Capture de petites molécules Communication entre les tissus et les cellules à l’aide d’imagerie de la spectrométrie de masse

Summary

Une nouvelle méthode de préparation de l’échantillon a été développée pour accueillir la co-culture de cellules et de tissus pour détecter l’échange de petites molécules à l’aide de la spectrométrie de masse d’imagerie.

Abstract

Imagerie de spectrométrie de masse (IMS) a été systématiquement appliquée à trois types d’échantillons : coupes tissulaires, sphéroïdes et colonies microbiennes. Ces types d’échantillons ont été analysés à l’aide de spectrométrie de désorption-ionisation laser assistée par matrice time-of-flight masse (MALDI-TOF MS) de visualiser la répartition des protéines, des lipides et métabolites dans l’ensemble de l’échantillon biologique d’intérêt. Nous avons développé une méthode de préparation d’échantillon roman qui combine les forces des trois demandes précédentes pour déterminer une démarche sous-explorée pour identifier la communication chimique dans le cancer, par ensemencement des cultures de cellules de mammifères en gel d’agarose dans coculture avec des tissus sains, suivies par la dessiccation de l’échantillon. Cellules et tissus de mammifères sont cultivées à proximité permettant la communication chimique par diffusion entre les tissus et les cellules. À des moments spécifiques, l’échantillon d’agarose est séché de la même manière que des colonies microbiennes préparé pour l’analyse de l’IMS. Notre méthode a été développée afin de modéliser la communication entre le cancer des ovaires séreuse haut grade dérivé de la trompe de Fallope comme il interagit avec l’ovaire au cours de la métastase. Optimisation de la préparation de l’échantillon a permis l’identification de la noradrénaline comme composante chimique clé dans le microenvironnement ovarienne. Cette méthode nouvellement mis au point peut être appliquée à d’autres systèmes biologiques qui nécessitent une compréhension de la communication chimique entre les cellules adjacentes ou de tissus.

Introduction

Imagerie de la spectrométrie de masse (IMS) a été optimisé afin de caractériser la distribution spatiale des caractéristiques moléculaires en trois applications utilisées : tranches de tissus, sphéroïdes et colonies microbiennes^1,2,3. Tranches de tissus peuvent servir à évaluer la localisation des métabolites dans le contexte des conditions biologiques dans une foule, ciblées ou non ciblées dans une plage de masse déterminée. Toutefois, les différences entre les caractéristiques moléculaires sont la plus importante et la plus évidente lorsqu’un tissu sain est comparé à une condition de malade, par exemple, une tumeur. Cette approche de l’IMS est particulièrement adaptée à la détection des biomarqueurs de la maladie, cependant, acquisition d’échantillons de tissus à des stades distincts dans la progression de la maladie (par exemple les grades de la tumeur) s’oppose à l’identification des signaux qui pourraient être importantes pour l’initiation de la maladie. L’échange d’informations par le biais de l’espace est un élément omniprésent de nombreux systèmes biologiques, et tranches de tissus ne peuvent pas capturer ce relais dynamique chimique. Une technique qui peut être capable de visualiser la diffusion et l’échange chimique est IMS des colonies microbiennes cultivées sur gélose ; petites molécules peuvent se diffuser à travers et l’agar et peuvent être capturés par l’intermédiaire de spectrométrie de masse (MALDI-TOF) de désorption-ionisation laser assistée par matrice⁴. Cette configuration de croissance peut être utilisée pour identifier des molécules échangées entre des entités biologiques discrets (colonies) et peut aussi déterminer la directionnalité de la production de métabolites. La plate-forme conçue initialement pour la croissance des colonies microbiennes a été adaptée pour explorer le métabolisme primaire des tissus explants cultivés avec des cellules de mammifères, et IMS a été utilisée pour évaluer l’échange chimique dynamique dans un système in vitro chez les mammifères.

Dans les dernières années, il est devenu clair que le cancer ovarien séreux de haut grade (HGSOC) est souvent originaire de l’épithélium de la trompe de Fallope (ETP) et puis métastase dans l’ovaire au cours de la maladie début développement^{5,6, 7 , 8}. la raison que les ETP tumorigène cellules propagation à l’ovaire, où les grosses tumeurs finissent par forment et métastases plus loin, est actuellement incertaine. Des recherches antérieures a mis l’accent sur le rôle des protéines ovariens à la métastase primaire à l’ovaire ; Toutefois, il a récemment été démontré que la transition entre un milieu sain et un tissu tumorigène entraîne une perturbation massive du métabolisme cellulaire et modifie la production de petites molécules^9,10,11. C’est pourquoi, nous avons supposé que les petites molécules échangées entre l’ETP et de l’ovaire peuvent être en partie responsables de la métastase primaire de HGSOC.

