Summary
Hier presenteren we een protocol dat de meting van lichte evoked electroretinogram reacties van larvale zebrafish vereenvoudigt. Een roman kegelvormige spons-tip-elektrode kan helpen om de studie van visuele ontwikkeling in larvale zebrafish met behulp van de electroretinogram ERG gemakkelijker te bereiken met betrouwbare resultaten en lagere kosten.
Abstract
De zebravissen (Danio rerio) wordt vaak gebruikt als een gewervelde model in developmental studies en is bijzonder geschikt voor visuele neurowetenschappen. Voor functionele metingen van visuele prestaties is electroretinography (ERG) een ideale niet-invasieve methode, die goed ingeburgerd in hogere gewervelde dieren is. Deze aanpak wordt steeds vaker gebruikt voor de behandeling van de visuele functie in zebrafish, met inbegrip van tijdens de vroege developmental larvale stadia. De meest gebruikte opname-elektrode voor larvale zebrafish ERG tot op heden is echter de glazen micropipet-elektrode, die gespecialiseerde apparatuur voor de productie vereist, het presenteren van een uitdaging voor laboratoria met beperkte middelen. Hier presenteren we een larvale zebrafish ERG protocol met behulp van een elektrode kegelvormige spons-tip. De roman elektrode is gemakkelijker te vervaardigen en handvat, zuiniger, en minder kans op schade van het larvale oog dan de glazen micropipet. Zoals eerder gepubliceerde ERG methoden, kan het huidige protocol buitenste retinale functie via fotoreceptor en de antwoorden van de bipolaire cel, de a - en b-Golf, respectievelijk beoordelen. Het protocol kan illustreren de verfijning van de visuele functie gedurende de vroege ontwikkeling van het larven van de zebravis, ter ondersteuning van het hulpprogramma, gevoeligheid en betrouwbaarheid van de roman elektrode. De vereenvoudigde elektrode is vooral handig wanneer tot oprichting van een nieuw systeem van de ERG of het wijzigen van bestaande kleine-dier ERG apparaat voor meting van de zebravis, medeplichtigheid aan onderzoekers in de visuele neurowetenschappen te gebruiken van de zebravis model organisme.
Introduction
De zebravissen (Danio rerio) is een veel gebruikte genetische gewervelde model, met inbegrip van studies van de visuele neurowetenschappen geworden. De toenemende populariteit van deze soort kan worden toegeschreven aan voordelen waaronder gemak van genetische manipulatie, de zeer geconserveerde gewervelde visuele systeem (neuron typen, anatomische morfologie en organisatie en onderliggende genetica), de hoge vruchtbaarheid en lagere kosten van de veehouderij in vergelijking met zoogdieren modellen1. De niet-invasieve electroretinogram (ERG) heeft al lange tijd gebruikt klinisch te beoordelen van menselijke visuele functie, en in het laboratorium-omgeving te kwantificeren visie op een aantal grote en kleine soorten waaronder knaagdieren en larvale zebrafish2,3 , 4 , 5. de meest voorkomende geanalyseerde ERG componenten zijn de a-Golf en b-Golf, afkomstig uit de researchdieren licht-sensing en bipolaire interneuronen, respectievelijk. In larvale zebrafish, verschillende lagen in de retina zijn opgericht door 3 dagen na bevruchting (dpf) en de morfologie van de fotoreceptor kegel terminal synapses volwassen vóór 4 dpf6,7. Buitenste retinale functie van larvale zebrafish wordt aldus vastgesteld vóór 4 dpf, wat betekent dat de ERG meetbare vanaf deze jonge leeftijd vanaf is. Vanwege de korte experimentele cyclus en de eigenschappen van de hoog-productie van het model, heeft de ERG vereffend larvale zebrafish voor functionele beoordeling van ziekte modellen, kleur visie en retinale ontwikkeling analyseren, bestuderen van visuele circadiane ritmen en8,9,10,11,12testen van drugs.
