Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Electroretinogram inspelning i Larval Zebrafiskar använder A roman konformade Sponge-tip elektrod

doi: 10.3791/59487 Published: March 27, 2019

Summary

Här presenterar vi ett protokoll som förenklar mätning av ljus evoked electroretinogram svar från larval Zebrafiskar. En roman konformade sponge-tip elektrod kan bidra till att göra studier av visuell utveckling i larval Zebrafiskar använder electroretinogram ERG lättare att uppnå med tillförlitliga resultat och lägre kostnader.

Abstract

Zebrafiskar (Danio rerio) används ofta som ryggradsdjur modell i utvecklande studier och är särskilt lämplig för visuell neurovetenskap. För funktionella mätningar av visuell prestanda är elektroretinografi (ERG) en idealisk icke-invasiv metod, som har varit väl etablerat i högre ryggradsdjur. Detta tillvägagångssätt används allt oftare för att undersöka funktionen Visuell i Zebrafiskar, inklusive under de tidiga utvecklingsstadierna larver. Den vanligaste inspelning elektroden för larval Zebrafiskar ERG hittills är dock glas mikropipett elektroden, som kräver specialutrustning för dess tillverkning, presentera en utmaning för laboratorier med begränsade resurser. Här presenterar vi en larval Zebrafiskar ERG-protokollet använder en konformad sponge-tip elektrod. Romanen elektroden är lättare att tillverkning och handtag, mer ekonomisk, och mindre benägna att skada larval ögat än glas mikropipett. Som tidigare publicerade ERG metoder, kan det nuvarande protokollet bedöma yttre näthinnans funktion genom ljusmätare och bipolär cell svaren, a - och b-vågen, respektive. Protokollet kan tydligt illustrera förfining av visuell funktion under hela den tidiga utvecklingen av zebrafisk larver, stödja den nytta, känslighet och tillförlitlighet av romanen elektroden. Förenklade elektroden är särskilt användbart när om inrättande av ett nytt system för ERG eller ändra befintliga små-djur ERG apparater för Zebrafiskar mätning, medhjälp forskare i de visuella neurovetenskaperna att använda Zebrafiskar modellerar organism.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Zebrafiskar (Danio rerio) har blivit en allmänt använd genetiska ryggradsdjur modell, inklusive studier av de visuella neurovetenskaperna. Den ökande populariteten av denna art kan tillskrivas fördelar inklusive användarvänlighet genmanipulation, mycket ryggradsdjur visuella systemet (neuron typer, anatomiska morfologi och organisation och underliggande genetik), hög fruktsamhet och lägre kostnader för djurhållning jämfört med däggdjur modeller1. Den icke-invasiva electroretinogram (ERG) har länge använts kliniskt bedöma mänskliga synfunktion, och i inställningen laboratorium för att kvantifiera vision i en rad stora och små arter, inklusive gnagare och larver Zebrafiskar2,3 , 4 , 5. de vanligaste analyserade ERG-komponenterna är en våg och b-våg, med ursprung från ljus-sensing fotoreceptorer och bipolär interneuroner, respektive. I larval Zebrafiskar, distinkta lager i näthinnan bildas av 3 dagar efter befruktning (dpf) och morfologi av ljusmätare konen terminal synapses mogna innan 4 dpf6,7. Yttre näthinnans funktion av larval Zebrafiskar är således fastställas förrän 4 dpf, vilket innebär att ERG är mätbara från denna tidiga ålder och framåt. På grund av den korta experimentella cykeln och egenskaperna hög genomströmning av modellen, har ERG tillämpats larval Zebrafiskar för funktionell bedömning av sjukdomsmodeller, analysera färg vision och retinal utveckling, studera visuella dygnsrytm och testa droger8,9,10,11,12.

Men nuvarande metoder för larval Zebrafiskar ERG har några komplexitet som kan göra det svårare att anta. Publicerade larval Zebrafiskar ERG protokoll använder ofta en glas mikropipett fylld med elektriskt ledande vätska som den inspelning elektroden3,4,5,13, vilket kräver en hög kvalitet mikropipett Tips3. Specialutrustning, såsom en mikropipett avdragare och i vissa fall en microforge, som krävs för deras tillverkning. Detta kan vara en utmaning för laboratorier med begränsade resurser och leder till extra kostnader även när anpassning finns små djur ERG system för mätning av larval Zebrafiskar visuell funktion. Även när utjämnad, kan skarpa mikropipett spetsen skada ytan av larval ögat. Dessutom är kommersiella mikropipett hållare för elektrofysiologi konstruerade med en fast silver tråd. Dessa fasta ledningar bli passiviseras efter upprepad användning, som kräver inköp av ny innehavare leder till ökade underhållskostnader.

