Summary
Burada, larva Zebra balığı ışık çatışmaya electroretinogram tepkiler ölçüm kolaylaştırır bir iletişim kuralı mevcut. Bir roman koni şeklindeki sünger-uç elektrot larva Zebra balığı electroretinogram ERG güvenilir sonuçlar ve daha düşük maliyet ile elde etmek için daha kolay kullanılmasını görsel geliştirme çalışma yapmak yardımcı olabilir.
Abstract
Zebra balığı (Danio rerio) yaygın gelişimsel çalışmalarda omurgalı bir model olarak kullanılır ve görsel Nöroloji için özellikle uygundur. İşlevsel görsel performans ölçülerini daha yüksek omurgalı türler iyi kurulmuş oldu ideal bir non-invaziv yöntem electroretinography (ERG) dir. Bu yaklaşım giderek Zebra balığı, erken gelişimsel larva evrelerinde de dahil olmak üzere görsel işlevinde incelenmesi için kullanılıyor. Larva Zebra balığı ERG bugüne için en sık kullanılan kayıt elektrot laboratuarlar için bir meydan okuma ile sınırlı kaynakları sunan kendi üretimi için özel ekipman gerektirir cam micropipette elektrot be. Burada, bir koni şeklindeki sünger-uç elektrot kullanan bir larva Zebra balığı ERG Protokolü mevcut. Roman elektrot üretimi ve kolu, daha ekonomik ve daha az daha cam micropipette larva göz zarar olasılığı için daha kolay olur. Daha önce yayımlanmış ERG yöntemleri gibi geçerli protokol dış retina işlevini, photoreceptor ve bipolar hücre yanıtları, a ve b-dalga, anılan sıraya göre değerlendirebilirsiniz. Protokol açıkça Zebra balığı larva, yardımcı programı, duyarlılık ve roman elektrot güvenilirliğini destekleyen erken gelişimi boyunca görsel işlevi arıtma göstermek. Yeni ERG sistemi kurulması veya varolan küçük hayvan ERG cihazları, Zebra balığı ölçüm, araştırmacılar görsel Nöroloji içinde Zebra balığı kullanmak için yardım için değiştirme model organizma Basitleştirilmiş elektrot özellikle yararlıdır.
Introduction
Zebra balığı (Danio rerio) görsel Nöroloji çalışmaları da dahil olmak üzere bir çok kullanılan genetik omurgalı modeli haline geldi. Bu tür artan popülaritesi genetik manipülasyon, son derece korunmuş omurgalı görsel sistem (nöron tipleri, anatomik morfoloji ve organizasyon ve altta yatan genetik), yüksek verimlilik kolaylığı dahil avantajları için bağlanabilir ve Hayvancılık memeli modelleri1' e göre daha az maliyeti. Non-invaziv electroretinogram (ERG) uzun klinik olarak insan görsel işlevi, değerlendirmek için kullanılmıştır ve vizyon irili ufaklı tür dahil kemirgen ve larva Zebra balığı2,3 dizi ölçmek için laboratuvar ortamında , 4 , 5. en sık analiz ERG dalga a ve b-dalga, photoreceptors ışık algılama ve bipolar interneurons, sırasıyla kaynaklanan bileşenleridir. Larva Zebra balığı, retina farklı katmanlarda 3 gün sonrası döllenme (dpf) tarafından kurulur ve terminal photoreceptor koni morfolojisi olgun önce 4 dpf6,7synapses. Larva Zebra balığı dış retina işlevi böylece 4 dpf ERG bu erken yaşlarında itibaren ölçülebilir anlamına gelir, daha önce kuruldu. Kısa deneysel döngüsü ve modelinin yüksek üretilen iş özellikleri nedeniyle, ERG hastalık modelleri, işlev değerlendirmesi larva Zebra balığı için uygulanmış olan renk vizyon ve retina geliştirme analiz, görsel sirkadiyen ritim eğitimi ve test uyuşturucu8,9,10,11,12.
Ancak, larva Zebra balığı için geçerli yaklaşımlar ERG benimsemeye zorlaştırmak bazı karmaşıklıklar var. Yayımlanmış larva Zebra balığı ERG protokolleri yaygın olarak yüksek kaliteli micropipette gerektiren kayıt elektrodu3,4,5,13, iletken sıvı ile dolu bir cam micropipette kullanın İpucu3. Özel ekipman, micropipette çekici gibi ve bir microforge, bazı durumlarda, kendi üretimi için gereklidir. Bu laboratuvarlar sınırlı kaynaklara sahip için bir meydan okuma olabilir ve ek bir ücret için bile kullanılabilir küçük hayvan ERG sistemleri larva Zebra balığı görsel işlev ölçüm için adapte ne zaman açar. Ne zaman bile düzeltti, keskin micropipette ipucu larva göz yüzeyine zarar verebilir. Ayrıca, ticari micropipette sahipleri Elektrofizyoloji için sabit bir gümüş tel ile inşa edilir. Bunlar teller sabit artan bakım ücreti için önde gelen yeni sahipleri satın gerektiren tekrarlayan kullanımdan sonra düzgünleştirilecek olmak.
Burada kurulan küçük hayvan ERG kurulumları larva Zebra balığı ERG ölçümler için uyarlamak için yararlıdır bir koni şeklindeki sünger-ipucu kayıt elektrodu, kullanarak bir ERG yöntemi açıklanmaktadır. Elektrot kolayca ortak polivinil asetat (PVA) sünger ve diğer özel ekipman olmadan ince gümüş tel kullanılarak yapılır. Bizim veri bu roman elektrot hassas ve 4 ve 7 dpf arasında larva Zebra balığı retina sinir devreleri fonksiyonel gelişimi göstermek için güvenilir olduğunu gösteriyor. Bu ekonomik ve pratik sünger-uç elektrot Yeni ERG sistemleri oluşturma veya varolan küçük hayvan sistemleri, Zebra balığı Etütler değiştirme araştırmacılar için yararlı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm electroretinogram (ERG) yordamlar uygulama bakım için Avustralya Ulusal Sağlık ve tıbbi araştırma Konseyi kuralları hükümleri ve hayvanların kullanımı göre yapıldı ve kurumsal hayvan Etik Komitesi tarafından kabul edildi Melbourne Üniversitesi.
1. arabellek hazırlık
- Japon balığı zil'ın arabellek (1.25 M NaCl, 26 mM KCl, 25 mm CaCl2, 10 mM MgCl2, 100 mM glikoz, 100 mM HEPES) x 10 hazırlamak Ters Ozmos (RO) su kullanarak. PH 7.8 arabelleğe ayarlamak ve 0,22 mikron filtre kullanarak arabellek sterilize. 4 ° C'de 10 x arabellek çözüm stok3depolar.
Not: 10 zil'ın arabellek x 3 ay içinde kullanılmalıdır. - Deneme günü, 1 Japon balığı zil'ın arabellek x 10 x ters osmoz su kullanarak goldfish zil'ın arabellek sulandrarak olun.
Not: 1 x goldfish zil'ın arabellek larva Zebra balığı, yerleşim için kullanılan sünger de dahil olmak üzere PVA sünger ve üzerinde kayıt elektrot uç sünger doyurmak için kullanılır.
2. elektrot hazırlık
-
Koni şeklinde sünger kayıt elektrot hazırlayın.
- Platin elektrot kurşun uzantısından erkek sonunda kesti ve sondan 10 mm bir neşter bıçak kullanarak dış politetrafloroetilen izolasyon kaplama kaldırın. İç tel elektrot kurşun zarar vermemesi için dikkat ediniz.
- Gümüş tel (0.3 mm çap) 40 mm boy kesme ve güvenli bir şekilde bu elektrot kurşun maruz iç tel ile gümüş tel entwining tarafından ekleyebilirsiniz. ~ 15 mm uzunluğunda gümüş tel (şekil 1A) maruz bırakarak yalıtım bant kullanarak ortak örtmek.
