Summary
Новый метод пробоподготовки была разработана для размещения клеток и тканей coculture обнаружить малые молекулы exchange с помощью тепловизионных масс-спектрометрии.
Abstract
Imaging масс-спектрометрия (IMS) регулярно был применен для трех типов образцов: разделов ткани, сфероидов и микробных колоний. Эти типы образцов были проанализированы с использованием матрицы с помощью лазерной десорбции/ионизации время полета масс-спектрометрия (MALDI-TOF MS) для визуализации распределения белки, липиды и метаболитов через биологический образец интерес. Мы разработали метод подготовки Роман образца, который сочетает в себе сильные стороны трех предыдущих приложений для решения underexplored подход к выявлению химическая связь в рак, путем посева культуры mammalian клеток в агарозы в coculture с здоровые ткани, после высыхания образца. У млекопитающих ткани и клетки cocultured в непосредственной близости, позволяя химическая связь через диффузии между ткани и клетки. В определенное время точках образца на основе агарозы высушена таким же образом как микробной колоний, подготовленный для анализа IMS. Наш метод был разработан для модели связи между высококачественного Серозный рак яичников, производный от маточной трубе, как он взаимодействует с яичника во время метастазов. Оптимизация подготовки пробы привело к идентификации норадреналин как ключевого химического компонента в яичников микроокружения. Этот недавно разработанный метод может применяться для других биологических систем, которые требуют понимания химической связи между соседними клетки или ткани.
Introduction
Imaging масс-спектрометрия (IMS) был оптимизирован для характеризовать пространственное распределение молекулярных компонентов в три широко используемых приложений: фрагменты тканей, сфероидов и микробных колоний1,2,3. Фрагменты тканей могут использоваться для оценки локализации метаболитов в контексте биологических условий в узле, либо целевых или нецелевого в пределах определенного диапазона массы. Однако различия между молекулярные особенности являются наиболее значительных и очевидно здоровых тканей по сравнению с больными условие, например, опухоль. Этот подход IMS особенно приспособлены для обнаружения болезни биомаркеров, однако, получение образцов тканей на отдельных стадиях прогрессирования заболевания (например, опухоль классы) исключает возможность идентификации сигналов, которые могут быть важны для инициирования болезни. Обмен информацией через пространство является вездесущий особенностью многих биологических систем, и кусочки ткани не может захватить этот динамический химических реле. Один из методов, который способен визуализации химического обмена и распространения является IMS микробной колоний, выращенных на плитах агара; малые молекулы способны распространять через и через агар и может быть захвачен через матрицы с помощью лазерной десорбции/ионизации (MALDI-TOF) масс-спектрометрии4. Этот рост установки может использоваться для идентификации молекул, обмениваются дискретных биологических образований (колоний) и также может определить направленность производства метаболит. Платформа, первоначально разработанный для роста микроорганизмов колонии была адаптирована к изучить первичный метаболизм эксплантов ткани, выросло с mammalian клеток, и МСМ была использована для оценки динамического химического обмена в системе экстракорпорального млекопитающих.
В последние несколько лет стало ясно, что высокий класс Серозный рак яичников (HGSOC) часто происходит в маточной трубе эпителия (FTE) и затем метастазирует в яичнике во время ранних заболеваний развития5,6, 7 , 8. Причина, что онкогенной FTE клетки распространились на яичнике, где большие опухоли в конечном итоге формируют и далее метастазировать, в настоящее время непонятно. Предыдущие исследования были направлены на роль яичников белков в первичной метастазирования яичников; Однако недавно было продемонстрировано что переход от здоровой онкогенной ткани приводит к массовым нарушения клеточного метаболизма и изменяет производство малых молекул9,10,11. Таким образом мы предположили, что малые молекулы, обмениваются ФТЕ и яичника может быть частично отвечает за основной метастазов HGSOC.
С помощью нашего недавно разработанные процедуры IMS, мы определили, что coculture онкогенной FTE и здоровой ткани яичника индуцирует производства норадреналина из яичника. Однако другие типы клеток или нормальные клетки ФТЕ не вызывают этот эффект. Чрезвычайный преимущество этого метода является, что могут быть визуализированы молекулярного производства и обмена сигналами, которые представляют реальных молекул, так что даже в coculture это можно определить источник сигнала. Это преимущество над анализ гомогенизированных образцов, где все пространственная информация теряется. В нашей модели системы мы смогли четко назначить производства норадреналина в яичнике. Норадреналина связано с метастазами и chemoresistance рака яичников, и наши обнаружения этой молекулы проверила, что метод Роман IMS может раскрыть биологически соответствующих молекул12,13, 14. Эта проверка позволяет нам предложить, что это новое применение IMS может быть особенно полезно для исследовательских групп, которые пытаются определить малых молекул в coculture средах и понять раннего события, влияющие ячейки преобразования и метастаз. Общая цель этого метода заключается в том, для выяснения личности и пространственного распределения мелких молекул во время обмена между тканей и органов, представлены в vitro 3D клеточных культур или ex vivo ткани.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все животные процедуры соответствовали национальные институты здравоохранения руководящие принципы для ухода и использования лабораторных животных и утвержденных Комитетом правомерного использования животных и уход (IACUC) в университете штата Иллинойс в Чикаго.
