообщили об оптимальных и рутинных условиях в наших руках. Поэтому исследователи должны проверить рекомендуемые концентрации, указанные производителем, или настроить их для определения их собственных оптимальных условий.
Что касается проблем, которые могут возникнуть с этой техникой, мы должны учитывать, что иногда 3-D матрицы не представляют ожидаемой однородной гель-подобной структуры. В этом случае важно проверить температуру и состояние рН растворов и отказаться от них в случае, если они неверны. Кроме того, рекомендуется провести контроль качества, такие как денатурирование полиакриламида гель электрофорез (SDS-PAGE) при снижении условий для проверки чистоты коллагена подготовки запасов. При таком подходе чистый и неповрежденный коллаген i типа показывает типичную схему миграции, состоящую из 2 мономерных цепей (No1 и No2), 3 димерических цепей (No11, No12, вариант No11) и 1 тримерная цепочка32,33. Если полученный коллаген не соответствует этому шаблону, его не следует использовать. Наконец, после иммуностоинга, аксоны могут появиться радиораспределенными при столкновении с клетками, выделяющими хеморепульсивную или хемопривлекательную молекулу. В этой ситуации, эффективность трансфекции должны быть проверены путем выполнения точки blotting техники на надлежащей системы совместной культуры (если ДНК плазмиды щелочной фосфатазы помечены) или путем обработки культуры средств массовой информации после трансфекции по западной Промокательной. Ограничение для рассмотрения заключается в том, что расстояние между совокупностью клеток и ткани explant имеет решающее значение. Если они находятся очень далеко друг от друга, мы не сможем увидеть какой-либо четкий эффект выделенной молекулы на ткани explant, но если они очень близко друг к другу, эффект будет слишком сильным, чтобы рассматривать как хороший результат. Исходя из нашего опыта, соответствующее расстояние составляет около одного эксплант-размера (400-500 мкм), потому что молекулярный градиент, генерируемый совокупностью клеток, будет расширяться излучаемого 400-500 мкм после 24 ч в культуре.
Кроме того, можно использовать коммерческие опухоли полученных экстракт ECM вместо коллагена хвост крысы. В этом случае все процедуры должны выполняться при температуре от 4 до 10 градусов по Цельсию, так как гелирование коммерческого экстракта ECM зависит от температуры. Таким образом, следует особое время следить за тем, чтобы все культурные блюда, советы пипетки, культурные носители и решения сохранялись при 4 градусах Цельсия.
Наконец, хотя представленный здесь метод в основном связан с анализом нейронных функций, таких как аксональный рост или миграция нейронов, он также становится полезным методом фармакологического скрининга, анализов адгезии, фибрилляции в пробирке эксперименты и стратегии тканевой инженерии34,35,36.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы благодарят Тома Иоганнана за редакционную консультацию и М. Сегуру-Фелиу за техническую помощь. Эта работа финансировалась Программой CERCA и Комиссией по университетам и исследованиям Департамента инноваций, университетов и предприятий Общего управления Каталонии (SGR2017-648). Эта работа была профинансирована испанским министерством исследований, инноваций и университета (MEICO) через BFU2015-67777-R и RTI2018-099773-B-100, испанской prion Network (Prionet Spain AGL2017-90665-REDT), и Институт Карлосiii, CIBERNED ( PRY-2018-2).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| 3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets (DAB) | Sigma | D5905 | |
| Adult Sprague-Dawley rats (8 to 9 weeks old) | Criffa-Credo, Lyon, France | ||
| Avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) | Vector Labs | PK-4000 | |
| B27 serum-free supplement 50x | Invitrogen | 17504-044 | |
| Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| cDNA plasmid vectors | |||
| COS1 cell lines | ATTC | CRL-1570 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | 16325 | |
| D-(+)-glucose (45% solution in water) for complete Neurobasal medium | Sigma | G8769 | |
| D-MEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium 1x ) for COS1 culture medium | Invitrogen | 41966-029 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline 10x (without Ca2+ and Mg2++) (D-PBS) for cultures | Invitrogen | 14200 | |
| Ethanol | merck | 108543 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid dihydrate disodium salt (EDTA) | Sigma | E5134 | |
| Fluorescence mounting media (e.g., Fluoromount-G or similar) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 17984-25 | |
| Gelatin powder | Sigma | G1890 | |
| Glacial acetic acid (Panreac, cat. no. 211008) | Panreac | 211008 | |