Här beskriver vi en ERG metod med en konformad sponge-tip inspelning elektrod, som är särskilt användbart för att anpassa etablerade små-djur ERG uppställningar för larval Zebrafiskar ERG mätningar. Elektroden görs enkelt med hjälp av gemensamma polyvinylacetat (PVA) svamp och fina silver tråd utan annan specialiserad utrustning. Våra data visar att denna roman elektrod är känsliga och tillräckligt tillförlitlig för att påvisa funktionell utveckling av retinal neurala kretsar i larval Zebrafiskar mellan 4 och 7 dpf. Denna ekonomiska och praktiska sponge-tip elektroden kan vara användbar för forskare att inrätta nya system för ERG eller ändra befintliga system för små djur, för Zebrafiskar studier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alla electroretinogram (ERG) förfaranden utfördes enligt bestämmelserna i den australiensiska nationella hälso- och medicinska forskningsrådet uppförandekoden för vård och användning av djur och godkändes av utskottet för institutionella djuretik på den University of Melbourne.

1. buffert förberedelse

  1. Förbereda 10 x guldfisk Ringers buffert (1,25 M NaCl, 26 mM KCl, 25 mm CaCl2, 10 mM MgCl2, 100 mM glukos, 100 mM HEPES) använder omvänd osmos (RO). Justera bufferten till pH 7,8 och sterilisera det buffert med 0,22 μm filter. Lagra 10 x bufferten vid 4 ° C som lösning lager3.
    Obs: 10 x Ringers buffert ska användas inom 3 månader.
  2. På dagen för experimentet, göra 1 x guldfisk Ringers buffert genom att späda 10 x guldfisk Ringers buffert med omvänd osmos.
    Obs: 1 x guldfisk Ringers buffert används för att mätta PVA svampen, inklusive svampen används för placering av larval Zebrafiskar, och svampen på inspelning elektrod spets.

2. elektrod förberedelse

  1. Förbereda konformade svamp inspelning elektroden.
    1. Skär den manliga slutet från tillägget platina elektrod bly och ta bort från slutet 10 mm av den yttre polytetrafluoreten isolering beläggning med hjälp av en skalpell blad. Ta hand inte kommer för att skada den inre tråden av elektrod bly.
    2. Skär en 40 mm längd av silvertråd (0,3 mm diameter) och säkert koppla detta till elektrod bly genom entwining i silvertråd med exponerade inre tråd. Innesluta det gemensamma använda isoleringstejp, lämnar en ~ 15 mm längd av silvertråd utsatt (figur 1A).
    3. Elektroplätera den exponerade silvertråd med klorid med hjälp av en 9 V DC-källa för 60 s för att förbättra signal överledning. Fördjupa den exponerade silverfärgade spetsen i fysiologisk koksaltlösning och Anslut den andra ändan till den positiva Polen på batteriet. Anslut en annan ledningen till den negativa terminalen av batteriet och fördjupa den andra änden av kabeln in i saltlösning2.
      Obs: Alternativt, KLORERA silver tråd genom att blötlägga det i 1 timme i en blekmedel lösning (aktiva ingrediensen 42 g/L natriumhypoklorit).
    4. Skär en ~ 20 x 20 mm torget av PVA svamp med sax för att göra en kon (figur 1A). Mätta svampen använder 1 x Ringers buffert. Under ett Mikroskop med en skala bar på okularet, använda en skalpell blad för att forma spetsen av könen till ~ 40 µm diameter. Luften torr konformade svampen på absorberande papper vävnad tills det är fast.
      Obs: PVA svampen expanderar kraftigt när mättat, därför är det viktigt att svampen först är mättad med koksaltlösning innan forma spetsen av konen.
    5. Efter chloriding torr luft silver tråd på ett läskpapper för 5 min. skär den silver tråden i torkade, fasta, konformad PVA svampen genom basen av konen. Isolera eventuella överskott exponerad metall med mask tejp för att minska solceller artefakter (Figur 1B-C).
      Obs: Efter varje experimentella session, ta bort svampen från silver tråd. Tvätta svampen använder omvänd osmos vatten och lufttorka för återanvändning. För att säkerställa optimal signal collection, rekommenderas enda silvertråd. PVA svampar bör inte återanvändas mer än 5 gånger.
    6. På dagen för experimentet, fördjupa svamp-spetsen av inspelningen elektroden i 1 x Ringers buffert för minst 15 min till helt mätta svampen.
  2. Förbereda referenselektroder som beskrivs ovan, men utan att bifoga svamp spetsen.
  3. Få marken elektroden kommersiellt.

