Summary
在这里, 我们提出了一个协议, 简化测量光诱发视网膜图像反应从幼虫斑马鱼。一种新型锥形海绵尖电极可以使利用电视图 erg 更容易地实现幼虫斑马鱼的视觉发育, 结果可靠, 成本更低。
Abstract
斑马鱼 (dadio rerio)通常用作发育研究中的脊椎动物模型, 特别适用于视觉神经科学。对于视觉性能的功能测量, 电像 (ERG) 是一种理想的非侵入性方法, 在高等脊椎动物物种中已经很好地确立了这一方法。这种方法正越来越多地用于检查斑马鱼的视觉功能, 包括在早期发育幼虫阶段。然而, 迄今为止, 幼虫斑马鱼 ERG 最常用的记录电极是玻璃微移液器电极, 这需要专门的制造设备, 这对资源有限的实验室提出了挑战。在这里, 我们提出了一个幼虫斑马鱼 ERG 协议使用锥形海绵尖端电极。与玻璃微移液器相比, 新型电极更容易制造和处理, 更经济, 也更不容易损坏幼虫的眼睛。与先前发布的 ERG 方法一样, 目前的协议可以通过光感受器和双极细胞响应-------------------------------------------------------------------------------------该协议可以清楚地说明斑马鱼幼虫在整个早期发育过程中视觉功能的完善, 支持新型电极的实用性、灵敏度和可靠性。简化的电极是特别有用的, 当建立一个新的 ERG 系统或修改现有的小动物 ERG 设备的斑马鱼测量, 帮助研究人员在视觉神经科学使用斑马鱼模型生物。
Introduction
斑马鱼 (Daio rerio)已成为一种广泛使用的遗传脊椎动物模型, 包括视觉神经科学的研究。这种物种越来越受欢迎, 这是因为遗传操作容易、高度保守的脊椎动物视觉系统 (神经元类型、解剖形态和组织以及潜在的遗传学)、高繁殖力等。与哺乳动物模式1相比, 畜牧业成本较低。非侵入性视网膜图 (erg) 长期以来一直被用于临床评估人类的视觉功能, 并在实验室环境中量化一系列大小物种的视力, 包括啮齿类动物和幼虫斑马鱼2,3,4 个,5. 最常分析的 erg 成分是 a 波和 b 波, 分别来自感光感受器和双极神经元间。在幼虫斑马鱼中, 通过受精后 3天 (dpf) 建立视网膜的不同层, 光感受器锥形末端突触的形态在 4 dpf6,7之前成熟。因此, 幼虫斑马鱼的视网膜外功能建立在 4 dpf 之前, 这意味着 ERG 是可测量的, 从这个早期开始。由于该模型的实验周期较短, 且具有高通量特性, ERG 已应用于幼虫斑马鱼的疾病模型功能评估、彩色视觉和视网膜发育分析、视觉生理节律研究等方面的应用。并检测药物8,9,10,11,12。
然而, 目前的方法对幼虫斑马鱼 ERG 有一些复杂性, 这可能会使其更难采用。已发布的幼虫斑马鱼 erg 协议通常使用充满导电液体的玻璃微型移液器作为记录电极3,4,5,13, 这需要高质量的微型移液器提示3。制造微管拉拔器等专用设备, 在某些情况下还需要微型锻造设备。这对资源有限的实验室来说可能是一个挑战, 即使在适应现有的小动物 ERG 系统来测量幼虫斑马鱼视觉功能时, 也会导致额外的费用。即使平滑时, 锐利的微型移液器尖端也会损坏幼虫眼睛的表面。此外, 用于电生理的商用微型移液器支架是用固定的银线建造的。这些固定的电线在重复使用后变得钝化, 需要购买新的支架, 从而增加维护成本。
在这里, 我们描述了一种 erg 方法使用锥形海绵尖端记录电极, 这是特别有用的适应已建立的小动物 ERG 设置的幼虫斑马鱼 ERG 测量。该电极很容易使用普通的聚醋酸乙烯酯 (PVA) 海绵和细银丝, 无需任何其他专用设备。我们的数据表明, 这种新型电极具有足够的灵敏度和可靠性, 可以证明4至 7 dpf 之间的幼虫斑马神经回路的功能发展。这种经济实用的海绵尖电极可能有助于研究人员建立新的 ERG 系统或修改现有的小动物系统, 用于斑马鱼的研究。
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Protocol
所有电子标志图 (ERG) 程序都是根据澳大利亚国家卫生和医学研究委员会动物护理和使用业务守则的规定进行的, 并得到了机构动物伦理委员会的批准。墨尔本大学。
1. 缓冲器准备
- 使用反渗透 (ro) 水制备10倍金鱼响铃的缓冲液 (1.25 Mm ncl、26 mm Kcl、25 mm ccl2、10 Mm Mgcl 2、100 mM 葡萄糖、100 mm hepes)。将缓冲液调整到 pH 7.8, 并使用0.22μm 过滤器对缓冲液进行灭菌。将10倍缓冲液存放在4°c 下, 作为溶液库存 3。
请注意:10倍响铃的缓冲器应在3个月内使用。 - 在实验当天, 利用反渗透水稀释10倍金鱼林格的缓冲液, 使1x 金鱼林格的缓冲液。
请注意:1x 金鱼林格的缓冲液用于饱和 PVA 海绵, 包括用于放置幼虫斑马鱼的海绵, 以及记录电极尖端上的海绵。
2. 电极制备
