Summary
提出了一种新的样品制备方法, 以适应细胞和组织共培养, 以检测小分子交换使用成像质谱。
Abstract
成像质谱 (IMS) 通常应用于三种类型的样品: 组织切片、球体和微生物菌落。使用矩阵辅助激光分离/飞行时质谱 (ALDI-TOF MS) 对这些样本类型进行了分析, 以可视化蛋白质、脂质和代谢物在感兴趣的生物样品中的分布。我们开发了一种新的样品制备方法, 该方法结合了前三个应用的优势, 通过将哺乳动物细胞培养播种成琼脂糖, 解决了一种未被充分探索的方法, 用于识别癌症中的化学通信。与健康组织一起共培养, 然后对样品进行干燥处理。哺乳动物组织和细胞在近距离被培养, 允许通过组织和细胞之间的扩散进行化学交流。在特定的时间点, 琼脂样品的干燥方式与为 IMS 分析准备的微生物菌落相同。我们的方法是建立模型的沟通之间的高水平浆液卵巢癌从输卵管, 因为它与卵巢在转移过程中的相互作用。样品制备的优化导致去甲肾上腺素作为卵巢微环境中的关键化学成分的鉴定。这种新开发的方法可以应用于其他生物系统, 这些系统需要了解相邻细胞或组织之间的化学通信。
Introduction
成像质谱 (ims) 经过优化, 可在组织切片、球体和微生物菌落 1、2、3三中表征分子特征的空间分布。组织切片可用于评估代谢物在宿主生物条件下的定位, 无论是有针对性的还是在特定的质量范围内的非目标。然而, 当一个健康的组织与疾病, 例如肿瘤相比时, 分子特征之间的差异是最显著和最明显的。这种 IMS 方法特别适用于检测疾病生物标志物, 然而, 在疾病进展的离散阶段 (如肿瘤等级) 获取组织样本, 排除了对启动疾病的重要性信号的识别。疾病。通过空间交换信息是许多生物系统普遍存在的特征, 组织切片无法捕获这种动态化学继电器。一种能够可视化化学交换和扩散的技术是在琼脂板上生长的微生物菌落的 IMS;小分子能够通过琼脂扩散, 并可通过矩阵辅助激光去光电离 (MALDI-TOF) 质谱4捕获。这种生长装置可用于识别离散生物实体 (菌落) 之间交换的分子, 也可以确定代谢物生产的方向性。最初为微生物菌落生长设计的平台被用来探索哺乳动物细胞生长的组织外植体的初级代谢, 并利用 IMS 对体外哺乳动物系统中的动态化学交换进行了评价。
在过去的几年里, 很明显, 高级浆液性卵巢癌 (hgsoc) 通常起源于输卵管上皮 (fte), 然后在疾病早期发展5,6,7.,8. 肿瘤性 fte 细胞扩散到卵巢的原因目前尚不清楚, 卵巢最终形成并进一步转移了大肿瘤。此前的研究主要集中在卵巢蛋白在卵巢原发转移中的作用;然而, 最近已经证明, 从健康组织到致瘤组织的转变会导致细胞代谢的大规模破坏, 并改变小分子9,10,11的产生。因此, 我们假设 FTE 和卵巢之间交换的小分子可能是 HGSOC 原发转移的部分原因。
利用我们新开发的 IMS 程序, 我们已经确定, 肿瘤致动 FTE 和健康卵巢组织的共培养诱导从卵巢产生去甲肾上腺素。然而, 其他细胞类型或正常的 FTE 细胞并没有引起这种效果。这种方法的一个非凡的好处是, 代表真实分子的分子产生和信号交换可以可视化, 因此即使在共业中, 也可以确定信号的来源。与对所有空间信息都丢失的同质化样品进行分析相比, 这是一个优势。在我们的模型系统中, 我们能够清楚地将去甲肾上腺素的产生分配给卵巢。去甲肾上腺素与卵巢癌的转移和化学耐药有关, 我们对这种分子的检测已经证实, 新的 ims 方法可以发现生物相关分子12,13 ,14. 这一验证使我们能够提出, IMS 的这一新应用对试图识别共培养环境中的小分子和了解影响细胞转化的早期事件的研究小组特别有帮助和转移。该方法的总体目标是阐明小分子在组织和器官间交换过程中的身份和空间分布, 这些组织和器官以体外三维细胞培养或体外组织为代表。
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Protocol