1. Подготовка реагентов
- Поддерживать мышиных oviductal эпителия (МО) клеток при 37 ° C с 5% CO2 в увлажненные инкубатора в альфа-СМИ минимум основных средних (αMEM), дополнены плода бычьим сывороточным 10% (ФБС), 2 мм L-глютамином, 10 мг/мл инсулин, трансферрин, селен (СТС) , 1,8 нг/мл эпидермального фактора роста (EGF), 100 ед/мл пенициллин стрептомицином, 1 мг/мл гентамицина и эстрадиол 17β 18.2 нг/мл. Клетки проходят каждые 3 – 4 дня, обеспечение того, что существует достаточное количество клеток в тот же день будет жертвовать мышей.
- 2% агарозном готовят путем смешивания 1 g легкоплавких агарозы с 50 мл дистиллированной воды. Автоклав агарозы, дайте ему остыть, а затем Алиготе (1 мл) 2 мл пробирок (см. Таблицу материалы) до агарозы затвердевает. Агарозы могут храниться при температуре-20 ° C на неопределенный срок.
- Подготовьте по крайней мере 2 мл 1 x Дульбекко изменения орла среднего (DMEM) средств массовой информации.
- Для матрицы MALDI-TOF MS, подготовить 10 мл по 5 мг/мл 1:1 альфа циано-4-hyroxycinnamic кислота (CHCA): dihydroxybenzoic кислота (DHB) (см. Таблицу материалы) в цвету ACN:H2O + 0,1% trifluoroacetic кислоты (ТФК). Sonicate решение, до тех пор, пока матрица растворяется.
2. мышь колонии и удаление яичника
- Поддерживать разведения пары CD-1 мышей с использованием стандартного жилья процедур. Рядом в день родов проверьте мышей каждый день так, что возраст щенков известен.
- Усыпить щенков в возрасте 16-18 дней с CO2 ингаляции в них руководящие принципы. Доставить CO2 (100%) в потоке ставка 10% – 20% камерная тома в минуту и продолжаться в течение двух минут после остановки дыхания. Подтвердите эвтаназии, шейки матки дислокации.
- Лечить все хирургическое оборудование, погрузив в 70% этиловом спирте. Теплый Лейбовиц в L-15 СМИ с 1 x пенициллин стрептомицином до 37 ° C.
- Влажные поверхности живота с 70% этанол дезинфицировать области и свести к минимуму загрязнение с волосами. Хватка кожи, охватывающих брюшной стенки с помощью тупого щипцы и использовать Ножницы хирургические сделать большой V-образные прорваться через кожу и брюшной стенки, подвергая внутренние органы.
- Переместите в сторону, используя пинцет внутренних органов. Отдельности захватить каждый рога матки с тонкой щипцами и слегка приподнимите.
- Найдите яичника, которая будет в конце рога матки, непосредственно ниже почки. Используйте Ножницы хирургические для того чтобы рассечь свободной соединительной ткани яичника. Затем пополам яичников рога.
- Переместить, яичников, маточных труб и около одной половины каждого рога матки подогретым Лейбовиц L-15 СМИ.
- Под микроскопом рассечения тщательно двигаться каждый яичник от окружающих Бурсы, освобождая его от маточных труб, Бурса и любой жировой ткани. Переместите каждый яичник новое блюдо Лейбовиц L-15 средств массовой информации.
- Пополам каждый яичник аксиально. Держите яичников части (теперь называется эксплантов) хранится при 37 ° C до обшивки агарозы.
3. Настройка и инкубации Ито лечение слайд для Cocultures
-
Неделимого cocultures
- Liquify агарозы при 70 ° C на горячей плите.
- Место 8-Ну делителя на вершине tinoxide Индий (ИТО)-лечение слайд (рис. 1A). Нижней резины на разделителем СПИД в адгезии к слайду, но убедитесь, что применять непрерывный нежный понижательное давление во время покрытия агарозы для обеспечения нет утечки или смешивания между скважинами.
