Summary
En ny metod för provberedning utvecklades för att rymma cell- och coculture för att upptäcka småmolekylära exchange med imaging masspektrometri.
Abstract
Imaging masspektrometri (IMS) har rutinmässigt kopplats till tre typer av prover: vävnadssnitt, spheroids och mikrobiell kolonier. Dessa typer av prov har analyserats med matrix-assisted laser desorption/jonisering time-of-flight masspektrometri (MALDI-TOF MS) för att visualisera fördelningen av proteiner, lipider och metaboliter över biologiska provet av intresse. Vi har utvecklat en roman prov förberedelse metod som kombinerar styrkan i de tre föregående program att ta itu med en underexploaterade metod för att identifiera kemisk kommunikation i cancer, genom sådd däggdjursceller kulturer i agaros i coculture med friska vävnader följt av uttorkning av provet. Däggdjursvävnader och celler är cocultured i närheten så att kemiska kommunikation via diffusion mellan vävnad och celler. Vid specifika tidpunkter torkas agaros-baserade provet på samma sätt som mikrobiella kolonier förberedd för IMS analys. Vår metod har utvecklats för att modellera kommunikationen mellan höggradig serös äggstockscancer, som härrör från äggledaren som det interagerar med äggstocken under metastaser. Optimering av provberedningen resulterade i identifieringen av noradrenalin som en kemisk nyckelkomponent i den ovarian mikromiljö. Denna nyutvecklade metoden kan tillämpas på andra biologiska system som kräver en förståelse för kemisk kommunikation mellan angränsande celler eller vävnader.
Introduction
Imaging masspektrometri (IMS) har optimerats för att karakterisera den rumsliga fördelningen av molekylär funktioner i tre allmänt använda program: vävnad segment, spheroids och mikrobiell kolonier1,2,3. Vävnad skivor kan användas för att utvärdera localizationen av metaboliter i samband med biologiska förhållandena i en värd, antingen riktade eller oriktad inom ett visst massa intervall. Men är skillnaderna mellan molekylär funktioner den mest betydande och uppenbara jämfört med en frisk vävnad är en sjuka tillstånd, till exempel en tumör. Denna IMS metod är särskilt anpassad till upptäckt av sjukdom biomarkörer, dock förvärva vävnadsprover diskret skeden i sjukdomsprogression (t ex tumör kvaliteter) utgör hinder för identifiering av signaler som kan vara viktiga för inledandet av den sjukdom. Utbyte av information genom rymden är en allestädes närvarande funktion av många biologiska system och vävnad skivor kan inte fånga detta dynamiska kemiska relä. En teknik som kan visualisera kemiska exchange och diffusion är IMS av mikrobiell kolonier odlas på agarplattor; små molekyler kan diffundera genom och över agar och kan fångas via matrix-assisted laser desorption/jonisering (MALDI-TOF) masspektrometri4. Denna tillväxt inställning kan användas för att identifiera molekyler som utbyts mellan diskreta biologiska enheter (kolonier) och kan även bestämma riktningen på metaboliten produktion. Den plattform som ursprungligen utformad för mikrobiell kolonin tillväxt anpassades till utforska den primära metabolismen av vävnad bladsticklingar vuxit med däggdjursceller och IMS användes för att utvärdera dynamiska kemiska utbyte i en in vitro-däggdjur system.
De senaste åren, har det blivit tydligt att höggradig serös äggstockscancer (HGSOC) ofta har sitt ursprung i äggledaren epitel (FTE) och sedan metastasizes till äggstocken under tidig sjukdom utveckling5,6, 7 , 8. anledningen till att tumörframkallande FTE celler spridit sig till äggstockarna, där stora tumörer så småningom bilda och metastasera ytterligare, är för närvarande oklart. Tidigare forskning har fokuserat på rollen av äggstockscancer proteiner i primära metastaser till äggstocken; Det har dock nyligen visat att övergången från en hälsosam till en tumörframkallande vävnad resulterar i massiva störningar av cellulär metabolism och förändrar produktionen av små molekyler9,10,11. Därför hypotesen vi att små molekyler som utbyts mellan FTE och äggstockarna kan vara delvis ansvarig för primära metastas av HGSOC.