3. Zebrafiskar förberedelse

  1. Mörka anpassa Zebrafiskar larver under natten (> 8 h) före inspelningar genom att placera Zebrafiskar i en 15 mL tub (< 20 larver per rör) insvept i aluminiumfolie i en mörk inkubator. Ta bort locket för att säkerställa tillräcklig syretillförsel.
  2. På dagen för inspelning, dra åt locket till inslagen i folie falcon röret som innehåller larver och se till att röret är ljus-bevis. Transportera larver till ERG lab.
  3. Häll fisk i petriskålar i mörkret med hjälp av dim röd belysning från en lysdiod (LED; 17,4 cd.m-2, λmax 600 nm). Täcka petriskålar med ljus-bevis handdukar för att minimera ljusexponering.

4. svamp plattform förberedelse

  1. Skär en rektangel av torr PVA svamp att passa tätt i en 35 mm petriskål. Säkerställa att tjockleken på svampen bör vara ungefär lika med djupet av petriskål.
  2. Gör ett litet snitt lodrätt igenom ena änden av svampen att rymma silver tråd av referenselektroden.
  3. Blöta PVA svampen i 1 x guldfisk Ringers buffert tills mättat. Sedan placera svampen i en ren 35-mm petriskål. Använda hushållspapper för att absorbera extra vätska tills ingen lösning utstrålar från svampen i svar på en ljus finger tryck.

5. djur och elektrod placering

  1. Söva larverna med 0,02% tricaine utspädd 1 x guldfisk Ringers buffert.
  2. Använd en 3 mL Pasteur-pipett för att överföra en sövda larv till en ruta av pappershandduk (~ 3 cm2).
  3. Lägg hushållspapper som innehåller larven på fuktig svamp-plattformen med hjälp av tången. Använd en fin borste indränkt i Ringers buffert för att justera positionen för larven. Se till att ena ögat är vänd uppåt, isolerade från någon närliggande vätska på torget av pappershandduk under larv.
  4. Glasyr larval kroppen, utom huvudet, med återfuktande Ögongel att hålla larven fuktig hela ERG inspelningen.
  5. Placera petriskål med svamp plattform på en liten vatten-uppvärmda plattform framför den Ganzfeld skål ljus stimulans ligger inuti en Faradays bur (figur 1 d).
    Obs: Underhåll av svampen och larver kroppen temperatur garanterar stabil ERG signaler.
  6. Referenselektroden in nedskärningen i plattform svampen (figur 1 d).
  7. Anslut den kommersiellt erhållna marken elektroden till Faraday bur.
  8. Tillmäter en elektrodhållare inspelning elektroden och säkra innehavaren att stereotaxic armen av en micromanipulator (figur 1 d). Använd en 3 mL Pasteur-pipett för att droppa en droppe av 1 x Ringers lösning på svamp spetsen av elektroden för förnyad mättnad.
  9. Placera mikroskopet i Faradays bur ERG plattformen för placering av elektrod.
    Obs: Belysning bör tillhandahållas av en dim röd lysdiod (17,4 cd.m-2, λmax 600 nm) att tillåta granskning av larven och placering av aktiva elektroden, samtidigt som dark-adaptation.
  10. Justera positionen för svamp plattformen att tillåta granskning av larven under mikroskopet. Använd sedan läskpapper för att ta bort överflödig vätska från elektroden svamp spets.
  11. Placera den aktiva elektroden så att den vidrör försiktigt den centrala hornhinnans yta av larval Zebrafiskar ögat (figur 1E).
  12. Flytta Ganzfeld skålen mot svamp plattformen och säkerställa att larven är täckt av skålen.
  13. Stäng Faradays bur för att minska störande elektromagnetiska ljud.