- Собрать клетки в 15 мл Конические трубки, центрифуг (5 мин на 800 об/мин) и Ресуспензируйте до 50k клеток на 150 мкл в 1 x DMEM СМИ. Если плотность разных клеток является оптимальным, убедитесь, что на данном этапе суспензию клеток 2 x окончательной плотности желаемого (например, для окончательного концентрация 50 000 ячеек в 300 мкл, плотность клеток на этот шаг 50 000 ячеек в 150 мкл).
- Перед покрытием культуры клеток, добавьте яичников экспланта центр скважины (рис. 1B).
- Добавьте агарозы в каждой культуре клетки в отдельных 2 мл трубки перед обшивкой. Для каждой скважины объединить 200 мкл суспензии клеток и 200 мкл сжиженых агарозы в 2-мл пробирку. Например для четырех скважин, объединить 800 мкл суспензии клеток и 800 мкл 2% агарозы. Некоторые смеси останется, но делать немного больше, чем необходимо избежать пузырьков воздуха во время закупорить.
- Добавьте агарозы для отдельных клеточных культур непосредственно перед покрытие этой клеточной культуры. Агарозы будет охлаждаться в соответствии с минуту, так что будьте готовы быстро пластины.
- Сразу же добавьте 300 мкл клеток/агарозы смеси для каждой скважины (рис. 1 c). Рисунок 1 c показывает три ячейки условия и состояние одного СМИ, каждый покрытием с и без яичника.
- Инкубируйте слайд при 37 ° C и 5% CO2 в увлажненные инкубатора.
-
Разделенные Cocultures.
- Вырежьте разделители из тонкой, гладкой пластмассы (рис. 2A).
Примечание: Этот эксперимент использует стороны бассейна, стерильные одноразовые СМИ, потому что они плоские и тонкий. Вырежьте их достаточно широк, чтобы поместить snugly в гипотенузы скважины (~ 13 мм). - Liquify агарозы при 70 ° C на горячей плите.
- Место 8-Ну делителя на вершине Ито лечение слайд (рис. 2B). Нижней резины на разделителем СПИД в адгезии к слайду, но убедитесь, что применять непрерывный нежный понижательное давление во время покрытия агарозы для обеспечения нет утечки или смешивания между скважинами.
- Собрать клетки в 15 мл Конические трубки, центрифуг (5 мин на 800 об/мин) и Ресуспензируйте до 50k клеток на 150 мкл в 1 x DMEM СМИ. Если плотность разных клеток является оптимальным, убедитесь, что на данном этапе суспензию клеток 2 x окончательной плотности желаемого (например для окончательного концентрации 50 000 ячеек в 300 мкл, плотность клеток на этот шаг, 50 000 ячеек в 150 мкл).
- Вставьте пластиковые разделители по диагонали скважин (рис. 2 c).
- Добавление агарозы для каждой ячейки подвеска, один в то время как раз перед обшивкой. Для каждой скважины объединить 100 мкл суспензии клеток и 100 мкл сжиженых агарозы в 2-мл пробирку. Например для четырех скважин, объединить 400 мкл культуры клеток и 400 мкл 2% агарозы. Некоторые клетки/агарозы смесь останется, но делать немного больше, чем необходимо избежать пузырьков воздуха во время закупорить.
- Добавьте агарозы для отдельных клеточных культур непосредственно перед покрытие этой клеточной культуры. Агарозы будет охлаждаться в соответствии с минуту, так что будьте готовы быстро пластины.
- На одной стороне делителя пластина 150 мкл клеток/агарозы смеси. Разрешить агарозы остыть и затвердеть (приблизительно 1 мин) и затем удалить разделитель (Рисунок 2D).
- Место экспланта завязи в центре пустой половины колодца. Место 150 мкл СМИ/агарозы смесь над верхней завязи и только в правильной стороне хорошо (Рисунок 2E).
- Инкубируйте слайд при 37 ° C и 5% CO2 в увлажненные инкубатора.
- Вырежьте разделители из тонкой, гладкой пластмассы (рис. 2A).
4. Сушка слайд и подготовке MALDI-TOF MS
- После четырех дней (или любой предпочтительный момент), удалить разделитель камеры от агарозы вилки и слайд (рис. 1 d). Аккуратно отделить стороны агарозы из камеры с плоский шпатель и осторожно потяните камеры вверх, стараясь не переместить любой агарозы вилки. Если они движутся, аккуратно переместите их таким образом, чтобы они не соприкасаются друг с другом.
- Место в слайд 37 ° C духовке около 4 ч, вращающихся 90° каждый час.
Примечание: Вращение слайда имеет важное значение для обеспечения распределения тепла даже всей выборки. - После высыхания, удалите слайд из духовки (Рисунок 1E).
- Применение матрицы решения с помощью распылителя (Рисунок 1F), со следующими параметрами: температура = 30 ° C, скорость потока = 0,2 мл/мин, количество проходов = 8, направление = CC и сопло расстояние = 40 мм.
Примечание: Вместо матрицы распылителем, художественная Аэрография может использоваться для применения жидких матрицы. То же решение матрица может использоваться для распыления, но требуется примерно вдвое больше решение. С горкой, зажимается так, что он висит вертикально, спрей слайд с 90° углом от приблизительно одной ногой прочь (адаптировано из Гофмана15) до матрицы слой видимым. - 1 мкл calibrant (красный фосфор для целей < 500 Да, смесь пептида (см. Таблицу материалы) для целей < 5000 Da) чтобы очистить место на слайде. Фосфор красный требует, не смешивая с матрицей, но пептид смесь смесь 1:1 с матрицей для помощи ионизации. Дождитесь calibrant для просушки.
- Нарисуйте X с использованием перманентный маркер в каждом углу слайда и принимать оптические изображения с помощью камеры или сканера на 1200 dpi.
5. Визуализация сбора данных масс-спектрометрии
- Открыть новую последовательность на программное обеспечение для анализа данных IMS (см. Таблицу материалы). Задайте ширину растрового желаемого пространственное разрешение, по крайней мере 50 мкм.
- Загрузить программное обеспечение для анализа оптической изображение слайда и установить три учить точек с помощью пересечений в Икса обращается в каждом углу.
- Обозначить области интереса для изображений в приобретение программного обеспечения и назвать их соответствующим образом.
- Калибровки инструмента, с помощью программного обеспечения сбора данных (см. Таблицу материалы) в течение 5 ppm ошибка.
- Сохранить оптимизированный метод и начать запуск. Этот эксперимент оптимизированы следующие параметры: полярности = положительный, детектор = Reflectron, лазерная размер = 2, мощность лазера = 50%, отражатель режим детектора прибыль = 3 x.
6. обработка данных IMS
- Импорт файла .mis в статистического программного обеспечения (см. Таблицу материалы) для анализа значения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Оптимально сушеные Ито слайд приведет к плоской сморщившимися образца с минимальными без морщин по всей поверхности агарозы и агарозы куски, которые поддерживают пространственное разделение на слайде (рис. 3). На рисунке 3A показывает, оптимального высыхания, а рисунок 3B показывает морщины, которые следует избегать. Эта оптимизация требует тщательного мониторинга слайда в духовке, как точное время может варьироваться на основе относительной влажности. Морщины слегка может повлиять на высоту, и поэтому массовые точность IMS сигналов, небольшие морщинки не повлияет на качество данных. Таким образом любой агарозы, который в конечном счете имеет незначительные морщины все еще могут быть проанализированы через MALDI-TOF MS. Слайд должен быть полностью высох, или это может привести к взрыву образца в условиях высокого вакуума MALDI-TOF масс-спектрометр.
Других субстратов помимо агарозы могут работать, но зачастую не поддерживают их структурной целостности после сушки или удаления хорошо камеры, что приводит в распространении через Ито слайд и потеря пространственной информации. Например мы проверили ранее коллагена как субстрат и это привело к распространению и потеря пространственной информации, когда хорошо камеры был удален (данные не показаны). Ткани используются должны быть в центре хорошо если это неделимые, или в центре треугольника, половина если оно разделено, так, что приобретение данных МСМ не загрязнены краевых эффектов. Рисунок 4 показывает примеры оптимально расположен ткани (Группа A) и плохо позиционируется ткани (Группа B). В рисунке 4В, ткани расположен на краю агарозы, когда образы, может привести ложных сигналов массы от краевых эффектов и не позволяют пользователям изображения агарозы, окружающие ткани, что означает, что выделяется сигналы могут быть пропущены во время анализа. Ткань должна быть как можно ближе к центру как можно скорее, как показано на рисунке 4A.
Серия экспериментов установлено, что камеру 8-Ну лучший судно для инкубации, по сравнению с 6-ну плиты и плиты 24-хорошо, потому что камеры 8-Ну приводит к минимальным возмущений в ячейки, в то время как другие большие камеры требуют агарозы плиты могут быть переданы Ито или нержавеющей стали слайд, после инкубации16. 8-Ну камер от нескольких брендов палата слайдов могут быть использованы, но те с Клей резиновый дно и параллельные стороны скважин облегчить легко введение и удаление пластиковый разделитель для разделенного скважин. 6-ну пластина требуется гораздо больше материала и сталкиваются с трудностями с сушкой таких больших площадей. 24-ну палата также были проблемы во время сушки, потому что мениска эффект проявляется в скважинах и поэтому вилки сушеные с значительно выше краев. 8-Ну палата не приводят эффекту мениска когда агарозы покрытием непосредственно в центре скважины, и агарозы вилки не должны быть переданы. Кроме того Камера 8-Ну позволяет 8 условий испытания или управлением в одном эксперименте. В зависимости от эксперимента может быть важным включить элементы управления, такие как (1) скважин без яичников эксплантов или клетки, (2) скважин с только ячейки, или (3) скважин с яичников эксплантов только. Потому что пробоподготовки (Точные концентрации средств массовой информации и агарозы, матрица суммы и т.д.) существенно отличается между запусками, следует сравнить условия, когда они приобретаются на тот же слайд.