En suivant notre procédure IMS nouvellement mis au point, nous avons déterminé que co-culture d’ETP tumorigène et tissu ovarien sain induit la production de noradrénaline par l’ovaire. Toutefois, autres types de cellules ou les cellules normales d’ETP ne pas permis d’obtenir cet effet. Un extraordinaire avantage de cette méthode est que la production moléculaire et l’échange de signaux qui représentent de véritables molécules peuvent être visualisées, ainsi, même dans une co-culture, il est possible de déterminer la source d’un signal. Il s’agit d’un avantage par rapport à l’analyse des échantillons homogénéisés, où toutes les informations spatiales sont perdues. Dans notre système de modèle, nous avons pu clairement affecter la production de noradrénaline à l’ovaire. La noradrénaline a été liée à la chimiorésistance des cancers de l’ovaire et des métastases, et notre détection de cette molécule a validé que la nouvelle méthode IMS peut découvrir des molécules biologiquement pertinente^{12,13, 14}. cette validation nous permet de proposer que cette nouvelle application d’IMS peut être particulièrement utile pour les groupes qui sont efforcent d’identifier des petites molécules dans des environnements de co-culture et pour comprendre les événements précoces qui influent sur la transformation des cellules de recherche et la métastase. L’objectif général de cette méthode est d’élucider l’identité et la distribution spatiale des petites molécules au cours de l’échange entre les tissus et organes, représentées par cultures de cellules 3D de in vitro ou ex vivo des tissus.

Protocol

Toutes les procédures d’animaux étaient conformes à la National Institutes of Health Guidelines pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et approuvé par le Comité institutionnel Animal Use et soin (IACUC) à l’Université de l’Illinois à Chicago.

1. préparation des réactifs

1. Maintenir l’épithélium tubaire murin (MOE) cellules à 37° C, avec 5 % de CO₂ dans un incubateur humidifié dans alpha médias milieu essentiel Minimum (αMEM) additionné de sérum de veau fœtal 10 % sélénium (FBS), 2 mM de L-glutamine, 10 mg/mL d’insuline, transferrine, (STI) , 1,8 facteur de croissance épidermique (EGF), ng/mL 100 U/mL de pénicilline-streptomycine, 1 mg/mL de gentamycine et 18,2 ng/mL d’estradiol-17β. Les cellules du col tous les 3-4 jours, assurant que le même jour, il y a suffisamment de cellules les souris seront sacrifiés.
2. Préparer 2 % d’agarose en mélangeant 1 g d’agarose low-melting avec 50 mL d’eau distillée. Autoclave l’agarose, laisser refroidir et puis aliquote (1 mL) dans 2 mL tubes (voir Table des matières) avant de l’agarose se solidifie. Agarose peut être stockée indéfiniment à-20 ° C.
3. Préparer au moins 2 mL de média de Medium (DMEM) de l’aigle de la modification de 1 x Dulbecco.
4. Pour la matrice MALDI-TOF MS, préparer 10 mL de 5 mg/mL d’acide alpha-cyano-4-hyroxycinnamic 1:1 (ACSSD) : acide dihydroxybenzoïque (DHB) (voir la Table des matières) dans les 90/10 ACN:H₂O + 0,1 % d’acide trifluoroacétique (TFA). Laisser agir la solution jusqu'à ce que la matrice est dissoute.

2. la souris colonie et retrait de l’ovaire

1. Maintenir les couples reproducteurs de souris CD-1 à l’aide de procédures standard de logement. Près le jour de l’accouchement, vérifier les souris tous les jours pour que l’âge des petits est connue.
2. Euthanasier les chiots 16 – 18 jours après la naissance de CO₂ par inhalation selon les directives des NIH. Livrer de CO₂ (100 %) à un débit taux de 10 % – 20 % volume par minute de chambre et continuer pendant deux minutes après que la respiration s’était arrêté. Confirmer l’euthanasie par dislocation cervicale.
3. Désinfecter tout le matériel chirurgical en immergeant dans l’éthanol à 70 %. Réchauffer des médias L-15 de Leibovitz avec 1 x pénicilline-streptomycine à 37 ° C.
4. Mouiller la surface abdominale avec de l’éthanol 70 % pour désinfecter la zone et pour minimiser la contamination avec des cheveux. Saisissez la peau recouvrant la paroi abdominale utilisant émoussé forceps et l’utilisation des ciseaux chirurgicaux pour faire une grande forme en V coupe à travers la peau et la paroi abdominale, exposant les organes internes.
5. Déplacer les organes internes sur le côté avec une pincette. Individuellement, saisir chaque corne utérine avec une pince fine et soulevez légèrement.
6. Localiser l’ovaire, qui aura lieu à la fin de la corne utérine, immédiatement en dessous du rein. Utiliser des ciseaux chirurgicaux à disséquer l’ovaire libre du tissu conjonctif. Ensuite, couper la corne ovarienne en deux.
7. Déplacer l’ovaire, l’oviducte et environ une moitié de chaque corne utérine aux médias L-15 de Leibovitz préchauffé.
8. Sous un microscope à dissection déplacer délicatement chaque ovaire de la bursa environnante, libérant de l’oviducte, bursa et tout le tissu adipeux. Passer chaque ovaire à un nouveau plat des médias L-15 de Leibovitz.
9. Couper chaque ovaire en deux axialement. Garder les morceaux ovariennes (maintenant appelés explants) maintenues à 37 ° C jusqu’au bordé d’agarose.