6. Electroretinogram inspelning

  1. Använd datorprogrammet av viss ERG systemet (se tabell av material för detaljer) att utlösa stimulansen och förvärva data baserat på de inställningar som rekommenderas nedan2.
    1. Ställ in samplingsfrekvens för systemet till 4 KHz över en 650 ms inspelning fönster (2 560 punkter) i programvaran förvärvet.
    2. Ställa in förstärkning av systemet till 1000 ×.
    3. Ange band-passera filtrering av systemet till 1 – 300 Hz.
    4. Använda en notch-filter för att minska 60 Hz (eller 50 Hz, beroende på lokala allmännyttiga frekvens) buller.
      Obs: Den idealiska ljudnivån bör inte vara mer än ±10 µV.
  2. Inleda insamling av data med hjälp av proceduren som beskrivs nedan.
    1. Använda en enda test-blixt (0,06 log cd.s/m2) för att mäta ett test svar från ögat att bedöma placering av elektroder.
      Obs: Denna intensitet av test flash bör resultera i en b-våg amplitud större än 25 µV i 4-dpf larver. Om en robust svar inte kan mätas, sedan placera elektroderna och göra en annan testa flash för att bekräfta att elektroderna är väl positionerade.
    2. Efter test-blixten, tillåter djuret att mörka anpassa för 3 min i mörker innan inspelningar.
    3. Presentera blixtar från dimmer till ljusare ljus intensitet.
    4. Genomsnittliga signaler över upprepas enligt den signal-brus-nivån.
      Obs: Generellt, i genomsnitt fler signaler på dimmer ljus nivåer (inte mindre än 3 repetitioner) och färre på de ljusare Ljusnivåerna (vanligtvis 1 upprepa). Gradvis förlänga intervallet mellan stimulans från 10 till 60 s från dämpad till ljusaste ljusnivån. Ett prov protokoll visas i tabell 1.
    5. Efter inspelningarna, humant döda larver med 0,1% tricaine.

7. analys

  1. Mäta en-wave amplituden från baslinjen till det negativa a-wave tråget och b-våg amplituden från negativa a-wave tråg till positiva b-våg peak.
  2. Mäta implicita gånger för a - och b-våg från stimulans uppkomst att dalvärdet av a-vågen och toppen av b-vågen, respektive.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Detta avsnitt ger representativa resultat för ERG mätningar tas dagligen från 4 till 7 dpf. Från 4 dpf visar ERG Svaren robust a - och b-wave-komponenter, som uppstår från fotoreceptorer och bipolära celler, respektive. Vid varje ålder testade, amplituden av b-vågen ökat med ljusintensitet (figur 2; Figur 3). Särskilt, känslighet larval Zebrafiskar näthinnan till dimmer blinkar ökade med åldern. Den a - och b-vågen var inte igenkännliga stödnivåer lägre än-1.61 logga cd.s/m2 på 4 dpf, medan tydliga signaler var detekterbar dessa stödnivåer för äldre larver (figur 2). B-våg svaret ökade avsevärt mellan 4 och 5 dpf (P < 0,0001, Figur 2A -B; Figur 3B). Även om b-vågen vid lägre intensitet visade små förändringar mellan 5 och 7 dpf, signalen på 2.48 log cd.s/m2 var större på 7 dpf jämfört med 5 och 6 dpf (P < 0,0001, Figur 2; Figur 3B). A - och b-wave implicita gånger blev betydligt snabbare efter 5 dpf (P < 0,0001, Figur 3 c -D). Sammantaget visar dessa resultaten mognaden av zebrafisk näthinnans funktion mellan 4 till 7 dpf. Intressant, verkade en-wave amplituden minska från 5 till 7 dpf (figur 3A). Det kan bero att mognaden av synapsförbindelser i yttre näthinnan förkortar svarstiden för bipolära celler svaren, vilket resulterar i snabbare b-våg debut som döljer en-vågen. Den som vill studera en-vågen kan anställa farmakologisk behandling till block efter photoreceptoral reaktioner (dvs komponenten b-våg).