| Hank’s balanced salt solution | Invitrogen | 24020083 | |
| Heat-inactivated foetal bovine serum | Invitrogen | 10108-165 | |
| Heat-inactivated horse serum | Invitrogen | 26050-088 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2, 32 to 33% in water) | Sigma | 316989 | |
| L-glutamine 200 mM solution (100x) for complete Neurobasal and COS1 medium | Invitrogen | 25030-024 | |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Invitrogen | 11668-019 | |
| Mice pregnant female (embryonic day 12.5 to 16.5; E12.5-16.5) | Criffa-Credo, Lyon, France | ||
| Modified Minimum Essential Medium Eagle (MEM) | Invitrogen | 11012-044 | |
| Monoclonal antibody against class III β-tubulin (clone TUJ-1) | Biolegend | 801201 | |
| N-2 supplement 100x | Invitrogen | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 1,040,051,000 | |
| Penicillin/streptomycin solution 100x | Invitrogen | 15140-22 | |
| Phosphate buffered saline 10x (PBS) for immunocytochemistry | Invitrogen | AM9624 | |
| Secondary antibody: biotinylated horse anti-mouse | Vector Labs | BA-2000 | |
| Serum-free medium (Opti-MEM) | Invitrogen | 11058-021 | |
| Sodium azide | Panreac | 162712 | |
| Sodium bicarbonate solution 7.5% | Invitrogen | 25080-094 | |
| Sterile culture grade H2O | Sigma | W3500 | |
| TritonTM X-100 | Sigma | X100 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Trypsin-EDTA (Trypsin (0.05% (wt/vol) with EDTA (1x) | Invitrogen | 25300-054 | |
| Equipment | |||
| 1 large and 1 small curved scissors for dissection | Fine tools Instruments or similar | ||
| 1.5 mL conical centrifuge tubes | Eppendorf or similar | ||
| 15 mL conical centrifuge tubes | Corning or similar | ||
| 2 haemostats | Fine tools Instruments or similar | ||
| 2 small straight dissecting scissors | Fine tools Instruments or similar | ||
| 200 mL centrifuge tubes for centrifugation | Nalgene or similar | ||
| 200 mL sterile glass conical flasks | |||
| 2 L glass beaker | |||
| 4- and 6-well culture plates | Nunc | 176740 and 140675 | |
| Automatic pipette pumps and disposable 10 mL and 25 mL filter-containing sterile plastic pipettes. | Gilson, Brand, Eppendorf or similar | ||
| Automatic pipettes, sterile filter tips and current sterile tips | Gilson, Eppendorf or similar | ||
| Bench top microcentrifuge with angle fixed rotor | Eppendorf, Beckman Coulter or similar | ||
| Bench top refrigerated centrifuge with swing-bucket rotor (with 1.5, 15 and 50 mL tube adaptors) | Eppendorf, Beckman Coulter or similar | ||
| Cell culture incubator at 37 °C, 5% CO2 and 95% air | |||
| Dialysis tubing cellulose membrane | Sigma | D9402 | |
| Dialysis tubing closures | Sigma | Z37101-7 | |
| Disposable glass pipettes | |||
| Dissecting microscope with dark field optics | Olympus SZ51 or similar | ||
| High-speed refrigerated Beckman Coulter centrifuge or similar with angle fixed rotor | |||
| Laminar flow hood | |||
| Large 100 mm, 60 mm and small 35 mm Ø cell culture dishes | Nunc | 150679 , 150288 and 150318, respectively | |
| Magnetic stirrer and magnetic spin bars | IKA or similar | ||
| McIlwain tissue chopper | Mickle Laboratory Engineering | ||
| One pair of fine straight forceps and one pair of curved forceps | Fine tools Instruments or similar | ||
| Razor blades for the tissue chopper | |||
| Scalpels (number 15 and 11) | |||
| Two pairs of fine spatulas for transferring collagen and tissue pieces | Fine tools Instruments or similar |
References
- Ramón y Cajal, S. Les nouvelles idées sur la structure du système nerveux chez l'homme et chez les vertébrés. , (1894).
- Ramón y Cajal, S. Nuevo concepto de la histología de los centros nerviosos. , (1893).
- Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Tsai, L. H. Guiding neuronal cell migrations. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (2), 001834 (2010).
- Tessier-Lavigne, M., Goodman, C. S. The molecular biology of axon guidance. Science. 274 (5290), 1123-1133 (1996).
- Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).
- Kolodkin, A. L., Tessier-Lavigne, M. Mechanisms and molecules of neuronal wiring: a primer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (6), 001727 (2011).
- Rosentreter, S. M., et al. Response of retinal ganglion cell axons to striped linear gradients of repellent guidance molecules. Journal of Neurobiology. 37 (4), 541-562 (1998).
- Knoll, B., Weinl, C., Nordheim, A., Bonhoeffer, F. Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration. Nature Protocols. 2 (5), 1216-1224 (2007).
- von Philipsborn, A. C., et al. Growth cone navigation in substrate-bound ephrin gradients. Development. 133 (13), 2487-2495 (2006).