所有动物程序都符合国家卫生研究院《实验室动物护理和使用准则》, 并得到芝加哥伊利诺伊大学机构动物使用和护理委员会的批准。
1. 试剂的制备
- 在α最小基本培养基 (αMEM) 培养基的加湿孵化器中保持小鼠输卵管上皮细胞 (moe) 37°C, 并辅以10% 的胎牛血清 (fbs)、2mm l-谷氨酰胺、10mgml 胰岛素、转铁蛋白、硒 (its), 1.8 ngml 表皮生长因子 (EGF)、100 U/peniclin 链霉素、1 Mg/l 庆大霉素和 18.2 ngml estradol-17β。每3-4天通过一次细胞, 确保在牺牲老鼠的同一天有足够的细胞。
- 将1克低熔融琼脂糖与50毫升的蒸馏水混合, 制备2% 琼脂糖。高压灭菌器琼脂糖, 允许冷却, 然后在琼脂糖凝固之前, 在2毫升管中使用 aliquot (1 mL ) (见材料表)。琼脂糖可以无限期地储存在-20°c。
- 准备至少2毫升的1x 杜尔贝科的修改鹰的媒体 (DMEM) 介质。
- 对于 MALDI-TOF MS 的矩阵, 在 90:acn:h 2 o + 0.1% 三氟乙酸 (TFA) 中制备 10 mgml 为1Α-氰基-4-透明肉桂酸 (chca):d 羟基苯甲酸 (DHB) (见材料表).松解, 直到矩阵溶解。
2. 老鼠殖民地和子房去除
- 使用标准住房程序维持 cd-1小鼠的繁殖对。在分娩当天附近, 每天检查老鼠, 这样幼崽的年龄就知道了。
- 根据国家卫生研究院的指导原则, 在16-18岁时通过吸入二氧化碳对幼崽进行安乐死。交付 CO2 (100%)以每分钟 10%-20% 的室体积, 并在呼吸停止后继续两分钟。通过宫颈脱位确认安乐死。
- 用70% 乙醇淹没所有手术设备进行消毒。温暖莱博维茨的 L-15 培养基与1x 青霉素链霉素到37°c。
- 用70% 的乙醇弄湿腹部表面, 对该区域进行消毒, 并最大限度地减少头发污染。用钝器抓住覆盖腹壁的皮肤, 用手术剪刀将皮肤和腹壁切开一个大 v 形, 露出内脏。
- 用钳子将内脏移动到一侧。用精细的钳子单独抓住每个子宫角, 轻轻抬起。
- 找到卵巢, 它将在子宫角的末端, 紧接肾脏的下方。使用手术剪刀解剖卵巢没有结缔组织。然后, 把卵巢角切成两半。
- 将卵巢、输卵管和大约一半的子宫角转移到预热的莱博维茨的 L-15 培养基上。
- 在解剖显微镜下小心地将每个卵巢从周围的囊中移开, 使其从输卵管、囊和任何脂肪组织中解脱出来。将每个卵巢移动到莱博维茨 l-15 媒体的新菜。
- 将每个子房切成半轴向。将卵巢碎片 (现在称为外植体) 保持在 37°c, 直到琼脂糖电镀。
3. 设置和孵化经 ito 处理的滑块
-
未分割的共用
- 将琼脂糖在70°c 时液化在热板上。
- 将8井分隔线放在经过过的一氧化二氮 (ITO) 处理的幻灯片上 (图 1a)。分压机上的橡胶底部有助于粘附在滑块上, 但在琼脂糖电镀过程中一定要施加连续的温和向下压力, 以确保井间不会漏水或混合。
- 在15毫升锥形管中收集细胞, 离心机 (800 转/分 5分钟), 并在 1x DMEM 介质中重新悬浮到每 150μl 50Μl 的50k 细胞。如果不同的细胞密度是最佳的, 请确保在此步骤中, 细胞悬浮液是所需最终密度的 2倍 (例如, 对于300Μl 中 50, 000个细胞的最终浓度, 此步骤中的细胞密度为150μl 中的 50, 000个细胞)。
- 在电镀细胞培养之前, 在井心加入卵巢外植体 (图 1b)。
- 在电镀前, 在单个2毫升管中的每个细胞培养中加入琼脂糖。对于每口井, 将200Μl 的细胞悬浮液和200μl 的液化琼脂糖结合在一个2毫升的管中。例如, 对于四口井, 将800Μl 的细胞悬浮液和800μl 的2% 琼脂糖结合起来。一些混合物将被留下, 但使稍微超过必要的避免气泡在移液过程中。
- 在电镀该细胞培养之前, 立即在单个细胞培养中添加琼脂糖。琼脂糖将在不到一分钟的时间内冷却, 所以要准备好迅速板块。