Med vårt nyutvecklade IMS-förfarande, som vi har konstaterat att coculture tumörframkallande FTE och friska äggstocksvävnad inducerar produktionen av noradrenalin från äggstocken. Dock Omalizumab andra celltyper eller normala FTE celler denna effekt. En extra fördel med denna metod är att molekylär produktion och utbyte av signaler som representerar riktiga molekyler kan visualiseras, så även i en coculture är det möjligt att fastställa källan till en signal. Detta är en fördel över analys av homogeniserade prover, där alla rumsliga information går förlorad. I vår modellsystem kunde vi tydligt tilldela äggstocken produktionen av noradrenalin. Noradrenalin har kopplats till metastaser och chemoresistance av äggstockscancer, och vår upptäckt av denna molekyl har validerat att romanen IMS metod kan avslöja biologiskt relevanta molekyler12,13, 14. denna validering kan vi föreslå att denna nya ansökan av IMS kan vara särskilt användbara för forskningsgrupper som försöker att identifiera små molekyler i coculture miljöer och förstå tidiga händelser som påverkar celltransformation och metastasering. Det övergripande målet med denna metod är att belysa identitet och rumslig distribution av små molekyler under utbyte mellan vävnader och organ, representerade antingen genom in vitro- 3D cellkulturer eller ex vivo vävnad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djur förfaranden var enligt de nationella institut för hälsa riktlinjer för vård och användning av laboratoriedjur och godkänts av utskottet för institutionella djur användning och vård (IACUC) vid University of Illinois at Chicago.
1. beredning av reagens
- Upprätthålla murina oviductal epitel (MOE) celler vid 37° C med 5% CO2 i en fuktad inkubator i alfa minst viktigt Medium (αMEM) media kompletteras med 10% fetalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 10 mg/mL insulin, transferrin, selen (ITS) , 1,8 ng/mL epidermal tillväxtfaktor (EGF), 100 U/mL penicillin-streptomycin, 1 mg/mL gentamycin och 18,2 ng/mL östradiol-17ß. Passera cellerna var 3 – 4 dagar, se till att det finns tillräckligt med celler på samma dag mössen kommer att offras.
- Förbered 2% agaros genom att blanda 1 g av låg-smältande agaros med 50 mL destillerat vatten. Autoklav Agarens, låt svalna, och sedan alikvot (1 mL) i 2 mL rör (se Tabell för material) innan agarosen stelnar. Agaros kan förvaras vid-20 ° C på obestämd tid.
- Bered minst 2 mL 1 x Dulbeccos modifierade örnens Medium (DMEM) media.
- För matrisen för MALDI-TOF MS, förbereda 10 mL av 5 mg/mL 1:1 alpha-cyano-4-hyroxycinnamic syra (CHCA): dihydroxybenzoic syra (DHB) (se Tabell för material) i 90: 10 ACN:H2O + 0,1% trifluorättiksyra (TFA). Sonikera lösning tills matris är upplöst.
2. mus koloni och äggstock borttagning
- Upprätthålla häckande par av CD-1 möss med boendestandard procedurer. Nära dagen för förlossning, kontrollera möss varje dag så att åldern valparna är känd.
- Avliva valparna på 16 – 18 dagars ålder av CO2 inandning per NIH riktlinjer. Leverera CO2 (100%) vid ett flöde av 10 – 20% kammare volym per minut och fortsätta i två minuter efter andning hade slutat. Bekräfta dödshjälp genom cervikal Dislokation.
- Desinficera alla kirurgiska utrustning genom att dränka i 70% etanol. Värma Leibovitzs l-15 media med 1 x penicillin-streptomycin till 37 ° C.
- Blöt buk ytan med 70% etanol att desinficera området och minimera kontaminering med hår. Ta tag i huden som täcker bukväggen med trubbig pincett och Använd kirurgisk sax för att göra en stor V-form skär genom huden och bukväggen, utsätta de inre organen.
- Flytta de inre organen till sida med hjälp av tången. Individuellt greppa varje livmoderns horn med fin pincett och lyft lite.
- Leta upp äggstocken, som kommer att vara i slutet av livmoderns horn, omedelbart nedanför njurarna. Använd kirurgisk sax för att dissekera äggstocken gratis av bindväv. Sedan halvera cystor horn.
- Flytta äggstocken, äggledaren och cirka en halv av varje livmoderns horn till pre värmde Leibovitzs l-15 media.
- Flytta försiktigt varje äggstock från omgivande bursa, befriat den från äggledaren, bursa och någon fettvävnad under dissekera Mikroskop. Flytta varje äggstock till en ny maträtt av Leibovitzs l-15 media.
- Halvera varje äggstock axiellt. Hålla cystor bitar (som nu kallas bladsticklingar) hålls vid 37 ° C tills plätering av agaros.
3. inrättande och ruvning ITO-behandlade bilden för Cocultures
-
Odelade cocultures
- Kondensera Agarens vid 70 ° C på en värmeplatta.
- Placera 8-väl delaren ovanpå den indium tinoxide (ITO)-behandlade bild (figur 1A). Gummi botten på delningslisten aids i vidhäftning till bild, men se till att gälla kontinuerlig skonsam prispress under agaros plätering att säkerställa att inga läckage eller blandning mellan brunnar.