Дальнейшие эксперименты определил, что Ито покрытием слайд является лучшей платформой для инкубации, когда по сравнению с стальной пластине MALDI потому что слайд позволяет для визуального контроля ячейки государственных и позиционирования. Например используя слайд Ито, мы можем проверить что клетки имеют нормальной морфологии и что они поддерживают однородность распределения всей агарозы до и следующие усыхания16. Слайд также позволит для включения люминесцентных клеточных линий, при необходимости. Кроме того удаление камеры до высыхания обязан поддерживать полностью вилку агарозы. Если слайд сморщившимися с 8-Ну палаты придерживался, пластиковые тянет вилку агарозы врозь и приводит в крупных трещин в вилках. Рисунок 5 показывает проблемы когда Палата не удаляется до высыхания.
При анализе клеточных популяций, важно что пространственным разрешением по крайней мере 50 мкм начать захватить небольшой размер ткани и сотовых взаимодействий. С распыляется матрицы это можно достичь разрешение 5 μm, но это увеличивает общее время для сбора данных масс-спектрометрии во время дают сопоставимые результаты. Пространственное разрешение также зависит от способности сосредоточиться лазера MALDI-TOF масс-спектрометр.
В целом мы оптимизировали этот слайд установки лучше всего обнаружить обменялись малых молекул в coculture. Таким образом при анализе данных мы ищем молекулярных компонентов, которые присутствуют только или значительно более обильны в агарозном плагин, который представляет состояние биологического интереса. Потому что есть возможность включить семь других элементов управления и условий на слайде, это может быть достигнуто визуально и при помощи статистического программного обеспечения, предназначенные для данных МСМ. Наш процесс dereplication после обнаружения пространственно отношение масс обширен, так что мы можем ортогонально получить данные с высоким разрешением массы и фрагментации. Первый шаг, который мы принимаем dereplication является поиск номинальной массы через базу данных, как человеческие метаболом базы данных (HMDB) для млекопитающих метаболитов. Большинство молекул в базе данных имеют значительное количество спектров, охватывающих многие методы для сравнения с экспериментальными данными. После того как номинальной массой потенциальных кандидата молекул как их предполагаемого личность, это часто можно сравнить физические данные, такие как MS/MS фрагментации, УФ профиль и время хранения между структурой кандидата и стандартным.
Например выявление норадреналина в coculture онкогенной FTE клетки инкубировали с тканей яичника проверить, что этот метод IMS способны обнаруживать соответствующих малых молекул из этой системы16. Рисунок 6 изображает чувствительность IMS работает, показаны тип данных, которые могут ожидать, следуя протоколу для неделимых камер. Рисунок 7 показывает аналогично репрезентативных данных для разделенных камеры установки.
Рисунок 1: рабочий процесс для пробоподготовки неразделенных coculture. (A) придерживаться 8-Ну палата проводящих сторону Ито покрытием слайда. (B) место наполовину яичников в центре скважин для coculture условий. (C) добавить 300 мкл суспензии агарозы/клеток прямо в скважины. Убедитесь, что есть нет пузырьков воздуха и что яичник остается в центре скважины. Если pipetted агарозы нарушается яичника, аккуратно Используйте наконечник пипетки по центру перед агарозы остывает. (D) после четырех дней инкубации (или иным образом оптимизировать время) удалить 8-Ну камеры от слайда. Если агарозы остается прикрепленным к камере, аккуратно отсоединить вилку агарозы из камеры, с помощью шпателя и переместить его на слайде. Агарозы не будут придерживаться слайда, поэтому он будет легко передвигаться. Использовать «X» на каждом углу слайда и сфотографироваться. Химчистка (E) в слайд 37 ° C духовке в течение 4 ч, вращающейся 90 ° каждый час. Агарозы должна быть полностью сморщившимися и следует ли плашмя на слайде. (F) применить матрица выбора через распылитель или Аэрограф к слайду. Матрица слой должен быть виден как желтый. Сканирование слайдов на сканер на 1200 dpi и добавить calibrants или стандартов для анализа MALDI-TOF MS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: рабочий процесс для пробоподготовки разделенных coculture. (A) Cut вкладки из тазика СМИ (~ 13 мм) и обеспечить, чтобы стороны прямо. (B) присоединить 8-Ну палата проводящих сторону Ито покрытием слайда. (C) вставить разделители по диагонали в скважинах. (D) добавить 150 мкл клеточной культуры в агарозном к одной стороне делителя, позволяют агарозы для охлаждения и удалить разделитель. (E) добавить завязи центр пустой хорошо половины и крышка с 150 мкл СМИ и агарозы подвески. Эта цифра воспроизводится с разрешения от Zink et al. 201816. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: морщины в агарозном вилки. Морщины могут образовываться в агарозном вилки, если слайд не в духовке слишком долго. Это не будет препятствовать образец из анализа MALDI-TOF MS, но может повлиять на качество данных. (A) изображение оптимально сушеные слайд. Все агарозы, окружающих тканей яичника является полностью плоские и без морщин, обеспечивая широкие области для анализа IMS. (B) изображение плохо сушеные слайд с морщинистой агарозы всей выборки. Эта цифра воспроизводится с разрешения от Zink et al. 201816. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: позиционирование ткани. Позиция ткани в сухих образцов очень важна для сбора данных. (A) сушеные агарозы вилки разделенных камер показывают яичника в центре одной половины колодец, который является оптимальным для изображений. (B) сушеные агарозы вилки разделенной камеры, где яичник не был центром для инкубации или сушки. Тканей яичника сушат по периметру вилки агарозы и поэтому не могут быть проанализированы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: слайды с камерой сушки. Когда слайд установлен в духовке до удаления камеры, агарозы вилки более строго придерживаться пластика, чем для себя и начать тянуть друг от друга в жару. Это приводит к тяжелой трещин в агарозы и мало адгезии сам слайд. Этот большой трещины, не способствуют IMS анализа. Вверху: Слайд после высыхания 2 h с камерой 8-Ну придерживается. Все вилки агарозы, но две трещины через центр за счет адгезии к палате 8-хорошо. Внизу: Слайд после удаления камеры 8-хорошо. Только один плагин агарозы оставался на слайде. Эта цифра воспроизводится с разрешения от Zink et al. 201816. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6: выявление уникальных сигналы. При сравнении 8 условий, это можно обнаружить сигналы, которые являются уникальными для одной одно условие. (A) сушеные изображение слайда используется для обучения MALDI-TOF масс-спектрометр какие регионы к изображению. Здесь мы выбрали малых регионов вокруг тканей яичника для IMS на 50 µm. (B) A представитель изображение сигнала m/z , upregulated в одном состоянии против всех восьми на тот же слайд. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7: репрезентативных данных от разделенной камеры установки. Тканей яичника изложена в белом. M/z 112 выделяется от половины хорошо содержащие яичника. МСМ была исполнена на 50 мкм. Эта цифра воспроизводится с разрешения от Zink et al. 201816. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Существует растущее число доказательств того, что подразумевает норадреналина в роль в HGSOC12,17,18, и этот метод вносит более механистических информации. С по меньшей мере восемь биологических условиях на тот же слайд метод можно объяснить биологического контроля как ген и специфичность клетки, а также элементы управления мультимедиа в одном IMS. В то время как метод был оптимизирован для оценки обмен малых молекул в модели первичной метастазов в HGSOC, любую ячейку или тип ткани, которые могут быть помещены в агарозном может быть заменен проанализировать широкий спектр биологических вопросов и болезни государства.
Одним из наиболее важных шагов в протоколе является обеспечение типы ткани или клетки находятся в непосредственной близости друг к другу и находятся в центре вилку агарозы. Еще одним важным соображением является оптимизация время сушки для весь слайд. Этот метод был оптимизирован с помощью тканей яичника, которая легко высушить и небольшой размер которого привели к мало сушки осложнений. Однако другие ткани, с различным составом как жир, имеют очень разные профили сушки и поэтому требуют более обширные усыхания оптимизации. После сушки был оптимизирован для биологической пробы, оставшиеся рабочего процесса должен требовать лишь минимальные изменения.
Во время массовых спектральных приобретения вполне вероятно, что многие проекты потребует анализа составных групп помимо малых молекул. IMS параметры для приобретения и выбор матрицы, таким образом, должны быть приспособлены для создания лучших данных для соответствующей цели, если это известно. Кроме того мы только провели сбор данных в положительных режиме с матрицей CHCA:DHB 50: 50, но отрицательных режим эксперименты могут предпочесть другой тип матрицы, и крупных молекул будет более легко обнаружить в другой матрице также. Этот метод может использоваться с диапазоном широкие массы в нецелевого подхода или с более узкий диапазон массы для целенаправленного поиска. В случае метод выше обсуждалось малые молекулы были объектом интереса, потому что внимание было обнаруживать молекулы, которые были обменены через агарозы между представителями клеток и тканей. Хотя мы не можем претендовать ограничения с точки зрения размера и структуры, которые тормозят движение через агарозы, нашей целью было обнаружить маленькие молекулы, поэтому наше решение матрицы и MALDI-TOF MS параметры оптимизированы для этой цели. Будущие эксперименты в настоящее время разрабатываются для целевых липидов и белков, которые могут быть пропущены в наш оригинальный метод приобретения.