3. mise en place et en Incubant la diapositive imprégnées d’ITO pour Cocultures

1. Indivis cocultures
   1. Liquéfier l’agarose à 70 ° C sur une plaque chauffante.
   2. Placer le diviseur de 8 puits sur le dessus de la tinoxide d’indium (ITO)-lame traitée (Figure 1 a). Le fond en caoutchouc sur le diviseur du sida dans l’adhésion à la diapositive, mais assurez-vous d’appliquer continue légère pression à la baisse au cours de l’électrodéposition d’agarose pour garantir aucune fuite ou mélange entre puits.
   3. Prélever des cellules dans un tube conique de 15 mL, centrifugeuse (5 min à 800 tr/min) et remettre en suspension les cellules par 150 µL dans 1 x DMEM médias à 50k. Si une densité cellulaire différente est optimale, veillez à ce que, à cette étape, la suspension cellulaire est 2 x la densité finale souhaitée (par exemple, pour une concentration finale de 50 000 cellules dans 300 µL, densité cellulaire à cette étape est de 50 000 cellules dans 150 µL).
   4. Avant l’ensemencement de la culture cellulaire, ajouter explant ovarienne au centre du puits (Figure 1 b).
   5. Ajouter agarose à chaque culture de cellules dans des tubes individuels 2 mL juste avant l’ensemencement. Pour chaque puits, mélanger 200 µL de suspension cellulaire et 200 µL d’agarose liquéfié dans un tube de 2 mL. Par exemple, pour quatre puits, mélanger 800 µL de suspension cellulaire et 800 µL d’agarose à 2 %. Un mélange sera laissé, mais ce qui rend un peu plus nécessaire évite les bulles d’air pendant le pipetage.
      1. Ajouter agarose aux cultures de cellules individuelles, immédiatement avant cette culture cellulaire de placage. L’agarose va refroidir en moins d’une minute, alors soyez prêt à plaque rapidement.
   6. Immédiatement ajouter 300 µL du mélange cellulaire / d’agarose dans chaque puits (Figure 1). Figure 1 montre les trois conditions de la cellule et l’état d’un média, que chacun plaqué avec et sans un ovaire.
   7. Incuber à lame à 37 ° C et 5 % de CO₂ dans un incubateur humidifié.
2. Cocultures divisées.
   1. Couper des séparateurs de plastique mince et lisse (Figure 2 a).
      Remarque : Cette expérience utilise les côtés d’un bassin de stériles jetables médias parce qu’ils sont plat et mince. Coupez-les juste assez large pour s’adapter parfaitement à l’hypoténuse du puits (~ 13 mm).
   2. Liquéfier l’agarose à 70 ° C sur une plaque chauffante.
   3. Placer le diviseur de 8 puits sur le dessus de la diapositive imprégnées d’ITO (Figure 2 b). Le fond en caoutchouc sur le diviseur du sida dans l’adhésion à la diapositive, mais assurez-vous d’appliquer continue légère pression à la baisse au cours de l’électrodéposition d’agarose pour garantir aucune fuite ou mélange entre puits.
   4. Prélever des cellules dans un tube conique de 15 mL, centrifugeuse (5 min à 800 tr/min) et remettre en suspension les cellules par 150 µL dans 1 x DMEM médias à 50k. Si une densité cellulaire différente est optimale, assurez-vous que, à cette étape, la suspension cellulaire est 2 x la densité finale souhaitée (par exemple pour une concentration finale de 50 000 cellules dans 300 µL, densité cellulaire à cette étape est 50 000 cellules dans 150 µL).
   5. Insérer des intercalaires en plastique en diagonale dans les puits (Figure 2).
   6. Ajouter agarose à chaque suspension de cellules, un à la fois juste avant l’ensemencement. Pour chaque puits, mélanger 100 µL de suspension cellulaire et 100 µL d’agarose liquéfié dans un tube de 2 mL. Par exemple, pour quatre puits, mélanger 400 µL de culture cellulaire et 400 µL d’agarose à 2 %. Un mélange de cellules/agarose restera-t-il mais ce qui rend un peu plus nécessaire évite les bulles d’air pendant le pipetage.
      1. Ajouter agarose aux cultures de cellules individuelles, immédiatement avant cette culture cellulaire de placage. L’agarose va refroidir en moins d’une minute, alors soyez prêt à plaque rapidement.
   7. D’un côté de la cloison, plaque 150 µL du mélange de cellule/gel d’agarose. Permettre d’agarose refroidir et se solidifier (environ un min) et ensuite enlever le séparateur (Figure 2D).
   8. Placer au centre de la moitié vide du puits ovaire explant. 150 place mélange de médias/agarose µL au-dessus de l’ovaire et seulement dans le bon côté du puits (Figure 2E).
   9. Incuber à lame à 37 ° C et 5 % de CO₂ dans un incubateur humidifié.

