Использование трехмерных органотипных культур для визуализации морфологии и функциональных маркеров слюнных желез может обеспечить новый взгляд на механизмы повреждения тканей после облучения. Описанный здесь протокол к разделу, культуре, излучать, пятно, и изображение 50-90 мкм толщиной слюнных желез разделы до и после воздействия ионизирующего излучения.
Гипосаливация и ксеростомия создают хронические устные осложнения, которые снижают качество жизни больных раком головы и шеи, которые лечатся лучевой терапией. Экспериментальные подходы к пониманию механизмов дисфункции слюнных желез и восстановления были сосредоточены на в моделях естественных условиях, которые являются инвалидами из-за неспособности систематически экран терапевтических кандидатов и эффективность в трансфекции способность манипулировать конкретными генами. Цель этой слюнной железы органотипных культура протокол для оценки максимального времени жизнеспособности культуры и характеризуют клеточных изменений после ex естественных условиях лучевой терапии. Мы использовали иммунофлуоресцентное окрашивание и кофокальные микроскопии, чтобы определить, когда конкретные популяции клеток и маркеры присутствуют в течение 30-дневного периода культуры. Кроме того, сотовые маркеры ранее зарегистрированных в в естественных условиях излучения модели оцениваются в культурах, которые облученных ex естественных условиях. Двигаясь вперед, этот метод является привлекательной платформой для быстрого ex в естественных условиях оценки мышиных и человека слюнных желез ткани ответы на терапевтические агенты, которые улучшают функцию слюнных.
Правильная функция слюнных желез имеет важное значение для здоровья полости рта и изменяется после лечения рака головы и шеи с лучевой терапией1. В 2017, около 50 000 новых случаев рака головы и шеи были зарегистрированы в Соединенных Штатах2. Из-за повреждающих ткани и часто необратимых последствий лучевой терапии на окружающих нормальных тканях, таких как слюнные железы, пациенты часто остаются с тяжелыми побочными эффектами и уменьшением качества жизни2,3, 4. в Общие осложнения, вызванные радиационным повреждением проявляется в таких симптомах, как Ксеростомия (субъективное чувство сухости во рту), кариеса зубов, нарушение способности жевать и глотать, нарушения речи и скомпрометированных устных микробиомов2, 3-х , 4. Эти симптомы коллективно может привести к недоеданию и нарушение выживания в пострадавших лиц5. В то время как дисфункция слюнных желез в этой популяции была хорошо документирована, основные механизмы повреждения клеток ацинар были оспорены, и мало интеграции между различными моделями животных6,7.
Текущие методы изучения функции слюнной железы и радиационно-индуцированных повреждений включают использование в моделях естественных условиях, увековечены клеточных линий, двумерных (2-D) первичных клеточных культур, а также трехмерные (3-D) культуры салисферы8, 9,10,11,12. Традиционно, модели клеточной культуры от увековечены клеточных линий и 2-D культур привлекать однослоистых клеток культивировали на плоских поверхностях и ценны для быстрой, простой и экономически эффективных экспериментов. Однако, искусственные условия культуры клетки могут изменить состояние дифференцировки и физиологические реакции клеток, котор подвергли действию к различным условиям, и результаты часто не могут перевести к всем моделям организма14,15. Кроме того, увековечены клеточных культур требует модуляции р. р. деятельности, которая имеет решающее значение для реакции слюнных желез на повреждение ДНК16,17.
3-D культуры салисфера обогащаются для стволовых клеток и клетки-предшественников в раннем времени точки в культуре и были полезны для понимания радиозентивности этого подмножества слюнных желез клеток9,18. Критическое ограничение всех этих моделей культуры они неэффективны в визуализации 3-D структуры слюнной железы, в том числе внеклеточной матрицы (ЕОС) и клеточных взаимодействий в течение различных слоев, которые имеют решающее значение в модуляции слюнных секреции15. Необходимость метода, который включает в себя поведение ткани в целом, но может также манипулировать в лабораторных условиях для изучения последствий лечения необходимо для дальнейшего обнаружить основные механизмы радиационно-индуцированной слюнной железы Дисфункции.
Живая ткань секционирования и культуры был документально ранее19,20 и часто используется для изучения мозга ткани взаимодействия21. В предыдущих исследованиях, околоушной (пар) слюнных желез ткани от мышей был секционного примерно на 50 мкм и культивировали до 48 ч, и анализ жизнеспособности, гибель клеток, и функция была выполнена после19. SU et al. (2016) расширена по этой методологии путем культивирования человеческих Подчелюстные железы (SMGs) секционные на 35 мкм или 50 мкм в течение 14 дней20. Предлагаемый метод является продвижение в том, что она включает в себя как околоушной и подчелюстной слюнных желез секционные на 50 мкм и 90 мкм и оценка культур в течение 30 дней. Способность вырезать диапазон толщины ткани имеет важное значение при оценке клеточных и клеточных взаимодействий, которые актуальны для клеточных процессов, включая апокально-базолатеральной полярности и иннервации для секреции. Кроме того, ломтики слюнной железы были облучены в то время как в культуре, чтобы определить целесообразность этой модели культуры для изучения радиационно-индуцированных повреждений слюнных желез.