- 立即将细胞琼脂糖混合物的300μl 添加到每口井中 (图 1C)。图 1c显示了三个单元条件和一个介质条件, 每个都有一个卵巢和没有卵巢。
- 在37°c 和 5% co 2 下加湿孵化器中孵育滑块。
-
分裂的组织。
- 从薄薄的光滑塑料中切割分隔线 (图 2 a)。
注: 本实验使用无菌一次性媒体盆的两侧, 因为它们是平薄的。将它们切割得足够宽, 以紧贴井的斜边 (~ 13 毫米)。 - 将琼脂糖在70°c 时液化在热板上。
- 将8井分隔线放在 ito 处理的幻灯片顶部 (图 2b)。分压机上的橡胶底部有助于粘附在滑块上, 但在琼脂糖电镀过程中一定要施加连续的温和向下压力, 以确保井间不会漏水或混合。
- 在15毫升锥形管中收集细胞, 离心机 (800 转/分 5分钟), 并在 1x DMEM 介质中重新悬浮到每 150μl 50Μl 的50k 细胞。如果不同的细胞密度是最佳的, 请确保在此步骤中, 细胞悬浮液是所需最终密度的 2倍 (例如, 对于300Μl 中 50, 000个细胞的最终浓度, 此步骤中的细胞密度为150μl 中的 50, 000个细胞)。
- 将塑料分隔线对角插入井中 (图 2c)。
- 在电镀前的每个细胞悬浮液中一次添加琼脂糖。对于每口井, 将100μl 的细胞悬浮液和100μl 的液化琼脂糖结合在一个2毫升的管中。例如, 对于四口井, 将400μl 的细胞培养和400μl 的2% 琼脂糖结合起来。一些细胞糖混合物将被留下, 但使稍微超过必要的避免气泡在移液过程中。
- 在电镀该细胞培养之前, 立即在单个细胞培养中添加琼脂糖。琼脂糖将在不到一分钟的时间内冷却, 所以要准备好迅速板块。
- 在分隔线的一侧, 板150Μl 的细胞琼脂糖混合物。允许琼脂糖冷却和凝固 (大约 1分钟), 然后取出分隔线 (图 2d)。
- 将卵巢外植体放在井的空一半的中心。将 150μl-媒体-琼脂糖混合物放置在卵巢顶部, 并且仅放置在井的正确一侧 (图 2e)。
- 在37°c 和 5% co 2 下加湿孵化器中孵育滑块。
- 从薄薄的光滑塑料中切割分隔线 (图 2 a)。
4. 干燥幻灯片和准备 MALDI-TOF MS
- 四天后 (或任何首选时间点) 后, 从琼脂糖插头和滑块上取下室分频器 (图 1d)。用扁平的铲子轻轻地将琼脂从室内分离出琼脂的两侧, 轻轻地将室内向上拉, 注意不要移动任何琼脂糖插头。如果它们确实移动, 轻轻重新定位它们, 这样它们就不会互相接触。
- 将滑块放在37°c 的烤箱中大约 4小时, 每小时旋转90°。
请注意:滑块的旋转对于确保整个样品的均匀热量分布非常重要。 - 干燥后, 将幻灯片从烤箱中取出 (图 1e)。
- 使用喷雾器应用矩阵溶液 (图 1F), 具有以下参数: 温度 = 30°c, 流速 = 0.2 mL/min, 刀路数 = 8, 方向 = cc, 喷嘴距离 = 40 mm。
注: 艺术喷枪可以用来应用液体矩阵, 而不是矩阵喷雾器。相同的矩阵溶液可用于喷涂, 但所需溶液的数量大约是原来的两倍。在将滑块夹紧使其垂直悬挂时, 从大约1英尺远的地方 (从 Hoffmann15改编) 的90°角度喷射滑块, 直到可以看到矩阵层。 - 加入1Μl 的校准剂 (磷红的目标和 lt;500 的, 一种肽混合物 (见材料表) 的目标和 lt;5,000 da), 以清除幻灯片上的斑点。磷红不需要与基质混合, 但肽混合物需要1:1 与基质的混合物, 以帮助电离。等待校准干燥。
- 在幻灯片的每个角落使用永久标记绘制 X, 并使用相机或扫描仪拍摄 1, 200 dpi 的光学图像。
5. 成像质谱数据采集
- 在 IMS 数据分析软件上打开一个新序列 (请参见材料表)。将栅格宽度设置为所需的空间分辨率, 至少为50μm。
- 将幻灯片的光学图像上载到分析软件, 并使用每个角中 x 的交叉点设置三个教学点。
- 在采集软件中指定感兴趣的成像区域, 并相应地对其进行命名。
- 使用数据采集软件 (见材料表) 在 5 ppm 误差范围内校准仪器。