Huidige benaderingen voor larvale zebrafish ERG heeft echter enkele complexiteiten die kunnen maken het moeilijker om te nemen. Gepubliceerde larvale zebrafish ERG protocollen gebruiken meestal een glas micropipet gevuld met geleidende vloeistof als de opname elektrode3,4,5,13, waarvoor een micropipet van hoge kwaliteit Tip3. Gespecialiseerde apparatuur, zoals een micropipet trekker en in sommige gevallen een microforge, zijn vereist voor de fabricage ervan. Dit kan een uitdaging voor laboratoria met beperkte middelen en leidt tot extra kosten, zelfs bij de aanpassing van de beschikbare kleine dierlijke ERG systemen voor het meten van de visuele functie larvale zebrafish. Zelfs wanneer gladgestreken, kan de scherpe micropipet tip schade aan het oppervlak van de larvale oog. Bovendien, worden commerciële micropipet houders voor electrofysiologie geconstrueerd met een vaste zilveren draad. Deze vaste draden worden gepassiveerd na herhaald gebruik, waarbij de aankoop van nieuwe houders leidt tot hogere onderhoudskosten.
Hier beschrijven we een ERG-methode met behulp van een kegelvormige spons-tip opname-elektrode, dat is met name handig voor de aanpassing van de gevestigde kleine-dier ERG setups voor larvale zebrafish ERG metingen. De elektrode wordt gemakkelijk gemaakt met behulp van gemeenschappelijke polyvinylacetaat (PVA) spons en fijn zilver draad zonder andere gespecialiseerde apparatuur. Onze gegevens blijkt dat deze roman elektrode is gevoelig en betrouwbaar genoeg is om aan te tonen van de functionele ontwikkeling van retinale neurale circuits in larvale zebrafish tussen 4 en 7 dpf. Deze economische en praktische spons-tip-elektrode kan nuttig zijn voor onderzoekers tot de oprichting van nieuwe ERG systemen of het wijzigen van bestaande systemen van de kleine dieren, voor zebrafish studies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle electroretinogram (ERG) procedures werden uitgevoerd volgens de bepalingen van de Australische nationale gezondheids- en medische Onderzoeksraad gedragscode voor de verzorging en het gebruik van dieren en goedgekeurd door het Comité van de institutionele dierenethiek op de Universiteit van Melbourne.
1. buffer voorbereiding
- Voorbereiden van de 10 x goudvis Ringer's buffer (1,25 M NaCl, 26 mM KCl, 25 mm CaCl2, 10 mM MgCl2, glucose 100 mM, 100 mM HEPES) met behulp van omgekeerde osmose (RO) water. Aanpassen van de buffer met pH 7,8 en steriliseren van de buffer met behulp van 0,22 μm filter. De 10 x buffer bij 4 ° C worden opgeslagen als de oplossing voorraad3.
Opmerking: De 10 x Ringer's buffer dient binnen 3 maanden. - Op de dag van het experiment, 1 x goudvis Ringer's buffer te maken door verdunnen van de 10 x goudvis Ringer's buffer met behulp van omgekeerde osmosewater.
Opmerking: De 1 x goudvis Ringer's buffer wordt gebruikt om te verzadigen de PVA spons, de spons gebruikt voor de plaatsing van larvale zebrafish, waaronder en de spons op het puntje van de elektrode opname.
2. elektrode voorbereiding
-
De kegel-vormig spons opname elektrode voor te bereiden.
- Snijd de andere stekker van de platina-elektrode lood extensie en verwijder aan het einde 10 mm van het buitenste polytetrafluorethyleen isolatie coating met behulp van een scalpel blad. Wees voorzichtig niet te beschadigen de binnenste draad van de leiding van de elektrode.
- Knip een 40 mm lengte van zilver draad (0.3 mm doorsnede) en dit veilig te hechten aan de elektrode leiding door de vervlechting van de zilver draad met de blootgestelde binnenste draad. Omsluiten het gewricht met behulp van isolerend tape, verlaten van een ~ 15 mm lengte van zilver draad blootgesteld (figuur 1A).