Помимо ограничения обнаружения соединение класса этот метод также требует, что клетки быть совместимы с агарозы, и что образец ткани (если используется) быть адаптированы к вписываются в восемь ну камеру. Некоторые ткани могут быть адаптированы к больших скважин, если меньше биологических условий, необходимых для сравнения, но важно, что выбранные ткани способен сушки до однородной высоты менее чем 100-200 мкм после высыхания4. Несколько биологических образцов может оцениваться как более чем один тип ячейки в связи с ткани. Потому что подготовка образца способна отделить пространственно на основе агарозы клеточных культур, это можно назначить визуализируется m/z 's источник культуры клеток на основе наблюдаемых диффузии шаблонов.
С помощью IMS для изучения разделов ткани от человеческих образцов или трансгенные мыши модели резюмирует сложности тканей. Однако образцах трудно получить, что значительно может ограничить способность изучать вещи, как прогрессирование болезни. Ткани из трансгенные мыши модели могут быть собраны в четко определенных временных точках. Однако, мыши модели может быть трудоемким и дорогим для разработки. Кроме того всю сложность реальных тканей в обоих из этих моделей может сделать это трудно точно оценить связь между конкретными клетки или ткани. Напротив метод, представленные здесь является весьма гибкой. Различные ткани или клеточных линий можно cocultured на тот же слайд для изучения различий в области коммуникации. Например нормальные клетки или клетки тумора от же ткани может быть культивированный на тот же слайд, чтобы понять различия за счет трансформации. Курс обучения может раскрыть Роман сигнальные каскады между ячейками, или малых молекул ингибиторов и/или РНК-интерференции могут быть включены для изучения роли конкретных сигнальных молекул или метаболитов. Мы считаем, что эти возможности будет сделать этот метод полезен для изучения коммуникации для ячеек в самых разнообразных контекстах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать
Acknowledgments
Финансирование было предоставлено Чикаго биомедицинских консорциум с поддержкой от Searle фондов в Чикаго по общинным (C-076) (L.M.S.); Университет Иллинойса в Чикаго запуска средства (L.M.S.); Грант 543296 из Альянса Фонд исследований рака яичников (M.D.); и UG3 ES029073 (J.E.B.) и национальным центром для продвижения трансляционная наук, Национальный институт здравоохранения, через Грант UL1TR002003 (Джеб и LMS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Falcon tubes | Denville | C1017-O | To collect cells |
| 8-well chamber (Millipore EZ-slide chamber) | Millipore | PEZGS0816 | Repurposed from Millipore Millicell EZ-slide chamber slide |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998-4L | Solvent for sprayed matrix |
| Alpha Minimum Essential Medium (αMEM) | Fisher | 10-022-CV | Cell culture media |
| Autoflex speed MALDI-TOF LRF | Bruker | For IMS data analysis | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | To collect cells and remove supernatant |
| CHCA Matrix | Bruker Daltonic | 8201344 | Matrix sprayed onto dried slide |
| DHB Matrix | Bruker Daltonic | 8201346 | Matrix sprayed onto dried slide |
| Disposable Scalpels | Fisher | 22-079-707 | For removal of the ovaries |
| Dissecting Scissors | Fisher | 13-804-6 | For removal of the ovaries |
| DMEM Media | Gibco | 11995-065 | Media mixed with agarose |
| epidermal growth factor | Peprotech Inc. | 100-15 | Cell culture media supplement |
| Eppendorf tubes | Genesee Scientific | 22-282 | For agarose aliquots |
| Estradiol-17β | Simga-Aldrich | E2758 | Cell culture media supplement |
| Fetal Bovine Serum | Denville | fb5001 | Cell culture media supplement |
| FlexControl 3.4 | Bruker Daltonic | IMS data acquisition software | |
| FlexImaging 4.1 | Bruker Daltonic | IMS data analysis software | |
| Forceps (fine) | Fsiher | 22-327379 | For removal of the ovaries |
| Gentamycin | Cellgro | 30-005-CR | Cell culture media supplement |
| Insulin, Transferrin, Selenium (ITS) | Sigma-Aldrich | 11074547001 | Cell culture media supplement |
| ITO-coated slide | Bruker | 8237001 | Platform for co-culture incubation |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 11415064 | Media used during tissue dissection |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | Cell culture media supplement |
| Low-melting agarose | Sigma-Aldrich | A9414-10G | Mixed with media for plating |
| Media basin | Corning | 4870 | Used to cut plastic dividers for divided chambers |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | Cell culture media supplement |
| Peptide Calibration Standard | Bruker Daltonic | 8206195 | Calibrant for medium mass range |
| Phophorus red | Sigma-Aldrich | 343-242-5G | Calibrant for low mass range |
| SCiLS Lab 2015 | Bruker Daltonic | IMS data statistical analysis | |
| Surgical Forceps (blunt) | Fisher | 08-875-8B | For removal of the ovaries |
| TFA | Fisher Technologies | A116-50 | Added to matrix solution |
| TM Sprayer | HTX Technologies | For applying matrix |
References
- Paine, M. R., et al. Whole Reproductive System Non-Negative Matrix Factorization Mass Spectrometry Imaging of an Early-Stage Ovarian Cancer Mouse Model. PLoS One. 11 (5), e0154837 (2016).