- 保存优化后的方法并开始运行。本实验优化了以下参数: 极性 = 正, 检测器 = 反射管, 激光尺寸 = 2, 激光功率 = 50%, 反射器模式检测器增益 = 3倍。
6. 处理 IMS 数据
- 将. mis 文件导入统计软件 (见材料表), 以分析意义。
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Representative Results
最佳干燥的 ITO 滑块将产生一个扁平干燥的样品, 在琼脂糖和琼脂糖件的表面上有最小到没有皱纹, 从而保持滑块上的空间分离 (图 3)。图 3 a显示了最佳干燥, 而图 3 b显示了应避免的皱纹。这种优化需要仔细监测烤箱中的滑梯, 因为确切的时间可能会根据相对湿度而变化。虽然皱纹会对高度产生轻微影响, 因此 IMS 信号的质量精度也会下降, 但轻微的皱纹不会影响数据的质量。因此, 任何最终有轻微皱纹的琼脂糖仍然可以通过 ALDI-TOF MS 进行分析。幻灯片必须完全干燥, 否则这可能导致样品在 MALDI-TOF 质谱仪的高真空环境中爆炸。
除琼脂糖之外的其他基材可能有效, 但在井室干燥或拆除时, 有时不会保持其结构完整性, 从而导致在 ITO 滑块中蔓延, 空间信息丢失。例如, 我们以前曾测试过胶原蛋白作为底物, 这导致了空间信息的扩散和丢失时, 井室被删除 (数据未显示)。如果不分割, 所使用的组织应该在井的中心, 如果被分割, 则应该在半三角形的中心, 这样 IMS 数据的采集就不会受到边缘效应的污染。图 4显示了最佳位置组织 (a 面板) 和位置不良的组织 (面板 b) 的示例。在图4B 中, 组织位于琼脂糖边缘, 当成像时, 可能会产生来自边缘效应的虚假质量信号, 不允许用户对组织周围的琼脂糖进行成像, 这意味着可能会漏掉分泌的信号在分析过程中。组织应尽可能靠近中心, 如图 4 a所示。
一系列实验确定, 与6井板和24孔板相比, 8 井室是最好的孵化容器, 因为8井室对细胞的干扰最小, 而其他较大的室需要琼脂糖板在孵育16后被转移到 ito 或不锈钢滑块中。可以使用多个品牌的室滑梯的8孔室, 但那些与胶粘剂橡胶底部和平行的一侧的井方便了容易引入和删除塑料分隔器的分裂。6井板需要更多的材料, 在干燥这么大的区域时面临困难。24井室在干燥过程中也存在问题, 因为半月板效应在井中很明显, 因此, 插头干燥的边缘明显较高。当琼脂糖直接镀在井的中心时, 8 井室不会产生半月板效应, 琼脂糖塞也不必转移。此外, 8 井室允许在一个实验中测试或控制8个条件。根据实验的不同, 可能需要包括一些控制, 例如 (1) 没有卵巢外植体或细胞的井, (2) 只有细胞的井, 或 (3) 只有卵巢外植体的井。由于样品制备 (精密介质和琼脂糖浓度、基质量等) 在不同的运行之间略有不同, 因此在同一幻灯片上获得样品时, 应比较条件。
进一步的实验确定, 与钢制 MALDI 板相比, ito 涂层滑块是最佳的孵化平台, 因为该滑块允许对细胞状态和位置进行可视化验证。例如, 使用 ITO 幻灯片, 我们可以验证细胞是否具有正常的形态, 并且它们在干燥16之前和之后在整个琼脂糖上保持均匀分布。幻灯片还将允许根据需要纳入荧光细胞系。此外, 需要在干燥前拆除箱体, 以保持整个琼脂糖塞。如果将滑块与8井室连接在一起, 塑料会将琼脂糖插头分开, 导致插头出现重大裂纹。图 5显示了干燥前未取出腔室时所面临的问题。
在分析细胞群时, 重要的是空间分辨率至少为 50μm, 才能开始捕获组织和细胞相互作用的小尺寸。使用喷涂矩阵, 可以实现5μm 的分辨率, 但这延长了收集质谱数据的总体时间, 同时产生了可比较的结果。空间分辨率还取决于在 ALDI-TOF 质谱仪中聚焦激光的能力。