- Electroplate de blootgestelde zilver draad met chloride met behulp van een 9 V DC-bron voor 60 s ter verbetering van de geleiding van het signaal. Dompel onder tip voor het blootgestelde zilver in normale zout en sluit het andere uiteinde met de positieve aansluitklem van de accu. Sluit een ander draad aan op de negatieve aansluitklem van de accu en het andere uiteinde van de draad in de zoute2onderdompelen.
Opmerking: Als alternatief, chlorine de zilver draad door het inweken gedurende 1 uur in een bleekwater oplossing (werkzame bestanddeel natriumhypochloriet 42 g/L). - Snijd een ~ 20 x 20 mm vierkant van PVA spons met behulp van schaar te maken van een kegel (figuur 1A). Verzadigen de spons met 1 x Ringer's buffer. Onder een microscoop met een schaal bar op het oculair, kunt een scalpel blad vorm van de top van de kegel met diameter van ~ 40 µm. Lucht drogen de kegel-vormig spons op absorberend papier weefsel totdat het is solide.
Opmerking: De PVA spons wordt aanzienlijk vergroot wanneer verzadigde, dus is het belangrijk dat de spons eerst is verzadigd met zout voor het vormgeven van de top van de kegel. - Na chloriding droge lucht de zilver draad op een absorberende weefsel voor 5 min. invoegen de zilver draad in de gedroogde, solide, kegelvormige PVA spons via de onderkant van de kegel. Isoleer alle overtollige blootgestelde metaal met behulp van mask tape om fotovoltaïsche artefacten (Figuur 1B-C).
Opmerking: Na elke experimentele sessie, de spons van de zilver draad te verwijderen. Was de spons met behulp van omgekeerde osmosewater en lucht droog voor hergebruik. Optimale signaal collectie is, eenmalig gebruik van zilver draad raadzaam. PVA sponsen mogen niet meer dan 5 keer worden hergebruikt. - Op de dag van het experiment, dompel onder de spons-tip van de opname-elektrode in 1 x Ringer's buffer gedurende ten minste 15 minuten volledig verzadigen de spons.
- Referentie-elektroden bereiden zoals beschreven hierboven, maar zonder de spons-tip.
- De grond elektrode commercieel verkrijgen.
3. de zebravis voorbereiding
- Donker 's nachts aan te passen van zebravis larven (> 8 h) voorafgaand aan opnames door het plaatsen van zebrafish in een tube van 15 mL (< 20 larven per buis) verpakt in aluminiumfolie in een donkere incubator. Verwijder het deksel om voldoende zuurstofvoorziening te waarborgen.
- Op de dag van opname, draai de deksel aan de buis van de folie verpakte falcon met larven en zorg ervoor dat de buis lichtdicht. De larven van het vervoer naar het lab ERG.
- Giet de vis in petrischalen in het donker met de hulp van dim rode verlichting van een licht afgevende diodes (LED; 17.4 cd.m-2, λmax 600 nm). Petrischalen met lichtdicht handdoeken om te minimaliseren van de blootstelling aan licht te dekken.
4. spons Platform voorbereiding
- Snijd een rechthoek van droge PVA spons te passen zonder speling in een 35 mm petrischaal. Ervoor zorgen dat de dikte van de spons ongeveer gelijk is aan de diepte van de petrischaal moet.
- Maken een kleine snede verticaal door het ene uiteinde van de spons aan de zilveren draad van de referentie-elektrode.
- Week de PVA spons in 1 x goudvis Ringer's buffer tot verzadiging. Dan, plaats de spons in een petrischaal schoon 35-mm. Gebruik een papieren handdoek om extra vloeistof absorberen tot geen oplossing van de spons in reactie op een lichte vinger druk straalt.
5. dieren en elektrode plaatsing
- Anesthetize de larven met behulp van 0,02% tricaïne verdund in 1 x goudvis Ringer's buffer.
- Gebruik een 3 mL Pipet van Pasteur te dragen een narcose larve naar een vierkant van papieren handdoek (~ 3 cm2).