4. glisser de séchage et préparation de MALDI-TOF MS

1. Après quatre jours (ou n’importe quel point du temps préféré), enlever la cloison de la chambre des prises d’agarose et du toboggan (Figure 1). Détacher délicatement les côtés de l’agarose de la chambre avec une spatule plate et tirer doucement la chambre vers le haut, en veillant à ne pas déplacer les fiches d’agarose. Si elles ne se déplacent pas, doucement repositionnez-les afin qu’ils ne touchent pas un de l’autre.
2. Placez la lame dans un four à 37 ° C pendant environ 4 h, rotation 90° toutes les heures.
   Remarque : La rotation de la lame est importante pour assurer la distribution de chaleur uniforme dans l’ensemble de l’échantillon.
3. Une fois sec, retirez la lame du four (Figure 1E).
4. Appliquer la solution de matrice à l’aide du pulvérisateur (Figure 1F), avec les paramètres suivants : température = 30 ° C, débit = 0,2 mL/min, nombre de passes = 8, direction = CC et la distance de buse = 40 mm.
   Remarque : Au lieu d’un pulvérisateur de matrice, un aérographe artistique peut être utilisé pour appliquer la matrice liquide. La même solution de matrice peut être utilisée pour vaporiser, mais il faut environ deux fois plus de solution. Avec le toboggan serré de sorte qu’il est suspendu verticalement, pulvériser la diapositive sous un angle de 90° d’environ un pied de distance (adapté de Hoffmann¹⁵) jusqu'à ce que la matrice de calque est visible.
5. Ajouter 1 µL de degré (phosphore rouge pour cibles < 500 Da, un mélange de peptides (voir Table des matières) pour les cibles < 5 000 Da) à la tache claire sur la diapositive. Phosphore rouge ne nécessite aucun mélange avec la matrice, mais le mélange de peptide requiert mélange 1:1 avec la matrice à l’aide d’ionisation. Attendez calibrant à sécher.
6. Dessiner un X à l’aide d’un marqueur permanent dans chaque coin de la diapositive et de prendre une image optique à l’aide d’un appareil photo ou un scanner à 1200 dpi.

5. Acquisition de données de spectrométrie de masse imagerie

1. Ouvrez une nouvelle séquence sur le logiciel d’analyse de données IMS (voir Table des matières). Définissez la largeur de trame à résolution spatiale désirée, au moins 50 µm.
2. Télécharger l’image optique du glissement vers le logiciel d’analyse et trois set enseignent en utilisant les intersections dans le x dans chaque coin.
3. Désigner des zones d’intérêt pour l’imagerie dans le logiciel d’acquisition et leur nom en conséquence.
4. Calibrer l’instrument en utilisant le logiciel d’acquisition de données (voir la Table des matières) au sein de l’erreur de 5 ppm.
5. Enregistrez la méthode optimisée et commencer la course. Cette expérience optimisé les paramètres suivants : polarité = positif, détecteur = Réflectron, taille Laser = 2, puissance Laser = 50 %, réflecteur mode détecteur gain = x 3.

6. traitement des données IMS

1. Importer un fichier .mis dans un logiciel de statistique (voir Table des matières) pour l’analyse de l’importance.

Representative Results

Une diapositive ITO parfaitement sec se traduira par un échantillon desséché plat avec peu ou pas de rides sur la surface du gel d’agarose et morceaux d’agarose qui maintiennent la séparation spatiale sur la lame (Figure 3). Figure 3 a montre un séchage optimal, tandis que la Figure 3 b montre les rides qui sont à proscrire. Cette optimisation nécessite attention comme heures exactes peuvent varier la surveillance de la diapositive dans le four, basée sur l’humidité relative. Alors que les rides peuvent influer légèrement sur la hauteur, et donc la précision de masse de l’IMS signale, rides légères n’affectera pas la qualité des données. Donc, tout d’agarose qui n’a finalement que des rides légères peut encore doser par MALDI-TOF MS. La diapositive doit être complètement sec, ou cela pourrait conduire à une explosion de l’échantillon dans l’environnement sous vide élevé du spectromètre de masse MALDI-TOF.