总体而言, 我们优化了此幻灯片设置, 以最佳检测在共培养中交换的小分子。因此, 在数据分析过程中, 我们正在寻找仅存在或明显更丰富的分子特征, 这种分子特征代表了感兴趣的生物条件。由于可以选择在幻灯片上包含其他七个控件和条件, 因此可以通过视觉和为 IMS 数据设计的统计软件来实现这一点。我们在检测到空间相关质量后进行的反拔过程是广泛的, 因此我们可以正交获取高分辨率的质量和碎片数据。我们进行脱皮的第一步是通过一个数据库 (如哺乳动物代谢产物的人类代谢数据库 (HMDB)) 来搜索名义质量。数据库中的大多数分子都有大量的光谱, 涵盖了许多与实验数据进行比较的技术。一旦标称质量具有潜在的候选分子作为其假定的标识, 通常可以比较候选结构和标准之间的物理数据, 如 mmsms 碎片、UV 剖面和保留时间。
例如, 在与卵巢组织培养的肿瘤致细胞共育中识别去甲肾上腺素, 已经证明这种 IMS 方法能够检测出该系统中的相关小分子16。图 6描述了 ims 运行的敏感性, 显示了通过遵循未分割室的协议可能期望的数据类型。图 7同样显示了划分腔设置的代表性数据。
图 1: 未分割共种的样品制备工作流程.(A) 将8孔室涂在 ito 涂层滑块的导电侧。(B) 将一半的卵巢放置在井的中心, 以达到共培养条件。(C) 将300μl 的琼脂细胞悬浮液直接放入井中。确保没有气泡, 卵巢仍留在井中。如果移液琼脂糖扰乱了卵巢, 在琼脂糖冷却前, 轻轻地使用移液尖端将其居中。(D) 经过四天的孵育 (或以其他方式优化时间), 从滑梯上取出8井室。如果琼脂糖仍然附着在室内, 使用铲子轻轻分离腔中的琼脂糖插头, 并将其重新定位在滑梯上。琼脂糖不会粘附在滑梯上, 所以很容易移动。在幻灯片的每个角落绘制一个 "X" 并拍摄照片。(E) 将滑块在37°c 烤箱中干燥 4小时, 每小时旋转90°。琼脂糖应该完全干燥, 并应平躺在滑梯上。(F) 通过喷雾器或喷枪将所选矩阵应用于滑动。矩阵图层应显示为黄色。以 1200 dpi 的速度扫描扫描仪上的幻灯片, 并添加用于 MALDI-TOF MS 分析的校准剂或标准。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 分业共培养样品制备的工作流程。(A) 将标签从介质盆中切下 (~ 13 毫米), 并确保两侧是直的。(B) 将8孔连接到 it 涂层滑块的导电侧。(C) 将分隔线对角线插入井中。(D) 在琼脂糖中加入150μl 细胞培养, 使琼脂糖冷却, 并去除分隔线。(E) 将卵巢添加到空井一半的中心, 并以150μl 的介质和琼脂糖悬浮液覆盖。经 Zink 等人许可, 这一数字转载.请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 琼脂糖塞的皱纹.如果滑梯在烤箱中留得太久, 就会在琼脂糖塞中形成皱纹。这并不排除将样本排除在 ALDI-TOF MS 分析中, 但可能会影响数据的质量。(A) 最佳干燥幻灯片的图像。所有围绕卵巢组织的琼脂糖完全平坦, 没有皱纹, 为 IMS 分析提供了充足的区域。(B) 在整个样品中, 用皱巴巴的琼脂糖擦干不好的幻灯片的图像。经 Zink 等人许可, 这一数字转载.请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 组织的定位.组织在干样品中的位置对数据采集具有重要意义。(A) 分裂腔中的干琼脂塞显示在一半井的中心的子房, 这是成像的最佳选择。(B) 卵巢不以孵化或干燥为中心的分室干琼脂塞。在琼脂糖塞的周长上干燥的卵巢组织, 因此无法进行分析。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5: 与箱体干燥滑块.当滑块在烤箱中拆除前设置时, 琼脂糖插头比自身更强烈地粘附在塑料上, 并开始在高温下拉开。这导致琼脂糖出现严重裂缝, 对滑梯本身的粘附程度很小。这么大的裂纹不利于 IMS 分析。顶部: 在8孔室粘附的2小时干燥后滑动。所有琼脂糖塞, 但两个裂开通过中心由于粘附到8井室。底部: 取出8孔室后滑动。滑梯上只剩下一个琼脂糖插头。经 Zink 等人许可, 这一数字转载.请点击这里查看此图的较大版本.