- Samla in celler i en 15 mL koniska rör, centrifug (5 min vid 800 rpm) och resuspendera till 50k celler per 150 µL i 1 x DMEM media. Om en annan cell densiteten är optimal, se till att cellsuspensionen i detta steg är 2 x den slutliga tätheten önskas (t.ex. för en slutlig koncentration på 50 000 celler i 300 µL, cell densiteten vid detta steg är 50.000 celler i 150 µL).
- Tillsätt cystor explant före plätering cellkultur, till mitten av brunnen (figur 1B).
- Lägg till agaros i varje cellkultur i enskilda 2 mL rör strax före plätering. För varje brunn, kombinera 200 µL cellsuspension och 200 µL av flytande agaros i en 2 mL tub. Till exempel för fyra brunnar, kombinera 800 µL cellsuspension och 800 µL av 2% agaros. Vissa blandning kommer att vara kvar, men att göra något mer än nödvändigt undviker luftbubblor under pipettering.
- Lägga till agaros till enskilda cellkulturer omedelbart före plätering det cellkulturen. Agarens kommer cool i under en minut, så var beredd på att plattan snabbt.
- Tillsätt omedelbart 300 µL av cell/agaros blandningen till varje brunn (figur 1 c). Figur 1 c visar tre cellen villkor och en media villkora, var klädd med och utan en äggstock.
- Inkubera bild vid 37 ° C och 5% CO2 i en fuktad inkubator.
-
Delad Cocultures.
- Skär avdelare från tunna, släta plast (figur 2A).
Obs: Detta experiment använder sidorna av en steril engångs media bassäng eftersom de är platta och tunna. Skär dem bara tillräckligt bred för att passa väl in i hypotenusen av brunnen (~ 13 mm). - Kondensera Agarens vid 70 ° C på en värmeplatta.
- Plats 8-väl delaren ovanpå ITO-behandlade bilden (figur 2B). Gummi botten på delningslisten aids i vidhäftning till bild, men se till att gälla kontinuerlig skonsam prispress under agaros plätering att säkerställa att inga läckage eller blandning mellan brunnar.
- Samla in celler i en 15 mL koniska rör, centrifug (5 min vid 800 rpm) och resuspendera till 50k celler per 150 µL i 1 x DMEM media. Om en annan cell densiteten är optimal, se till att cellsuspensionen i detta steg är 2 x den slutliga tätheten önskas (t.ex. för en slutlig koncentration på 50 000 celler i 300 µL, cell densiteten vid detta steg är 50.000 celler i 150 µL).
- Sätt in plast avdelare diagonalt i wells (figur 2 c).
- Lägga till agaros varje cellsuspension en i taget strax före plätering. För varje brunn, kombinera 100 µL cellsuspension och 100 µL av flytande agaros i en 2 mL tub. Till exempel för fyra brunnar, kombinera 400 µL cellkultur och 400 µL av 2% agaros. Vissa cell/agaros blandning kommer att vara kvar men att göra något mer än nödvändigt undviker luftbubblor under pipettering.
- Lägga till agaros till enskilda cellkulturer omedelbart före plätering det cellkulturen. Agarens kommer cool i under en minut, så var beredd på att plattan snabbt.
- På ena sidan av avdelaren, tallrik 150 µL av cell/agaros blandning. Tillåta agaros svalna och stelna (cirka en minut) och ta sedan bort avdelaren (figur 2D).
- Placera äggstock explant i mitten av den tomma halvan av brunnen. Plats 150 µL media/agaros blandningen över toppen av äggstockarna, och endast i rätt sida av brunnen (figur 2E).
- Inkubera bild vid 37 ° C och 5% CO2 i en fuktad inkubator.
- Skär avdelare från tunna, släta plast (figur 2A).
4. torkning Slide och förbereda för MALDI-TOF MS
- Efter fyra dagar (eller någon önskad tidpunkt), ta bort kammare avdelare från agaros pluggarna och bilden (figur 1 d). Försiktigt loss sidorna Agarens från kammaren med en platt spatel och dra försiktigt i kammaren uppåt, att vara noga med att inte flytta någon agaros pluggar. Om de går, försiktigt flytta dem, så att de inte vidrör varandra.
- Placera bilden i en 37 ° C ugn i ungefär 4 h, rotera 90° varje h.
Obs: Rotation av bilden är viktigt att säkerställa jämn värmefördelning i hela provet. - När torr, ta bort bilden från ugnen (figur 1E).
- Tillämpa matrix-lösning med spruta (figur 1F), med följande parametrar: temperatur = 30 ° C, flöde = 0,2 mL/min, antalet passeringar = 8, riktning = CC och munstycke avstånd = 40 mm.
