Summary

Лучевая терапия Органотипных культур от подчелюстной и околоушной слюнных желез модели ключ в естественных характеристик

Published: May 17, 2019
doi:

Summary

Использование трехмерных органотипных культур для визуализации морфологии и функциональных маркеров слюнных желез может обеспечить новый взгляд на механизмы повреждения тканей после облучения. Описанный здесь протокол к разделу, культуре, излучать, пятно, и изображение 50-90 мкм толщиной слюнных желез разделы до и после воздействия ионизирующего излучения.

Abstract

Гипосаливация и ксеростомия создают хронические устные осложнения, которые снижают качество жизни больных раком головы и шеи, которые лечатся лучевой терапией. Экспериментальные подходы к пониманию механизмов дисфункции слюнных желез и восстановления были сосредоточены на в моделях естественных условиях, которые являются инвалидами из-за неспособности систематически экран терапевтических кандидатов и эффективность в трансфекции способность манипулировать конкретными генами. Цель этой слюнной железы органотипных культура протокол для оценки максимального времени жизнеспособности культуры и характеризуют клеточных изменений после ex естественных условиях лучевой терапии. Мы использовали иммунофлуоресцентное окрашивание и кофокальные микроскопии, чтобы определить, когда конкретные популяции клеток и маркеры присутствуют в течение 30-дневного периода культуры. Кроме того, сотовые маркеры ранее зарегистрированных в в естественных условиях излучения модели оцениваются в культурах, которые облученных ex естественных условиях. Двигаясь вперед, этот метод является привлекательной платформой для быстрого ex в естественных условиях оценки мышиных и человека слюнных желез ткани ответы на терапевтические агенты, которые улучшают функцию слюнных.

Introduction

Правильная функция слюнных желез имеет важное значение для здоровья полости рта и изменяется после лечения рака головы и шеи с лучевой терапией1. В 2017, около 50 000 новых случаев рака головы и шеи были зарегистрированы в Соединенных Штатах2. Из-за повреждающих ткани и часто необратимых последствий лучевой терапии на окружающих нормальных тканях, таких как слюнные железы, пациенты часто остаются с тяжелыми побочными эффектами и уменьшением качества жизни2,3, 4. в Общие осложнения, вызванные радиационным повреждением проявляется в таких симптомах, как Ксеростомия (субъективное чувство сухости во рту), кариеса зубов, нарушение способности жевать и глотать, нарушения речи и скомпрометированных устных микробиомов2, 3-х , 4. Эти симптомы коллективно может привести к недоеданию и нарушение выживания в пострадавших лиц5. В то время как дисфункция слюнных желез в этой популяции была хорошо документирована, основные механизмы повреждения клеток ацинар были оспорены, и мало интеграции между различными моделями животных6,7.

Текущие методы изучения функции слюнной железы и радиационно-индуцированных повреждений включают использование в моделях естественных условиях, увековечены клеточных линий, двумерных (2-D) первичных клеточных культур, а также трехмерные (3-D) культуры салисферы8, 9,10,11,12. Традиционно, модели клеточной культуры от увековечены клеточных линий и 2-D культур привлекать однослоистых клеток культивировали на плоских поверхностях и ценны для быстрой, простой и экономически эффективных экспериментов. Однако, искусственные условия культуры клетки могут изменить состояние дифференцировки и физиологические реакции клеток, котор подвергли действию к различным условиям, и результаты часто не могут перевести к всем моделям организма14,15. Кроме того, увековечены клеточных культур требует модуляции р. р. деятельности, которая имеет решающее значение для реакции слюнных желез на повреждение ДНК16,17.

3-D культуры салисфера обогащаются для стволовых клеток и клетки-предшественников в раннем времени точки в культуре и были полезны для понимания радиозентивности этого подмножества слюнных желез клеток9,18. Критическое ограничение всех этих моделей культуры они неэффективны в визуализации 3-D структуры слюнной железы, в том числе внеклеточной матрицы (ЕОС) и клеточных взаимодействий в течение различных слоев, которые имеют решающее значение в модуляции слюнных секреции15. Необходимость метода, который включает в себя поведение ткани в целом, но может также манипулировать в лабораторных условиях для изучения последствий лечения необходимо для дальнейшего обнаружить основные механизмы радиационно-индуцированной слюнной железы Дисфункции.