- Plaats de keukenrol met de larve op de vochtige spons-platform met behulp van de verlostang. Gebruik een fijne borstel gedrenkt in Ringer's buffer om de positie van de larve. Erop toe dat één oog zijde naar boven gekeerd, geïsoleerd uit een nabijgelegen vloeistof op het plein van papieren handdoek onder de larve.
- Glazuur het larvale lichaam, met uitzondering van het hoofd, met hydraterende eye gel de larve om vochtig te houden gedurende de opname van de ERG.
- Plaats de petrischaal met spons platform op een klein water-verwarmd platform voor de Ganzfeldexperiment kom lichte stimulus gelegen in een kooi van Faraday (Figuur 1 d).
Opmerking: Onderhoud van de temperatuur van de spons en het larvale lichaam zorgt voor stabiele ERG signalen. - De referentie-elektrode in de snede gemaakt in de platform spons (Figuur 1 d) invoegen.
- Sluit de commercieel verkregen grond elektrode aan de kooi van Faraday.
- De opname-elektrode hechten aan een elektrode-houder en de houder aan de stereotaxic tak van een micromanipulator (Figuur 1 d) veilig. Gebruik een 3 mL Pipet van Pasteur te druppelen één druppel 1 x Ringer's oplossing op het puntje van de spons van de elektrode voor opnieuw verzadiging.
- Plaats de Microscoop in de kooi van Faraday op de ERG platform voor plaatsing van de elektrode.
Opmerking: Verlichting moet worden verstrekt door een dim rode LED (17.4 cd.m-2, λmax 600 nm) dat de waarneming van de larve en de plaatsing van de actieve elektrode, met behoud van de dark-adaptation. - Pas de positie van de spons-platform dat de waarneming van de larve onder de Microscoop. Gebruik vervolgens absorberend weefsel verwijderen overtollige vocht uit de elektrode spons tip.
- Plaats de actieve elektrode zodat het zachtjes het centrale hoornvlies oppervlak van het oog van de larvale zebrafish (figuur 1E raakt).
- Verplaats de Ganzfeldexperiment-kom naar de spons-platform en ervoor zorgen dat de larve wordt gedekt door de kom.
- Sluit de kooi van Faraday ter vermindering van de externe elektromagnetische ruis.
6. Electroretinogram opname
-
Gebruik van de computersoftware van het systeem ERG bijzondere (zie tabel van materialen voor details) activeren van de stimulus en het verwerven van gegevens op basis van de instellingen aanbevolen onder2.
- Stel de samplefrequentie van het systeem op 4 KHz over een 650 ms venster (2,560 punten) opnemen in de acquisitie software.
- De winst van het systeem ingesteld op 1000 ×.
- Band pass filter van het systeem tot 1 – 300 Hz instellen.
- Een inkeping filter gebruiken om 60 Hz (of 50 Hz, afhankelijk van de frequentie van de lokale nut) ruis.
Opmerking: Het ideale geluidsniveau moet niet meer dan ±10 µV.
-
Verzamelen van de gegevens met behulp van de hieronder beschreven procedure te beginnen.
- Gebruik een interne test-flash (0.06 log cd.s/m2) voor het meten van een reactie van de test van het oog om te beoordelen de positionering van de elektroden.
Opmerking: Deze intensiteit van test flash moet resulteren in een b-Golf amplitude groter is dan 25 µV in 4-dpf larven. Als een robuust antwoord kan niet worden gemeten, dan verplaatsen de elektroden en doen een andere test flits te bevestigen dat de elektroden zijn goed geplaatst. - Na de test-flash, toestaan dat het dier te donker passen gedurende 3 minuten in volledige duisternis voor opnames.
- Flitsen van dimmer naar helderder licht intensiteit aanwezig.
- Gemiddelde signalen over herhaalt volgens het signal-to-noise-niveau.
Opmerking: In het algemeen gemiddeld meer signalen op de dimmer lichtniveaus (maar liefst 3 herhalingen) en minder op de helderder lichtniveaus (meestal 1 herhalen). Geleidelijk verlengen het interval tussen prikkel van 10 tot 60 s van het schemerigste aan helderste licht niveau. Een monster-protocol is vermeld in tabel 1. - Na de opnames, humaan doden larven met 0,1% tricaïne.
