Summary
세포 및 조직 coculture 이미징 질량 분석을 사용 하 여 작은 분자 exchange 검색에 맞게 샘플 준비 하는 새로운 방법 개발 되었다.
Abstract
질량 분석 (IMS) 이미징 정기적으로에 적용 된 세 가지 유형의 샘플: 조직 섹션, spheroids, 그리고 미생물 식민지. 이러한 샘플 유형은 관심사의 생물학 견본에서 단백질, 지질, 및 대사 산물의 분포를 시각화 하는 매트릭스 보조 레이저 탈 착/이온화 시간의 비행 질량 분석 (MS MALDI TOF)를 사용 하 여 분석 되었습니다. 우리는 포유류 세포 배양에서 agarose로 시드 여 암, 화학 통신 식별 underexplored 접근을 해결 하기 위해 3 개의 이전 응용 프로그램의 장점을 결합 하 여 새로운 샘플 준비 방법 개발 건강 한 조직 샘플의 건조 뒤 coculture. 포유류 조직 및 세포는 조직과 세포 사이 보급을 통해 화학 통신을 허용 하는 가까운 근접에서 cocultured. 특정 시간 점에서 agarose 기반 샘플 미생물 식민지 IMS 분석에 대 한 준비와 같은 방식으로 건조 됩니다. 우리의 방법은 고급 액 난소 암 전이 동안 난소와 상호 작용 하는 나 팔 관에서 파생 된 간의 통신 모델을 개발 되었다. 샘플 준비의 최적화 결과 난소 microenvironment에서 주요 화학 성분으로 norepinephrine의 식별. 새로 개발된 된이 메서드는 인접 한 셀 또는 조직 간의 화학 커뮤니케이션의 이해를 필요로 하는 다른 생물 학적 시스템에 적용할 수 있습니다.
Introduction
3 널리 사용 되는 응용 프로그램에 기능을 분자의 공간 분포 특성에 최적화 된 질량 분석 (IMS) 이미징: 조직 슬라이스, spheroids, 및 미생물 식민지1,2,3. 조직 조각 호스트, 타겟 또는 특정 대량 범위 내에서 타겟이 불분명 한 생물학 상황의 맥락에서 대사 산물의 지역화를 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. 그러나, 건강 한 조직 질병 상태, 예를 들어 종양에 비교 될 때 가장 중요 하 고 명백한 분자 기능 사이의 차이점은. 그러나 IMS 이렇게 질병 바이오 마커의 검출에 특히 적응은,, 질병의 진행 (예: 종양 등급)에 개별 단계에서 조직 샘플을 확보 하는 걸로의 개시에 대 한 중요 한 될 수 있는 신호 식별은 질병입니다. 공간을 통해 정보 교환 많은 생물 학적 시스템의 유비 쿼터 스 기능 이며 조직 조각이 동적 화학 릴레이 캡처할 수 없습니다. 화학 및 확산을 시각화 수 있는 1 개의 기술은 이다 한 천 배지;에 성장 하는 미생물 식민지의 IMS 작은 분자는 agar 전역을 통해 확산을 수 있으며 매트릭스 보조 레이저 탈 착 또는 이온화 (MALDI-TOF) 질량 분석4를 통해 캡처할 수 있습니다. 이 성장 설치 개별 생물 엔터티 (식민지) 간에 교환 하는 분자를 식별 하는 데 수 고 또한 대사 산물 생산의 방향성을 결정할 수 있습니다. 원래 미생물 식민지 성장을 위해 설계 된 플랫폼 적응 포유류 세포, 성장 조직 explants의 기본 신진 대사를 탐험 하 고 IMS는 생체 외에서 포유류 시스템에서 동적 화학 교환 평가 하는 데 사용 되었다.
지난 몇 년 동안, 그것은 분명 고급 액 난소 암 (HGSOC) 종종 나 팔 관 상피 (FTE)에서 유래 하 고 다음 초기 질병 개발5,6, 중 난소에 metastasizes 되고있다 7 , 8. tumorigenic FTE 확산 어디 결국 큰 종양 형성 및 전이 더, 난소 세포 이유 현재 명확 하지 않다. 이전 연구는 난소; 하 주 전이 난소 단백질의 역할에 집중 그러나, 그것은 최근 증명 되었습니다 tumorigenic 조직에 건강에서 전환 세포질 물질 대사의 대규모 장애 발생 및 작은 분자9,,1011의 생산을 변경. 따라서, 우리가 가설 작은 분자는 FTE 및 난소 사이 교환 분할 책임 있는 HGSOC의 주 전이 될 수 있습니다.
우리의 새로 개발된 된 IMS 절차를 사용 하 여, 우리 결정 coculture tumorigenic FTE 및 건강 한 난소 조직을 난소에서 norepinephrine의 생산을 유도 한다. 그러나, 다른 세포 유형 또는 정상적인 FTE 셀이이 효과 유도 하지 않았다. 이 방법의 특별 한 혜택은 분자 생산 및 실제 분자를 나타내는 신호를 교환 구상 될 수 있다, 그래서 심지어는 coculture에서는 신호의 소스를 확인할 수 있습니다. 이것이 무 균된 샘플의 분석에 이점을 모든 공간 정보가 손실 됩니다. 우리의 모델 시스템에서 명확 하 게 난소에 norepinephrine의 생산을 할당할 수 있었습니다. Norepinephrine 전이 및 chemoresistance 난소 암에 연결 되었습니다 및이 분자의 우리의 감지 소설 IMS 메서드 생물학 관련 분자12,13, 를 찾아낼 수 있습니다 확인 했다 14.이 유효성 검사 제안 하는 IMS의이 새로운 응용 프로그램 그룹을 coculture 환경에서 작은 분자를 식별 하 고 셀 변환에 영향을 주는 초기 이벤트를 이해 하는 것을 시도 하는 연구를 특히 도움이 될 수 있습니다 그리고 전이입니다. 이 방법의 전반적인 목표는 정체성과 조직 및 장기, 3D 세포 배양 체 외에서 또는 vivo 전 조직에 의해 표현 사이의 교환 동안 작은 분자의 공간적 분포를 명료 하 게.
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Protocol
모든 동물 절차 지침에 따라 국립 연구소의 건강 관리 및 실험 동물의 사용 되었고, 시카고에 일리노이의 대학에서 기관 동물 사용 관리 (IACUC) 위원회에 의해 승인.
1입니다. 시 약의 준비
- Murine oviductal 상피 (모에) 세포가 5% CO2 보충 10% 태아 둔감 한 혈 청 알파 최소 필수 매체 (αMEM) 미디어에서 습도 인큐베이터에서 37 ° C에서 2 m L-글루타민, 10 mg/mL 인슐린, 올려진다, m (FBS), 셀레늄 (ITS) 유지 1.8 ng/mL 표 피 성장 인자 (EGF), 100 U/mL 페니실린-스, 1 mg/mL gentamycin 및 18.2 ng/mL estradiol-17β. 3-4 일 마다 셀을 통과, 같은 날에 충분 한 셀이 보장 쥐 것 이다 희생.
- 증류수 50ml와 낮은 녹는 agarose의 1 g을 혼합 하 여 2 %agarose 준비 합니다. 압력솥 agarose, 냉각, 그리고 2 mL에 다음 약 수 (1 mL) 튜브 ( 재료의 표참조) agarose 고형화 하기 전에. Agarose는-20 ° C에서 무기한으로 저장할 수 있습니다.
- 1 x Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM) 미디어의 적어도 2 개 mL를 준비 합니다.
- MALDI TOF MS에 대 한 행렬에 대 한 준비 10 mL 5 mg/mL의 1:1 알파-cyano-4-hyroxycinnamic 산 (CHCA): dihydroxybenzoic 산 (DHB) ( 재료의 표참조) 90: 10 ACN:H2O + 0.1 %trifluoroacetic 산 (TFA). 매트릭스를 해산 때까지 솔루션을 sonicate.
2. 마우스 식민지 및 난소 제거
- 표준 주택 절차를 사용 하 여 CD-1 쥐의 번 식 쌍을 유지 합니다. 출산 일 가까이 확인 쥐 매일 있도록 새끼 나이 알려져 있다.
- NIH 지침 당 CO2 흡입에 의해 나이 16-18 일에 강아지를 안락사. CO2 (100%)를 제공 흐름 율 10%-20%의 용량 분당 고 호흡 중지 했다 후에 2 분 동안 계속. 자 궁 경부 전위 여 안락사를 확인 합니다.
- 70% 에탄올에 잠수 하 여 모든 수술 장비를 소독. 따뜻한 Leibovitz의 L-15 미디어 1 x 페니실린-37 ° c.에 스
- 젖은 머리와 오염 최소화 하 고 지역 소독 70% 에탄올과 복 부 표면. 잡고 피부 복 벽을 덮고 큰 있도록 무딘 집게와 사용에 대 한 수술가 위를 사용 하 여 V 자형 잘라 피부와 복 벽을 통해 내부 장기를 노출.
- 쪽 집게를 사용 하 여 내부 장기를 이동 합니다. 개별적으로 각 자 궁 경적 미세 집게로을 약간 들어올립니다.
- 난소를, 신장 바로 아래 자 궁 경적의 끝에 있을 것입니다 찾습니다. 수술가 위를 사용 하 여 결합 조직의 무료 난소를 해 부. 다음, 반으로 난소 나 팔을 잘라.
- 난소, 수 란 관, 그리고 약 하나 이동 미리 따뜻하게 Leibovitz L-15 미디어 각 자 궁 경적의 절반.
- 해 현미경으로 신중 하 게는 수 란 관, 부르사, 및 어떤 지방 조직에서 자유롭게 주변 부르사에서 각 난소를 이동 합니다. Leibovitz의 L-15 미디어의 새로운 요리를 각 난소를 이동 합니다.
- 축방향 반으로 잘라 각 난소. 난소 조각 (지금 이라고 explants) agarose의 도금까지 37 ° C에서 보관 하십시오.
3. 설정 하 고 Cocultures에 대 한 이토 처리 슬라이드 잠복기
-
전적인된 cocultures
- 뜨거운 접시에 70 ° C에서 agarose 유동화
- 인듐 tinoxide (이토) 위에 8 잘 분배기를 배치-대우 슬라이드 (그림 1A). 구분선에 고무 바닥 슬라이드, 접착 보조 하지만 새 또는 우물 사이 혼합 되도록 agarose 도금 동안 지속적인 부드러운 하향 압력을 적용 해야 합니다.
- 15 mL 원뿔 튜브, 분리기 (800 rpm에서 5 분), 세포를 수집 하 고 50 k resuspend 1 x DMEM 미디어에서 150 µ L 당 세포. 다른 셀 밀도 최적의 경우이 단계에서 세포 현 탁 액은 2 배 최종 밀도 원하는 (예를 들어,에 대 한 300 µ L,이 단계에서 세포 밀도에서 50, 000 셀의 최종 농도 50, 000 셀 150 µ L에) 있는지 확인 합니다.
- 세포 배양을 도금 하기 전에 난소 explant 추가 (그림 1B)의 센터에.
- 개별 2 mL 튜브 도금 직전에 각 세포 배양을 agarose를 추가 합니다. 각 잘 세포 현 탁 액의 200 µ L 및 2 mL 튜브에서 가스용 용기 agarose의 200 µ L를 결합 하 여. 예를 들어 4 개의 우물, 세포 현 탁 액의 800 µ L 및 2 %agarose 800 µ L를 결합 한다. 어떤 혼합, 남아 있을 것입니다 하지만 pipetting 동안 기포를 방지 필요 약간 이상 만들기.
- 바로 그 세포 배양을 도금 하기 전에 개별 셀 문화 agarose를 추가 합니다. agarose는 분 아래에서 시원한, 그래서 접시 빨리 준비 될 것 이다.
- 즉시 각 음 (그림 1C)에 셀/agarose 혼합물의 300 µ L를 추가 합니다. 그림 1 c 3 셀 조건 및 하나의 미디어 상태, 각 도금와 난소 없이 보여줍니다.
- 습도 인큐베이터에서 37 ° C, 5% CO2 에서 슬라이드를 품 어.
-
분할된 Cocultures입니다.
- 디바이 더 얇은, 부드러운 플라스틱 (그림 2A)에서 잘라.
참고:이 실험 때문에 평평 하 고 얇은 멸 균 일회용 미디어 분 지의 측면을 사용 합니다. 우물 (~ 13 m m)의 사변에 snugly에 맞게 충분히 넓게 단지 그들을 잘라. - 뜨거운 접시에 70 ° C에서 agarose 유동화
- (그림 2B) 이토 처리 슬라이드 위에 8 잘 분배기를 놓습니다. 구분선에 고무 바닥 슬라이드, 접착 보조 하지만 새 또는 우물 사이 혼합 되도록 agarose 도금 동안 지속적인 부드러운 하향 압력을 적용 해야 합니다.
- 15 mL 원뿔 튜브, 분리기 (800 rpm에서 5 분), 세포를 수집 하 고 50 k resuspend 1 x DMEM 미디어에서 150 µ L 당 세포. 다른 셀 밀도 최적의 경우이 단계에서 세포 현 탁 액은 원하는 최종 밀도 x 2 있는지 확인 (예: 300 µ L에서 50, 000 셀의 최종 농도 대 한이 단계에서 세포 밀도 150 µ L에서 50000 셀).
- 우물 (그림 2C)에 대각선 플라스틱 분배기를 삽입 합니다.
- 도금 하기 전에 그냥 한 번에 한 각 세포 현 탁 액을 agarose를 추가 합니다. 각 잘 세포 현 탁 액의 100 µ L 및 2 mL 튜브에서 가스용 용기 agarose의 100 µ L를 결합 하 여. 예를 들어 4 개의 우물, 세포 배양의 400 µ L 및 2 %agarose 400 µ L를 결합 한다. 일부 셀/agarose 혼합물 남아 있을 것입니다 하지만 pipetting 동안 기포를 방지 필요 약간 이상 만들기.
- 바로 그 세포 배양을 도금 하기 전에 개별 셀 문화 agarose를 추가 합니다. agarose는 분 아래에서 시원한, 그래서 접시 빨리 준비 될 것 이다.
- 구분선의 1 개의 측에 셀/agarose 혼합물의 150 µ L 플레이트. Agarose 냉각 및 응고 (약 1 분) 분배기 (그림 2D) 제거를 허용 합니다.
- 난소 explant 우물의 빈 절반의 중앙에 배치 합니다. 난소, 그리고 우물 (그림 2E)의 올바른 측면에만 정상 장소 150 µ L media/agarose 혼합물.
- 습도 인큐베이터에서 37 ° C, 5% CO2 에서 슬라이드를 품 어.
- 디바이 더 얇은, 부드러운 플라스틱 (그림 2A)에서 잘라.
4. 건조 슬라이드 MALDI TOF MS에 대 한 준비
- 후 4 일 (또는 어떤 선호 시간 포인트) agarose 플러그 및 슬라이드 (그림 1D)에서 챔버 분배기를 제거. 부드럽게 편평한 주걱으로 약 실에서 agarose의 측면을 분리 하 고 부드럽게 당겨 챔버, 상향 되 고 어떤 agarose 플러그를 이동 하지 않도록 주의. 만약 그들이 이동 할 부드럽게 위치를 변경할 그들 그들은 서로 만지고 있다 그래야.
- 장소 4 h 약 37 ° C 오븐에서 슬라이드 마다 h 90 ° 회전 합니다.
참고: 슬라이드의 회전은 샘플에 걸쳐도 열 분포를 보장 하기 위해 중요 합니다. - 일단 건조, 오븐 (그림 1E)에서 슬라이드를 제거 합니다.
- 다음 매개 변수 (그림 1 층), 분무기를 사용 하 여 행렬 솔루션 적용: 온도 = 30 ° C, 유량 0.2 mL/min, 패스의 수를 = = 8, 방향 = 받는 사람, 참조 및 노즐 거리 = 40 m m.
참고: 매트릭스 분무기 대신 예술적인 에어브러쉬는 액체 매트릭스를 적용 사용할 수 있습니다. 같은 매트릭스 솔루션 스프레이, 사용할 수 있습니다 하지만 약 두 배나 많은 솔루션이 필요 합니다. 고정 되도록 세로로 응답 슬라이드와 슬라이드 스프레이 90 ° 각도에서 멀리 대략 1 개 발에서 (호프만15에서 적응) 매트릭스까지 레이어 표시 됩니다. - Calibrant의 1 µ L을 추가 (대상에 대 한 인 레드 < 500 다, 펩 티 드 혼합물 ( 재료의 표참조) 대상에 대 한 < 5000 다) 슬라이드에 명확한 자리를. 인 레드, 매트릭스와 혼합 되지 않음 필요 하지만 펩 티 드 혼합물을 이온화를 돕기 위해 매트릭스와 1:1 혼합물. Calibrant 건조 기다립니다.
- X를 그리기는 슬라이드의 각 모서리에 영구 마커를 사용 하 고 1200 dpi에서 카메라 또는 스캐너를 사용 하 여 광학 이미지.
5. 영상 질량 분석 데이터 수집
- IMS 데이터 분석 소프트웨어에 새로운 시퀀스를 엽니다 ( 재료의 표참조). 원하는 해상도, 50 µ m 래스터 폭을 설정 합니다.
- 슬라이드의 광학 이미지 분석 소프트웨어를 업로드 하 고 설정된 3에서 교차로 사용 하 여 가르쳐는 x의 각 모서리에 그려진.
- 영상 수집 소프트웨어에 대 한 관심 영역을 지정 하 고 그에 따라 그들의 이름을.
- 데이터 수집 소프트웨어를 사용 하 여 악기를 보정 ( 재료의 표참조) 5 ppm 오류 내.
- 최적화 된 메서드를 저장 하 고 실행을 시작 합니다. 이 실험 다음 매개 변수를 최적화: 극성 = 긍정, 검출기 Reflectron, 레이저 크기 = 2, 레이저 파워 = = 50%, 반사 모드 탐지기 이득 = 3 x.
6. 처리 IMS 데이터
- 통계 소프트웨어에.mis 파일 가져오기 ( 재료의 표참조) 의미의 분석을 위해.
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Representative Results
최적으로 말린된 이토 슬라이드와 평면 desiccated 샘플 귀 착될 것 이다 agarose와 agarose 조각을 슬라이드 (그림 3)에서 공간 별거를 유지 하는 표면에서 주름을 최소화. 그림 3A 보여줍니다 최적의 건조, 그림 3B 보여 주름을 피해 야 한다. 이 최적화에 주의 상대 습도에 따라 정확한 시간 수 다를 오븐에서 슬라이드의 모니터링이 필요 합니다. 주름을 약간 높이 영향을 미칠 수 따라서 IMS의 대량 정확도 신호 하는 동안 약간의 주름 데이터의 품질을 영향 하지 않습니다. 따라서, 궁극적으로 약간의 주름을가지고 어떤 agarose 여전히 MALDI TOF MS를 통해 분석할 수 있습니다. 슬라이드를 완전히 건조 해야 합니다 또는이 MALDI TOF 질량 분석기의 높은 진공 환경에서 샘플의 폭발으로 이어질 수 있습니다.
Agarose 이외 다른 기판 작동할 수 있지만 종종 건조 또는 이토 슬라이드 및 공간 정보 확산에 결과 잘 챔버의 제거 그들의 구조적 무결성을 유지 하지 않습니다. 예를 들어 우리는 이전 테스트 기판으로 콜라겐이 확산 귀착되 고 공간 정보 잘 실 었을 때의 손실 제거 (데이터 표시 되지 않음). 사용 하는 조직 이어야 한다 분할, 그렇지 않으면 우물의 센터에 또는 절반 삼각형의 센터에 그것은 분할 하는 경우 있도록 IMS 데이터 수집 가장자리 효과 함께 오염 되지. 그림 4 는 심하게 위치 조직 (패널 B) 최적 위치 조직 (패널 A)의 예를 보여 줍니다. 그림 4B에서 조직은 agarose의 가장자리에 있는, 몇 군데, 발생할 수 있습니다 때 가장자리 효과에서 false 대량 신호 이며 agarose 주변 조직, 즉 분 비 신호를 놓칠 수 있습니다 이미지를 사용자가 허용 하지 않습니다 동안 분석. 그림 4A에서 같이 조직, 센터에 가까운 해야 합니다.
일련의 실험 8 잘 챔버 6 잘 플레이트와 24-잘 접시, 보육에 대 한 최고의 선박이 발생 하기 때문에 8 잘 챔버는 셀에 최소한의 물결에 다른 큰 챔버 필요한 결정 agarose는 인큐베이션16다음 이토 또는 스테인레스 스틸 슬라이드에 옮겨질 석판. 8 잘 챔버 챔버 슬라이드의 여러 브랜드에서 사용할 수 있습니다, 하지만 그 우물의 접착 고무 바닥과 평행 면 쉽게 소개 및 분할된 웰 스에 대 한 플라스틱 분배기의 제거 촉진. 6 잘 플레이트 훨씬 더 많은 자료를 요구 하 고 같은 넓은 영역을 건조와 어려움에 직면. 24 잘 챔버 또한 문제가 건조 하는 동안 우물에서 초승달 모양 효과 분명 하기 때문에 따라서, 플러그는 상당히 높은 가장자리와 말린. agarose는 우물의 센터에 직접 도금 및 agarose 플러그 옮겨질 필요가 없을 때 8 잘 챔버 초승달 모양 적용에서 되지는지 않습니다. 또한, 8 음 챔버 8 조건 테스트 또는 하나의 실험에 대 한 제어를 할 수 있습니다. 실험에 따라 (1) 난소 explants 또는 셀, 셀만, 웰 스 (2) 또는 (3) 난소 explants만 함께 우물 우물 같은 컨트롤을 포함 하는 것이 중요 수 있습니다. 샘플 준비 (정확한 미디어와 agarose 농도, 매트릭스 금액, 등) 실행 사이의 약간 다릅니다, 때문에 그들은 동일한 슬라이드에서 얻어지지 때 조건 비교 한다.
추가 실험은 이토 코팅 슬라이드 스테이트와 위치 슬라이드 셀의 허용 하기 때문에 MALDI 강판에 비해 부 화에 대 한 최고의 플랫폼 했다 결정 했다. 예를 들어, 이토 슬라이드를 사용 하 여, 우리가 확인할 수 있습니다 셀 정상적인 형태를가지고 그들은 이전에 agarose 및 다음 건조16균일 분포를 유지. 필요에 따라 슬라이드 또한 형광 세포의 설립에 대 한 있게 됩니다. 또한, 이전에 건조 챔버의 제거 agarose 플러그의 전체를 유지 하기 위해 필요 합니다. 슬라이드와 함께 포장해 8 잘 챔버 준수, 플라스틱과 agarose 플러그를 끌어 당긴 다 떨어져 플러그에 큰 균열 발생. 그림 5 에서는 챔버 건조 이전에 제거 되지 않은 때 직면 하는 문제를 보여 줍니다.
세포 인구를 분석할 때 중요 한 공간 해상도 조직과 세포 상호 작용의 작은 크기를 캡처를 시작 하려면 적어도 50 µ m입니다. 분무 매트릭스, 5 µ m 해상도 달성 하는 것 이지만이 유사한 결과 양보 하는 동안 질량 분석 데이터를 수집 하기 위해 전체 시간을 길게. 공간적 해상도 또한 MALDI TOF 질량 분석기에 레이저 초점을 맞추는 기능에 따라.
전반적으로, 우리 가장 coculture에 교환된 작은 분자를 감지 하이 슬라이드 설치를 최적화 했습니다. 따라서, 데이터 분석 중 우리만 존재 또는 관심의 생물학적 상태를 나타내는 agarose 플러그에 훨씬 더 풍부한 분자 기능을 찾고 있습니다. 7 다른 컨트롤 및 슬라이드에 대 한 조건을 포함 하는 옵션 이므로 이것을 시각과 IMS 데이터 통계 소프트웨어 도움 얻을 수 있습니다. 공간 관련 대 중의 검출에 따라 우리의 dereplication 과정은 우리가 기가 고해상도 질량 및 조각화 데이터를 가져올 수 있도록 광범위 한. 우리는 dereplication에 대 한 첫 번째 단계는 데이터베이스, 포유류 대사 산물에 대 한 인간의 대사체 데이터베이스 (HMDB) 등을 통해 명목 질량의 검색입니다. 데이터베이스에 있는 분자의 대부분이 스펙트럼 비교 실험 데이터에 대 한 많은 기술을 다루는 수가 있다. 일단 명목상 대 중 그들의 상 상속 id로 잠재적인 후보 분자를가지고, 그것은 종종 MS/MS 조각화, UV, 프로필과 후보 구조와 표준 사이의 보존 기간 같은 물리적 데이터를 비교할 수 있습니다.
예를 들어 난소 조직을 incubated tumorigenic FTE 셀의 coculture에 norepinephrine의 식별이 IMS 메서드는이 시스템16에서 관련 작은 분자를 감지 능력을 검증 했다. 그림 6 한 전적인된 챔버에 대 한 프로토콜에 따라 기대할 수 있습니다 데이터의 종류를 보여주는 IMS 실행의 감도를 보여준다. 그림 7 은 유사 하 게 분할된 상공 회의소 설치에 대 한 대표적인 데이터를 보여준다.
그림 1: 전적인된 coculture의 샘플 준비에 대 한 워크플로. (A) ITO 코팅 슬라이드의 전도성 측면 Adhere 8 잘 챔버. (B) 장소 coculture 조건에 대 한 우물의 센터에서 난소를 절반 가까이 떨어졌다. (C) 우물에 직접 agarose/셀 서 스 펜 션의 추가 300 µ L. 없음 기포는 난소 우물의 센터에 남아 있는지 확인 합니다. Pipetted agarose는 난소를 방해 하는 경우 부드럽게는 agarose 냉각 하기 전에 센터를 피펫으로 팁을 사용 합니다. (D) 외피의 4 일 후 (또는 그렇지 않으면 시간 최적화) 8-잘 챔버 슬라이드에서 제거. Agarose 챔버에 연결 된 경우, 부드럽게 agarose 주걱을 사용 하 여 상공에서 플러그를 분리 하 고 슬라이드에 위치. agarose 이동 하는 것이 쉬울 것 이다 그래서 슬라이드, 준수 하지 것 이다. 슬라이드의 각 모서리에 'X' 그리고 사진의 찍을. (E) 퍼 4 h, 회전 90 ° 각 시간에 대 한 37 ° C 오븐에 슬라이드. Agarose 완전히 포장해 해야 하 고 슬라이드에 평평 거짓말 한다. (F) 슬라이드는 분무기 또는 어 브러시를 통해 선택의 적용 매트릭스. 매트릭스 레이어 표시 되어야 노란색으로. 1200 dpi 스캐너에 슬라이드를 스캔 하 고 calibrants 또는 MALDI TOF MS 분석에 대 한 표준을 추가 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 분할된 coculture의 샘플 준비에 대 한 워크플로. (A) 잘라내어 미디어 분 지 (~ 13 m m)에서 탭 양쪽 직선 인지 확인. (B) 연결 8 잘 챔버 이토 코팅 슬라이드의 전도성 측면. (C) 우물에 대각선 분배기를 삽입. (D) 추가 150 µ L 세포 배양 agarose 분배기의 1 개의 측에 냉각, agarose를 허용 하 고 구분선을 제거. (E) 추가 난소 미디어 agarose 정지의 150 µ L 빈 잘 반 하 고 커버의 센터. 이 그림은 아연 외. 201816허가 재현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: agarose 플러그에 주름. 너무 오랫동안 오븐에 남아 있는 슬라이드 경우 주름 agarose 플러그에 형성할 수 있다. 이 샘플 MALDI TOF MS 분석에서 배제 하지 하지만 데이터의 품질에 영향을 미칠 수 있습니다. (A) 최적 건조 슬라이드의 이미지. 모든 난소 조직을 둘러싼 agarose는 완전히 평평 하 고 주름, IMS 분석을 위한 충분 한 공간을 제공 무료로. (B) 샘플에 걸쳐 주름된 agarose 제대로 말린된 슬라이드의 이미지. 이 그림은 아연 외. 201816허가 재현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 조직의 위치. 말린된 샘플에 조직의 위치 데이터 수집을 위한 매우 중요 하다. (A) 분할된 챔버의 말린 agarose 플러그 한의 중심에는 난소를 보여은 이미징에 대 한 최적의 우물의 절반. (B) 난소는 하지 부 화 또는 건조에 대 한 중심으로 나누어 챔버의 agarose 플러그를 건조. 난소 조직 agarose 플러그의 둘레에 건조 하 고 그러므로 분석 될 수 없습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 건조 챔버와 슬라이드. 슬라이드 챔버 제거 전에 오븐에 설정 되어, agarose 플러그 그들 자신에 보다는 플라스틱 더 강력 하 게 준수 하 고 열에서 떨어져 당겨 시작 합니다. 슬라이드 자체에 agarose와 작은 접착에 심각한 균열이 발생합니다. 이 큰 균열 IMS 분석에 도움이 되지 않습니다. 상위: 슬라이드 후 2 h 건조 8 잘 챔버와 준수 합니다. 모든 agarose 플러그 하지만 두 접착 8 음 실로 인해 센터를 통해 금이. 아래: 8 음 챔버의 제거 후 슬라이드. 하나만 agarose 플러그 슬라이드에 남아 있었다. 이 그림은 아연 외. 201816허가 재현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: 독특한 신호 감지. 8 조건을 비교할 때 1 개의 단일 조건에 고유한 신호 가능 하다. (A)는 말린된 슬라이드 이미지 가르쳐 MALDI TOF 질량 분석기는 지역 이미지에 사용 됩니다. 여기 우리 50 µ m. (B) A 대표 이미지 upregulated 8 동일한 슬라이드에 대 한 조건에는 m/z 신호에서 IMS에 대 한 난소 조직 주위에 작은 영역을 선택 했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7: 대표 데이터로 나누어 실 설치. 난소 조직 화이트 요약. M/z 112는 잘 포함 하는 난소의 절반에서 은닉 된다. IMS는 50 µ m에서 수행 되었다. 이 그림은 아연 외. 201816허가 재현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
HGSOC12,,1718, norepinephrine의 역할 연루 증거의 성장 시체 이며이 기술은 더 기계 정보를 기여 하고있다. 생물 학적 조건 같은 슬라이드에 적어도 8, 메서드 단일 IMS에 미디어 컨트롤 뿐만 아니라 유전자와 세포 특이성 run과 같은 생물 학적 컨트롤에 대 한 계정 수 있습니다. 메서드가 최적화 되었습니다 동안 평가 하 교환 HGSOC, 모든 셀에에서 기본 전이 모델에서 작은 분자 또는 조직 유형 agarose에 배치할 수 있는 다양 한 생물 학적 질문 및 질병 상태를 분석 하 대용 될 수 있다.
프로토콜의 가장 중요 한 단계 중 하나는 조직 또는 세포 유형 서로 게 가까운 근접에서 고 agarose 플러그의 중심에 존재 하도록은. 또 다른 중요 한 고려 사항은 전체 슬라이드에 대 한 건조 시의 최적화입니다. 이 방법은 난소 조직는 쉽게 건조 하 고 작은 건조 합병증 귀착되 었 다 작은 크기를 사용 하 여 최적화 되었다. 그러나, 다른 조직, 지방, 같은 다른 구성 아주 다른 건조 프로필 있고 더 광범위 한 건조 최적화 필요. 건조 생물 학적 샘플에 대 한 최적화 된, 후 나머지 워크플로 최소한의 변경만을 요구 해야 합니다.
질량 스펙트럼 중, 그것은 가능성이 많은 프로젝트 이외에 작은 분자 화합물 그룹의 분석에 필요 합니다. 따라서, 수집 및 행렬의 선택에 대 한 IMS 매개 변수는 경우 알려져 해당 대상에 대 한 최고의 데이터를 생성 하기 위해 적응 해야 합니다. 또한, 우리는 50: 50 CHCA:DHB 매트릭스와 긍정적인 모드에서 데이터 수집을 수행 했습니다 하지만 부정적인 모드 실험 매트릭스의 다른 종류를 선호 수 있습니다 그리고 더 큰 분자 뿐만 아니라 다른 매트릭스에 더 쉽게 검출 될 것 이다. 메서드를 사용 하면 좁은 대량 범위 또는 타겟이 불분명 한 접근에 넓은 대량 범위와 대상된 검색에 대 한 사용할 수 있습니다. 위의 논의 메서드의 경우 작은 분자는 초점 세포 및 조직 대표자 사이 agarose를 통해 교환 되었다 분자를 검출 하기 때문에 관심의 대상 이었다. 비록 우리가 agarose 통해 움직임을 억제 하는 크기와 구조 한계를 주장할 수 없습니다, 우리의 목표는 그 목표에 대 한 우리의 매트릭스 결정 및 TOF MALDI MS 매개 변수 최적화 했다 그래서 작은 분자를 검출 하기 했다. 미래 실험을 개발 되 고 있다 지질 및 단백질 우리의 원래 취득 방법에서 놓칠 수 있습니다.
복합 클래스 검색 제한 외에도이 메서드는 또한 셀 agarose와 호환 되 고 조직 샘플 (사용) 하는 경우 8 잘 챔버에 맞게 적용할 수를 해야 합니다. 특정 조직 적은 생물 학적 조건에 비교를 위해, 필요 하지만 선택한 조직은 건조4후 200 미만 100 µ m의 균일 한 높이에 건조 능력을 중요 한 큰 웰 스에 적응 될 수 있다. 여러 생물 학적 샘플 티슈와 통신에서 하나 이상의 셀 종류 등 평가 수 있습니다. 샘플 준비 agarose 기반 셀 문화 공간 분리 수 있기 때문에, 그것은 수 할당 시각 m/z 's 셀 문화 소스를 관찰된 확산 패턴에 따라.
IMS를 사용 하 여 인간의 샘플 또는 유전자 변형 마우스 모델에서 조직 단면도 공부 하는 것이 조직의 복잡성. 그러나, 인간의 샘플은 얻기, 어렵다는 극적으로 질병의 진행 같은 것 들을 공부 하는 기능을 제한할 수 있습니다. 유전자 변형 마우스 모델에서 조직은 잘 정의 된 시간 지점에서 수집할 수 있습니다. 하지만, 마우스 모델 시간과 개발 비용이 될 수 있습니다. 또한, 이러한 모델에 실제 조직 전체 복잡 특정 셀 또는 조직 간의 통신을 정확 하 게 평가 하기 어려운 하 만들 수 있습니다. 반면, 여기에 제시 된 방법은 높은 적응력. 다른 조직 또는 세포 커뮤니케이션에서 차이 조사 하는 동일한 슬라이드에 cocultured 수 있습니다. 예를 들어 정상 세포 또는 동일한 조직에서 종양 세포 변환 인해 차이 이해 하는 것 같은 슬라이드에 경작 될 수 있습니다. 시간 과정 연구 소설 신호 폭포 세포 사이 밝히기 수 있습니다 또는 작은 분자 억제제 및 RNAi 수 포함 될 특정 신호 분자 또는 대사 산물의 역할을 검토 합니다. 우리는이 기술을 다양 한 상황에서에서 셀 커뮤니케이션을 공부 하는 데 유용 하 게 됩니다 이러한 가능성을 믿습니다.
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Disclosures
저자 공개할 게 없다
Acknowledgments
Searle 자금 시카고 커뮤니티 신탁 (C-076) (L.M.S.);에서 지원 시카고 생물 의학 협회에서 제공한 자금 일리노이 대학 시카고 시작 기금 (L.M.S.); 난소 암 연구 기금 동맹 (메릴랜드);에서 543296를 부여 그리고 UG3 ES029073 (J.E.B.)와 국립 센터에 발전 변환 과학, 국립 보건 연구원, 그랜트 UL1TR002003 통해 (젭 & LMS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Falcon tubes | Denville | C1017-O | To collect cells |
| 8-well chamber (Millipore EZ-slide chamber) | Millipore | PEZGS0816 | Repurposed from Millipore Millicell EZ-slide chamber slide |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998-4L | Solvent for sprayed matrix |
| Alpha Minimum Essential Medium (αMEM) | Fisher | 10-022-CV | Cell culture media |
| Autoflex speed MALDI-TOF LRF | Bruker | For IMS data analysis | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | To collect cells and remove supernatant |
| CHCA Matrix | Bruker Daltonic | 8201344 | Matrix sprayed onto dried slide |
| DHB Matrix | Bruker Daltonic | 8201346 | Matrix sprayed onto dried slide |
| Disposable Scalpels | Fisher | 22-079-707 | For removal of the ovaries |
| Dissecting Scissors | Fisher | 13-804-6 | For removal of the ovaries |
| DMEM Media | Gibco | 11995-065 | Media mixed with agarose |
| epidermal growth factor | Peprotech Inc. | 100-15 | Cell culture media supplement |
| Eppendorf tubes | Genesee Scientific | 22-282 | For agarose aliquots |
| Estradiol-17β | Simga-Aldrich | E2758 | Cell culture media supplement |
| Fetal Bovine Serum | Denville | fb5001 | Cell culture media supplement |
| FlexControl 3.4 | Bruker Daltonic | IMS data acquisition software | |
| FlexImaging 4.1 | Bruker Daltonic | IMS data analysis software | |
| Forceps (fine) | Fsiher | 22-327379 | For removal of the ovaries |
| Gentamycin | Cellgro | 30-005-CR | Cell culture media supplement |
| Insulin, Transferrin, Selenium (ITS) | Sigma-Aldrich | 11074547001 | Cell culture media supplement |
| ITO-coated slide | Bruker | 8237001 | Platform for co-culture incubation |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 11415064 | Media used during tissue dissection |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | Cell culture media supplement |
| Low-melting agarose | Sigma-Aldrich | A9414-10G | Mixed with media for plating |
| Media basin | Corning | 4870 | Used to cut plastic dividers for divided chambers |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | Cell culture media supplement |
| Peptide Calibration Standard | Bruker Daltonic | 8206195 | Calibrant for medium mass range |
| Phophorus red | Sigma-Aldrich | 343-242-5G | Calibrant for low mass range |
| SCiLS Lab 2015 | Bruker Daltonic | IMS data statistical analysis | |
| Surgical Forceps (blunt) | Fisher | 08-875-8B | For removal of the ovaries |
| TFA | Fisher Technologies | A116-50 | Added to matrix solution |
| TM Sprayer | HTX Technologies | For applying matrix |
References
- Paine, M. R., et al. Whole Reproductive System Non-Negative Matrix Factorization Mass Spectrometry Imaging of an Early-Stage Ovarian Cancer Mouse Model. PLoS One. 11 (5), e0154837 (2016).
- Yang, Y. L., Xu, Y., Straight, P., Dorrestein, P. C. Translating Metabolic Exchange with Imaging Mass Spectrometry. Nature Chemical Biology. 5 (12), 885-887 (2009).
- Li, H., Hummon, A. B. Imaging Mass Spectrometry of Three-Dimensional Cell Culture Systems. Analytical Chemistry. 83 (22), 8794-8801 (2011).
- Yang, J. Y., et al. Primer on Agar-Based Microbial Imaging Mass Spectrometry. Journal of Bacteriology. 194 (22), 6023-6028 (2012).
- Coscia, F., et al. Integrative Proteomic Profiling of Ovarian Cancer Cell Lines Reveals Precursor Cell Associated Proteins and Functional Status. Nature Communications. 7, 12645 (2016).
- Labidi-Galy, S. I., et al. High Grade Serous Ovarian Carcinomas Originate in the Fallopian Tube. Nature Communications. 8 (1), (2018).
- Klinkebiel, D., Zhang, W., Akers, S. N., Odunsi, K., Karpf, A. R. DNA Methylome Analyses Implicate Fallopian Tube Epithelia as the Origin for High-Grade Serous Ovarian Cancer. Molecular Cancer Research. 14 (9), 787-794 (2016).
- Falconer, H., Yin, L., Gronberg, H., Altman, D. Ovarian Cancer Risk After Salpingectomy: A Nationwide Population-Based Study. JNCI Journal of the National Cancer Institute. 107 (2), dju410 (2015).
- Dean, M., Davis, D. A., Burdette, J. E. Activin A Stimulates Migration of the Fallopian Tube Epithelium, an Origin of High-Grade Serous Ovarian Cancer, through Non-Canonical Signaling. Cancer Letters. 391, 114-124 (2017).
- King, S. M., Burdette, J. E. Evaluating the Progenitor Cells of Ovarian Cancer: Analysis of Current Animal Models. BMB Reports. 44 (7), 435 (2011).
- Reznik, E., et al. Landscape of Metabolic Variation across Tumor Types. Cell Systems. 6 (3), 301-313 (2018).
- Watkins, J. L., et al. Clinical Impact of Selective and Nonselective Beta-Blockers on Survival in Patients with Ovarian Cancer: Beta-Blockers and Ovarian Cancer Survival. Cancer. 121 (19), 3444-3451 (2015).
- Lutgendorf, S. K., et al. Stress-Related Mediators Stimulate Vascular Endothelial Growth Factor Secretion by Two Ovarian Cancer Cell Lines. Clinical Cancer Research. 9 (12), 4514-4521 (2003).
- Sood, A. K. Stress Hormone-Mediated Invasion of Ovarian Cancer Cells. Clinical Cancer Research. 12 (2), 369-375 (2006).
- Hoffmann, T., Dorrestein, P. C. Homogeneous Matrix Deposition on Dried Agar for MALDI Imaging Mass Spectrometry of Microbial Cultures. Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 26 (11), 1959-1962 (2015).
- Zink, K. E., Dean, M., Burdette, J. E., Sanchez, L. M. Imaging Mass Spectrometry Reveals Crosstalk between the Fallopian Tube and the Ovary That Drives Primary Metastasis of Ovarian Cancer. ACS Central Science. 4 (10), 1360-1370 (2018).
- Armaiz-Pena, G. N., et al. Src Activation by β-Adrenoreceptors Is a Key Switch for Tumour Metastasis. Nature Communications. 4, 1403 (2013).
- Choi, M. J., et al. HTERT Mediates Norepinephrine-Induced Slug Expression and Ovarian Cancer Aggressiveness. Oncogene. 34 (26), 3402 (2015).