-
准备锥形海绵记录电极。
- 从铂电极引线延伸切割男性端, 并使用手术刀刀片从外部聚四氟乙烯绝缘涂层的端部去除10毫米。注意不要损坏电极引线的内丝。
- 切割40毫米长的银线 (直径 0.3 mm), 并通过将银丝与外露的内丝缠绕在一起, 将其牢固地连接到电极引线上。使用绝缘胶带将接头包起来, 使大约15毫米长的银丝露出来 (图 1a)。
- 电镀暴露的银丝用氯化物使用 9 V 直流电源为 60秒, 以提高信号传导。将暴露的银尖浸入正常盐水中, 并将另一端连接到电池的正端子。将另一根电线连接到电池的负极, 并将电线的另一端浸入盐水2中。
请注意:或者, 将银丝浸泡在漂白剂溶液 (活性成分 42 gl 次氯酸钠) 中 1小时, 从而将银丝氯化。 - 用剪刀切割约20毫米 x 20 毫米 PVA 海绵, 制成圆锥 (图 1a)。使用1x 响铃的缓冲液饱和海绵。在目镜上带有刻度条的显微镜下, 使用手术刀刀片将圆锥的顶点塑造成 ~ 40μm 直径。空气干燥锥形海绵吸收纸组织, 直到它是固体。
请注意:PVA 海绵在饱和时显著膨胀, 因此, 在塑造圆锥的顶端之前, 海绵首先被盐水饱和是很重要的。 - 在氯化后, 空气干燥银丝在吸收组织 5分钟. 插入干, 固体, 锥形 PVA 海绵通过圆锥的基础。使用掩膜胶带绝缘任何多余的暴露金属, 以减少光伏伪影 (图 1B-C)。
请注意:每次实验结束后, 将海绵从银线上取出。用反渗透水清洗海绵, 空气干燥后再使用。为确保最佳的信号采集, 建议单次使用银线。PVA 海绵的重复使用次数不应超过5次。 - 在实验当天, 将记录电极的海绵尖浸入1x 响铃的缓冲液中至少 15分钟, 使海绵完全饱和。
- 如上所述, 准备参考电极, 但不要连接海绵尖端。
- 以商业方式获得接地电极。
3. 斑马鱼的制备
- 在录音前, 将斑马鱼放入一个15毫升的管 (lt;20 每个管的幼虫) 中, 在一个深色的孵化器中包裹, 以深色方式适应斑马鱼幼虫一夜。取下盖子, 以确保充足的氧气供应。
- 在记录当天, 将盖子拧紧到含有幼虫的箔包裹的猎鹰管上, 并确保管是防光的。将幼虫运送到 ERG 实验室。
- 借助发光二极管 (LED; 17.4 cdm-2, 最大600纳米) 发出的昏暗的红色照明, 将鱼倒进黑暗中的petri 培养皿中。使用防光毛巾覆盖培养皿, 以最大限度地减少光线照射。
4. 海绵平台准备
- 剪下一个长方形的干 PVA 海绵, 以适应紧贴在一个35毫米的 Petri 菜。确保海绵的厚度应大致等于培养皿的深度。
- 通过海绵的一端垂直进行一个小的切割, 以容纳参考电极的银丝。
- 将 PVA 海绵浸泡在1x 金鱼林格的缓冲液中, 直到饱和。然后, 将海绵放在一个干净的35毫米培养皿中。使用纸巾吸收多余的液体, 直到没有溶液从海绵中渗出, 以响应轻手指按下。
5. 动物和电极定位
- 用0.02% 的毛滴剂在1x 金鱼林格液中稀释, 对幼虫进行麻醉。
- 使用3毫升巴斯德移液器将麻醉过的幼虫转移到方形纸巾上 (~ 3 厘米2)。
- 使用钳子将装有幼虫的纸巾放在潮湿的海绵平台上。使用浸泡在林格缓冲液中的精细刷子来调整幼虫的位置。确保一只眼睛朝上, 与幼虫下方的纸巾方形上的任何附近液体隔离。
- 在整个 ERG 记录过程中, 用保湿眼胶覆盖幼虫身体, 不包括头部, 以保持幼虫湿润。
- 将带有海绵平台的 Petri 盘放置在位于法拉第笼内的 Ganzfeld 碗灯刺激的小热水平台上 (图 1D)。
请注意:保持海绵和幼虫体的温度可确保稳定的 ERG 信号。 - 将参考电极插入平台海绵中的切口 (图 1d)。
- 将商业获得的接地电极连接到法拉第笼。
- 将记录电极连接到电极支架上, 并将保持器固定在微机械手的立体定向臂上 (图 1d)。使用3毫升的巴斯德移液器在电极的海绵尖端上滴下一滴1x 林格液, 以实现再饱和。
- 将显微镜放置在法拉第保持架上的 ERG 平台上, 以便放置电极。
请注意:照明应由昏暗的红色 LED (17.4 cd.m, 最大 600nm) 提供,以便观察幼虫和活性电极的位置, 同时保持暗适应。 - 调整海绵平台的位置, 以便在显微镜下观察幼虫。然后, 使用吸收性组织去除电极海绵尖端多余的液体。
- 放置有源电极, 使其轻轻接触幼虫斑马鱼眼的中心角膜表面 (图 1E)。
- 将甘兹菲尔德碗向海绵平台移动, 确保幼虫被碗覆盖。
- 关闭法拉第保持架, 以减少多余的电磁噪声。
6. 电子记录
-
使用特定 ERG 系统的计算机软件 (有关详细信息, 请参阅材料表) 触发刺激, 并根据下面建议的设置获取数据.
- 通过采集软件中650毫秒的记录窗口 (2, 560点), 将系统的采样率设置为 4 KHz。
- 将系统增益设置为 1, 000x。
- 将系统的带通滤波设置为 1–300 Hz。
- 使用凹槽滤波器来降低 60 Hz (或 50 Hz, 具体取决于本地公用频率) 的噪声。