- Gebruik een interne test-flash (0.06 log cd.s/m2) voor het meten van een reactie van de test van het oog om te beoordelen de positionering van de elektroden.
7. analyse
- Het meten van de amplitude van een golf van basislijn tot de negatieve a-Golf-trog en de b-Golf amplitude van de negatieve a-Golf-trog tot de positieve b-Golf-piek.
- Meet de impliciete tijden van de a - en b-Golf vanaf stimulans begin aan de trog van de a-Golf en het hoogtepunt van de b-Golf, respectievelijk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deze sectie bevat representatieve resultaten voor ERG metingen dagelijks van 4 tot 7 dpf. Vanaf 4 dpf Toon ERG reacties robuuste componenten van de a - en b-Golf, die uit researchdieren en bipolaire cellen, respectievelijk voortvloeien. Op elke leeftijd getest, de amplitude van het b-wave verhoogd met lichte intensiteit (Figuur 2; Figuur 3). Met name de gevoeligheid van het netvlies van de larvale zebrafish aan dimmer flitsen verhoogd met de leeftijd. De a - en b-Golf waren niet herkenbaar bij intensiteiten lager dan-1.61 log cd.s/m2 op 4 dpf, overwegende dat duidelijke signalen waarneembaar bij deze intensiteiten voor oudere larven (Figuur 2). Het b-wave antwoord groeide aanzienlijk tussen 4 en 5 dpf (P < 0,0001; Figuur 2A -B; Figuur 3B). Hoewel het b-wave bij lagere intensiteiten weinig verandering tussen 5 en 7 dpf toonde, het signaal op 2,48 log cd.s/m2 was groter bij 7 dpf vergeleken met 5 en 6 dpf (P < 0,0001; Figuur 2; Figuur 3B). A - en b-wave impliciete keer werd aanzienlijk sneller na 5 dpf (P < 0,0001; Figuur 3 c -D). Deze resultaten tonen over het algemeen rijping van zebravis retinale functie tussen 4 tot en met 7 dpf. Interessant is dat leek de amplitude van een golf te verlagen van 5 tot 7 dpf (figuur 3A). Dit kan zijn omdat de rijping van synaptic verbindingen in de buitenste retina de latentie van bipolaire cellen reacties verkort, wat resulteert in sneller b-golf begin dat de per-Golf maskeert. Degenen die willen studeren het a-golf kunnen gebruikmaken van farmacologische behandeling blok post photoreceptoral Reacties (dat wil zeggen het b-wave onderdeel).
Figuur 1: zebravis G anzfeld ERG opgezet met de kegel-vormig spons-tip elektrode. (A) de kegel-vormig spons uiteinde en de gechloreerde zilveren elektrode zijn lucht gedroogd voordat de bouw van de spons-tip-elektrode. (B-C) De gechloreerde zilver draad wordt vervolgens ingevoegd in de kegel van de spons door de basis te vormen van de volledige elektrode. (D) In de typische larvale zebrafish Ganzfeldexperiment ERG setup, de referentie-elektrode wordt ingevoegd in de spons-platform en de larve van de zebravis wordt gedekt door de Ganzfeldexperiment kom. (E) de spons-tip elektrode raakt zachtjes het centrale hoornvlies oppervlak van de larvale oog. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: representatieve gemiddelde ERG sporen van wild-type larvale zebrafish. Gemiddelde ERG sporen van wildtype zebravis op (A) 4 dpf (n = 8), (B) 5 dpf (n = 8), (C) 6 dpf (n = 7), en (D) 7 dpf (n = 9). Reacties waren ontlokte gebruik flitsers van witte LED's. Op elke leeftijd, tonen de sporen reacties op flitsen van (van beneden naar boven)-2.75,-2.11,-1.61,-0.81, 0,06, 0.72, 1,55, 1.89, 2.18, 2,48 log cd.s/m2. Schaal bar = 50 µV. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: ERG a - en b-wave amplitudes en impliciete tijden voor 4 tot en met 7 dpf zebrafish. (A) groep gemiddelde (± standaardafwijking van het gemiddelde) a-Golf amplitude toegenomen met flash intensiteit, maar daalde met leeftijd in 4 – 7 dpf larven. (B) gemiddelde b-Golf amplitude in 4 – 7 dpf larven verhoogd met flash intensiteit; amplitude groeide tussen 4 en 5 dpf. (C) gemiddelde a-Golf impliciete en (D) gemiddelde b-Golf impliciete tijd werd sneller tussen 5, 6 en 7 dpf. Lijnen van passend zijn afgeleid van niet-lineaire regressie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Stimulans lichtintensiteit (log cd.s.m-2) | Aantal herhalingen | Interval tussen stimulus (s) |
| -2.75 | 3 tot en met 6 | 10 |
| (30 s voor volgende) | ||
| -2.11 | 3 tot en met 6 | 10 |
| (30 s voor volgende) | ||
| -1.61 | 3 tot en met 6 | 10 |
| (30 s voor volgende) | ||
| -0.81 | 3 tot en met 6 | 10 |
| (60 s voor volgende) | ||
| 0,06 | 3 tot en met 6 | 10 |
| (60 s voor volgende) | ||
| 0.72 | 1 tot en met 3 | 60 |
| 1.55 | 1 tot en met 3 | 60 |
| 1.89 | 1 tot en met 3 | 60 |
| 2.18 | 1 tot en met 3 | 60 |
| 2,48 | 1 tot en met 3 | 60 |
Tabel 1: Voorbeeld protocol van ERG opnames. Stimulans presentaties start van het schemerigste (boven) en de vooruitgang te helderder (onder) lichtniveaus, met geleidelijk meer onderlinge stimulans intervallen om ervoor te zorgen dat donkere aanpassing wordt gehandhaafd. Het aantal signalen gemiddeld bij elke intensiteit, hangt af van de signal-to-noise-niveau.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Functionele uitlezingen zoals de ERG zijn steeds belangrijker in de suite van tools gebruikt bij het bestuderen van larvale zebrafish8,,9,,12,14geworden. Als gevolg van de geringe omvang van het larvale zebrafish oog, zijn glas micropipetten aangepast als de opname van elektroden in de meest gepubliceerde protocollen3,4,5,8,9 , 12 , 13 , 14. hier beschrijven we een larvale zebrafish ERG protocol met behulp van een eenvoudiger kegelvormige spons-tip-elektrode. De roman elektrode kan worden gebruikt om kleine-dier ERG standaardsystemen voor het meten van larvale zebrafish retinale functie zonder extra apparatuur te wijzigen. De materialen voor het maken van de spons-tip-elektrode zijn gewoon commerciële PVA spons en 0.3 mm zilver draad, waardoor deze zuiniger dan vorige benaderingen. Een ander voordeel is dat, in tegenstelling tot de harde en scherpe micropipet tip, de zachtere elektrode spons tip minder kans is op schade van het larvale oog. Ten slotte, de PVA spons helpt om vocht tot het larvale oog tijdens de opname.
De sleutel tot succesvolle toepassing van de elektrode spons-tip is om ervoor te zorgen volledige verzadiging van de spons. Dit duurt normaal gesproken niet minder dan 15 minuten van onderdompelen in 1 x goudvis Ringer's buffer. Onvolledige verzadiging van de spons kan verhogen het ruisniveau vanwege sneller drogen van de elektrode. Voor beter signaal collectie, nieuwe elektroden maken voor elke experimentele sessie (over het algemeen < 8 h) wordt sterk aanbevolen. Herhaald gebruik kan leiden tot verminderde ERG signalen, waardoor vergelijkingen tussen sessie moeilijker.
Wanneer positionering van de larvale zebravis op het platform van de spons, moet zorg worden genomen om ervoor te zorgen dat het oog te meten niet in contact met alle omringende oplossing of de papieren handdoek onder de vissen is. Dergelijke contacten broek het elektrische circuit, als de referentie-elektrode is ingesloten in het platform van de spons en de ERG vermindert.