Autres substrats en dehors de l’agarose peuvent fonctionner, mais souvent ne conservent pas leur intégrité structurale lors de séchage ou de la suppression de la chambre bien, ce qui résulte en l’étalant sur la diapositive ITO et la perte de l’information spatiale. Par exemple, nous avons testé précédemment collagène comme substrat et il en est résulté dans la propagation et perte de l’information spatiale lorsque la chambre de puits a été supprimé (données non présentées). Le tissu utilisé devrait être au centre du puits s’il est indivis, ou dans le centre du triangle la moitié si elle est divisée, afin que l’acquisition de données IMS n’est pas contaminée par des effets de bord. La figure 4 montre des exemples de tissus idéalement situé (groupe A) et les tissus mal positionné (groupe B). Dans la Figure 4 b, le tissu est situé sur le bord de l’agarose qui, lorsqu’imagée, vous risquez est faux signaux massives contre les effets de bord et ne permet pas aux utilisateurs de l’agarose entourant les tissus, ce qui signifie que sécrétée signaux peut-être manquer d’image pendant l’analyse. Le tissu doit être aussi près du centre que possible, comme le montre la Figure 4 a.

Une série d’expériences a déterminé qu’une chambre de 8 puits était le meilleur bateau pour l’incubation, par rapport à une plaque de 6 puits et une plaque de 24 puits, parce que la chambre de 8 puits provoque des perturbations minimes aux cellules, tandis que les autres chambres plus grandes exigent d’agarose dalles d’être transféré à une diapositive ITO ou en acier inoxydable après incubation de¹⁶. Les chambres de 8 puits de plusieurs marques de diapositives de chambre peuvent être utilisées, mais ceux avec un adhésif caoutchouc fond et parallèle des puits facilitent l’introduction facile et suppression d’une ligne de séparation en plastique pour les puits divisées. La plaque 6 puits beaucoup plus matériel requis et posé des difficultés des grands domaines de séchage. La chambre 24 puits aussi eu des problèmes pendant le séchage, car l’effet du ménisque était évident dans les puits et par conséquent, les bouchons séché avec des bords nettement plus élevés. La chambre de 8 puits n’entraîne pas l’effet du ménisque lorsque l’agarose est plaquée directement dans le centre du puits, et des prises d’agarose n’ont pas à être transféré. En outre, la chambre de 8 puits permet 8 conditions pour être testé ou contrôlé pour en une seule expérience. Selon l’expérience, il peut être important d’inclure des contrôles tels que (1) puits sans explants ovariennes ou cellules, (2) puits avec cellules seulement, ou puits (3) avec seulement des explants ovariennes. Parce que la préparation des échantillons (concentration précise de médias et d’agarose, montant de la matrice, etc.) diffère légèrement entre les exécutions, les conditions devraient être comparées lorsqu’ils sont acquis sur la même lame.

D’autres expériences a déterminé qu’une lame revêtement ITO a été la meilleure plate-forme pour l’incubation par rapport à une plaque d’acier MALDI parce que la diapositive permet une vérification visuelle de la cellule de l’état et positionnement. Par exemple, à l’aide de la glissière de ITO, nous pouvons vérifier que les cellules ont une morphologie normale et qu’ils maintenaient une répartition homogène tout au long de l’agarose avant et suivant la dessiccation¹⁶. La diapositive permettra aussi l’incorporation des lignées de cellules fluorescentes au besoin. En outre, la suppression de la chambre avant la dessiccation est tenue de maintenir l’intégralité de la fiche d’agarose. Si la diapositive est desséchée avec la chambre de 8 puits respecté, le plastique tire la plug d’agarose apart et se traduit par grandes fissures dans les bouchons. La figure 5 illustre les problèmes rencontrés lorsque la chambre n’est pas retirée avant le séchage.

Lors de l’analyse de populations de cellules, il est important que la résolution spatiale est au moins 50 µm de commencer à capturer la petite taille des interactions tissulaires et cellulaires. Avec matrice de pulvérisation, il est possible de parvenir à 5 µm, mais cela allonge le temps de rassembler les données de spectrométrie de masse tout en donnant des résultats comparables. Résolution spatiale dépend aussi de la capacité de se concentrer le laser dans le spectromètre de masse MALDI-TOF.