Obs: I stället för en matris spruta, en konstnärlig airbrush kan användas för att applicera flytande matris. Samma matris lösning kan användas för att spruta, men ungefär dubbelt så mycket lösning krävs. Med i bilden som spänns så att den hänger lodrätt, spraya bilden från en 90° vinkel från ungefär en fot bort (anpassad från Hoffmann15) tills matrisen lager är synligt. - Tillsätt 1 µL av standard (fosfor röd för mål < 500 Da, en peptid blandning (se Tabell för material) för mål < 5 000 Da) till tydlig plats på bilden. Fosfor röd kräver ingen blandning med matrix, men peptid blandningen kräver 1:1 blandning med matrix stöd jonisering. Vänta på standard torka.
- Rita ett X med en permanent markörpenna i varje hörn av bilden och ta en optisk bild med en kamera eller en skanner med 1200 dpi.
5. imaging Mass Spectrometry Data Acquisition
- Öppna en ny sekvens på IMS data analys programvara (se Tabell för material). Ange Rasterbredd till önskad rumslig upplösning, minst 50 µm.
- Ladda upp den optiska bilden av bilden till analys programvara och ange tre undervisa punkter med hjälp av korsningarna i den x dras i varje hörn.
- Utse områden av intresse för imaging i programvaran förvärvet och namnge dem med detta.
- Kalibrera instrumentet med hjälp av data förvärv programvara (se Tabell för material) inom 5 ppm fel.
- Spara optimerad metoden och börja springa. Detta experiment optimerad följande parametrar: polaritet = positiv, detektor = Reflectron, Laser storlek = 2, Laser power = 50%, reflektor läge detektor vinst = 3 x.
6. bearbeta IMS Data
- .Mis importfilen i statistisk programvara (se Tabell för material) för analys av betydelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett optimalt torkade ITO-bild kommer att resultera i ett platt desiccated prov med minimal till ingen rynkor över ytan av agaros och agaros bitar som upprätthåller rumsliga avskiljandet i bilden (figur 3). Figur 3A visar optimal torkning, medan figur 3B visar de rynkor som bör undvikas. Denna optimering kräver noggrann övervakning av bilden i ugnen, som exakta tider kan variera baserat på den relativa fuktigheten. Även rynkor kan något påverkar höjden, och därför massa riktigheten av IMS signaler, kommer att liten rynkor inte påverka kvaliteten på data. Därför kan någon agaros som i slutändan har mindre rynkor fortfarande analyseras via MALDI-TOF MS. Bilden måste torkas helt eller detta kan leda till en explosion av provet i hög vakuum miljön av den MALDI-TOF masspektrometer.
Andra substrat bortsett från agaros kan fungera, men ofta gånger bibehåller inte sin strukturella integritet vid torkning eller borttagning av väl kammaren, vilket resulterar i att sprida över ITO bild och förlust av rumslig information. Exempelvis har vi tidigare testat kollagen som substrat och detta resulterade i att sprida och förlust av rumslig information när väl kammaren var bort (inga data anges). Den vävnad som används bör vara i mitten av brunnen om det är odelat eller i mitten av halva triangeln om det delas, så att förvärvet av IMS data inte är förorenade med kanteffekter. Figur 4 visar exempel på optimalt belägen vävnad (panel A) och dåligt placerade vävnad (panel B). I figur 4B, vävnaden ligger i utkanten av Agarens som, när avbildas, kan leda till falska massa signaler från kanteffekter och tillåter inte användare att bilden Agarens omgivande vävnaden, vilket innebär att utsöndras signaler kan missas under analysen. Vävnaden ska vara så nära mitten som möjligt, som visas i figur 4A.
En serie experiment fastställt att en 8-väl kammare var bästa fartyget för inkubation, jämfört med en 6-väl och en 24-väl plåt, eftersom 8-väl kammaren resulterar i minimala störningar på cellerna, medan andra större avdelningar kräver agaros plattor ska överföras till en ITO eller rostfritt stål bild efter inkubation16. 8-väl kamrarna från flera märken av kammaren diabilder kan användas, men de med en självhäftande gummi botten och parallella sidor av brunnarna underlätta enkel introduktion och avlägsnande av en plast avdelare för de delade brunnarna. 6-väl plattan krävs mycket mer material och haft problem med torkning sådana stora områden. 24-väl kammaren hade även problem under torkning, eftersom menisken effekten var uppenbart i brunnarna och därför pluggar torkas med betydligt högre kanter. 8-väl kammaren resulterar inte i menisken effekten när Agarens är klädd direkt i mitten av brunnen och agaros pluggar inte behöver överföras. Dessutom tillåter 8-väl kammaren 8 villkor att testas eller kontrollerade för i ett enda experiment. Beroende på experimentet, kan det vara viktigt att inkludera kontroller såsom (1) brunnar med inga cystor bladsticklingar eller celler, (2) wells med enbart celler eller (3) brunnar med ovariell bladsticklingar endast. Eftersom provberedningen (exakt media och agaros koncentration, matrix belopp, etc.) skiljer sig något mellan körningar, bör förhållanden jämföras när de förvärvas med samma bild.