请注意:理想的噪声水平不应超过±10μv。
-
使用下面描述的过程开始数据收集。
- 使用单个测试闪光灯 (0.06 log cd. sp2) 测量来自眼睛的测试响应, 以评估电极的位置。
请注意:这种强度的测试闪光灯应导致 b 波振幅大于25μv 的4-Dpf 幼虫。如果无法测量鲁棒响应, 则重新定位电极并进行另一个测试闪光灯, 以确认电极位置良好。 - 在测试闪光灯之后, 让动物在完全黑暗中适应3分钟后再录音。
- 从调光器到更明亮的光强的闪光灯。
- 根据信噪比水平重复的平均信号。
请注意:一般情况下, 在调光器的光水平 (不少于3次重复) 下, 平均信号会更多, 在较亮的光水平 (通常为1次重复) 的信号会更少。逐渐将刺激间隔从最暗的调光级别延长到60秒。示例协议如表 1所示。 - 录音后, 用0.1% 的滴虫人道地杀死幼虫。
- 使用单个测试闪光灯 (0.06 log cd. sp2) 测量来自眼睛的测试响应, 以评估电极的位置。
7. 分析
- 测量从基线到负波槽的 a 波振幅, 从负波槽到正波波峰的 b 波振幅。
- 分别测量从刺激开始到波槽和 b 波峰值的 a 波和 b 波隐式时间。
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Representative Results
本节提供了每天从4到 7 dpf 进行的 ERG 测量的代表性结果。从 4 dpf, ERG 反应显示鲁棒的 a 和 b 波成分, 这分别产生于光感受器和双极细胞。在每次测试时, b 波的振幅随光强的增加而增加 (图 2;图 3)。值得注意的是, 幼虫斑马鱼视网膜对变暗闪光的敏感性随着年龄的增长而增加。在强度低于-1.61 日志 cd. s m 2 的强度下, 在 4 dpf 时, a-o 和 b 波无法识别, 而在这些强度下, 较老的幼虫则可以检测到清晰的信号 (图 2).b 波响应在4和 5 dpf 之间显著增长 (p < 0.0001;图 2 a-b;图 3B)。虽然低强度的 b 波在5和 7 dpf 之间变化不大, 但在 2.48 log cd. sm 2 的信号在 7 dpf 时大于5和 6 Dpf (p < 0.0001;图 2;图 3B)。在 5 dpf (p < 0.0001 后, a 波和 b 波隐式时间明显加快;图 3 c-d)。总体而言, 这些结果表明斑马鱼视网膜功能在4至 7 dpf 之间成熟。有趣的是, a 波振幅似乎从5到 7 Dpf (图 3 a)。这可能是因为外视网膜突触连接的成熟缩短了双极细胞响应的潜伏期, 导致 b 波发生更快, 掩盖了 a-wave。那些希望研究 a-波波可以使用药理治疗来阻止光侧后的反应 (即 b 波成分)。
图 1: 斑马鱼g用锥形海绵尖电极建立.(a) 锥形海绵尖端和氯化银电极在构建海绵尖电极之前进行风干。(B-C)随后, 通过基座将氯化银丝插入海绵锥, 形成完整的电极。(d) 在典型的幼虫斑马鱼甘兹菲尔德 erg 设置中 , 参考电极入海绵平台 , 斑马鱼幼虫被甘兹菲尔德碗覆盖。(e) 海绵尖端电极轻轻接触幼虫眼的中央角膜表面。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 具有代表性的野生幼虫斑马鱼的平均 erg 痕迹.野生斑马鱼的平均 ERG 痕迹在 (a) 4 dpf (n = 8)、(b) 5 dpf (n = 8)、(c) 6 dpf (n = 7) 和 (d) 7 dpf (n = 9)。使用白色 Led 的闪光灯获得响应。在每个年龄, 痕迹显示对闪烁 (从下到上) 的反应 (从下到上)-2.75,-2.11,-1.61,-0.81, 0.81, 0.81, 1.61, 1.61, 2.75, 2.75 log cd. s m 2.刻度栏 = 50μv. 请点击此处查看此图的较大版本.
图 3: 4 至 7 dpf 斑马鱼的 ERG-和 b 波振幅及隐式时间.(a) 在 4-7 dpf 幼虫中, 群平均 (均值的±标准误差) 随着闪光强度的增加而增加, 但随着年龄的增长而减小。(b) 4–7 dpf 幼虫的平均 b 波振幅随闪光强度的增加而增加;振幅在4到 5 dpf 之间增长。(c) 平均波隐式时间和 (d) 平均 b 波内隐时间在5、6和 7 dpf 之间变得更快。最佳拟合线来自非线性回归。请点击这里查看此图的较大版本.
| 刺激光强 (日志 cd-2) | 重复次数 | 刺激间间隔 |
| -2.75 | 3至6 | 10 |
| (下一个之前 30秒) | ||
| -2.11 | 3至6 | 10 |
| (下一个之前 30秒) | ||
| -1.61 | 3至6 | 10 |
| (下一个之前 30秒) | ||
| -0.81 | 3至6 | 10 |
| (60秒前) | ||
| 0.06 | 3至6 | 10 |