- Chen, H., He, Z., Tessier-Lavigne, M. Axon guidance mechanisms: semaphorins as simultaneous repellents and anti-repellents. Nature Neuroscience. 1 (6), 436-439 (1998).
- Jessell, T. M., Sanes, J. R. Development. The decade of the developing brain. Current Opinion in Neurobiology. 10 (5), 599-611 (2000).
- Serafini, T., et al. The netrins define a family of axon outgrowth-promoting proteins homologous to C. elegans UNC-6. Cell. 78 (3), 409-424 (1994).
- Charron, F., Tessier-Lavigne, M. Novel brain wiring functions for classical morphogens: a role as graded positional cues in axon guidance. Development. 132 (10), 2251-2262 (2005).
- Fournier, M. F., Sauser, R., Ambrosi, D., Meister, J. J., Verkhovsky, A. B. Force transmission in migrating cells. Journal of Cell Biology. 188 (2), 287-297 (2010).
- Dent, E. W., Gertler, F. B. Cytoskeletal dynamics and transport in growth cone motility and axon guidance. Neuron. 40 (2), 209-227 (2003).
- Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (5), 332-343 (2009).
- Castellani, V. B. Protocols for Neuronal Cell Culture. , Humana Press Inc. (2001).
- Gahwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
- Bornstein, M. B. Reconstituted rattail collagen used as substrate for tissue cultures on coverslips in Maximow slides and roller tubes. Laboratory Investigation. 7 (2), 134-137 (1958).
- Billings-Gagliardi, S., Wolf, M. K. A simple method for examining organotypic CNS cultures with Nomarski optics. In Vitro. 13 (6), 371-377 (1977).
- Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proceedings of the National Academy of Science. 76 (3), 1274-1278 (1979).
- Lumsden, A. G., Davies, A. M. Earliest sensory nerve fibres are guided to peripheral targets by attractants other than nerve growth factor. Nature. 306 (5945), 786-788 (1983).
- Chedotal, A., et al. Semaphorins III and IV repel hippocampal axons via two distinct receptors. Development. 125 (21), 4313-4323 (1998).
- Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78 (3), 425-435 (1994).
- Klein, R. Eph/ephrin signaling in morphogenesis, neural development and plasticity. Current Opinion in Cell Biology. 16 (5), 580-589 (2004).
- Wang, K. H., et al. Biochemical purification of a mammalian slit protein as a positive regulator of sensory axon elongation and branching. Cell. 96 (6), 771-784 (1999).
- Emonard, H., Grimaud, J. A., Nusgens, B., Lapiere, C. M., Foidart, J. M. Reconstituted basement-membrane matrix modulates fibroblast activities in vitro. Journal of Cell Physiology. 133 (1), 95-102 (1987).
- Knapp, D. M., Helou, E. F., Tranquillo, R. T. A fibrin or collagen gel assay for tissue cell chemotaxis: assessment of fibroblast chemotaxis to GRGDSP. Experimental Cell Research. 247 (2), 543-553 (1999).
- Kapur, T. A., Shoichet, M. S. Immobilized concentration gradients of nerve growth factor guide neurite outgrowth. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 68 (2), 235-243 (2004).
- Torres-Espin, A., Santos, D., Gonzalez-Perez, F., del Valle, J., Navarro, X. Neurite-J: an image-J plug-in for axonal growth analysis in organotypic cultures. Journal of Neuroscience Methods. 236, 26-39 (2014).
- Balestrini, J. L., et al. Comparative biology of decellularized lung matrix: Implications of species mismatch in regenerative medicine. Biomaterials. 102, 220-230 (2016).
- Qian, J., et al. Kinetic Analysis of the Digestion of Bovine Type I Collagen Telopeptides with Porcine Pepsin. Journal of Food Science. 81 (1), 27-34 (2016).
- Eyre, D. R., Weis, M., Hudson, D. M., Wu, J. J., Kim, L. A novel 3-hydroxyproline (3Hyp)-rich motif marks the triple-helical C terminus of tendon type I collagen. Journal of Biological Chemistry. 286 (10), 7732-7736 (2011).
- Garnotel, R., et al. Human blood monocytes interact with type I collagen through alpha x beta 2 integrin (CD11c-CD18, gp150-95). Journal of Immunology. 164 (11), 5928-5934 (2000).
- Montolio, M., et al. A semaphorin 3A inhibitor blocks axonal chemorepulsion and enhances axon regeneration. Chemistry and Biology. 16 (7), 691-701 (2009).
- Garcia-Gareta, E. Collagen gels and the 'Bornstein legacy': from a substrate for tissue culture to cell culture systems and biomaterials for tissue regeneration. Experimental Dermatology. 23 (7), 473-474 (2014).