Ytterligare experiment fastställt att en ITO-belagd bilden den bästa plattformen för inkubation jämfört med en stålplåt MALDI eftersom bilden tillåter för visuell kontroll av cellen statliga och positionering. Exempelvis kan använder ITO bilden, vi verifiera att cellerna har normal morfologi och att de upprätthåller homogen fördelning i hela agaros före och följande uttorkning16. Bilden kommer också att för införlivandet av fluorescerande cellinjer som behövs. Dessutom, krävs borttagning av kammaren innan uttorkning för att bibehålla helheten av agaros kontakten. Om bilden är uttorkad med 8-väl kammaren följs, plasten drar agaros kontakten isär och resulterar i stora sprickor i pluggarna. Figur 5 visar de problem när kammaren inte tas bort innan torkning.
När analysera cellpopulationer, är det viktigt att den rumsliga upplösningen är minst 50 µm att börja fånga den lilla storleken av vävnad och cellulär interaktion. Med besprutade matrix, det är möjligt att uppnå 5 µm upplösning, men detta förlänger den totala tiden att samla masspektrometri data medan ger jämförbara resultat. Rumslig upplösning är också beroende av förmågan att fokusera lasern i den MALDI-TOF masspektrometer.
Sammantaget har vi optimerat denna bild setup för att bäst upptäcka utbytta små molekyler i coculture. Därför söker vi under dataanalys molekylär funktioner som endast är närvarande eller är betydligt mer rikligt i en agaros plug som representerar det biologiska tillståndet av intresse. Eftersom det finns alternativet att inkludera sju andra kontroller och villkor i bilden, kan detta uppnås visuellt och hjälp av statistisk programvara avsedd för IMS data. Vår dereplication process efter uppdagande av rumsligt relevanta massorna är omfattande så att vi kan ortogonalt erhålla en högupplöst massa och fragmentering data. Det första steget som vi tar för dereplication är en sökning av nominella massan genom en databas, till exempel mänskliga bröstmjölkssammansättningen databas (HMDB) för däggdjur metaboliter. De flesta av molekylerna i databasen har ett betydande antal spectra som omfattar många tekniker för jämförelse med experimentella data. När nominella massorna har potentiella kandidat molekyler som deras förmodade identitet, är det ofta möjligt att jämföra fysiska data såsom MS/MS fragmentering, UV profil och retentionstiden mellan kandidat struktur och en standard.
Till exempel validerat identifiering av noradrenalin i coculture av tumörframkallande FTE cellerna inkuberas med äggstocksvävnad denna IMS metod som kan upptäcka relevanta små molekyler från detta system16. Figur 6 skildrar känsligheten av IMS körs, visar vilken typ av data som man kan förvänta sig genom att följa protokollet för odelade chambers. Figur 7 visar likaså representativa data för den delade kammare setup.
Figur 1: arbetsflöde för provberedning av odelade coculture. (A) Följ 8-väl kammaren till ledande sida av ITO-belagda bild. (B) plats halveras äggstockarna i mitten av brunnar för coculture villkor. (C) lägga till 300 µL av agaros/cellsuspension direkt i brunnar. Kontrollera att det finns inga luftbubblor och att äggstockarna kvar i mitten av brunnen. Om för Agarens störd äggstocken, försiktigt använda Pipettera tipset för att centrera den innan Agarens svalnar. (D) efter fyra dagars inkubation (eller annars optimerad tid) ta bort 8-väl kammare från bilden. Om agaros sitter kvar till avdelningen, försiktigt lossa agaros plug från kammare med hjälp av en spatel och flytta den på bilden. Agarens fäster inte på bilden, så blir det lätt att flytta. Rita ett 'X' i varje hörn av bilden och ta ett foto. (E) torr i bilden i en 37 ° C ugn i 4 h, roterande 90 ° varje timme. Agaros bör vara helt uttorkad och bör ligga platt på bilden. (F) Apply matris av val via en spruta eller airbrush att glida. Matrix lager bör vara synlig som gult. Skanna bilden på en skanner med 1200 dpi och lägga till calibrants eller standarder för MALDI-TOF MS analys. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: arbetsflöde för provberedning av delade coculture. (A) klippa flikar ur media basin (~ 13 mm) och se till att sidorna är raka. (B) bifoga 8-väl kammaren till ledande sida av ITO-belagda bild. (C) infoga avdelare diagonalt i brunnar. (D), Tillsätt 150 µL cellkultur i agaros till ena sidan av avdelare, tillåta agaros svalna och ta bort avdelare. (E) Lägg till äggstockarna att centrera av Tom väl halva och täck med 150 µL av media och agaros suspension. Denna siffra Reproducerad med tillstånd från Zink et al. 201816. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: rynkor i agaros pluggar. Rynkor kan bildas i agaros pluggar om bilden är kvar i ugnen för länge. Detta kommer inte att hindra provet från MALDI-TOF MS analys men kan påverka kvaliteten på data. (A) bild av en optimalt torkade bilden. Alla Agarens kring äggstocksvävnad är helt platt och fri från rynkor, som ger gott om området för IMS analys. (B) bild av en dåligt torkade bild med skrynkliga Agarens hela provet. Denna siffra Reproducerad med tillstånd från Zink et al. 201816. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: positionering av vävnad. Ställning av vävnad i torkat prov är mycket viktigt för datainsamling. (A) torkad agaros pluggar av delade kammare Visa äggstocken i centrum av en hälften av brunnen, som är optimal för avbildning. (B) torkade agaros pluggar av delade kammare där äggstocken inte var centrerad för inkubation eller torkning. Äggstocksvävnad torkas på omkretsen av agaros pluggar, och därför inte kan analyseras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: torkning diabilder med kammare. När bilden ligger i ugnen före kammare borttagning, agaros pluggarna följa starkare plast än till själva och börja dra isär i värmen. Detta resulterar i allvarliga sprickor i Agarens och lilla vidhäftning till bild själv. Sprickor detta stora bidrar inte till IMS analys. Överst: Skjut efter 2 h uttorkning med 8-väl kammare följs. Alla agaros pluggar men två knäckt genom centrum på grund av vidhäftning till 8-väl kammaren. Botten: Skjut efter avlägsnande av 8-väl kammare. Endast en agaros plug återstod i bilden. Denna siffra Reproducerad med tillstånd från Zink et al. 201816. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: att upptäcka unika signaler. När man jämför 8 villkor, är det möjligt att upptäcka signaler som är unika för ett enda villkor. (A) den torkade bilden används för att undervisa de MALDI-TOF masspektrometer vilka regioner till bild. Här har vi valt små regioner runt äggstocksvävnad för IMS på 50 µm. (B) en representativ bild av en m/z -signal som är uppreglerad i ett skick kontra alla åtta med samma bild. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: representativa uppgifter från delade kammare setup. Äggstocksvävnad beskrivs i vitt. M/z 112 utsöndras från hälften av den brunn innehållande äggstocken. IMS utfördes vid 50 µm. Denna siffra Reproducerad med tillstånd från Zink et al. 201816. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finns en växande mängd bevis som ifrågasätter noradrenalins roll i HGSOC12,17,18, och denna teknik har bidragit mer mekanistisk information. Med minst åtta biologiska villkor på samma bild, kan metoden står för biologiska kontroller som genen och cell specificitet samt mediakontroller i en enda IMS springa. Samtidigt som metoden var optimerad för att utvärdera utbytte små molekyler i en modell av primära metastaser i HGSOC, valfri cell eller vävnadstyp som kan placeras i agaros kan ersättas för att analysera en mängd olika biologiska frågor och stater sjukdom.
En av de viktigaste stegen i protokollet är att säkerställa att vävnads- eller typer är i nära närhet till varandra och finns i mitten av agaros kontakten. Ett annat viktigt övervägande är optimering av torktiden för hela bilden. Denna metod var optimerad använder äggstocksvävnad, som torkas enkelt och vars litenhet resulterade i lite uttorkande komplikationer. Dock andra vävnader, med olika sammansättning såsom fett, mycket olika snabbtorkande profiler och kräver därför mer omfattande uttorkning optimering. Efter torkning har optimerats för det biologiska provet, bör den återstående arbetsflöden kräver endast minimal förändring.
Under massa spektrala förvärvet är det troligt att många projekt kommer att kräva analys av sammansatta grupper än små molekyler. IMS parametrarna för förvärv och val av matris, därför bör anpassas till generera bästa data för respektive mål, om det är känt. Dessutom, vi bara har utfört datainsamling i positivt läge med en 50: 50 CHCA:DHB matris, men negativa läge experiment kanske föredrar en annan typ av matris och större molekyler skulle upptäckas lättare i en annan matris samt. Metoden kan användas med en bred massa utbud i en oriktade strategi eller med ett smalare massa utbud för en målinriktad sökning. När det gäller den ovan diskuterade metoden var små molekyler målet av intresse eftersom fokus var att identifiera molekyler som utbyttes genom Agarens mellan företrädare för celler och vävnad. Även om vi inte kan hävda de begränsningar vad gäller storlek och struktur som hämmar rörligheten genom agarosgelelektrofores, var vårt mål att upptäcka små molekyler, så vår matris beslut och MALDI-TOF MS parametrar var optimerad för detta mål. Framtida experiment utvecklas till rikta lipider och proteiner som kan ha missats i vår ursprungliga förvärvsmetoden.