- Yang, Y. L., Xu, Y., Straight, P., Dorrestein, P. C. Translating Metabolic Exchange with Imaging Mass Spectrometry. Nature Chemical Biology. 5 (12), 885-887 (2009).
- Li, H., Hummon, A. B. Imaging Mass Spectrometry of Three-Dimensional Cell Culture Systems. Analytical Chemistry. 83 (22), 8794-8801 (2011).
- Yang, J. Y., et al. Primer on Agar-Based Microbial Imaging Mass Spectrometry. Journal of Bacteriology. 194 (22), 6023-6028 (2012).
- Coscia, F., et al. Integrative Proteomic Profiling of Ovarian Cancer Cell Lines Reveals Precursor Cell Associated Proteins and Functional Status. Nature Communications. 7, 12645 (2016).
- Labidi-Galy, S. I., et al. High Grade Serous Ovarian Carcinomas Originate in the Fallopian Tube. Nature Communications. 8 (1), (2018).
- Klinkebiel, D., Zhang, W., Akers, S. N., Odunsi, K., Karpf, A. R. DNA Methylome Analyses Implicate Fallopian Tube Epithelia as the Origin for High-Grade Serous Ovarian Cancer. Molecular Cancer Research. 14 (9), 787-794 (2016).
- Falconer, H., Yin, L., Gronberg, H., Altman, D. Ovarian Cancer Risk After Salpingectomy: A Nationwide Population-Based Study. JNCI Journal of the National Cancer Institute. 107 (2), dju410 (2015).
- Dean, M., Davis, D. A., Burdette, J. E. Activin A Stimulates Migration of the Fallopian Tube Epithelium, an Origin of High-Grade Serous Ovarian Cancer, through Non-Canonical Signaling. Cancer Letters. 391, 114-124 (2017).
- King, S. M., Burdette, J. E. Evaluating the Progenitor Cells of Ovarian Cancer: Analysis of Current Animal Models. BMB Reports. 44 (7), 435 (2011).
- Reznik, E., et al. Landscape of Metabolic Variation across Tumor Types. Cell Systems. 6 (3), 301-313 (2018).
- Watkins, J. L., et al. Clinical Impact of Selective and Nonselective Beta-Blockers on Survival in Patients with Ovarian Cancer: Beta-Blockers and Ovarian Cancer Survival. Cancer. 121 (19), 3444-3451 (2015).
- Lutgendorf, S. K., et al. Stress-Related Mediators Stimulate Vascular Endothelial Growth Factor Secretion by Two Ovarian Cancer Cell Lines. Clinical Cancer Research. 9 (12), 4514-4521 (2003).
- Sood, A. K. Stress Hormone-Mediated Invasion of Ovarian Cancer Cells. Clinical Cancer Research. 12 (2), 369-375 (2006).
- Hoffmann, T., Dorrestein, P. C. Homogeneous Matrix Deposition on Dried Agar for MALDI Imaging Mass Spectrometry of Microbial Cultures. Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 26 (11), 1959-1962 (2015).
- Zink, K. E., Dean, M., Burdette, J. E., Sanchez, L. M. Imaging Mass Spectrometry Reveals Crosstalk between the Fallopian Tube and the Ovary That Drives Primary Metastasis of Ovarian Cancer. ACS Central Science. 4 (10), 1360-1370 (2018).
- Armaiz-Pena, G. N., et al. Src Activation by β-Adrenoreceptors Is a Key Switch for Tumour Metastasis. Nature Communications. 4, 1403 (2013).
- Choi, M. J., et al. HTERT Mediates Norepinephrine-Induced Slug Expression and Ovarian Cancer Aggressiveness. Oncogene. 34 (26), 3402 (2015).