Живая ткань секционирования и культуры был документально ранее19,20 и часто используется для изучения мозга ткани взаимодействия21. В предыдущих исследованиях, околоушной (пар) слюнных желез ткани от мышей был секционного примерно на 50 мкм и культивировали до 48 ч, и анализ жизнеспособности, гибель клеток, и функция была выполнена после19. SU et al. (2016) расширена по этой методологии путем культивирования человеческих Подчелюстные железы (SMGs) секционные на 35 мкм или 50 мкм в течение 14 дней20. Предлагаемый метод является продвижение в том, что она включает в себя как околоушной и подчелюстной слюнных желез секционные на 50 мкм и 90 мкм и оценка культур в течение 30 дней. Способность вырезать диапазон толщины ткани имеет важное значение при оценке клеточных и клеточных взаимодействий, которые актуальны для клеточных процессов, включая апокально-базолатеральной полярности и иннервации для секреции. Кроме того, ломтики слюнной железы были облучены в то время как в культуре, чтобы определить целесообразность этой модели культуры для изучения радиационно-индуцированных повреждений слюнных желез.

Цель этой слюнной железы органотипных культура протокол для оценки максимального времени жизнеспособности культуры и характеризуют клеточных изменений после ex естественных условиях лучевой терапии. Чтобы определить максимальное время разделы, которые являются жизнеспособными после рассечения, ТриАН синего окрашивания, живые окрашивание клеток, и иммуногистолехимического окрашивания для клеточной смерти были выполнены. Кофокальная микроскопия и иммунолюминесцентная окрашивание использовались для оценки популяции конкретных клеток, морфологических структур и уровней распространения. Ткани раздел культур также подвергаются ионизирующего излучения для определения последствий излучения на различных маркеров в этой 3-D модели. Индукция клеточной смерти, разрушение цитоскелета, потеря маркеров дифференциации, и компенсационного распространения в облученных ex естественных условиях культуры были по сравнению с предыдущими исследованиями в моделях естественных условиях. Эта методология предоставляет средства для изучения роли клеточных взаимодействий после радиационного поражения и обеспечивает экспериментальную модель для эффективной оценки эффективности терапевтических вмешательств (манипуляции генами или фармакологические агенты ), которые могут быть менее подходящими для в естественных условиях моделей.

Protocol

1. Приготовление вибратома Спрей съемные компоненты вибратом включая буфер лоток, лезвие крепления, агарозы блок плесень, и лабораторный фильм с 70% этанола, то УФ-стерилизации, по крайней мере 30 мин. Поместите и закрепите дополнительный лист лабораторной пленки над буферным л?…

Representative Results

Первичные 2-D культуры выращиваются в фетальной сыворотке говядины (ФПС) дополнены средствами массовой информации в то время как первичная 3-D культура салисферы, как правило, культивируются в сыворотке без условий10,11. Кроме того, два пред…

Discussion

Исследования слюнных желез использовал ряд моделей культуры, в том числе увековечены 2-D культур, первичных 2-D культур, 3-D культуры салисферы, и 3-D органные культуры из эмбриональных эксфолиантов для выяснения вопросов на основе биологии и физиологии. Эти модели культуры дали глубокую ин…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана в части пилотным финансированием, предоставляемый университетом Аризоны Управление исследований и открытий и национальных институтов здравоохранения (R01 DE023534) Кирстен Limesand. Обучение биологии рака Грант, T32CA009213, при условии стипендиальной поддержки Вэнь Юй Вонг. Авторы хотели бы поблагодарить м. Райс за его ценный технический вклад.