Förutom begränsningen av sammansatta klass upptäckt kräver den här metoden också att cellerna vara kompatibel med agarosgelelektrofores, och att vävnadsprov (om sådan används) anpassas för att passa in i en åtta-väl kammare. Vissa vävnader kan anpassas till större wells om färre biologiska förhållanden krävs för jämförelse, men det är avgörande att den valda vävnaden är kapabel att torka till en enhetlig höjd av mindre än 100 till 200 µm efter uttorkning4. Flera biologiska prover kunde utvärderas till exempel mer än en celltyp i kommunikation med en vävnad. Eftersom provberedningen kan rumsligt skilja agaros-baserade cellkulturer, är det möjligt att tilldela visualiseras m/z 's till cell kultur källa baserat på observerade diffusion mönster.
Använda IMS för att studera vävnadssnitt från mänskliga prover eller transgena musmodeller recapitulates komplexiteten i vävnader. Mänskliga prover är dock svårt att få, som dramatiskt kan begränsa möjligheten att studera saker som sjukdomsprogression. Vävnad från transgena musmodeller kan samlas på väl definierade tidpunkter. Men, mus-modeller kan vara tidskrävande och dyra att utveckla. Dessutom kan hela komplexiteten i riktiga vävnader i båda dessa modeller göra det svårt att exakt utvärdera kommunikationen mellan specifika celler eller vävnader. Däremot är den metoden som presenteras här en mycket anpassningsbar. Olika vävnader eller cellinjer kan vara cocultured med samma bild att undersöka skillnader i kommunikation. Exempelvis kan normala celler eller tumörceller från samma vävnad vara odlade med samma bild att förstå skillnader på grund av omvandling. Tid kursen studier kan avslöja nya signalering cascades mellan celler, eller liten molekyl-hämmare och/eller RNAi kunde införlivas för att undersöka rollen som särskilda signalmolekyler eller metaboliter. Vi anser att dessa möjligheter kommer att göra denna teknik användbar för att studera cell-till-cell kommunikation i en mängd olika sammanhang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja
Acknowledgments
Finansieringen tillhandahölls av Chicago biomedicinsk konsortiet med stöd från Searle fonderna på The Chicago Community Trust (C-076) (L.M.S.); University of Illinois at Chicago start medel (L.M.S.); Grant 543296 från Ovarian Cancer Research Fund Alliance (M.D.); och UG3 ES029073 (J.E.B.) och av National Center for framåt translationell vetenskaper, National Institute of Health, genom bidrag UL1TR002003 (JEB & LMS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Falcon tubes | Denville | C1017-O | To collect cells |
| 8-well chamber (Millipore EZ-slide chamber) | Millipore | PEZGS0816 | Repurposed from Millipore Millicell EZ-slide chamber slide |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998-4L | Solvent for sprayed matrix |
| Alpha Minimum Essential Medium (αMEM) | Fisher | 10-022-CV | Cell culture media |
| Autoflex speed MALDI-TOF LRF | Bruker | For IMS data analysis | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | To collect cells and remove supernatant |
| CHCA Matrix | Bruker Daltonic | 8201344 | Matrix sprayed onto dried slide |
| DHB Matrix | Bruker Daltonic | 8201346 | Matrix sprayed onto dried slide |
| Disposable Scalpels | Fisher | 22-079-707 | For removal of the ovaries |
| Dissecting Scissors | Fisher | 13-804-6 | For removal of the ovaries |
| DMEM Media | Gibco | 11995-065 | Media mixed with agarose |
| epidermal growth factor | Peprotech Inc. | 100-15 | Cell culture media supplement |
| Eppendorf tubes | Genesee Scientific | 22-282 | For agarose aliquots |
| Estradiol-17β | Simga-Aldrich | E2758 | Cell culture media supplement |
| Fetal Bovine Serum | Denville | fb5001 | Cell culture media supplement |
| FlexControl 3.4 | Bruker Daltonic | IMS data acquisition software | |
| FlexImaging 4.1 | Bruker Daltonic | IMS data analysis software | |
| Forceps (fine) | Fsiher | 22-327379 | For removal of the ovaries |
| Gentamycin | Cellgro | 30-005-CR | Cell culture media supplement |
| Insulin, Transferrin, Selenium (ITS) | Sigma-Aldrich | 11074547001 | Cell culture media supplement |
| ITO-coated slide | Bruker | 8237001 | Platform for co-culture incubation |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 11415064 | Media used during tissue dissection |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | Cell culture media supplement |
| Low-melting agarose | Sigma-Aldrich | A9414-10G | Mixed with media for plating |
| Media basin | Corning | 4870 | Used to cut plastic dividers for divided chambers |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | Cell culture media supplement |
| Peptide Calibration Standard | Bruker Daltonic | 8206195 | Calibrant for medium mass range |
| Phophorus red | Sigma-Aldrich | 343-242-5G | Calibrant for low mass range |
| SCiLS Lab 2015 | Bruker Daltonic | IMS data statistical analysis | |
| Surgical Forceps (blunt) | Fisher | 08-875-8B | For removal of the ovaries |
| TFA | Fisher Technologies | A116-50 | Added to matrix solution |
| TM Sprayer | HTX Technologies | For applying matrix |
References
- Paine, M. R., et al. Whole Reproductive System Non-Negative Matrix Factorization Mass Spectrometry Imaging of an Early-Stage Ovarian Cancer Mouse Model. PLoS One. 11 (5), e0154837 (2016).
- Yang, Y. L., Xu, Y., Straight, P., Dorrestein, P. C. Translating Metabolic Exchange with Imaging Mass Spectrometry. Nature Chemical Biology. 5 (12), 885-887 (2009).
- Li, H., Hummon, A. B. Imaging Mass Spectrometry of Three-Dimensional Cell Culture Systems. Analytical Chemistry. 83 (22), 8794-8801 (2011).
- Yang, J. Y., et al. Primer on Agar-Based Microbial Imaging Mass Spectrometry. Journal of Bacteriology. 194 (22), 6023-6028 (2012).
- Coscia, F., et al. Integrative Proteomic Profiling of Ovarian Cancer Cell Lines Reveals Precursor Cell Associated Proteins and Functional Status. Nature Communications. 7, 12645 (2016).
- Labidi-Galy, S. I., et al. High Grade Serous Ovarian Carcinomas Originate in the Fallopian Tube. Nature Communications. 8 (1), (2018).
- Klinkebiel, D., Zhang, W., Akers, S. N., Odunsi, K., Karpf, A. R. DNA Methylome Analyses Implicate Fallopian Tube Epithelia as the Origin for High-Grade Serous Ovarian Cancer. Molecular Cancer Research. 14 (9), 787-794 (2016).
- Falconer, H., Yin, L., Gronberg, H., Altman, D. Ovarian Cancer Risk After Salpingectomy: A Nationwide Population-Based Study. JNCI Journal of the National Cancer Institute. 107 (2), dju410 (2015).
- Dean, M., Davis, D. A., Burdette, J. E. Activin A Stimulates Migration of the Fallopian Tube Epithelium, an Origin of High-Grade Serous Ovarian Cancer, through Non-Canonical Signaling. Cancer Letters. 391, 114-124 (2017).
- King, S. M., Burdette, J. E. Evaluating the Progenitor Cells of Ovarian Cancer: Analysis of Current Animal Models. BMB Reports. 44 (7), 435 (2011).
- Reznik, E., et al. Landscape of Metabolic Variation across Tumor Types. Cell Systems. 6 (3), 301-313 (2018).
- Watkins, J. L., et al. Clinical Impact of Selective and Nonselective Beta-Blockers on Survival in Patients with Ovarian Cancer: Beta-Blockers and Ovarian Cancer Survival. Cancer. 121 (19), 3444-3451 (2015).
- Lutgendorf, S. K., et al. Stress-Related Mediators Stimulate Vascular Endothelial Growth Factor Secretion by Two Ovarian Cancer Cell Lines. Clinical Cancer Research. 9 (12), 4514-4521 (2003).
- Sood, A. K. Stress Hormone-Mediated Invasion of Ovarian Cancer Cells. Clinical Cancer Research. 12 (2), 369-375 (2006).
- Hoffmann, T., Dorrestein, P. C. Homogeneous Matrix Deposition on Dried Agar for MALDI Imaging Mass Spectrometry of Microbial Cultures. Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 26 (11), 1959-1962 (2015).
- Zink, K. E., Dean, M., Burdette, J. E., Sanchez, L. M. Imaging Mass Spectrometry Reveals Crosstalk between the Fallopian Tube and the Ovary That Drives Primary Metastasis of Ovarian Cancer. ACS Central Science. 4 (10), 1360-1370 (2018).
- Armaiz-Pena, G. N., et al. Src Activation by β-Adrenoreceptors Is a Key Switch for Tumour Metastasis. Nature Communications. 4, 1403 (2013).
- Choi, M. J., et al. HTERT Mediates Norepinephrine-Induced Slug Expression and Ovarian Cancer Aggressiveness. Oncogene. 34 (26), 3402 (2015).