Zelfs met goed verzadigde elektrode spons tips optreedt geleidelijke drogen, die is duidelijk meer ruis in ERG signalen. Moet dit gebeuren, een daling van 1 x goudvis Ringer's op de basis van de kegel met behulp van de 1 mL spuit en een naald 30 G x ½" druppelen. Als u toevoegt dat de oplossing tot aan de vingertop spons reduceert het geluidsniveau niet, Controleer of het oog niet in contact met een omringende vloeistof en zorgen ervoor dat het uiteinde van de elektrode is gecentreerd op het hoornvlies apex.
De opnames in de representatieve resultaten gemeld hier werden gemaakt met een bandfilter instelling van 1 tot 300 Hz, die kan geen bemonstering van oscillerende potentieel (OP) — golven op het b-wave afgeleid van de derde-orde retinale neuronen met inbegrip van amacrine en de ganglion cellen 15,16,17. Een hogere instelling voor lage frequentie doorlaten (bijvoorbeeld 500 of 1000 Hz) mogelijk beter geschikt voor opname OP zijn.
Kortom helpt de kegel-vormig spons-tip-elektrode te vereenvoudigen larvale zebrafish ERG opname met bestaande kleine-dier ERG systemen, betrouwbare resultaten leveren. Representatieve resultaten tonen aan dat ERG amplitude tussen 4 en 5 dpf, met verdere rijping groeit tussen 5 en 7 dpf manifesteren als sneller impliciete tijden. Onze eenvoudige ERG protocol met de economische en praktische kegelvormige spons-tip-elektrode profiteert onderzoekers bestuderen zebrafish retinale functie. De techniek kan ook worden aangepast om te kunnen beoordelen van volwassen zebrafish of andere gewervelde modellen met kleine ogen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen informatieverschaffing die relevant zijn voor dit werk.
Acknowledgments
Financiering voor dit project werd verstrekt door een subsidie van het Instituut van de neurowetenschappen Melbourne (aan PTG, PRJ & BVB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm filter | Millex GP | SLGP033RS | Filters the 10× goldfish ringer's buffer for sterilizatio |
| 1 mL syringe | Terumo | DVR-5175 | With a 30G × ½" needle to add drops of saline to the electrode sponge tip to prevent drying and increased noisein the ERG signals. |
| 30 G × ½" needle | Terumo | NN*3013R | For adding saline toteh sopnge tip electrode. |
| Bioamplifier | ADInstruments | ML135 | For amplifying ERG signals. |
| Bleach solution | King White | 9333441000973 | For an alternative method of sliver electrode chlorination. Active ingredient: 42 g/L sodium hypochlorite. |
| Circulation water bath | Lauda-Ko?nigshoffen | MGW Lauda | Used to make the water-heated platfrom. |
| Electrode lead | Grass Telefactor | F-E2-30 | Platinum cables for connecting silver wire electrodes to the amplifier. |
| Faraday Cage | Photometric Solution International | For maintianing dark adaptation and enclosing the Ganzfeld setup to improve signal-to-noise ratio. | |
| Ganzfeld Bowl | Photometric Solution International | Custom designed light stimulator: 36 mm diameter, 13 cm aperture size. | |
| Luxeon LEDs | Phillips Light Co. | For light stimulation twenty 5W and one 1W LEDs. | |
| Micromanipulator | Harvard Apparatus | BS4 50-2625 | Holds the recording electrode during experiments. |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | version 2010 | Spreadsheet software for data analysis. |
| Moisturizing eye gel | GenTeal Gel | 9319099315560 | Used to cover zebrafish larvae during recordings to avoiding dehydration. Active ingredient: 0.3 % Hypromellose and 0.22 % carbomer 980. |
| Pasteur pipette | Copan | 200C | Used to caredully transfer larval zebrafish. |
| Powerlab data acquisition system | ADInstruments | ML785 | Controls the LEDs to generate stimuli. |
| PVA sponge | MeiCheLe | R-1675 | For the placement of larval zebrafish and making the cone-shaped electrode ti |
| Saline solution | Aaxis Pacific | 13317002 | For electroplating silver wire electrode. |
| Scope Software | ADInstruments | version 3.7.6 | Simultaneously triggers the stimulus through the Powerlab system and collects data |
| Silver (fine round wire) | A&E metal | 0.3 mm | Used to make recording and reference ERG electrodes. |
| Stereo microscope | Leica | M80 | Used to shape and measure the cone-shaped sponge apex (with scale bar on eyepiece). Positioned in the Faraday cage for electrode placement. |
| Tricaine | Sigma-aldrich | E10521-50G | For anaethetizing larval zebrafish. |
| Water-heated platform | custom-made | For maintianing the temperature of the sponge platform and the larval body during ERG recordings |
References
- Roper, C., Tanguay, R. L. Handbook of Developmental Neurotoxicology (Second Edition). Slikker, W., Paule, M. G., Wang, C. , Academic Press. 143-151 (2018).
- Nguyen, C. T., et al. Simultaneous Recording of Electroretinography and Visual Evoked Potentials in Anesthetized Rats. Journal of visualized experiments: JoVE. , e54158 (2016).
- Chrispell, J. D., Rebrik, T. I., Weiss, E. R. Electroretinogram analysis of the visual response in zebrafish larvae. Journal of visualized expriment: JoVE. (97), (2015).
- Seeliger, M. W., Rilk, A., Neuhauss, S. C. Ganzfeld ERG in zebrafish larvae. Documenta Ophthalmologica. 104 (1), 57-68 (2002).
- Fleisch, V. C., Jametti, T., Neuhauss, S. C. Electroretinogram (ERG) Measurements in Larval Zebrafish. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, pdb prot4973 (2008).
- Biehlmaier, O., Neuhauss, S. C., Kohler, K. Synaptic plasticity and functionality at the cone terminal of the developing zebrafish retina. Developmental Neurobiololgy. 56 (3), 222-236 (2003).
- Gestri, G., Link, B. A., Neuhauss, S. C. The visual system of zebrafish and its use to model human ocular diseases. Developmental Neurobiololgy. 72 (3), 302-327 (2012).
- Saszik, S., Bilotta, J., Givin, C. M. ERG assessment of zebrafish retinal development. Visual Neuroscience. 16 (5), 881-888 (1999).
- Niklaus, S., et al. Cocaine accumulation in zebrafish eyes leads to augmented amplitudes in the electroretinogram. Matters. 3 (6), e201703000003 (2017).
- Tanvir, Z., Nelson, R. F., DeCicco-Skinner, K., Connaughton, V. P. One month of hyperglycemia alters spectral responses of the zebrafish photopic ERG. Disease models & mechanisms. , dmm. 035220 (2018).
- Kakiuchi, D., et al. Oscillatory potentials in electroretinogram as an early marker of visual abnormalities in vitamin A deficiency. Molecular medicine reports. 11 (2), 995-1003 (2015).
- Emran, F., Rihel, J., Adolph, A. R., Dowling, J. E. Zebrafish larvae lose vision at night. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2010).
- Makhankov, Y. V., Rinner, O., Neuhauss, S. C. An inexpensive device for non-invasive electroretinography in small aquatic vertebrates. Journal of Neuroscience Methods. 135 (1-2), 205-210 (2004).
- Bilotta, J., Saszik, S., Sutherland, S. E. Rod contributions to the electroretinogram of the dark-adapted developing zebrafish. Developmental Dynamics. 222 (4), 564-570 (2001).
- Cameron, M. A., Barnard, A. R., Lucas, R. J. The electroretinogram as a method for studying circadian rhythms in the mammalian retina. Journal of genetics. 87 (5), 459-466 (2008).
- Bui, B. V., Armitage, J. A., Vingrys, A. J. Extraction and modelling of oscillatory potentials. Documenta Ophthalmologica. 104 (1), 17-36 (2002).
- Bui, B. V., Fortune, B. Ganglion cell contributions to the rat full-field electroretinogram. The Journal of Physiology. 555 (1), 153-173 (2004).