Materials

Vibratome VT1000S Leica Biosystems N/A Vibratome for sectioning
Double Edge Stainless Steel Razor Blades Electron Microscopy Sciences 72000
Agarose Fisher Scientific BP165-25 Low-melt
Parafilm Sigma-Aldrich P6543
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Lonza 17-745H PSA
24-well plate CellTreat 229124
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) Gibco 14190-144
Loctite UltraGel Control Superglue Loctite N/A Purchased at hardware store
Natural Red Sable Round Paintbrush Princeton Art & Brush Co 7400R-2
Gentamicin Sulfate Fisher Scientific ICN1676045
Transferrin Sigma-Aldrich T-8158-100mg
L-glutatmine Gibco 25030-081
Trace Elements MP Biomedicals ICN1676549
Insulin Fisher Scientific 12585014
Epidermal Growth Factor Corning 354001
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H0888
Retinoic acid Fisher Scientific R2625-50MG
Fetal Bovine Serum Gibco A3160602
DMEM/F12 Media Corning 150-90-CV
Millicell Cell Culture Insert Millipore Sigma PICM01250 12 mm, 0.4 um pore size for 24 well plate
0.4% Trypan Blue Sigma-Aldrich T8154
LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570) Thermo-Fisher R37601 Only used LIVE dye component
Anti-Ki-67 Antibody Cell Signaling Technology 9129S
Anti-E-cadherin Antibody Cell Signaling Technology 3195S
Anti-Cleaved Caspase-3 Antibody Cell Signaling Technology 9661L
Anti-SMA Antibody Sigma-Aldrich C6198
Anti-amylase Antibody Sigma-Aldrich A8273
Anti-CD31 Antibody Abcam ab28364
Anti-TUBB3 Antibody Cell Signaling Technology 5568S
Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit Thermo-Fisher A20185
Alexa Fluor 594 Phalloidin Thermo-Fisher A12381
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP1600
Triton X-100 Sigma-Aldrich 21568-2500
Paraformaldehyde Prills Fisher Scientific 5027632
New England Nuclear Blocking Agent Perkin Elmer 2346249 No longer sold
DAPI Cell Signaling Technology 4083S
Prolong Gold Antifade Mounting Media Invitrogen P36934
Leica SPSII Spectral Confocal Leica Biosystems N/A For confocal imaging
Leica DMIL Inverted Phase Contrast Microscope Leica Biosystems N/A
Cobalt-60 Teletherapy Instrument Atomic Energy of Canada Ltd Theratron-80 N/A
Amac Box, Clear The Container Store 60140 Agarose block mold