- 9 V DC kaynak 60 için kullandığını klorür ile maruz gümüş tel electroplate sinyal iletim geliştirmek için s. Normal salin maruz gümüş ipucunda bırakın ve diğer ucunu bataryanın pozitif terminaline bağlayın. Pilin eksi terminali için başka bir tel bağlamak ve diğer ucunu içine tuz2tel bırakın.
Not: Alternatif olarak, gümüş tel 1 saat içinde çamaşır suyu çözüm (etkin madde 42 g/L sodyum hipoklorit) için ıslatarak klorlamak. - Bir ~ 20 x 20 mm PVA kare bir koni (şekil 1A) yapmak için makas kullanarak sünger kesti. 1 x zil'ın arabellek kullanarak sünger doyurmak. Mercek üzerinde bir ölçek çubuğu ile mikroskop altında bir neşter bıçak koni ~ 40 µm çapı için tepe şekil için kullanın. Hava Kuru emici kağıt doku üzerinde koni şeklindeki sünger kadar sağlamdır.
Not: PVA sünger önemli ölçüde zaman doymuş genişletir, böylece sünger ilk koni apeks şekillendirme önce serum fizyolojik ile doymuş olduğunu önemlidir. - Chloriding sonra hava kuru 5 dk. Ekle emici bir doku üzerinde gümüş tel koni tabanı ile kurutulmuş, katı, koni şeklinde PVA sünger içine gümüş tel. Fotovoltaik eserler (Şekil 1B-C) azaltmak için maske bant kullanarak herhangi bir aşırı maruz metal izole.
Not: Deneysel her oturum sonrası sünger gümüş tel kaldırın. Ters Ozmos su ve hava kuru yeniden kullanılmak üzere kullanarak sünger yıkayın. En iyi sinyal koleksiyon emin olmak için gümüş tel tek kullanılması önerilir. PVA sünger daha--dan 5 kere yeniden değil. - Deneme günü, kayıt elektrot sünger ucu içine 1 x zil'ın arabellek tam sünger doyurmak en az 15 dakika bırakın.
- Referans elektrotlar sünger ucu bağlama olmadan, ama yukarıda açıklandığı şekilde hazırlayın.
- Zemin elektrot ticari olarak elde edilir.
3. Zebra balığı hazırlık
- Karanlık gecede Zebra balığı larva uyum (> 8 h) kayıtları bir 15 mL tüp içinde Zebra balığı yerleştirerek önce (< tüp başına 20 larva) karanlık bir kuluçka alüminyum folyo sarılı. Yeterli oksijen kaynağı sağlamak için kapağı kaldırın.
- Kayıt günü, larva içeren folyo sarılı Şahin tüp için kapak sıkın ve tüp ışık geçirmez olduğundan emin olun. ERG laboratuarının taşıma larvaları.
- Balık içine Petri yemekler karanlıkta bir ışık yayan diyot (LED; 17.4 cd.m-2, λmax 600 nm) üzerinden loş kırmızı aydınlatma yardımıyla dökün. Petri yemekler ışığa maruz en aza indirmek için ışık geçirmez havlu kullanarak kapak.
4. sünger Platform hazırlama
- Bir dikdörtgen bir kuytu bir 35 mm içinde Petri kabına sığdırmak için Kuru PVA sünger kesti. Sünger kalınlığı petri kabına derinliğe kadar kabaca eşit olmalıdır emin olun.
- Dikey olarak referans elektrot gümüş tel karşılamak için sünger bir ucunu üzerinden küçük bir kesim yapmak.
- 1 x doymuş kadar Japon balığı zil'ın arabellek PVA sünger emmek. O zaman, Sünger temiz 35 mm kabında yer. Sünger bir ışık parmak basın yanıt olarak gelen çözüm sızar kadar ekstra sıvı emmek için kağıt havlu kullanın.
5. hayvan ve elektrot konumlandırma
- 1 Japon balığı zil'ın arabellek x seyreltilmiş %0.02 tricaine kullanarak larva anestezi.
- 3 mL Pasteur pipet imzalat bir larva bir kare kağıt havlu (~ 3 cm2) üzerine aktarmak için kullanın.
- Forseps kullanarak nemli sünger platformda larva içeren kağıt havlu koyun. Zil'ın arabellekte batırılmış bir ince fırça larva konumunu ayarlamak için kullanın. Bu bir göz yukarı, yüzler yakın herhangi bir sıvı kağıt havlu altında larva meydanında dan izole emin olun.
- Larva ERG kayıt boyunca nemli tutmak için göz jeli nemlendirici ile başından hariç larva vücut sır.
- Bir platformda küçük su ısıtmalı bir Faraday kafesinde (şekil 1 d) yer alan Ganzfeld kase hafif uyarıcı önünde sünger platformu ile Petri kabına yerleştirin.
Not: Sünger ve larva vücut sıcaklığını bakımından istikrarlı ERG sinyalleri sağlar. - Platform sünger (şekil 1 d) yapılan kesim içine referans elektrot yerleştirin.
- Ticari olarak elde edilen yere elektrot Faraday kafesi bağlayın.
- Kayıt elektrot bir elektrot tutucu ekleyin ve bir micromanipulator (şekil 1 d) stereotaksik kol sahibine güvenli. 1 x zil'ın çözüm yeniden doygunluk için elektrot sünger ucunda bir damla damla için 3 mL Pasteur pipet kullanın.
- Mikroskop Faraday kafesi elektrot yerleştirme için ERG platform üzerine getirin.
Not: Aydınlatma dark-adaptation muhafaza ederken bir loş kırmızı LED (17.4 cd.m-2, λmax 600 nm) larva gözlenmesi izin vermek ve aktif elektrot yerleştirme tarafından sağlanmalıdır. - Mikroskop altında larva gözlenmesi izin vermek için sünger platformu konumunu ayarlamak. O zaman, emici doku aşırı sıvı elektrot sünger uç--dan kaldırmak için kullanın.
- Larva Zebra balığı göz (şekil 1E) Merkezi Kornea yüzeyine hafifçe dokunana aktif elektrot konumlandırın.
- Ganzfeld kase sünger platformu doğru hareket ve larva tarafından kase kaplıdır emin olun.
- Yabancı elektromanyetik gürültü azaltmak için Faraday kafesi kapatın.
6. Electroretinogram kayıt
-
Belirli ERG sistem bilgisayar yazılımı kullanımını2önerilen ayarlara dayalı uyarıcı tetikler ve veri elde etmek için (malzeme tablo ayrıntılar için bakınız).
- Sistem örnekleme oranı set 4 KHz ila 650 pencere (2,560 puan) kayıt satın alma yazılımı ms üzerinde.
- Kazanç sistemi 1000 × için ayarlayın.
- 1-300 Hz sisteminin bant geçiren filtre ayarlayın.
- 60 Hz (veya bağlı olarak yerel elektrik frekansı 50 Hz) azaltmak için bir çentik filtresi kullanın gürültü.
Not: İdeal gürültü seviyesi ±10 µV fazla olmalıdır.
-
Aşağıda açıklanan yordamı kullanarak veri koleksiyon başlatın.
- Elektrotlar konumlandırma değerlendirmek için göz testi yanıtından ölçmek için tek testi flash (0,06 günlük cd.s/m2) kullanın.
Not: Bu yoğunluğu testi Flash 4-dpf larva 25 µV daha büyük bir b-dalga genlik sonuçlanmalıdır. Sağlam bir yanıt ölçülemez, elektrotlar yeniden konumlandırmak ve başka yapmak test elektrotlar iyi konumlandırılmış onaylamak için flash. - Test-flash, takip izin hayvan karanlık önce kayıtları tam karanlıkta 3 dakikadır uyum.
- Hediye dimmer daha parlak ışık yoğunluklarda için yanıp söner.
- Ortalama sinyalleri arasında sinyal-gürültü düzeyine göre yinelenir.
Not: Genellikle, daha fazla sinyalleri dimmer ışık düzeyleri (hiç az 3 tekrarlar) ve daha parlak ışık düzeyleri (genellikle 1 tekrar) daha az ortalama. Yavaş yavaş 10 arası uyarıcı aralığı 60 uzatmak s dimmest için en parlak ışık seviyesi ile. Bir örnek protokolü Tablo 1' de gösterilen. - Sonra kayıtları, insanca %0,1 tricaine kullanarak larvaları öldürmek.
- Elektrotlar konumlandırma değerlendirmek için göz testi yanıtından ölçmek için tek testi flash (0,06 günlük cd.s/m2) kullanın.
7. analiz
- Negatif dalga bir yalak için taban çizgisinden bir dalga genlik ve negatif dalga bir yalak üzerinden b dalgasının genliği olumlu b-dalga tepeye kadar ölçer.
- A ve b-dalga örtülü zamanlardan uyarıcı başlangıçlı bir dalga çukur ve b-dalga, zirve için sırasıyla ölçmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu bölüm için her gün için 7 dpf 4'ten alınan ERG ölçümlere temsilcisi sonuçları sağlar. 4 dpf ERG yanıt-e doğru photoreceptors ve iki kutuplu hücreler, sırasıyla kaynaklanan sağlam bir - ve b-dalga bileşenleri gösterir. Test her yaşta b dalgasının genliği hafif şiddette (Şekil 2; arttı. Şekil 3). Özellikle, yaşla birlikte artan dimmer yanıp söner için larva Zebra balığı retina duyarlılığını. NET sinyaller bu yoğunluklarda büyük larva (Şekil 2) için tespit, ancak a ve b-dalga-1.61 cd.s/m2 4 dpf adlı oturum daha düşük yoğunluklarda, tanınabilir değildi. B-dalga yanıt önemli ölçüde 4 ve 5 dpf arasında büyüdü (P < 0,0001; Şekil 2A -B; Şekil 3B). B dalgasının daha düşük yoğunluklarda, 5 ve 7 dpf arasında küçük bir değişiklik olsa da, sinyal 2.48 günlük cd.s/m2 7 dpf 5 ve 6 dpf ile karşılaştırıldığında, daha büyük (P < 0,0001; Şekil 2; Şekil 3B). A ve b dalga örtülü haline geldi önemli ölçüde daha hızlı sonra 5 dpf (P < 0,0001; Şekil 3 c -D). Genel olarak, bu sonuçlar arasında 4-7 dpf Zebra balığı retina işlevinin olgunlaşma gösterilmektedir. İlginçtir, bir dalga genlik azaltmak için 5 ila 7 dpf (şekil 3A) ortaya çıktı. Sinaptik bağlantıları'nda dış retina olgunlaşma İki kutuplu hücreler yanıt, bu bir dalga maskeler daha hızlı b-dalga başlangıçlı kaynaklanan gecikme süresi kısalır nedeni bu olabilir. O bir dalga okumak isteyen farmakolojik tedavi blok sonrası photoreceptoral yanıtları (yani b-dalga bileşeni) kullanabilirsiniz.
Şekil 1: Zebra balığı G anzfeld ERG koni şeklindeki sünger-uç elektrot ile kurmak. (A) koni şeklindeki sünger ucu ve klorlu gümüş elektrot sünger-uç elektrot oluşturmak yoluyla önce kuru hava vardır. (B-C) Daha sonra klorlu gümüş tel sünger koni tam elektrot oluşturmak için Bankası aracılığıyla eklenir. (D) tipik larva Zebra balığı Ganzfeld ERG kurulumunda sünger platformu referans elektrot eklenir ve Zebra balığı larva tarafından Ganzfeld kase kaplıdır. (E) sünger-uç elektrot yavaşça larva göz Merkezi Kornea yüzeyine dokunduğundan. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: vahşi tipi larva Zebra balığı temsilcisi ortalama ERG izleri. Ortalama (A) 4, wildtype Zebra balığı izleri ERG dpf (n = 8), (B) 5 dpf (n = 8), (C) 6 dpf (n = 7) ve (D) 7 dpf (n = 9). Yanıt-e doğru gelen beyaz LED flaş kullanarak elde edildi. Her yaşta yanıp söner yanıt (aşağıdan yukarıya) göstermektedir-2.75,-2.11,-1.61,-0.81, 0,06, 0,72, 1,55, 1.89, 2.18, 2,48 oturum cd.s/m2. Ölçek çubuğu 50 µV. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: ERG a ve b-dalga genlikleri ve örtülü saatleri 4 ile 7 dpf Zebra balığı. (A)grubu ortalama (ortalama ± standart hatası) dalga bir flaş yoğunluğu ile artmış ama yaş 4 – 7 dpf larvaları ile azalmıştır genlik. (B) ortalama b-dalgasının genliği 4 – 7 dpf larvaları ile flash yoğunluk artmak içinde; genlik 4 ve 5 dpf arasında büyüdü. (C) ortalama bir dalga örtülü zaman ve (D) ortalama b-dalga örtülü zamanı 5, 6 ve 7 dpf arasında daha hızlı oldu. Satırları en uygun doğrusal olmayan regresyon türetilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Uyarıcı ışık şiddeti (günlük cd.s.m-2) | Tekrar sayısı | Arası uyarıcı aralığı (s) |
| -2.75 | 3-6 | 10 |
| (30 s ileri önce) | ||
| -2.11 | 3-6 | 10 |
| (30 s ileri önce) | ||
| -1.61 | 3-6 | 10 |
| (30 s ileri önce) | ||
| -0.81 | 3-6 | 10 |
| (60 s ileri önce) | ||
| 0,06 | 3-6 | 10 |
| (60 s ileri önce) | ||
| 0,72 | 1-3 | 60 |
| 1,55 | 1-3 | 60 |
| 1.89 | 1-3 | 60 |
| 2.18 | 1-3 | 60 |
| 2,48 | 1-3 | 60 |
Tablo 1: ERG kayıtları örnek protokolü. Uyarıcı sunumlar için giderek daha fazla arası uyarıcı aralıklarla o karanlık adaptasyon korunur emin olmak için daha parlak (alt) ışık düzeylerini ilerleme ve dimmest (üst) başlatın. Sinyal-gürültü olarak sinyalleri her yoğunlukta ortalama sayısı bağlıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ERG gibi fonksiyonel sonuçlar larva Zebra balığı8,9,12,14eğitim için kullanılan araçlar dizisi içinde giderek daha önemli hale gelmiştir. Larva Zebra balığı göz küçük boyutu nedeniyle, cam MİKROPİPETLER en yayımlanmış protokolleri3,4,5,8,9 ' elektrotlar kayıt olarak adapte olması , 12 , 13 , 14. burada basit bir koni şeklindeki sünger-uç elektrot bir larva Zebra balığı ERG iletişim kuralı'nı açıklar. Roman elektrot larva Zebra balığı retina fonksiyon ek herhangi bir ekipman olmadan ölçmek için standart küçük hayvan ERG sistemleri değiştirmek için kullanılabilir. Sünger-uç elektrot yapmak için sadece ticari PVA sünger ve 0.3 mm gümüş tel, bu önceki yaklaşımlar daha ekonomik yapan malzemelerdir. Sert ve keskin micropipette uç aksine, daha nazik vekibar elektrot sünger ucu larva göz zarar olasılığı daha düşüktür, başka bir avantajdır. Son olarak, PVA sünger nem larva göz kaydı boyunca korumak için yardımcı olur.
Bir sünger tam doygunluk sağlamak için sünger-uç elektrot başarılı uygulama anahtarıdır. Bu normalde 1 x goldfish zil'ın arabellek sırılsıklam en az 15 dakika sürer. Bir sünger eksik doygunluk elektrot daha hızlı kurutma nedeniyle gürültü seviyesi artırabilirsiniz. Deneysel her oturum (genellikle < 8 h) dağlık salık vermek için yeni elektrotlar yapma daha iyi sinyal toplama için. Tekrar kullanım arası oturum karşılaştırmalar daha zor hale azaltılmış ERG sinyalleri için yol açabilir.
Larva Zebra balığı sünger platformu üzerine yerleştirirken ölçülecek göz çevresindeki herhangi bir çözüm veya kağıt havlu altında balık temas değil emin olmak için bakım alınması gerekir. Referans elektrot sünger peron içinde gömülü ve ERG azaltır bu kişi elektrik devresi, şort.
Bile iyi doymuş elektrot sünger ipuçları ile yavaş yavaş kurutma, ERG sinyaller artan gürültü olarak belirgin olduğu ortaya çıkar. Bu gerçekleşmesi gereken, 1 x goldfish zil'ın 1 mL şırınga ve iğne 30 G x ½" kullanarak koni tabanının üzerine bir damla damla. Sünger ucu çözümü gürültü azaltmaz ekleme göz çevresindeki sıvı temas olmadığından emin olun ve elektrot uç kornea tepe üzerinde merkezli olun.
Rapor burada temsilcisi sonuçlarında kayıtları 1-300 Hz, salınım potansiyeller (OP) örnekleme izin vermeyen bir bant ayarı ile yapılan — b-Wave dalgacık türetilmiş dahil olmak üzere üçüncü dereceden retina neurons amacrine ve ganglion hücreleri 15,16,17. Daha yüksek kurar ayarları (örneğin, 500 ya da 1000 Hz) daha iyi OP kayıt için uygun olabilir.
Özetle, koni şeklindeki sünger-uç elektrot larva Zebra balığı ERG kayıt güvenilir sonuçlar sağlayan mevcut küçük hayvan ERG sistemleri ile basitleştirmeye yardımcı olur. ERG genlik arasında 5 ve 7 dpf tezahür örtülü kat daha hızlı arasında daha fazla olgunlaşma ile 4 ve 5 dpf büyür temsilcisi sonuçlar gösterilmektedir. Ekonomik ve pratik koni şeklindeki sünger-uç elektrot ile bizim basit ERG Protokolü Zebra balığı retina fonksiyon eğitim müfettişler yararlanabilir. Teknik aynı zamanda yetişkin Zebra balığı veya diğer omurgalı modelleri küçük gözleri ile değerlendirmek için adapte edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar bu çalışmaya ilgili hiçbir açıklamalar var.
Acknowledgments
Bu proje için finansman bir grant tarafından Melbourne nörolojik Bilimler Enstitüsü'nden (FTG, PRJ & BVB) sağlandı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm filter | Millex GP | SLGP033RS | Filters the 10× goldfish ringer's buffer for sterilizatio |
| 1 mL syringe | Terumo | DVR-5175 | With a 30G × ½" needle to add drops of saline to the electrode sponge tip to prevent drying and increased noisein the ERG signals. |
| 30 G × ½" needle | Terumo | NN*3013R | For adding saline toteh sopnge tip electrode. |
| Bioamplifier | ADInstruments | ML135 | For amplifying ERG signals. |
| Bleach solution | King White | 9333441000973 | For an alternative method of sliver electrode chlorination. Active ingredient: 42 g/L sodium hypochlorite. |
| Circulation water bath | Lauda-Ko?nigshoffen | MGW Lauda | Used to make the water-heated platfrom. |
| Electrode lead | Grass Telefactor | F-E2-30 | Platinum cables for connecting silver wire electrodes to the amplifier. |
| Faraday Cage | Photometric Solution International | For maintianing dark adaptation and enclosing the Ganzfeld setup to improve signal-to-noise ratio. | |
| Ganzfeld Bowl | Photometric Solution International | Custom designed light stimulator: 36 mm diameter, 13 cm aperture size. | |
| Luxeon LEDs | Phillips Light Co. | For light stimulation twenty 5W and one 1W LEDs. | |
| Micromanipulator | Harvard Apparatus | BS4 50-2625 | Holds the recording electrode during experiments. |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | version 2010 | Spreadsheet software for data analysis. |
| Moisturizing eye gel | GenTeal Gel | 9319099315560 | Used to cover zebrafish larvae during recordings to avoiding dehydration. Active ingredient: 0.3 % Hypromellose and 0.22 % carbomer 980. |
| Pasteur pipette | Copan | 200C | Used to caredully transfer larval zebrafish. |
| Powerlab data acquisition system | ADInstruments | ML785 | Controls the LEDs to generate stimuli. |
| PVA sponge | MeiCheLe | R-1675 | For the placement of larval zebrafish and making the cone-shaped electrode ti |
| Saline solution | Aaxis Pacific | 13317002 | For electroplating silver wire electrode. |
| Scope Software | ADInstruments | version 3.7.6 | Simultaneously triggers the stimulus through the Powerlab system and collects data |
| Silver (fine round wire) | A&E metal | 0.3 mm | Used to make recording and reference ERG electrodes. |
| Stereo microscope | Leica | M80 | Used to shape and measure the cone-shaped sponge apex (with scale bar on eyepiece). Positioned in the Faraday cage for electrode placement. |
| Tricaine | Sigma-aldrich | E10521-50G | For anaethetizing larval zebrafish. |
| Water-heated platform | custom-made | For maintianing the temperature of the sponge platform and the larval body during ERG recordings |
References
- Roper, C., Tanguay, R. L. Handbook of Developmental Neurotoxicology (Second Edition). Slikker, W., Paule, M. G., Wang, C. , Academic Press. 143-151 (2018).
- Nguyen, C. T., et al. Simultaneous Recording of Electroretinography and Visual Evoked Potentials in Anesthetized Rats. Journal of visualized experiments: JoVE. , e54158 (2016).
- Chrispell, J. D., Rebrik, T. I., Weiss, E. R. Electroretinogram analysis of the visual response in zebrafish larvae. Journal of visualized expriment: JoVE. (97), (2015).
- Seeliger, M. W., Rilk, A., Neuhauss, S. C. Ganzfeld ERG in zebrafish larvae. Documenta Ophthalmologica. 104 (1), 57-68 (2002).
- Fleisch, V. C., Jametti, T., Neuhauss, S. C. Electroretinogram (ERG) Measurements in Larval Zebrafish. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, pdb prot4973 (2008).
- Biehlmaier, O., Neuhauss, S. C., Kohler, K. Synaptic plasticity and functionality at the cone terminal of the developing zebrafish retina. Developmental Neurobiololgy. 56 (3), 222-236 (2003).
- Gestri, G., Link, B. A., Neuhauss, S. C. The visual system of zebrafish and its use to model human ocular diseases. Developmental Neurobiololgy. 72 (3), 302-327 (2012).
- Saszik, S., Bilotta, J., Givin, C. M. ERG assessment of zebrafish retinal development. Visual Neuroscience. 16 (5), 881-888 (1999).
- Niklaus, S., et al. Cocaine accumulation in zebrafish eyes leads to augmented amplitudes in the electroretinogram. Matters. 3 (6), e201703000003 (2017).
- Tanvir, Z., Nelson, R. F., DeCicco-Skinner, K., Connaughton, V. P. One month of hyperglycemia alters spectral responses of the zebrafish photopic ERG. Disease models & mechanisms. , dmm. 035220 (2018).
- Kakiuchi, D., et al. Oscillatory potentials in electroretinogram as an early marker of visual abnormalities in vitamin A deficiency. Molecular medicine reports. 11 (2), 995-1003 (2015).
- Emran, F., Rihel, J., Adolph, A. R., Dowling, J. E. Zebrafish larvae lose vision at night. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2010).
- Makhankov, Y. V., Rinner, O., Neuhauss, S. C. An inexpensive device for non-invasive electroretinography in small aquatic vertebrates. Journal of Neuroscience Methods. 135 (1-2), 205-210 (2004).
- Bilotta, J., Saszik, S., Sutherland, S. E. Rod contributions to the electroretinogram of the dark-adapted developing zebrafish. Developmental Dynamics. 222 (4), 564-570 (2001).
- Cameron, M. A., Barnard, A. R., Lucas, R. J. The electroretinogram as a method for studying circadian rhythms in the mammalian retina. Journal of genetics. 87 (5), 459-466 (2008).
- Bui, B. V., Armitage, J. A., Vingrys, A. J. Extraction and modelling of oscillatory potentials. Documenta Ophthalmologica. 104 (1), 17-36 (2002).
- Bui, B. V., Fortune, B. Ganglion cell contributions to the rat full-field electroretinogram. The Journal of Physiology. 555 (1), 153-173 (2004).