Dans l’ensemble, nous avons optimisé cette configuration de diapositive pour mieux détecter les échangés petites molécules coculture. Par conséquent, au cours de l’analyse des données, nous recherchons des caractéristiques moléculaires qui sont présentes ou sont significativement plus abondants dans un plug d’agarose qui représente la condition biologique d’intérêt. Parce qu’il y a l’option pour inclure les sept autres contrôles et conditions sur la diapositive, ceci peut être réalisé visuellement et aide logiciel statistique conçu pour les données d’IMS. Notre processus de duplication, suite à la détection des masses dans l’espace pertinents est vaste, afin que nous pouvons obtenir orthogonalement une données à haute résolution de masse et de la fragmentation. La première étape que nous tenons pour duplication est une recherche de la masse nominale grâce à une base de données, tels que la base de données métabolome humain (BDMH) pour les métabolites chez les mammifères. La plupart des molécules dans la base de données ont un grand nombre de spectres couvrant de nombreuses techniques pour les comparer avec les données expérimentales. Une fois que les masses nominales ont des molécules de candidats potentiels comme leur identité putative, il est souvent possible de comparer des données physiques tels que la fragmentation MS/MS, UV profile et les temps de rétention entre la structure du candidat et un étalon.

Par exemple, l’identification de norépinéphrine dans la co-culture de tumorigène ETP cellules incubées avec le tissu ovarien a validé que cette méthode d’IMS est capable de détecter de petites molécules de ce système de¹⁶. Figure 6 illustre la sensibilité des pistes IMS, indiquant le type de données que l'on peut attendre en suivant le protocole pour chambres indivises. La figure 7 illustre de même des données représentatives pour l’installation de chambre divisée.

Figure 1 : flux de travail pour la préparation de l’échantillon de coculture indivise. (A) chambre 8 puits collez à côté conducteur de diapositive ITO-enduit. (B) lieu divisé par deux ovaires au centre du puits pour conditions de coculture. (C) ajouter 300 µL de suspension d’agarose/cellulaire directement dans le puits. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air et que l’ovaire reste au centre du puits. L’agarose pipeté perturbée de l’ovaire, utilisez l’embout de la pipette pour le centrer avant l’agarose refroidit. (D) après quatre jours d’incubation (ou sinon optimisé temps) retirer la chambre 8 puits de diapositive. Si agarose demeure attachée à la chambre, doucement se détacher plug d’agarose de l’alvéole à l’aide d’une spatule et le repositionner sur la diapositive. L’agarose n’adhérera pas à la diapositive, il sera facile à déplacer. Dessiner un « X » sur chaque coin de la diapositive et prenez une photo. (E) sécher la lame dans un four à 37 ° C pendant 4 h, rotation de 90 ° par heure. Agarose doit être complètement desséchée et doit être plat sur la diapositive. (F) appliquer matrice de choix via un pulvérisateur ou un aérographe à glisser. Couche de la matrice doit être visible dans le jaune. Numériser des diapositives sur un scanner à 1200 dpi et ajoutez calibrants ou normes pour l’analyse de MALDI-TOF MS. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : flux de travail pour la préparation de l’échantillon de coculture divisé. (A) coupe comprimés hors bassin médias (~ 13 mm) et faire en sorte que les côtés sont droites. (B) fixer 8 puits chambre côté conducteur de diapositive ITO-enduit. (C) Insérez les diviseurs en diagonale dans les puits. Culture cellulaire (D), ajouter 150 µL dans l’agarose à côté de la cloison, permettent d’agarose refroidir et enlever la cloison. (E) ajouter ovaire au centre moitié bien vide et housse avec 150 µL de la suspension de médias et d’agarose. Cette figure reproduite avec la permission de Zink et coll. 2018¹⁶. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : les plis des prises d’agarose. Les rides peuvent se former dans les prises d’agarose si la diapositive est laissée dans le four pendant trop longtemps. Cela n’empêchera pas l’échantillon de MALDI-TOF MS analyse mais peut affecter la qualité des données. (A) l’Image d’une diapositive séchée de manière optimale. Tout l’agarose entourant le tissu ovarien est complètement plate et sans rides, fournissant l’espace pour l’analyse de l’IMS. (B) l’Image d’une lame mal séchée avec ridée d’agarose dans l’ensemble de l’échantillon. Cette figure reproduite avec la permission de Zink et coll. 2018¹⁶. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : positionnement du tissu. Position de tissu dans l’échantillon séché est très importante pour l’acquisition de données. (A) prises d’agarose secs des chambres divisées montrent l’ovaire dans le centre de l’une moitié du puits, qui est optimale pour l’imagerie. (B) séchées prises d’agarose de chambre divisée où ovaire n’était pas centrée pour incubation ou le séchage. Le tissu ovarien séché sur le périmètre des bouchons d’agarose et par conséquent ne peuvent pas être analysé. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : diapositives avec la chambre de séchage. Lorsque la lame est dans le four avant le retrait de la chambre, les prises d’agarose plus fortement adhèrent au plastique qu’à eux-mêmes et commencent à tirer dehors dans la chaleur. Cela se traduit par graves fissures dans l’agarose et faible adhérence à la diapositive elle-même. Ce grand fissures ne sont pas propices à l’analyse de l’IMS. Haut : Diapositive après que dessiccation 2 h avec chambre de 8 puits ont adhéré. Toutes les prises d’agarose, mais deux fissuré par le centre en raison de l’adhésion à la chambre de 8 puits. En bas : Diapositive après le retrait de la chambre de 8 puits. Un seul plug d’agarose est resté sur la diapositive. Cette figure reproduite avec la permission de Zink et coll. 2018¹⁶. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : détection des signaux uniques. Lorsque l'on compare les 8 conditions, il est possible de détecter des signaux qui sont propres à une seule condition. Image de diapositive (A) les séché est utilisée pour enseigner le spectromètre de masse MALDI-TOF quelles régions de l’image. Ici nous avons sélectionné des petites régions autour du tissu ovarien pour IMS à 50 µm. (B) une représentation image d’un signal m/z qui est augmentée dans une condition contre les huit sur la même lame. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : les données représentatives de l’installation de chambre divisée. Tissu ovarien est contour blanc. Le m/z 112 est sécrété par la moitié de la cupule contenant l’ovaire. IMS a été réalisée à 50 µm. Cette figure reproduite avec la permission de Zink et coll. 2018¹⁶. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

Il y a un nombre croissant d’une preuve qui implique le rôle de la noradrénaline en HGSOC^12,17,18, et cette technique a fourni de l’information plus mécaniste. Au moins huit conditions biologiques présentes sur la même lame, la méthode peut expliquer les contrôles biologiques telles que gène et spécificité cellulaire ainsi que des contrôles de médias dans un seul IMS run. Alors que la méthode a été optimisée pour évaluer échangé petites molécules dans un modèle de métastases primaire chez HGSOC, n’importe quelle cellule ou type de tissu qui peut être placé dans l’agarose peut être remplacé pour analyser un large éventail de questions biologiques et états pathologiques.

Une des étapes plus importantes dans le protocole s’assure que les types de tissus ou de cellules sont à proximité d’un de l’autre et sont présents dans le centre de la prise de gel d’agarose. Une autre considération importante est l’optimisation de la durée de séchage pour l’ensemble de la diapositive. Cette méthode a été optimisée à l’aide de tissus ovariens, qui sèche facilement et dont la petite taille a donné lieu à des complications de séchage peu. Toutefois, les autres tissus, avec une composition différente tels que graisse, ont des profils très différents de séchage et requièrent donc une plus grande optimisation de dessiccation. Après que le séchage a été optimisé pour l’échantillon biologique, le flux de travail restant devrait exiger seulement minime altération.

Lors de l’acquisition de spectre de masse, il est probable que de nombreux projets nécessiteront l’analyse des groupes composés autres que les petites molécules. Les paramètres IMS pour l’acquisition et la sélection de matrice, donc, devraient être adaptées pour produire les meilleures données pour la cible respectif, si elle est connue. En outre, seulement, nous avons effectué d’acquisition de données en mode positif avec une matrice de CHCA:DHB 50/50, mais des expériences de mode négatif peuvent préférer un autre type de matrice et molécules plus grosses seraient plus facilement détectés dans une matrice de différente établissements. La méthode peut être utilisée avec une gamme large de masse dans une approche non ciblée ou avec un éventail plus restreint de masse pour une recherche ciblée. Dans le cas de la méthode discutée ci-dessus, petites molécules ont été la cible d’intérêt parce que l’objectif était de détecter des molécules qui ont été échangés par l’intermédiaire de l’agarose entre représentants de cellules et de tissus. Bien que nous ne pourrons prétendre les limitations en termes de taille et de structure qui empêchent le mouvement par le biais d’agarose, notre objectif était de détecter de petites molécules, alors notre décision de matrice et les paramètres de MALDI-TOF MS ont été optimisées pour cet objectif. Expériences futures sont développées pour cibler les lipides et les protéines qui ont été manquées dans notre méthode d’acquisition initiale.