| (60秒前) | ||
| 0.72 | 1至3 | 60 |
| 1.55 | 1至3 | 60 |
| 1.89 | 1至3 | 60 |
| 2.18 | 1至3 | 60 |
| 2.48 | 1至3 | 60 |
表 1:ERG 记录的示例协议.刺激演示从最暗 (顶部) 开始, 进入到更明亮 (底部) 的光水平, 刺激间隔逐渐延长, 以确保保持暗适应。每个强度的平均信号数取决于信噪比级别。
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Discussion
在用于研究幼虫斑马鱼8、9、12、14的工具套件中, erg 等功能读数变得越来越重要。由于幼虫斑马鱼眼体积小, 在大多数公布的协议 3、4、5、8、9中,玻璃微管被改编为记录电极,12,13,14. 在这里, 我们描述了一个使用更简单的锥形海绵尖电极的幼虫斑马鱼 erg 协议。这种新型电极可用于修改标准的小动物 ERG 系统, 以测量幼虫斑马鱼视网膜功能, 而无需任何额外的设备。制造海绵尖端电极的材料只是商业聚宝线海绵和0.3 毫米银丝, 这使得这比以前的方法更经济。另一个优点是, 与硬而尖锐的微移液器尖端相比, 温和的电极海绵尖端不太可能损害幼虫的眼睛。最后, PVA 海绵有助于在整个记录过程中保持幼虫眼睛的水分。
海绵尖端电极成功应用的关键是确保海绵的完全饱和度。这通常需要不少于15分钟浸泡在1x 金鱼林格的缓冲液。由于电极干燥速度更快, 海绵的不完全饱和会增加噪音水平。为了更好地采集信号, 强烈建议为每个实验会话 (一般 < 8小时) 制作新的电极。重复使用会减少 ERG 信号, 从而增加会话间比较的难度。
在将幼虫斑马鱼定位到海绵平台上时, 必须注意确保被测量的眼睛不会与任何周围溶液或鱼下面的纸巾接触。这种接触短路电路, 因为参考电极嵌入海绵平台, 减少 ERG。
即使使用饱和电极海绵提示, 也会逐渐干燥, 这在 ERG 信号中明显的噪声增加。如果发生这种情况, 使用1毫升注射器和一个30克 x 半 "针将1x 的金鱼林格的滴注在圆锥的底部。如果将溶液添加到海绵尖端不会降低噪音水平, 请检查眼睛与周围流体没有接触, 并确保电极尖端位于角膜先端。
此处报告的代表性结果中的记录是以 1–300 Hz 的带通设置进行的, 该设置不允许对振荡电位(op) 进行采样, 而振荡电位 (op) 是来自三阶视网膜神经元的 b 波上的小波, 包括amacrine 和神经节细胞 15,16,17。较高的低通设置 (例如, 500 或 1, 000 Hz) 可能更适合于 OP 录制。
总之, 锥形海绵尖电极有助于简化幼虫斑马鱼 ERG 记录与现有的小动物 ERG 系统, 提供可靠的结果。代表性结果表明, ERG 振幅在4到 5 dpf 之间增长, 在5到 7 dpf 之间进一步成熟, 表现为更快的隐式时间。我们简单的 ERG 协议与经济和实用的锥形海绵尖电极可以有利于研究斑马鱼视网膜功能的研究人员。该技术也可以用来评估成虫斑马鱼或其他脊椎动物模型与小眼睛。
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Disclosures
提交人没有与这项工作有关的披露。
Acknowledgments
该项目的资金由墨尔本神经科学研究所 (向 PTG、PRJ & BVB 提供) 的赠款提供。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm filter | Millex GP | SLGP033RS | Filters the 10× goldfish ringer's buffer for sterilizatio |
| 1 mL syringe | Terumo | DVR-5175 | With a 30G × ½" needle to add drops of saline to the electrode sponge tip to prevent drying and increased noisein the ERG signals. |
| 30 G × ½" needle | Terumo | NN*3013R | For adding saline toteh sopnge tip electrode. |
| Bioamplifier | ADInstruments | ML135 | For amplifying ERG signals. |
| Bleach solution | King White | 9333441000973 | For an alternative method of sliver electrode chlorination. Active ingredient: 42 g/L sodium hypochlorite. |
| Circulation water bath | Lauda-Ko?nigshoffen | MGW Lauda | Used to make the water-heated platfrom. |
| Electrode lead | Grass Telefactor | F-E2-30 | Platinum cables for connecting silver wire electrodes to the amplifier. |
| Faraday Cage | Photometric Solution International | For maintianing dark adaptation and enclosing the Ganzfeld setup to improve signal-to-noise ratio. | |
| Ganzfeld Bowl | Photometric Solution International | Custom designed light stimulator: 36 mm diameter, 13 cm aperture size. | |
| Luxeon LEDs | Phillips Light Co. | For light stimulation twenty 5W and one 1W LEDs. | |
| Micromanipulator | Harvard Apparatus | BS4 50-2625 | Holds the recording electrode during experiments. |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | version 2010 | Spreadsheet software for data analysis. |
| Moisturizing eye gel | GenTeal Gel | 9319099315560 | Used to cover zebrafish larvae during recordings to avoiding dehydration. Active ingredient: 0.3 % Hypromellose and 0.22 % carbomer 980. |
| Pasteur pipette | Copan | 200C | Used to caredully transfer larval zebrafish. |
| Powerlab data acquisition system | ADInstruments | ML785 | Controls the LEDs to generate stimuli. |
| PVA sponge | MeiCheLe | R-1675 | For the placement of larval zebrafish and making the cone-shaped electrode ti |
| Saline solution | Aaxis Pacific | 13317002 | For electroplating silver wire electrode. |
| Scope Software | ADInstruments | version 3.7.6 | Simultaneously triggers the stimulus through the Powerlab system and collects data |
| Silver (fine round wire) | A&E metal | 0.3 mm | Used to make recording and reference ERG electrodes. |
| Stereo microscope | Leica | M80 | Used to shape and measure the cone-shaped sponge apex (with scale bar on eyepiece). Positioned in the Faraday cage for electrode placement. |
| Tricaine | Sigma-aldrich | E10521-50G | For anaethetizing larval zebrafish. |
| Water-heated platform | custom-made | For maintianing the temperature of the sponge platform and the larval body during ERG recordings |
References
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