Summary
En ny metode for eksempel forberedelse ble utviklet for å imøtekomme celler og vev coculture for å oppdage små molekyl utveksling ved hjelp av tenkelig massespektrometri.
Abstract
Imaging massespektrometri (IMS) rutinemessig brukes på tre typer eksempler: vev inndelinger, spheroids og mikrobiell kolonier. Slike eksempler er analysert bruker matrix-assistert laser desorpsjon/ionisering tid-av-flight massespektrometri (MALDI-TOF MS) for å visualisere fordelingen av proteiner og lipider metabolitter over biologiske utvalget av interesse. Vi har utviklet en roman eksempel forberedelse metode som kombinerer styrken i de tre forrige programmene å ta en underexplored tilnærming for å identifisere kjemisk kommunikasjon i Krepsen, av seeding pattedyr cellekulturer i agarose i coculture med friske vevet etterfulgt av uttørking av prøven. Pattedyr vev og celler er cocultured i nærheten av La kjemisk kommunikasjon via spredning mellom vev og celler. På bestemte tidspunkt tørket agarose-baserte prøven på samme måte som mikrobiell kolonier forberedte IMS analyse. Vår metode ble utviklet for å modellere kommunikasjonen mellom høy klasse serous eggstokkreft avledet fra egglederen som den kommuniserer med eggstokken under metastasering. Optimalisering av eksempel utarbeidelsen resulterte i identifikasjon av noradrenalin som en kjemisk nøkkelkomponent i eggstokkreft microenvironment. Denne nyutviklet metoden kan brukes til andre biologiske systemer som krever en forståelse av kjemisk kommunikasjon mellom tilstøtende celler og vev.
Introduction
Imaging massespektrometri (IMS) er blitt optimert for å karakterisere den romlige fordelingen av molekylære funksjoner i tre brukte programmer: vev skiver, spheroids og mikrobiell kolonier1,2,3. Vev skiver kan brukes til å evaluere lokaliseringen av metabolitter i forbindelse med biologiske forhold i en vert, enten mål eller uønskede innenfor et bestemt masse. Men er molekylær funksjonsforskjellene den mest betydelige og åpenbare sammenlignet med et sunt vev er syke betingelse, for eksempel en svulst. Denne IMS er spesielt tilpasset påvisning av sykdom biomarkers, imidlertid anskaffe vevsprøver på separate stadier i sykdomsprogresjon (for eksempel svulst karakterer) utelukker identifikasjon av signaler som kan være viktig for initiering av den sykdom. Utveksling av informasjon gjennom rommet er en allestedsnærværende funksjon i mange biologiske systemer, og vev skiver ta ikke dette dynamiske kjemiske relé. En teknikk som kan visualisere kjemiske utveksling og diffusjon er IMS mikrobiell kolonier dyrket på agar platene. små molekyler kan diffus gjennom og over agar og kan hentes via matrix-assistert laser desorpsjon/ionisering (MALDI-TOF) massespektrometri4. Denne veksten oppsett kan brukes til å identifisere molekyler utveksles mellom atskilte biologiske enheter (kolonier) og kan også bestemme retningen for metabolitten produksjon. Plattformen er konstruert for mikrobiell kolonien vekst var tilpasset utforske primære metabolismen av vev explants vokst med pattedyrceller, og IMS ble brukt til å evaluere dynamisk kjemiske utveksling i et i vitro pattedyr system.
I de siste årene, har det blitt klart at høy klasse serous eggstokkreft (HGSOC) ofte kommer i egglederen epitel (FTE) og deretter metastasizes til eggstokken under tidlig sykdom utvikling5,6, 7 , 8. det at tumorigenic FTE celler spredning til eggstokkene, hvor store svulster til slutt danne og metastase ytterligere, er foreløpig uklart. Tidligere forskning har fokusert på rollen ovarian proteiner i primære metastasering til eggstokken; men har det nylig blitt demonstrert at overgangen fra en sunn til en tumorigenic vev resulterer i svær forstyrrelsen av cellenes stoffskifte og endrer produksjon av små molekyler9,10,11. Derfor hypotese vi at små molekyler utveksles mellom FTE og eggstokken kan være ansvarlig for primære metastasering av HGSOC.
Bruker vår nylig utviklede IMS prosedyre, har vi bestemt at coculture tumorigenic FTE og sunn ovarian vev induserer produksjon av noradrenalin fra eggstokken. Men andre celletyper eller normale FTE celler ikke framprovosere denne effekten. En ekstraordinær fordelen med denne metoden er at molekylær produksjon og utveksling av signaler som representerer virkelige molekyler kan visualiseres, så selv i en coculture er det mulig å finne kilden til et signal. Dette er en fordel over analyse av homogenisert prøver, hvor alle romlig informasjon er tapt. I vår modellsystem kunne vi tydelig tilordnes produksjon av noradrenalin eggstokken. Noradrenalin har vært knyttet til metastasering og chemoresistance av ovarian kreft og vår påvisning av dette molekylet har validert at metoden for romanen IMS kan avdekke biologisk relevante molekyler12,13, 14. denne valideringen lar oss foreslår at denne ny søknad av IMS kan være spesielt nyttig å forskningsgrupper prøver å identifisere små molekyler i coculture miljøer og forstå tidlige hendelser som påvirker celle transformasjon og metastasering. Det overordnede målet med denne metoden er å belyse identitet og romlige fordelingen av små molekyler under utvekslingen mellom vev og organer, representert i vitro 3D cellekulturer eller ex vivo vev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr prosedyrer ble den nasjonale institutter for helse retningslinjer og bruk av forsøksdyr og godkjent av institusjonelle dyr bruk og omsorg (IACUC) ved University of Illinois i Chicago.
1. forberedelse av reagenser
- Opprettholde murine oviductal epitel (MOE) celler på 37° C med 5% CO2 i en fuktet inkubator i alpha Minimum viktig Medium (αMEM) media med 10% fosterets bovin serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 10 mg/mL insulin, transferrin, selen (ITS) , 1,8 ng/mL til epidermal vekstfaktor (EGF), 100 U/mL penicillin-streptomycin, 1 mg/mL gentamycin og 18.2 ng/mL østradiol-17β. Passerer cellene hver 3-4 dager, det er nok celler på samme dag musene vil bli ofret.
- Forberede 2% agarose ved å blande 1 g av lav-smeltende agarose med 50 mL destillert vann. Autoclave agarose, la den avkjøles, og deretter aliquot (1 mL) i 2 mL rør (se Tabell for materiale) før agarose stivner. Agarose kan lagres på 20 ° C på ubestemt tid.
- Forbered minst 2 mL 1 x Dulbecco endret Eagle's Medium (DMEM) media.
- For matrise for MALDI-TOF MS, forberede 10 mL av 5 mg/mL 1:1 alpha-cyano-4-hyroxycinnamic syre (CHCA): dihydroxybenzoic syren (DHB) (se Tabell for materiale) i 90: 10 ACN:H2O + 0,1% trifluoroacetic acid (TFA). Sonicate løsning til matrise er oppløst.
2. musen kolonien og eggstokk fjerning
- Opprettholde avl par CD-1 mus ved hjelp av standard bolig prosedyrer. I nærheten dagen av fødsel, sjekk musene hver dag slik at alderen på valpene er kjent.
- Euthanize pups 16 til 18 dager gammel ved CO2 innånding per NIH retningslinjer. Levere CO2 (100%) på en rate på 10%-20% kammer volum per minutt og fortsette i to minutter etter åndedrett hadde stoppet. Bekreft euthanasia ved cervical forvridning.
- Desinfiser alle kirurgisk utstyr av submerging i 70% etanol. Varme Leibovitz's L-15 media med 1 x penicillin-streptomycin til 37 ° C.
- Våt abdominal overflaten med 70% etanol å desinfisere området og redusere forurensning med hår. Forstå huden dekke bukveggen bruker sløv tang og bruk kirurgisk saks for å gjøre en stor V-form skjære gjennom huden og bukveggen, utsette de indre organene.
- Flytte de indre organene til side ved hjelp av pinsett. Individuelt Grip hver livmor horn med fine tang og løfte litt.
- Finn eggstokk, som vil være på slutten av livmor horn, rett under nyrene. Bruk kirurgisk saks for å dissekere eggstokken gratis bindevev. Deretter halvert ovarian Hornet.
- Flytte eggstokken oviduct og omtrent en halvdel av hver livmor horn forvarmes Leibovitz L-15 Media.
- Under dissecting mikroskop Flytt forsiktig hver eggstokk fra den omkringliggende bursa, frigjøre den fra oviduct, bursa og noen fettvev. Flytt hver eggstokken til en ny rett Leibovitz's L-15 medier.
- Halvert hver eggstokk aksialt. Holde ovarian brikkene (nå kalt explants) holdt på 37 ° C før plating av agarose.
3. sette opp og rugende ITO-behandlet lysbildet for Cocultures
-
Udelt cocultures
- Gjør flytende agarose på 70 ° C på en kokeplate.
- Plasser 8-vel delelinjen på indium tinoxide (ITO)-behandlet lysbildet (figur 1A). Gummi nederst på delelinjen hjelpemidler i vedheft til lysbildet, men sørg for å bruke kontinuerlig milde press under agarose plating å sikre ikke lekker eller blanding mellom brønner.
- Samle celler i en 15 mL konisk tube, sentrifuger (5 min på 800 rpm), og resuspend til 50k celler per 150 µL i 1 x DMEM medier. Hvis en annen celle tetthet er optimal, kontroller at på dette trinnet celle suspensjon er 2 x siste tetthet ønsket (f.eks for en siste konsentrasjon av 50 000 celler i 300 µL, celle tetthet på dette trinnet er 50 000 celler i 150 µL).
- Før plating cellekultur, legger ovarian explant til midten av godt (figur 1B).
- Legge til agarose i hver cellekultur i individuelle 2 mL rør like før plating. For hver brønn, kombinere 200 µL av cellen suspensjon og 200 µL av flytende agarose i en 2 mL tube. For eksempel fire brønner, kombinere 800 µL av cellen suspensjon og 800 µL av 2% agarose. Noen blanding vil være igjen, men å gjøre litt mer enn nødvendig unngår luftbobler under pipettering.
- Legge til agarose i individuelle cellekulturer umiddelbart før plating at cellekultur. Agarose vil kjølig i under et minutt, så være forberedt på plate raskt.
- