Summary
שיטה של הכנת הדוגמא פותחה כדי להתאים coculture תאים ורקמות לזהות מולקולה קטנה exchange באמצעות ספקטרומטר מסה הדמיה.
Abstract
הדמיה ספקטרומטר מסה (IMS) באופן שגרתי הוחלה על שלושה סוגים של דוגמאות: מקטעי רקמת spheroids, מושבות חיידקים. סוגי דגימה אלה יש נותחו באמצעות לייזר בסיוע מטריקס (MALDI-TOF MS) ספקטרומטר מסה זמן-של-טיסה desorption/יינון להמחיש את ההפצה של חלבונים, ליפידים ו מטבוליטים מעבר הדגימה הביולוגי של עניין. פיתחנו שיטה הכנה מדגם רומן המשלב את נקודות החוזק של היישומים הקודמת שלוש לפנות בגישה כשתפסעו לצורך זיהוי תקשורת כימית ב סרטן, על ידי זריעה בתרבית של תאים מהונדסים לתוך agarose ב coculture עם רקמות בריא ואחריו לייבוש של המדגם. בתרבית של רקמות ותאים cocultured בסמיכות המאפשר תקשורת כימית באמצעות דיפוזיה בין רקמת תאים. בנקודות זמן מסוימות, המדגם מבוססי agarose הוא מיובש באותו אופן כמו מושבות חיידקים מוכן לניתוח IMS. השיטה שלנו פותחה על מודל התקשורת בין סרטן השחלות הצפק כיתה גבוהה, נגזר החצוצרה כמו זה מקיים אינטראקציה עם השחלה במהלך גרורות. אופטימיזציה של הכנת המדגם הביאו הזיהוי של נוראדרנלין בתור מרכיב כימי מפתח microenvironment השחלות. פיתח שיטה זו ניתן ליישם מערכות ביולוגיות אחרות הדורשות הבנה של תקשורת כימית בין תאים סמוכים או רקמות.
Introduction
הדמיה ספקטרומטר מסה (IMS) מוטבה כדי לאפיין את התפוצה המרחבית של תכונות מולקולרית ב שלושה יישומים בשימוש נרחב: פרוסות רקמות, spheroids ומושבות חיידקים1,2,3. פרוסות רקמות ניתן להעריך הלוקליזציה של מטבוליטים בהקשר של תנאי ביולוגי מחשב מארח, ממוקד או untargeted בתוך טווח מסוים המוני. עם זאת, הבדלים בין התכונות מולקולרית הם הכי משמעותי, ברור כאשר רקמה בריאה לעומת מצב חולני, לדוגמה, גידול. גישה זו IMS הוא מותאם במיוחד זיהוי סמנים למחלת, עם זאת, רכישת דגימות רקמה בשלבים דיסקרטית בהתקדמות המחלה (כגון ציונים הגידול) מונע זיהוי אותות יכול להיות חשוב לטקס החניכה של המחלה. חילופי מידע דרך החלל הוא תכונה בכל מקום של מערכות ביולוגיות רבות, רקמות פרוסות אינה יכולה ללכוד את ממסר כימי דינמי. טכניקה אחת המסוגלת להמחיש כימי exchange ודיפוזיה היא IMS של מושבות חיידקים גדל על פלטות אגר; מולקולות קטנות מסוגלים לנטרל את דרך ומעבר של אגר, ניתן ללכוד באמצעות ספקטרומטר מסה לייזר בסיוע מטריקס desorption/יינון (MALDI-TOF)4. תוכנית התקנה זו הצמיחה יכול לשמש כדי לזהות מולקולות המוחלפות בין ישויות ביולוגיות דיסקרטית (מושבות), באפשרותך גם לקבוע כיוון מטבוליט הייצור. פלטפורמת תוכנן במקור לצמיחה מושבת חיידקים הותאם לחקור את חילוף החומרים העיקרי של רקמות explants גדל עם בתרבית של תאים, IMS שימש כדי להעריך את ההחלפה כימי דינמי במערכת יונקים במבחנה.
מספר השנים האחרונות, הוא הפך ברור כי ציון גבוה סרטן שחלות נסיובי (HGSOC) לעיתים קרובות מהכנסותיהן האפיתל החצוצרה (FTE) ואז מתפשט השחלה במהלך בתחילת המחלה פיתוח5,6, 7 , 8. הסיבה tumorigenic FTE תאים התפשט אל השחלה, איפה גידולים גדולים בסופו של דבר יוצרים, גרורות נוספות, ברור כעת. מחקרים קודמים התמקדה התפקיד של חלבונים השחלות ב ראשי גרורות אל השחלה; עם זאת, זה לאחרונה הוכח כי המעבר בריאה טישו tumorigenic גורמת הרס גדול של חילוף החומרים הסלולר ומשנה את הייצור של מולקולות קטנות9,10,11. לכן, אנחנו שיערו כי מולקולות קטנות המוחלפות בין FTE את השחלה עשויים להיות אחראים חלקית גרורות העיקרי של HGSOC.
באמצעות הליך IMS פיתח שלנו, יש לנו נחוש כי coculture של tumorigenic FTE ורקמות השחלות בריא גורם הייצור של נוראדרנלין מן השחלה. עם זאת, תאים נורמליים FTE או סוגי תאים אחרים לא זכה אפקט זה. יתרון יוצאת דופן של שיטה זו הוא כי ניתן לאבחן את הייצור המולקולרי ואת חילופי אותות המייצגים מולקולות אמיתי, כך גם ב- coculture זה אפשרי לקבוע את מקור האות. נמצא יתרון על פני ניתוח דוגמאות הומוגני, כל המידע המרחבי אבוד. במערכת מודל שלנו, היינו יכולים להקצות באופן ברור את הייצור של נוראדרנלין השחלה. נוראדרנלין נקשר גרורה של chemoresistance של סרטן השחלות, שלנו זיהוי של מולקולה זו אומתה כי השיטה IMS הרומן יכול לחשוף מולקולות ביולוגית רלוונטית12,13, 14. אימות זה מאפשר לנו להציע כי היישום החדש הזה של IMS יכול להיות שימושי במיוחד למחקר קבוצות אשר מנסים לזהות מולקולות קטנות בסביבות coculture, כדי להבין בתחילת האירועים המשפיעים על טרנספורמציה תא גרורות. המטרה הכוללת של שיטה זו היא להבהיר את הזהות ואת התפוצה המרחבית של מולקולות קטנות במהלך חילופים בין רקמות ואיברים, המיוצג על-ידי במבחנה תרביות תאים תלת-ממד או רקמות ex-vivo .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים בבעלי חיים היו בהתאם מוסדות לאומיים של בריאות להנחיות על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה, אושרה על ידי הוועדה על עצמך (IACUC) ושימוש חיה מוסדיים ב אוניברסיטת אילינוי בשיקגו.
1. הכנת נוגדנים
- לשמור על תאים אפיתל מאתר oviductal (מו) ב 37° C עם 5% CO2 ב חממה humidified בתקשורת אלפא מינימום הכרחי בינוני (αMEM), בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS), 2 מ מגלוטמין, אינסולין 10 מ"ג/מ"ל, transferrin, סלניום (ITS) , 1.8 ng/mL גורם הגדילה באפידרמיס (EGF), 100 U/mL פניצילין-סטרפטומיצין gentamycin 1 מ"ג/מ"ל, אסטרדיול 18.2 ng/mL-17β. . תעביר את התאים כל 3-4 ימים, הבטחת שישנם מספיק תאים באותו יום העכברים יוקרב.
- להכין 2% agarose על ידי ערבוב 1g של התכה נמוכה agarose עם 50 מ ל מים מזוקקים. אוטוקלב agarose, להתקרר ולאחר מכן aliquot (1 מ"ל) ב- 2 mL צינורות (ראה טבלה של חומרים) לפני עפור agarose. Agarose ניתן לאחסן ב-20 ° C ללא הגבלת זמן.
- להכין לפחות 2 מ"ל של מדיה בינוני (DMEM) שונה הנשר של Dulbecco x 1.
- עבור המטריצה עבור MALDI-TOF MS, להכין 10 מ"ל של 5 מ"ג/מ"ל חומצה אלפא-cyano-4-hyroxycinnamic 1:1 (CHCA): חומצה dihydroxybenzoic (DHB) (ראה טבלה של חומרים) 90:10 ACN:H2O + 0.1% חומצה trifluoroacetic (TFA). Sonicate פתרון עד מטריקס היא התפרקה.
2. עכבר המושבה והסרה השחלה
- לשמור על זוגות של עכברים CD-1 באמצעות הליכים דיור סטנדרטית. ליד מיום parturition, לבדוק אם העכברים כל יום כך גיל הגורים ידוע.
- המתת חסד הגורים 16 – 18 ימים של גיל באמצעות אינהלציה2 CO לפי הנחיות NIH. לספק CO2 (100%) זרם בשיעור של 10% – 20% קאמרית נפח לדקה, במשך שתי דקות. אחרי נשימה נפסק. לאשר המתת חסד מאת נקע בצוואר הרחם.
- לחטא כל הציוד הכירורגי על ידי השוקע 70% אתנול. לחמם את המדיה L-15 של ליבוביץ עם פניצילין 1 x-סטרפטומיצין כדי 37 מעלות צלזיוס.
- פני השטח בטן עם 70% אתנול לחטא את האזור ולצמצם זיהום עם שיער רטוב. תפיסתו העור המכסה את דופן הבטן באמצעות מספריים כירורגיים בוטה מלקחיים והשימוש כדי להפוך גדול V-צורה לחתוך העור, דופן הבטן, לחשוף את האיברים הפנימיים.
- העבר האיברים הפנימיים בצד באמצעות מלקחיים. בנפרד לתפוס כל קרן הרחם עם מלקחיים בסדר והרם מעט.
- אתר השחלה, אשר יהיה בסוף הקרן הרחם, מיד מתחת הכליה. השתמש מספריים כירורגיים כדי לנתח את השחלה חינם של רקמת חיבור. לאחר מכן, לחצי הקרן השחלות.
- להזיז את השחלה, oviduct ואחד כ חצי של כל קרן הרחם למדיה L-15 של ליבוביץ ומחוממת מראש.
- תחת מיקרוסקופ ויבתר להעביר בזהירות כל השחלה בורסה שמסביב, פינוי זה את oviduct, בורסה, כל רקמת שומן. להעביר את השחלה כל תבשיל חדש של התקשורת L-15 של ליבוביץ.
- לחצי כל השחלה axially. לשמור את החלקים השחלות (נקרא עכשיו explants) שמרו ב 37 ° C עד ציפוי של agarose.
3. הגדרת ו המקננת השקופית שטופלו איטו עבור Cocultures
-
Cocultures המלאה
- ' נזילות ' את agarose-70 מעלות צלזיוס על פלטה חמה.
- מקם את המפריד 8-ובכן מעל tinoxide אינדיום (ITO)-מטופלים שקופית (איור 1 א'). לתחתית גומי על המחיצה מסייע אדהזיה לשקופית, אך הקפד להחיל רציפה לחץ כלפי מטה בעדינות במהלך agarose יופיצ כדי להבטיח לא דולף או ערבוב בין בארות.
- איסוף תאים צינור חרוטי 15 מ"ל, צנטריפוגה (5 דקות במהירות של 800 סל ד), resuspend ל 50k תאים לכל µL 150 בתקשורת x DMEM 1. אם צפיפות התאים היא אופטימלית, ודא כי בשלב זה הוא התליה תא 2 x צפיפות הסופי הרצוי (למשל, עבור ריכוז סופי של 50,000 תאים ב- 300 µL, צפיפות התאים בשלב זה הוא 50,000 תאים 150 µL).
- לפני ציפוי תרבית תאים, להוסיף explant השחלות למרכז באר (איור 1B).
- להוסיף agarose לכל תרבית תאים בודדים mL 2 צינורות לפני ציפוי. כל טוב, לשלב µL 200 של השעיה תא ו- 200 µL של agarose נזיל צינור 2 מ"ל. לדוגמה, עבור מארבע בארות לשלב 800 µL של השעיה תא µL 800 של 2% agarose. תערובת יישאר, אבל גורם הכרחי מעט יותר מונע בועות אוויר במהלך pipetting.
- להוסיף agarose תרביות תאים בודדים מיד לפני ציפוי הזה תרבית תאים. Agarose מגניב בתוך פחות מדקה, וכדאי להתכונן צלחת במהירות.
- מיד להוסיף 300 µL של תערובת תא/agarose כל טוב (איור 1C). איור 1C מציג שלושה תנאים התא ובכל תנאי מדיה אחד, שכל אחד מצופה עם ובלי שחלה.
- דגירה שקופיות-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 ב חממה humidified.
-
Cocultures חצויה.
- חותכים חוצצים מפלסטיק דק, חלקה (איור 2 א).
הערה: הניסוי הזה משתמש את הצדדים של אגן מדיה חד פעמי סטרילי כי הם שטוחים ודקים. חותכים אותם רחב מספיק כדי להתאים בקלות לכף היתר של הבאר (~ 13 מ מ). - ' נזילות ' את agarose-70 מעלות צלזיוס על פלטה חמה.
- מקם את המפריד 8-טוב על גבי השקופית שטופלו איטו (איור 2B). לתחתית גומי על המחיצה מסייע אדהזיה לשקופית, אך הקפד להחיל רציפה לחץ כלפי מטה בעדינות במהלך agarose יופיצ כדי להבטיח לא דולף או ערבוב בין בארות.
- איסוף תאים צינור חרוטי 15 מ"ל, צנטריפוגה (5 דקות במהירות של 800 סל ד), resuspend ל 50k תאים לכל µL 150 בתקשורת x DMEM 1. אם צפיפות התאים הוא אופטימלי, ודא כי בשלב זה התליה תא 2 x צפיפות הסופי הרצוי (למשל עבור ריכוז סופי של 50,000 תאים 300 µL, צפיפות התאים בשלב זה הוא 50,000 תאים 150 µL).
- הכנס חוצצים פלסטיק באלכסון וולס (איור 2C).
- להוסיף agarose כל השעיה תא אחד בכל פעם לפני ציפוי. כל טוב, לשלב 100 µL תא השעיה, µL 100 של agarose נזיל צינור 2 מ"ל. לדוגמה, עבור מארבע בארות לשלב µL 400 של תרבית תאים µL 400 של 2% agarose. תערובת תא/agarose יישאר אבל גורם הכרחי מעט יותר מונע בועות אוויר במהלך pipetting.
- להוסיף agarose תרביות תאים בודדים מיד לפני ציפוי הזה תרבית תאים. Agarose מגניב בתוך פחות מדקה, וכדאי להתכונן צלחת במהירות.
- בצד אחד של המחיצה, צלחת 150 µL תערובת תא/agarose. לאפשר agarose מגניב, לחזק (בערך דקה אחת), אז הסרה של הקו המפריד (איור דו-ממדי).
- מקום explant השחלה במרכז החצי הריקה של הבאר. במקום 150 µL תערובת מדיה/agarose מעל של השחלה, ולא רק על הצד הנכון של הבאר (2E איור).
- דגירה שקופיות-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 ב חממה humidified.
- חותכים חוצצים מפלסטיק דק, חלקה (איור 2 א).
4. ייבוש שקופית והכנת MALDI-TOF MS
- אחרי ארבעה ימים (או בכל נקודת זמן מועדף), הסר את המפריד קאמרית השתלים agarose, השקופית (איור 1D). בעדינות לנתק את צידי agarose מן החדר עם מרית שטוחה ומשוך בעדינות את התא כלפי מעלה, נזהר לא לזוז כל אטמי agarose. אם הם יזוזו בעדינות מיקום אותם כך הם לא נוגעים אחד בשני.
- מקם את השקופית בתנור 37 מעלות צלזיוס במשך כ- 4 שעות, סיבוב 90 מעלות כל h.
הערה: הסיבוב של השקופית חשוב להבטיח הפצה חימום לאורך כל המדגם. - לאחר יבש, להסיר את השקופית מן התנור (איור 1E).
- להחיל מטריקס פתרון באמצעות המרסס (איור 1F), עם הפרמטרים הבאים: טמפרטורת = 30 ° C, קצב הזרימה = 0.2 מ ל/דקה, מספר עובר = 8, כיוון = CC, ו זרבובית מרחק = 40 מ מ.
הערה: במקום ריסוס מטריקס, מברשת אמנותית אוויר יכול לשמש כדי להחיל מטריקס נוזלי. הפתרון מטריקס אותו יכול לשמש כדי לרסס, אך כ פתרון כפול נדרש. כאשר השקופית כשכרטיס כך זה נתקע אנכית, לרסס את השקופית מזווית 90° מ כ רגל אחת משם (Adapted הופמן15) עד המטריקס שכבה מוצגת. - להוסיף 1 µL של calibrant (זרחן אדום עבור מטרות < דא 500, תערובת פפטיד (ראה טבלה של חומרים) עבור מטרות < 5,000 Da) ברור ספוט בשקופית. זרחן אדום מחייב כל ערבוב עם מטריקס, אך התערובת פפטיד דורש תערובת 1:1 עם מטריקס לסייע יינון. חכו calibrant יבש.
- לצייר X באמצעות סמן קבוע בכל פינה של השקופית וקח תמונה אופטי באמצעות מצלמה או סורק ברזולוציה של 1200 dpi.
5. הדמיה ספקטרומטר מסה קירור והקפאה
- פתח רצף חדש על תוכנת ניתוח נתוני IMS (ראה טבלה של חומרים). הגדר את רוחב רסטר הרזולוציה המרחבית הרצויה, לפחות 50 מיקרומטר.
- להעלות את התמונה האופטי של השקופית לתוכנה ניתוח וללמד קבע שלוש נקודות בעזרת של צמתים ב האיקסים נמשך בכל פינה.
- לייעד אזורי עניין עבור הדמיה בתוכנה רכישה ותנו שם אותם בהתאם.
- לכייל את המכשיר באמצעות התוכנה רכישת נתונים (ראה טבלה של חומרים) בתוך 5 ppm שגיאה.
- להציל את שיטת אופטימיזציה ולהתחיל לרוץ. הניסוי הזה מיטבי בפרמטרים הבאים: קוטביות = חיובי, גלאי = Reflectron, לייזר גודל = 2, עוצמת הלייזר = 50%, המשקף רווח גלאי מצב = 3 x.
6. עיבוד נתוני IMS
- ייבוא קובץ .mis לתוך תוכנה סטטיסטית (ראה טבלה של חומרים) לצורך ניתוח של משמעות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שקופית מיובשים בצורה אופטימלית איטו תגרום מדגם מיובש שטוח עם מינימלי אין קמטים על פני השטח של agarose ושל חלקים agarose לשמור על הפרדה מרחבית על השקופית (איור 3). איור 3A מראה ייבוש אופטימלית, בעוד דמות 3B מראה הקמטים שיש להימנע. מיטוב זה דורש זהירות ניטור של השקופית בתנור, כמו באותו הזמן יכול להשתנות בהתאם ללחות יחסית. בעוד קמטים מעט יכול להשפיע על הגובה, ולכן דיוק מסת השמ אותות, קמטים קלים לא תשפיע על איכות הנתונים. לכן, ניתן עדיין לנתח כל agarose כי בסופו של דבר יש קמטים קלה באמצעות MS MALDI-TOF. השקופית יש לייבשם לגמרי או שזה עלול לגרום לפיצוץ של המדגם בסביבה ואקום גבוה של ספקטרומטר מסה MALDI-TOF.
מצעים אחרים מלבד agarose עשוי לפעול, אך במקרים רבים לא לשמור על שלמות מבנית שלהם על ייבוש או הסרה של החדר טוב, כשהתוצאה היא מתפשטת על פני שקופיות איטו אובדן מידע מרחבי. לדוגמה, קודם לכן בדקנו קולגן כמו מצע למוצלחת בהפצת ואת אובדן מידע מרחבי תא טוב היה מוסר (נתונים לא מוצג). הרקמה בשימוש צריך להיות במרכז הבאר אם זה המלאה, או במרכז המשולש חצי אם זה מחולק, כך רכישת נתוני IMS לא מזוהם עם אפקטי קצוות. איור 4 מציג דוגמאות של רקמה ממוקם בצורה אופטימלית (לוח א') ורקמות ממוקם קשות (לוח ב'). ב- איור 4B, הרקמה ממוקם על קצה agarose אשר, כאשר עם תמונה, עלול לגרום שווא אותות המונית מן ההשפעות קצה, והוא אינו מאפשר למשתמשים תמונה של agarose סביב הרקמה, ופירוש הדבר מופרש אותות עשויים לפספס במהלך ניתוח. רקמות צריך להיות כמה שיותר קרוב למרכז ככל האפשר, כפי שמתואר ב איור 4A.
סדרה של ניסויים נקבע כי חדר 8-ובכן היה כלי הקיבול. הטוב ביותר של אינקובציה, לעומת צלחת 6-ובכן, צלחת 24-. טוב, כי תא 8-ובכן גורמת לפליטת מינימלית על התאים, ואילו דורשים חללים גדולים נוספים agarose לוחות כדי להעביר שקופיות איטו או פלדת אל-חלד בעקבות הדגירה16. צ'יימברס 8-ובכן המותגים כמה שקופיות קאמרית יכול לשמש, אך אלה עם הצדדים התחתון, במקביל דבק גומי הבארות להקל והוצאה קלה של מחיצה פלסטיק בשביל הבארות מפולגת. לוח 6-ובכן חומר הרבה יותר הנדרשים, התמודד עם קשיים עם יבוש שטחים גדולים כאלה. תא 24-ובכן היו גם בעיות במהלך ייבוש, כי האפקט מניסקוס היה ניכר הבארות לכן, פקקים מיובשים עם קצוות גבוה משמעותית. תא 8-ובכן לא תגרום האפקט מניסקוס כאשר agarose הוא מצופה ישירות במרכז של הבאר, תקעים agarose אינם חייבים להיות מועברים. בנוסף, לתא 8-ובכן מאפשר תנאים 8 נבדק או מבוקר על ניסוי יחיד. בהתאם הניסוי, זה עשוי להיות חשוב לכלול פקדים כגון בארות (1) ללא השחלות explants או תאים, (2) וולס עם תאים בלבד או (3) וולס עם השחלות explants בלבד. כי הכנת הדוגמא (ריכוז agarose ומדיה מדויק, כמות מטריקס, וכו ') שונה במקצת בין פועל, יש להשוות תנאים כאשר הם נרכשים על השקופית אותו.
לניסויים נוספים קבע שהיה שקופיות מצופים איטו הפלטפורמה הטובה ביותר הדגירה בהשוואה צלחת MALDI פלדה כי השקופית מאפשר אימות חזותי של התא המדינה והמיקום. למשל, באמצעות השקופית איטו, נוכל לאמת כי התאים יש מורפולוגיה תקינה, כי הם שומרים על הפצה הומוגנית ברחבי agarose לפני לייבוש הבאים16. השקופית יאפשר גם התאגדות של שורות תאים פלורסנט כנדרש. בנוסף, הסרת החדר לפני לייבוש נדרש כדי לשמור על מכלול של התקע agarose. אם לשקופית זו desiccated עם תא 8-ובכן דבקה, הפלסטיק מושך את התקע agarose לגזרים ותוצאות ובסדקי הגדולות פקקים. איור 5 מדגים בעיות הפנים כאשר התא אינו מוסר לפני ייבוש.
בעת ניתוח אוכלוסיות תאים, חשוב כי הרזולוציה המרחבית היא מיקרומטר לפחות 50 להתחיל ללכוד גודלו הקטן של אינטראקציות רקמות וסלולר. עם מטריצה מותז, ניתן להשיג 5 מיקרומטר רזולוציה, אבל זה מאריך את הזמן הכולל כדי לאסוף את הנתונים ספקטרומטר מסה בזמן מניב תוצאות דומות. רזולוציה מרחבית תלויה גם היכולת להתמקד הלייזר בספקטרומטר מסה MALDI-TOF.
בסך הכל, אנו יש אופטימיזציה תוכנית התקנה זו השקופית בצורה הטובה ביותר לזהות מולקולות קטנות החליפו coculture. לכן, במהלך ניתוח נתונים אנו מחפשים תכונות מולקולרית רק נוכחים או הם באופן משמעותי יותר בשפע הכנס agarose המייצג את המצב הביולוגי של ריבית. כי יש האפשרות לכלול שבע פקדים אחרים, התנאים בשקופית, אפשר להשיג חזותי, הצטייד תוכנה סטטיסטית המיועדת נתוני IMS. תהליך dereplication בעקבות הגילוי של ההמונים במרחב הרלוונטי הוא מקיף כך orthogonally אפשר להשיג נתונים בנפח גדול ושברים ברזולוציה גבוהה. הצעד הראשון שאנו לוקחים dereplication הוא חיפוש של המסה הנומינלי דרך מסד נתונים, כגון האדם Metabolome מסד נתונים (HMDB) של המטבוליטים יונקים. רוב המולקולות של מסד הנתונים יש מספר משמעותי של ספקטרה כיסוי טכניקות רבות לשם השוואה לנתונים ניסיוני. ברגע ההמונים הנומינלי מולקולות מועמד פוטנציאלי כזהות בשם שלהם, לעתים קרובות אפשר להשוות נתונים פיזיים כגון פיצול MS/MS, פרופיל UV ומשך הזמן בין המבנה המועמד תקן.
לדוגמה, זיהוי של נוראדרנלין ב coculture של tumorigenic תאים FTE מודגרות עם רקמות השחלה אומתה כי שיטה זו IMS היא מסוגלת לאתר הרלוונטי מולקולות קטנות מ זו מערכת16. איור 6 מתאר את הרגישות של שלשול IMS, מציג את סוג הנתונים אחד יכול לצפות לפי הפרוטוקול עבור צ'יימברס המלאה. איור 7 מציג באופן דומה נציג נתונים עבור ההתקנה קאמרית מחולקת.
איור 1: זרימת עבודה עבור הכנת הדוגמא של המלאה coculture. (א) Adhere הקאמרית 8-ובכן לצד ואטימה של שקופיות מצופים איטו. (B) המקום חצוי השחלות במרכז של בארות תנאים coculture. (ג) להוסיף 300 µL של השעיה תא agarose ישירות לתוך בארות. ודא כי ישנם אין בועות אוויר, כי השחלה נשאר במרכז של הבאר. אם agarose pipetted מופרעת השחלה, בעדינות שימוש בקצה pipet כדי למרכז את זה לפני agarose מתקררת. (ד) לאחר ארבעה ימי דגירה (או אחרת אופטימיזציה זמן) להסיר הקאמרית 8-ובכן משקופית לשקופית. אם agarose נשאר צמוד לתא, בעדינות ניתוק בחיבור agarose מן החדר בעזרת מרית, לשנות את המיקום בשקופית. Agarose לא דוגלים אל השקופית, כך זה יהיה להעביר בקלות. לצייר 'X' על כל פינה של השקופית, לצלם תמונה. (E) יבש השקופית בתנור 37 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות, סיבוב 90 מעלות כל שעה. Agarose צריך להיות desiccated באופן מלא, צריך לשכב על השקופית. (F) החל מטריצה של בחירה באמצעות ריסוס או מברשת אוויר כדי להחליק. מטריקס שכבה צריך להיות גלוי כמו צהוב. לסרוק את השקופית על סורק ברזולוציה של 1200 dpi ולהוסיף calibrants או תקנים עבור ניתוח MALDI-TOF MS. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: זרימת עבודה עבור הכנת הדוגמא של coculture מחולק. (א) גזור לעקוב מתוך מדיה אגן (~ 13 מ מ) ולהבטיח כי הצדדים הם ישר. (B) צרף הקאמרית 8-ובכן לצד ואטימה של שקופיות מצופים איטו. (ג) להוסיף חוצצים באלכסון לתוך בארות. (ד) µL 150 להוסיף תרבית תאים ב- agarose לצד אחד של קו מפריד, לאפשר agarose להתקרר, ולהסיר קו מפריד. (E) הוסף השחלה למרכז של חצי ריק היטב ולכסות עם 150 µL של השעיה agarose ומדיה. איור זה לשכפל באישור אבץ ואח 201816. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: קמטים, תקעים agarose. קמטים שיכולים להיווצר פקקים agarose אם השקופית נשאר בתנור יותר מדי זמן. זה לא יימנע המדגם מניתוח MALDI-TOF MS אך עלול להשפיע על איכות הנתונים. (א) תמונה של שקופיות מיובשים בצורה אופטימלית. כל agarose המקיפים את רקמת השחלה הוא שטוח לגמרי, ללא קמטים, מתן בשפע באזור לניתוח IMS. (B) תמונה של שקופית לקוי מיובשים עם agarose מקומט לאורך כל המדגם. איור זה לשכפל באישור אבץ ואח 201816. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: מיצוב של רקמת. המיקום של רקמות בדוגמת מיובשים חשוב מאוד עבור רכישת נתונים. (א) יבשים תקעים agarose של צ'יימברס מחולקת להראות את השחלה במרכז אחד מחצית סביב הבאר, היא אופטימלית עבור הדמיה. (B) מיובשים תקעים agarose לשכת מחולקת איפה השחלה היה לא ממורכז דגירה או ייבוש. רקמת השחלה מיובשים על היקף השתלים agarose, ולכן לא יכול להיות מנותח. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: ייבוש שקופיות עם התא. כאשר השקופית מוגדר בתנור לפני הסרת קאמרית, פקקים agarose חזק יותר לדבוק הפלסטיק מאשר לעצמם ולהתחיל להפריד בחום. התוצאה סדקים חמורים של agarose, אדהזיה הקטן לשקופית עצמה. סדקים גדולים זה אינם להצטיינות ניתוח IMS. העליון: החלק לאחר 2 h לייבוש עם 8-ובכן קאמרית דבקה. תקעים agarose כל אלא שניים סדוק דרך המרכז עקב הידבקות לתא 8-ובכן. למטה: החלק לאחר הסרת הקאמרית 8-. טוב. הכנס agarose אחד בלבד נותר בשקופית. איור זה לשכפל באישור אבץ ואח 201816. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6: גילוי אותות ייחודיים. בעת השוואת תנאים 8, זה אפשרי לגילוי אותות ייחודיים בתנאי בודד אחד. תמונת השקופית (A) מיובשים משמש כדי ללמד MALDI-TOF ספקטרומטר מסה באילו אזורים לשיקוף. כאן יש לנו נבחרת אזורים קטנים סביב הרקמה השחלות עבור IMS ב 50 מיקרומטר (B) A מייצגת תמונת אות מ/z זה upregulated במצב אחד נגד כל שמונת בשקופית באותו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 7: נציג נתונים מהגדרת קאמרית מפולגת. רקמות השחלה מחולקת לרמות בלבן. מ/z 112 מופרש מן המחצית של טוב המכיל את השחלה. IMS בוצעה ב 50 מיקרומטר. איור זה לשכפל באישור אבץ ואח 201816. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
יש גופה הגוברת של ראיות שמסבך את התפקיד של נוראדרנלין HGSOC12,17,18, טכניקה זו תרמה מכניסטית יותר מידע. עם תנאים ביולוגית לפחות שמונה קיים על השקופית אותו, השיטה יכולה להתחשב ביולוגית פקדים כגון ג'ין, ירידה לפרטים תא, כמו גם הפקדים מדיה IMS יחיד להפעיל. בעוד השיטה היה מותאם להעריך החליפו מולקולות קטנות במודל של גרורות הראשי ב HGSOC, תא כלשהו או סוג הרקמה ניתן להציב אותם agarose. הרבה כדי לנתח מגוון רחב של שאלות ביולוגיות ועם מצבי מחלה.
אחד הצעדים החשובים ביותר בפרוטוקול זה להבטיח כי סוגי רקמות או התא הם בסמיכות אחד לשני ולא נמצאים במרכז התקע agarose. שיקול חשוב נוסף הוא אופטימיזציה של זמן הייבוש השקופית כולה. שיטה זו הייתה ממוטב באמצעות רקמות השחלה, אשר מיובשים בקלות וכתוצאה שגודלם קטן מעט סיבוכים ייבוש. עם זאת, רקמות אחרות, עם הרכב שונה כגון שומן, יש פרופילים ייבוש שונים, ולכן מחייבים שימוש יותר נרחב אופטימיזציה לייבוש. לאחר ייבוש מוטבה עבור המדגם ביולוגי, זרימת העבודה הנותרת צריך לדרוש שינוי מינימלי בלבד.
במהלך הרכישה המוני ספקטרלי, סביר כי פרויקטים רבים יחייבו הניתוח של קבוצות מורכבות מלבד מולקולות קטנות. הפרמטרים IMS עבור רכישה ומכירה את הבחירה של מטריקס, לכן, צריך להיות מותאם כדי ליצור את הנתונים הטוב ביותר עבור המטרה בהתאמה, אם הוא ידוע. בנוסף, אנחנו רק אמורה לבצע רכישת נתונים במצב חיובי עם מטריצה CHCA:DHB 50: 50, אבל מצב שלילי הניסויים עשויים להעדיף סוג שונה של מטריקס, מולקולות גדולות יותר יתגלה בקלות רבה יותר במטריצה שונה גם כן. השיטה ניתן עם מגוון רחב המוני בגישה untargeted או עם המוני מצומצמות לחיפוש ממוקד. במקרה של שיטת שנדונו לעיל, מולקולות קטנות היו ביעד של ריבית כי המוקד היה לזהות מולקולות הוחלפו דרך agarose בין נציגים תאים ורקמות. למרות שאנחנו לא טוענים את המגבלות מבחינת גודל ומבנה לעכב את התנועה דרך agarose, המטרה שלנו הייתה לזהות מולקולות קטנות, אז החלטת מטריקס ופרמטרים MALDI-TOF MS שלנו עברו אופטימציה עבור מטרה זו. ניסויים עתידיים מפותחים כדי למקד שומנים וחלבונים אשר ייתכן הוחמצו בשיטת הרכישה המקורית שלנו.
בנוסף המגבלה של תרכובת מחלקה לזיהוי, שיטה זו מחייבת גם כי התאים להיות תואמת ל- agarose, כי דגימת הרקמות (אם משתמשים) להיות מותאם כדי להתאים לתוך חדר שמונה-. טוב. רקמות מסוימות ניתן להתאים בארות גדול יותר אם התנאים הביולוגיים פחות נדרשים לשם השוואה, אבל זה הכרחי כי הרקמה שנבחר הוא מסוגל ייבוש לגובה אחיד של פחות מ- 100 עד 200 מיקרומטר לאחר לייבוש4. מספר דגימות ביולוגיות יוכל להעריך כגון סוג תא אחד או יותר בתקשורת עם טישו. כי הכנת המדגם הוא מסוגל להפריד במרחב תרביות תאים מבוססי agarose, זה ניתן להקצות דמיינו מ/z 's למקור תא תרבות המבוססת על דפוסים שנצפו דיפוזיה.
באמצעות IMS ללמוד רקמות מקטעים דגימות אנושי או העכבר הטרנסגניים מודלים recapitulates המורכבות של רקמות. עם זאת, דגימות האנושי הם קשה להשיג, אשר ניתן להגביל באופן דרמטי את היכולת ללמוד דברים כמו התקדמות המחלה. רקמה מתוך מודלים מהונדס העכבר ניתן לאסוף בנקודות זמן מוגדרים היטב. אבל, מודלים העכבר יכול להיות זמן רב ויקר לפתח. בנוסף, המורכבות מלא של רקמות האמיתי של מודלים אלה. שנינו יכולים להקשות להעריך במדויק תקשורת בין תאים ספציפיים או רקמות. לעומת זאת, השיטה המוצגת כאן היא מאוד יכולת הסתגלות. יכול להיות cocultured ברקמות שונות או שורות תאים בשקופית אותו לבחון הבדלים בתקשורת. לדוגמה, תאים נורמליים או תאים סרטניים מן הרקמה זהה יכולים להיות תרבותי בשקופית אותו כדי להבין את ההבדלים עקב השינוי. הזמן קורס לימודי עלולה לחשוף את הרומן cascades איתות בין תאים, או מעכבי מולקולה קטנה ו/או RNAi יכול לשלב לבחון את התפקיד של מולקולות איתות ספציפיים או מטבוליטים. אנו מאמינים שהאפשרויות הללו יגרום טכניקה זו שימושית עבור הלומדים לתקשורת במגוון רחב של הקשרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף
Acknowledgments
מימון סופק על ידי האיחוד ביו שיקגו עם תמיכה מקרנות סרל ב שיקגו הקהילה הקרן (C-076) (L.M.S.); אוניברסיטת אילינוי בשיקגו הפעלה קרנות (L.M.S.); מענק 543296 של הברית הקרן לחקר סרטן השחלות (רופאה); UG3 ES029073 (J.E.B.), על ידי המרכז הלאומי עבור קידום Translational מדעי, המכון הלאומי לבריאות, דרך גרנט UL1TR002003 (ג'ב & LMS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Falcon tubes | Denville | C1017-O | To collect cells |
| 8-well chamber (Millipore EZ-slide chamber) | Millipore | PEZGS0816 | Repurposed from Millipore Millicell EZ-slide chamber slide |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998-4L | Solvent for sprayed matrix |
| Alpha Minimum Essential Medium (αMEM) | Fisher | 10-022-CV | Cell culture media |
| Autoflex speed MALDI-TOF LRF | Bruker | For IMS data analysis | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | To collect cells and remove supernatant |
| CHCA Matrix | Bruker Daltonic | 8201344 | Matrix sprayed onto dried slide |
| DHB Matrix | Bruker Daltonic | 8201346 | Matrix sprayed onto dried slide |
| Disposable Scalpels | Fisher | 22-079-707 | For removal of the ovaries |
| Dissecting Scissors | Fisher | 13-804-6 | For removal of the ovaries |
| DMEM Media | Gibco | 11995-065 | Media mixed with agarose |
| epidermal growth factor | Peprotech Inc. | 100-15 | Cell culture media supplement |
| Eppendorf tubes | Genesee Scientific | 22-282 | For agarose aliquots |
| Estradiol-17β | Simga-Aldrich | E2758 | Cell culture media supplement |
| Fetal Bovine Serum | Denville | fb5001 | Cell culture media supplement |
| FlexControl 3.4 | Bruker Daltonic | IMS data acquisition software | |
| FlexImaging 4.1 | Bruker Daltonic | IMS data analysis software | |
| Forceps (fine) | Fsiher | 22-327379 | For removal of the ovaries |
| Gentamycin | Cellgro | 30-005-CR | Cell culture media supplement |
| Insulin, Transferrin, Selenium (ITS) | Sigma-Aldrich | 11074547001 | Cell culture media supplement |
| ITO-coated slide | Bruker | 8237001 | Platform for co-culture incubation |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 11415064 | Media used during tissue dissection |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | Cell culture media supplement |
| Low-melting agarose | Sigma-Aldrich | A9414-10G | Mixed with media for plating |
| Media basin | Corning | 4870 | Used to cut plastic dividers for divided chambers |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | Cell culture media supplement |
| Peptide Calibration Standard | Bruker Daltonic | 8206195 | Calibrant for medium mass range |
| Phophorus red | Sigma-Aldrich | 343-242-5G | Calibrant for low mass range |
| SCiLS Lab 2015 | Bruker Daltonic | IMS data statistical analysis | |
| Surgical Forceps (blunt) | Fisher | 08-875-8B | For removal of the ovaries |
| TFA | Fisher Technologies | A116-50 | Added to matrix solution |
| TM Sprayer | HTX Technologies | For applying matrix |
References
- Paine, M. R., et al. Whole Reproductive System Non-Negative Matrix Factorization Mass Spectrometry Imaging of an Early-Stage Ovarian Cancer Mouse Model. PLoS One. 11 (5), e0154837 (2016).
- Yang, Y. L., Xu, Y., Straight, P., Dorrestein, P. C. Translating Metabolic Exchange with Imaging Mass Spectrometry. Nature Chemical Biology. 5 (12), 885-887 (2009).
- Li, H., Hummon, A. B. Imaging Mass Spectrometry of Three-Dimensional Cell Culture Systems. Analytical Chemistry. 83 (22), 8794-8801 (2011).
- Yang, J. Y., et al. Primer on Agar-Based Microbial Imaging Mass Spectrometry. Journal of Bacteriology. 194 (22), 6023-6028 (2012).
- Coscia, F., et al. Integrative Proteomic Profiling of Ovarian Cancer Cell Lines Reveals Precursor Cell Associated Proteins and Functional Status. Nature Communications. 7, 12645 (2016).
- Labidi-Galy, S. I., et al. High Grade Serous Ovarian Carcinomas Originate in the Fallopian Tube. Nature Communications. 8 (1), (2018).
- Klinkebiel, D., Zhang, W., Akers, S. N., Odunsi, K., Karpf, A. R. DNA Methylome Analyses Implicate Fallopian Tube Epithelia as the Origin for High-Grade Serous Ovarian Cancer. Molecular Cancer Research. 14 (9), 787-794 (2016).
- Falconer, H., Yin, L., Gronberg, H., Altman, D. Ovarian Cancer Risk After Salpingectomy: A Nationwide Population-Based Study. JNCI Journal of the National Cancer Institute. 107 (2), dju410 (2015).
- Dean, M., Davis, D. A., Burdette, J. E. Activin A Stimulates Migration of the Fallopian Tube Epithelium, an Origin of High-Grade Serous Ovarian Cancer, through Non-Canonical Signaling. Cancer Letters. 391, 114-124 (2017).
- King, S. M., Burdette, J. E. Evaluating the Progenitor Cells of Ovarian Cancer: Analysis of Current Animal Models. BMB Reports. 44 (7), 435 (2011).
- Reznik, E., et al. Landscape of Metabolic Variation across Tumor Types. Cell Systems. 6 (3), 301-313 (2018).
- Watkins, J. L., et al. Clinical Impact of Selective and Nonselective Beta-Blockers on Survival in Patients with Ovarian Cancer: Beta-Blockers and Ovarian Cancer Survival. Cancer. 121 (19), 3444-3451 (2015).
- Lutgendorf, S. K., et al. Stress-Related Mediators Stimulate Vascular Endothelial Growth Factor Secretion by Two Ovarian Cancer Cell Lines. Clinical Cancer Research. 9 (12), 4514-4521 (2003).
- Sood, A. K. Stress Hormone-Mediated Invasion of Ovarian Cancer Cells. Clinical Cancer Research. 12 (2), 369-375 (2006).
- Hoffmann, T., Dorrestein, P. C. Homogeneous Matrix Deposition on Dried Agar for MALDI Imaging Mass Spectrometry of Microbial Cultures. Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 26 (11), 1959-1962 (2015).
- Zink, K. E., Dean, M., Burdette, J. E., Sanchez, L. M. Imaging Mass Spectrometry Reveals Crosstalk between the Fallopian Tube and the Ovary That Drives Primary Metastasis of Ovarian Cancer. ACS Central Science. 4 (10), 1360-1370 (2018).
- Armaiz-Pena, G. N., et al. Src Activation by β-Adrenoreceptors Is a Key Switch for Tumour Metastasis. Nature Communications. 4, 1403 (2013).
- Choi, M. J., et al. HTERT Mediates Norepinephrine-Induced Slug Expression and Ovarian Cancer Aggressiveness. Oncogene. 34 (26), 3402 (2015).