图 6: 检测唯一信号.在比较8个条件时, 可以检测到单个条件所独有的信号。(A) 干燥的幻灯片图像用于教 aldi-tof 质谱仪要图像的区域。在这里, 我们选择了在50μm 的情况下在 ims 的卵巢组织周围的小区域. (b) 一个具有代表性的m/z信号的图像, 在一个条件下被放大, 而在同一幻灯片上的所有八个。请点击这里查看此图的较大版本.
图 7: 来自分室设置的代表性数据.卵巢组织是概述在白色。112 是从含有卵巢的井的一半分泌出来的。IMS 在50μm 下进行。经 Zink 等人许可, 这一数字转载.请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
越来越多的证据表明, 去甲肾上腺素在 hgsoc12、17、18 中的作用, 这种技术提供了更多的机械信息。由于同一幻灯片上至少有8个生物条件, 该方法可以解释基因和细胞特异性等生物控制, 以及单一 IMS 运行中的媒体控制。虽然该方法经过优化, 以评估在 HGSOC 原发转移模型中交换的小分子, 任何细胞或组织类型, 可以放置在琼脂糖, 以分析各种生物问题和疾病状态。
该协议中最重要的步骤之一是确保组织或细胞类型彼此接近, 并存在于琼脂糖插头的中心。另一个重要的考虑因素是优化整个滑梯的干燥时间。该方法采用卵巢组织进行优化, 卵巢组织易于干燥, 体积小, 导致干燥并发症少。然而, 其他组织, 具有不同的成分, 如脂肪, 有非常不同的干燥配置文件, 因此需要更广泛的干燥优化。在对生物样品进行干燥优化后, 剩余的工作流程只需进行最小的更改。
在质谱采集过程中, 许多项目很可能需要分析小分子以外的复合基团。因此, 如果知道, 应调整用于获取的国际监测系统参数和矩阵的选择, 以便为各自的目标生成最佳数据。此外, 我们只在 50:50 CHCA:DHB 矩阵中进行了积极模式的数据采集, 但负模式实验可能更喜欢不同类型的矩阵, 较大的分子也更容易在不同的矩阵中检测到。该方法可在非目标方法中用于宽质量范围, 也可用于较窄的质量范围, 用于有针对性的搜索。在上述方法的情况下, 小分子是感兴趣的目标, 因为重点是检测通过琼脂糖在细胞和组织代表之间交换的分子。虽然我们不能声称在大小和结构方面的限制, 抑制运动通过琼脂糖, 我们的目的是检测小分子, 所以我们的矩阵决定和 ALDI-TOF MS 参数优化了这一目标。未来的实验正在开发中, 针对的是我们最初的采集方法中可能漏掉的脂类和蛋白质。
除了复合类检测的局限性外, 这种方法还要求细胞与琼脂糖兼容, 并要求组织样本 (如果使用) 适应8井室。如果需要的生物条件较少, 某些组织可以适应较大的井, 但至关重要的是, 所选组织能够在干燥4后干燥到100至200μm 的均匀高度.可以评估多个生物样本, 例如与组织通信的多个细胞类型。由于样品制备能够在空间上分离基于琼脂的细胞培养物, 因此可以根据观察到的扩散模式将可视化的 m\ z 分配给细胞培养源。
利用 IMS 研究人体样本或转基因小鼠模型中的组织切片, 可以概括组织的复杂性。然而, 人类样本很难获得, 这可能会极大地限制研究疾病进展等东西的能力。转基因小鼠模型的组织可以在明确定义的时间点收集。但是, 鼠标模型的开发可能非常耗时且成本高昂。此外, 这两种模型中真实组织的全部复杂性可能会使其难以准确评估特定细胞或组织之间的通信。相比之下, 这里介绍的方法适应性很强。不同的组织或细胞系可以在同一张幻灯片上共同培养, 以检查沟通上的差异。例如, 同一组织的正常细胞或肿瘤细胞可以在同一张幻灯片上培养, 以了解因转化而产生的差异。时间过程研究可能会发现细胞之间的新信号级联, 或小分子抑制剂和/或 RNAi 可以纳入, 以检查特定的信号分子或代谢物的作用。我们相信这些可能性将使这种技术在各种情况下用于研究细胞间通信。
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Disclosures
作者们没有什么可以透露的
Acknowledgments
芝加哥生物医学联合会在芝加哥社区信托基金 (c-076) (l. m. s.) 的支持下提供了资金;伊利诺伊大学芝加哥创业基金分校 (l. m. s.);卵巢癌研究基金联盟提供543296赠款 (医学博士);和 U3 ES029073 (j. e. b.) 和国家卫生研究所国家促进转化科学中心, 通过 UL1TR002003 (JEB & LMS) 赠款。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Falcon tubes | Denville | C1017-O | To collect cells |
| 8-well chamber (Millipore EZ-slide chamber) | Millipore | PEZGS0816 | Repurposed from Millipore Millicell EZ-slide chamber slide |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998-4L | Solvent for sprayed matrix |
| Alpha Minimum Essential Medium (αMEM) | Fisher | 10-022-CV | Cell culture media |