Figure 1
Figur 1: Zebrafiskar G anzfeld ERG som inrättats med konformad sponge-tip elektroden. (A), konformad svampen spets och klorerade silverelektroden är lufttorkad innan konstruera sponge-tip elektroden. (B-C) Därefter sätts de klorerade silvertråd in svamp konen genom basen att bilda kompletta elektroden. (D) i den typiska larval Zebrafiskar Ganzfeld ERG setup, referenselektroden sätts in svamp plattformen och Zebrafiskar larven täcks av Ganzfeld skålen. (E), svamp-spetsen elektroden vidrör försiktigt den centrala hornhinnans yta av larval ögat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: representativt genomsnitt ERG spår av vildtyp larval Zebrafiskar. Genomsnittlig ERG spår av vildtyp zebrafisk vid (A), 4 dpf (n = 8), (B), 5 dpf (n = 8), (C), 6 dpf (n = 7), och (D), 7 dpf (n = 9). Svaren var framkallade använder blinkar från vita lysdioder. Vid varje ålder, spår visar Svaren till ljusblixtar (från botten till toppen)-2.75,-2.11,-1.61, -0,81, 0,06, 0,72, 1,55, 1,89, 2,18, 2.48 logga cd.s/m2. Skalstapeln = 50 µV. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: ERG a - och b-wave amplituder och implicita tider för 4 till 7 dpf Zebrafiskar. (A) grupp genomsnittet (± standardavvikelsen för medelvärdet) a-våg amplitud ökat med blixtintensitet men minskat med ålder i 4 – 7 dpf larver. (B) genomsnittliga b-våg amplitud i 4 – 7 dpf larver ökade med blixtintensitet; amplitud växte mellan 4 och 5 dpf. (C) genomsnittliga a-wave implicita och (D) genomsnittliga b-våg implicita tid blev snabbare mellan 5, 6 och 7 dpf. Linjer för bästa passform härleds från icke-linjär regression. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Stimulus ljusintensitet (log cd.s.m-2) Antal repetitioner Intervallet mellan stimulus (s)
-2.75 3 till 6 10
(30 s innan nästa)
-2.11 3 till 6 10
(30 s innan nästa)
-1.61 3 till 6 10
(30 s innan nästa)
-0,81 3 till 6 10
(60 s innan nästa)
0,06 3 till 6 10
(60 s innan nästa)
0,72 1 till 3 60
1,55 1 till 3 60
1,89 1 till 3 60
2.18 1 till 3 60
2.48 1 till 3 60

Tabell 1: Exempel protokollet av ERG inspelningar. Stimulus presentationer börja från dämpad (överst) och framsteg ljusare (nederst) ljusnivåer, med gradvis längre mellan stimulus mellanrum för att säkerställa att mörka adaption upprätthålls. Antalet signaler i genomsnitt varje intensitet beror på signal-brus-nivå.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Funktionsavläsningar såsom ERG har blivit allt viktigare i sviten av verktyg som används för att studera larval Zebrafiskar8,9,12,14. På grund av den lilla storleken av larval Zebrafiskar ögat har glas Mikropipetter anpassats som spelar in elektroder i mest publicerade protokoll3,4,5,8,9 , 12 , 13 , 14. här beskriver vi ett larval Zebrafiskar ERG-protokollet använder en enklare konformade sponge-tip-elektrod. Romanen elektroden kan användas för att ändra standard small-animal ERG system för att mäta larval Zebrafiskar näthinnans funktion utan någon ytterligare utrustning. Material för att göra sponge-tip elektroden är helt enkelt kommersiella PVA svamp och 0,3 mm silver tråd, vilket gör detta mer ekonomiskt än tidigare metoder. En annan fördel är att, i motsats till hårda och vassa mikropipett tipset, skonsammare elektrod svamp spets är mindre benägna att skada larval ögat. Slutligen, PVA svampen hjälper till att bibehålla fukt för larval ögat hela inspelningen.

Nyckeln till framgångsrik tillämpning av sponge-tip elektroden är att säkerställa full mättnad av svampen. Detta tar normalt inte mindre än 15 minuter av blötläggning 1 x guldfisk Ringers buffert. Ofullständig mättnad av svampen kan öka ljudnivån på grund av snabbare torkning av elektroden. För bättre signal collection, att göra nya elektroder för varje experimentella session (allmänt < 8 h) rekommenderas varmt. Upprepad användning kan leda till minskad ERG signaler, försvårar jämförelser mellan session.