En plus de la limite de détection de la classe de composés, cette méthode requiert également que les cellules soient compatibles avec l’agarose, et que l’échantillon de tissu (si utilisé) soient adaptés pour s’insérer dans une chambre de huit puits. Certains tissus peuvent être adaptés aux plus grands puits si moins de conditions biologiques sont nécessaires aux fins de comparaison, mais il est crucial que le tissu choisi est capable de séchage jusqu'à une hauteur uniforme de moins de 100 à 200 µm après dessiccation⁴. Plusieurs échantillons biologiques peuvent être évaluées comme plus d’un type de cellule en communication avec un mouchoir en papier. Parce que la préparation de l’échantillon est capable de séparer dans l’espace des cultures cellulaires à base d’agarose, il est possible d’assigner visualisé m/z 's à la source de la culture de cellule basée sur la structure de diffusion observées.

À l’aide de IMS à l’étude des sections de tissu d’échantillons humains ou des modèles de souris transgéniques récapitule la complexité des tissus. Toutefois, les échantillons humains sont difficiles à obtenir, qui peut considérablement limiter la possibilité d’étudier des choses comme la progression de la maladie. Tissu de modèles murins transgéniques peut être collecté à des moments bien définis. Mais, des modèles de souris peuvent être fastidieux et coûteux à développer. En outre, toute la complexité du réels tissus dans deux de ces modèles peut rendre difficile à évaluer avec précision la communication entre des cellules ou des tissus. En revanche, la méthode présentée ici est une grande capacité d’adaptation. Différents tissus ou lignées de cellules peuvent être cultivées sur la même lame d’examiner les différences dans la communication. Par exemple, les cellules normales ou des cellules tumorales provenant du même tissu peuvent être cultivées sur la même lame pour comprendre les différences dues à la transformation. Des études temps peuvent découvrir des cascades de signalisation roman entre les cellules, ou inhibiteurs de petites molécules ou Arni pourrait être intégré pour examiner le rôle des molécules de signalisation spécifiques ou de métabolites. Nous croyons que ces possibilités vont faire cette technique utile pour l’étude de cellule-cellule communication dans une grande variété de contextes.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL Falcon tubes	Denville	C1017-O	To collect cells
8-well chamber (Millipore EZ-slide chamber)	Millipore	PEZGS0816	Repurposed from Millipore Millicell EZ-slide chamber slide
Acetonitrile	Sigma-Aldrich	34998-4L	Solvent for sprayed matrix
Alpha Minimum Essential Medium (αMEM)	Fisher	10-022-CV	Cell culture media
Autoflex speed MALDI-TOF LRF	Bruker		For IMS data analysis
Centrifuge	Eppendorf	5810 R	To collect cells and remove supernatant
CHCA Matrix	Bruker Daltonic	8201344	Matrix sprayed onto dried slide
DHB Matrix	Bruker Daltonic	8201346	Matrix sprayed onto dried slide
Disposable Scalpels	Fisher	22-079-707	For removal of the ovaries
Dissecting Scissors	Fisher	13-804-6	For removal of the ovaries
DMEM Media	Gibco	11995-065	Media mixed with agarose
epidermal growth factor	Peprotech Inc.	100-15	Cell culture media supplement
Eppendorf tubes	Genesee Scientific	22-282	For agarose aliquots
Estradiol-17β	Simga-Aldrich	E2758	Cell culture media supplement
Fetal Bovine Serum	Denville	fb5001	Cell culture media supplement
FlexControl 3.4	Bruker Daltonic		IMS data acquisition software
FlexImaging 4.1	Bruker Daltonic		IMS data analysis software
Forceps (fine)	Fsiher	22-327379	For removal of the ovaries
Gentamycin	Cellgro	30-005-CR	Cell culture media supplement
Insulin, Transferrin, Selenium (ITS)	Sigma-Aldrich	11074547001	Cell culture media supplement
ITO-coated slide	Bruker	8237001	Platform for co-culture incubation
Leibovitz's L-15 Medium	Gibco	11415064	Media used during tissue dissection
L-glutamine	Gibco	25030-081	Cell culture media supplement
Low-melting agarose	Sigma-Aldrich	A9414-10G	Mixed with media for plating
Media basin	Corning	4870	Used to cut plastic dividers for divided chambers
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140-122	Cell culture media supplement
Peptide Calibration Standard	Bruker Daltonic	8206195	Calibrant for medium mass range
Phophorus red	Sigma-Aldrich	343-242-5G	Calibrant for low mass range
SCiLS Lab 2015	Bruker Daltonic		IMS data statistical analysis
Surgical Forceps (blunt)	Fisher	08-875-8B	For removal of the ovaries
TFA	Fisher Technologies	A116-50	Added to matrix solution
TM Sprayer	HTX Technologies		For applying matrix