| Autoflex speed MALDI-TOF LRF | Bruker | For IMS data analysis | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | To collect cells and remove supernatant |
| CHCA Matrix | Bruker Daltonic | 8201344 | Matrix sprayed onto dried slide |
| DHB Matrix | Bruker Daltonic | 8201346 | Matrix sprayed onto dried slide |
| Disposable Scalpels | Fisher | 22-079-707 | For removal of the ovaries |
| Dissecting Scissors | Fisher | 13-804-6 | For removal of the ovaries |
| DMEM Media | Gibco | 11995-065 | Media mixed with agarose |
| epidermal growth factor | Peprotech Inc. | 100-15 | Cell culture media supplement |
| Eppendorf tubes | Genesee Scientific | 22-282 | For agarose aliquots |
| Estradiol-17β | Simga-Aldrich | E2758 | Cell culture media supplement |
| Fetal Bovine Serum | Denville | fb5001 | Cell culture media supplement |
| FlexControl 3.4 | Bruker Daltonic | IMS data acquisition software | |
| FlexImaging 4.1 | Bruker Daltonic | IMS data analysis software | |
| Forceps (fine) | Fsiher | 22-327379 | For removal of the ovaries |
| Gentamycin | Cellgro | 30-005-CR | Cell culture media supplement |
| Insulin, Transferrin, Selenium (ITS) | Sigma-Aldrich | 11074547001 | Cell culture media supplement |
| ITO-coated slide | Bruker | 8237001 | Platform for co-culture incubation |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 11415064 | Media used during tissue dissection |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | Cell culture media supplement |
| Low-melting agarose | Sigma-Aldrich | A9414-10G | Mixed with media for plating |
| Media basin | Corning | 4870 | Used to cut plastic dividers for divided chambers |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | Cell culture media supplement |
| Peptide Calibration Standard | Bruker Daltonic | 8206195 | Calibrant for medium mass range |
| Phophorus red | Sigma-Aldrich | 343-242-5G | Calibrant for low mass range |
| SCiLS Lab 2015 | Bruker Daltonic | IMS data statistical analysis | |
| Surgical Forceps (blunt) | Fisher | 08-875-8B | For removal of the ovaries |
| TFA | Fisher Technologies | A116-50 | Added to matrix solution |
| TM Sprayer | HTX Technologies | For applying matrix |
References
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