References

  1. Dirix, P., Nuyts, S., Van den Bogaert, W. Radiation-induced xerostomia in patients with head and neck cancer: a literature review. Cancer. 107 (11), 2525-2534 (2006).
  2. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer Statistics, 2017. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (1), 7-30 (2017).
  3. Hancock, P. J., Epstein, J. B., Sadler, G. R. Oral and dental management related to radiation therapy for head and neck cancer. Journal of the Canadian Dental Association. 69 (9), 585-590 (2003).
  4. Nguyen, N. P., et al. Quality of life following chemoradiation and postoperative radiation for locally advanced head and neck cancer. Journal for Oto-rhino-laryngology and Its Related Specialties. 69 (5), 271-276 (2007).
  5. Gorenc, M., Kozjek, N. R., Strojan, P. Malnutrition and cachexia in patients with head and neck cancer treated with (chemo)radiotherapy. Reports of Practical Oncology and Radiotherapy. Journal of Greatpoland Cancer Center in Poznań and Polish Society of Radiation Oncology. 20 (4), 249-258 (2015).
  6. Grundmann, O., Mitchell, G. C., Limesand, K. H. Sensitivity of salivary glands to radiation: from animal models to therapies. Journal of Dental Research. 88 (10), 894-903 (2009).
  7. Konings, A. W., Coppes, R. P., Vissink, A. On the mechanism of salivary gland radiosensitivity. International Journal of Radiation Oncology, Biology, and Physics. 62 (4), 1187-1194 (2005).
  8. Chan, Y. -. H., Huang, T. -. W., Young, T. -. H., Lou, P. -. J. Human salivary gland acinar cells spontaneously form three-dimensional structures and change the protein expression patterns. Journal of Cellular Physiology. 226 (11), 3076-3085 (2011).
  9. Nguyen, V. T., Dawson, P., Zhang, Q., Harris, Z., Limesand, K. H. Administration of growth factors promotes salisphere formation from irradiated parotid salivary glands. PLoS ONE. 13 (3), e0193942 (2018).
  10. Limesand, K. H., et al. Characterization of Rat Parotid and Submandibular Acinar Cell Apoptosis In Primary Culture. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 39 (3), 170 (2003).
  11. Wei, L., Xiong, H., Li, W., Li, B., Cheng, Y. Upregulation of IL-6 expression in human salivary gland cell line by IL-17 via activation of p38 MAPK, ERK, PI3K/Akt, and NF-κB pathways. Journal of Oral Pathology & Medicine. 47 (9), 847-855 (2018).
  12. Chuong, C., Katz, J., Pauley, K. M., Bulosan, M., Cha, S. RAGE expression and NF-κB activation attenuated by extracellular domain of RAGE in human salivary gland cell line. Journal of Cellular Physiology. 221 (2), 430-434 (2009).
  13. Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
  14. Bhadriraju, K., Chen, C. S. Engineering cellular microenvironments to improve cell-based drug testing. Drug Discovery Today. 7 (11), 612-620 (2002).
  15. Breslin, S., O’Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
  16. Avila, J. L., Grundmann, O., Burd, R., Limesand, K. H. Radiation-induced salivary gland dysfunction results from p53-dependent apoptosis. International Journal of Radiation Oncology, Biololgy, Physics. 73 (2), 523-529 (2009).
  17. Mitchell, G. C., et al. IGF1 activates cell cycle arrest following irradiation by reducing binding. of DeltaNp63 to the p21 promoter. Cell Death & Disease. 1, (2010).
  18. Lombaert, I. M. A., et al. Rescue of Salivary Gland Function after Stem Cell Transplantation in Irradiated Glands. PLoS ONE. 3 (4), (2008).
  19. Warner, J. D., et al. Visualizing form and function in organotypic slices of the adult mouse parotid gland. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 295 (3), G629-G640 (2008).
  20. Su, X., et al. Three-dimensional organotypic culture of human salivary glands: the slice culture model. Oral Diseases. 22 (7), 639-648 (2016).
  21. Mattei, G., Cristiani, I., Magliaro, C., Ahluwalia, A. Profile analysis of hepatic porcine and murine brain tissue slices obtained with a vibratome. PeerJ – The Journal of Life and Environmental Sciences. 3, 932 (2015).
  22. Pawley, J. . Handbook of Biological Confocal Microscopy. , (2006).
  23. Limesand, K. H., et al. Insulin-Like Growth Factor-1 Preserves Salivary Gland Function After Fractionated Radiation. International Journal of Radiation Oncology, Biology, and Physics. 78 (2), 579-586 (2010).
  24. Grundmann, O., Fillinger, J. L., Victory, K. R., Burd, R., Limesand, K. H. Restoration of radiation therapy-induced salivary gland dysfunction in mice by post therapy IGF-1 administration. BMC Cancer. 10, 417 (2010).
  25. Chibly, A. M., et al. aPKCzeta-dependent Repression of Yap is Necessary for Functional Restoration of Irradiated Salivary Glands with IGF-1. Scientific Reports. 8 (1), 6347 (2018).
  26. Wong, W. Y., Pier, M., Limesand, K. H. Persistent disruption of lateral junctional complexes and actin cytoskeleton in parotid salivary glands following radiation treatment. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 315 (4), R656-R667 (2018).
  27. Emmerson, E., et al. SOX2 regulates acinar cell development in the salivary gland. eLife. 6, (2017).
  28. Nedvetsky, P. I., et al. Parasympathetic innervation regulates tubulogenesis in the developing salivary gland. Developmental Cell. 30 (4), 449-462 (2014).
  29. Kwon, H. R., Nelson, D. A., DeSantis, K. A., Morrissey, J. M., Larsen, M. Endothelial cell regulation of salivary gland epithelial patterning. Development. 144 (2), 211-220 (2017).
  30. Mellas, R. E., Leigh, N. J., Nelson, J. W., McCall, A. D., Baker, O. J. Zonula occludens-1, occludin and E-cadherin expression and organization in salivary glands with Sjogren’s syndrome. Jounral of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (1), 45-56 (2015).
  31. Daley, W. P., et al. Btbd7 is essential for region-specific epithelial cell dynamics and branching morphogenesis in vivo. Development. 144 (12), 2200-2211 (2017).
  32. Nam, K., et al. Post-Irradiated Human Submandibular Glands Display High Collagen Deposition, Disorganized Cell Junctions, and an Increased Number of Adipocytes. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 64 (6), 343-352 (2016).

Play Video

Cite This Article
Meyer, R., Wong, W. Y., Guzman, R., Burd, R., Limesand, K. Radiation Treatment of Organotypic Cultures from Submandibular and Parotid Salivary Glands Models Key In Vivo Characteristics. J. Vis. Exp. (147), e59484, doi:10.3791/59484 (2019).

View Video