När positionering den larval Zebrafiskar på svamp plattformen, måste försiktighet iakttas så att ögat skall mätas inte är i kontakt med någon omgivande lösning eller hushållspapper under fisken. Sådan kontakt shorts den elektriska kretsen, eftersom referenselektroden är inbäddad i svamp-plattformen och minskar ERG.

Även med väl mättade elektrod svamp tips uppstår gradvis torkning, vilket är uppenbart som ökat buller i ERG signaler. Skulle detta inträffa, droppa en droppe av 1 x guldfisk-laktat på basen av konen med 1 mL spruta och injektionsnål 30 G x ½ ”. Om lägger till lösningen på svamp spetsen inte minskar ljudnivån, kontrollera att ögat inte är i kontakt med en omgivande vätska och att elektroden spetsen är centrerad på hornhinnans apex.

Inspelningarna i de representativa resultat redovisas här gjordes med en bandpass inställning 1 – 300 Hz, som inte medger provtagning av oscillerande potentialer (OP) — wavelets på b-vågen härrör från den tredje ordningens retinala nervceller inklusive amakrina och ganglion celler 15,16,17. En högre lowpass inställning (t.ex. 500 eller 1 000 Hz) kan vara bättre lämpad för OP inspelning.

Sammanfattningsvis, konformad sponge-tip elektroden hjälper till att förenkla larval Zebrafiskar ERG inspelning med befintliga små-animal ERG system, som ger tillförlitliga resultat. Representativa resultat visar att ERG amplituden växer mellan 4 och 5 dpf, med vidare mognad mellan 5 och 7 dpf manifesterar sig som snabbare implicita gånger. Vår enkla ERG protokoll med ekonomisk och praktisk konformade sponge-tip elektroden kan gynna utredarna studera Zebrafiskar näthinnans funktion. Tekniken kan också anpassas för att bedöma vuxna Zebrafiskar eller andra ryggradsdjur modeller med små ögon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga upplysningar som är relevanta för detta arbete.

Acknowledgments

Finansiering för projektet tillhandahölls av ett bidrag från Melbourne neurovetenskap Institute (till PTG, PRJ & BVBEN).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm filter Millex GP SLGP033RS Filters the 10× goldfish ringer's buffer for sterilizatio
1 mL syringe Terumo DVR-5175 With a 30G × ½" needle to add drops of saline to the electrode sponge tip to prevent drying and increased noisein the ERG signals.
30 G × ½" needle Terumo NN*3013R For adding saline toteh sopnge tip electrode.
Bioamplifier ADInstruments ML135 For amplifying ERG signals.
Bleach solution  King White 9333441000973 For an alternative method of sliver electrode chlorination. Active ingredient: 42 g/L sodium hypochlorite.
Circulation water bath Lauda-Ko?nigshoffen MGW Lauda Used to make the water-heated platfrom.
Electrode lead Grass Telefactor F-E2-30 Platinum cables for connecting silver wire electrodes to the amplifier.
Faraday Cage Photometric Solution International  For maintianing dark adaptation and enclosing the Ganzfeld setup to improve signal-to-noise ratio.
Ganzfeld Bowl Photometric Solution International  Custom designed light stimulator: 36 mm diameter, 13 cm aperture size.
Luxeon LEDs Phillips Light Co. For light stimulation twenty 5W and one 1W LEDs.
Micromanipulator Harvard Apparatus BS4 50-2625 Holds the recording electrode during experiments.
Microsoft Office Excel Microsoft version 2010 Spreadsheet software for data analysis.
Moisturizing eye gel GenTeal Gel 9319099315560 Used to cover zebrafish larvae during recordings to avoiding dehydration. Active ingredient: 0.3 % Hypromellose and 0.22 % carbomer 980.
Pasteur pipette Copan 200C Used to caredully transfer larval zebrafish.
Powerlab data acquisition system ADInstruments ML785 Controls the LEDs to generate stimuli.
PVA sponge MeiCheLe R-1675 For the placement of larval zebrafish and making the cone-shaped electrode ti
Saline solution Aaxis Pacific 13317002 For electroplating silver wire electrode.
Scope Software ADInstruments version 3.7.6 Simultaneously triggers the stimulus through the Powerlab system and collects data
Silver (fine round wire) A&E metal 0.3 mm Used to make recording and reference ERG electrodes.
Stereo microscope  Leica M80 Used to shape and measure the cone-shaped sponge apex (with scale bar on eyepiece). Positioned in the Faraday cage for electrode placement.
Tricaine  Sigma-aldrich E10521-50G For anaethetizing larval zebrafish.
Water-heated platform custom-made For maintianing the temperature of the sponge platform and the larval body during ERG recordings