Цель этой слюнной железы органотипных культура протокол для оценки максимального времени жизнеспособности культуры и характеризуют клеточных изменений после ex естественных условиях лучевой терапии. Чтобы определить максимальное время разделы, которые являются жизнеспособными после рассечения, ТриАН синего окрашивания, живые окрашивание клеток, и иммуногистолехимического окрашивания для клеточной смерти были выполнены. Кофокальная микроскопия и иммунолюминесцентная окрашивание использовались для оценки популяции конкретных клеток, морфологических структур и уровней распространения. Ткани раздел культур также подвергаются ионизирующего излучения для определения последствий излучения на различных маркеров в этой 3-D модели. Индукция клеточной смерти, разрушение цитоскелета, потеря маркеров дифференциации, и компенсационного распространения в облученных ex естественных условиях культуры были по сравнению с предыдущими исследованиями в моделях естественных условиях. Эта методология предоставляет средства для изучения роли клеточных взаимодействий после радиационного поражения и обеспечивает экспериментальную модель для эффективной оценки эффективности терапевтических вмешательств (манипуляции генами или фармакологические агенты ), которые могут быть менее подходящими для в естественных условиях моделей.
Исследования слюнных желез использовал ряд моделей культуры, в том числе увековечены 2-D культур, первичных 2-D культур, 3-D культуры салисферы, и 3-D органные культуры из эмбриональных эксфолиантов для выяснения вопросов на основе биологии и физиологии. Эти модели культуры дали глубокую ин…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана в части пилотным финансированием, предоставляемый университетом Аризоны Управление исследований и открытий и национальных институтов здравоохранения (R01 DE023534) Кирстен Limesand. Обучение биологии рака Грант, T32CA009213, при условии стипендиальной поддержки Вэнь Юй Вонг. Авторы хотели бы поблагодарить м. Райс за его ценный технический вклад.
Vibratome VT1000S | Leica Biosystems | N/A | Vibratome for sectioning |
Double Edge Stainless Steel Razor Blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
Agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | Low-melt |
Parafilm | Sigma-Aldrich | P6543 | |
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B | Lonza | 17-745H | PSA |
24-well plate | CellTreat | 229124 | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco | 14190-144 | |
Loctite UltraGel Control Superglue | Loctite | N/A | Purchased at hardware store |
Natural Red Sable Round Paintbrush | Princeton Art & Brush Co | 7400R-2 | |
Gentamicin Sulfate | Fisher Scientific | ICN1676045 | |
Transferrin | Sigma-Aldrich | T-8158-100mg | |
L-glutatmine | Gibco | 25030-081 | |
Trace Elements | MP Biomedicals | ICN1676549 | |
Insulin | Fisher Scientific | 12585014 | |
Epidermal Growth Factor | Corning | 354001 | |
Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | |
Retinoic acid | Fisher Scientific | R2625-50MG | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | A3160602 | |
DMEM/F12 Media | Corning | 150-90-CV | |
Millicell Cell Culture Insert | Millipore Sigma | PICM01250 | 12 mm, 0.4 um pore size for 24 well plate |
0.4% Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570) | Thermo-Fisher | R37601 | Only used LIVE dye component |
Anti-Ki-67 Antibody | Cell Signaling Technology | 9129S | |
Anti-E-cadherin Antibody | Cell Signaling Technology | 3195S | |
Anti-Cleaved Caspase-3 Antibody | Cell Signaling Technology | 9661L | |
Anti-SMA Antibody | Sigma-Aldrich | C6198 | |
Anti-amylase Antibody | Sigma-Aldrich | A8273 | |
Anti-CD31 Antibody | Abcam | ab28364 | |
Anti-TUBB3 Antibody | Cell Signaling Technology | 5568S | |
Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit | Thermo-Fisher | A20185 | |
Alexa Fluor 594 Phalloidin | Thermo-Fisher | A12381 | |
Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 21568-2500 | |
Paraformaldehyde Prills | Fisher Scientific | 5027632 | |
New England Nuclear Blocking Agent | Perkin Elmer | 2346249 | No longer sold |
DAPI | Cell Signaling Technology | 4083S | |
Prolong Gold Antifade Mounting Media | Invitrogen | P36934 | |
Leica SPSII Spectral Confocal | Leica Biosystems | N/A | For confocal imaging |
Leica DMIL Inverted Phase Contrast Microscope | Leica Biosystems | N/A | |
Cobalt-60 Teletherapy Instrument | Atomic Energy of Canada Ltd Theratron-80 | N/A | |
Amac Box, Clear | The Container Store | 60140 | Agarose block mold |