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Roper, C., Tanguay, R. L. Handbook of Developmental Neurotoxicology (Second Edition). Slikker, W., Paule, M. G., Wang, C. Academic Press. 143-151 (2018).
  2. Nguyen, C. T., et al. Simultaneous Recording of Electroretinography and Visual Evoked Potentials in Anesthetized Rats. Journal of visualized experiments: JoVE. e54158 (2016).
  3. Chrispell, J. D., Rebrik, T. I., Weiss, E. R. Electroretinogram analysis of the visual response in zebrafish larvae. Journal of visualized expriment: JoVE. (97), (2015).
  4. Seeliger, M. W., Rilk, A., Neuhauss, S. C. Ganzfeld ERG in zebrafish larvae. Documenta Ophthalmologica. 104, (1), 57-68 (2002).
  5. Fleisch, V. C., Jametti, T., Neuhauss, S. C. Electroretinogram (ERG) Measurements in Larval Zebrafish. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, pdb prot4973 (2008).
  6. Biehlmaier, O., Neuhauss, S. C., Kohler, K. Synaptic plasticity and functionality at the cone terminal of the developing zebrafish retina. Developmental Neurobiololgy. 56, (3), 222-236 (2003).
  7. Gestri, G., Link, B. A., Neuhauss, S. C. The visual system of zebrafish and its use to model human ocular diseases. Developmental Neurobiololgy. 72, (3), 302-327 (2012).
  8. Saszik, S., Bilotta, J., Givin, C. M. ERG assessment of zebrafish retinal development. Visual Neuroscience. 16, (5), 881-888 (1999).
  9. Niklaus, S., et al. Cocaine accumulation in zebrafish eyes leads to augmented amplitudes in the electroretinogram. Matters. 3, (6), e201703000003 (2017).
  10. Tanvir, Z., Nelson, R. F., DeCicco-Skinner, K., Connaughton, V. P. One month of hyperglycemia alters spectral responses of the zebrafish photopic ERG. Disease models & mechanisms. dmm. 035220 (2018).
  11. Kakiuchi, D., et al. Oscillatory potentials in electroretinogram as an early marker of visual abnormalities in vitamin A deficiency. Molecular medicine reports. 11, (2), 995-1003 (2015).
  12. Emran, F., Rihel, J., Adolph, A. R., Dowling, J. E. Zebrafish larvae lose vision at night. Proceedings of the National Academy of Sciences. (2010).
  13. Makhankov, Y. V., Rinner, O., Neuhauss, S. C. An inexpensive device for non-invasive electroretinography in small aquatic vertebrates. Journal of Neuroscience Methods. 135, (1-2), 205-210 (2004).
  14. Bilotta, J., Saszik, S., Sutherland, S. E. Rod contributions to the electroretinogram of the dark-adapted developing zebrafish. Developmental Dynamics. 222, (4), 564-570 (2001).
  15. Cameron, M. A., Barnard, A. R., Lucas, R. J. The electroretinogram as a method for studying circadian rhythms in the mammalian retina. Journal of genetics. 87, (5), 459-466 (2008).
  16. Bui, B. V., Armitage, J. A., Vingrys, A. J. Extraction and modelling of oscillatory potentials. Documenta Ophthalmologica. 104, (1), 17-36 (2002).
  17. Bui, B. V., Fortune, B. Ganglion cell contributions to the rat full-field electroretinogram. The Journal of Physiology. 555, (1), 153-173 (2004).
Electroretinogram inspelning i Larval Zebrafiskar använder A roman konformade Sponge-tip elektrod
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xie, J., Jusuf, P. R., Goodbourn, P. T., Bui, B. V. Electroretinogram Recording in Larval Zebrafish using A Novel Cone-Shaped Sponge-tip Electrode. J. Vis. Exp. (145), e59487, doi:10.3791/59487 (2019).More

Xie, J., Jusuf, P. R., Goodbourn, P. T., Bui, B. V. Electroretinogram Recording in Larval Zebrafish using A Novel Cone-Shaped Sponge-tip Electrode. J. Vis. Exp. (145), e59487, doi:10.3791/59487 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter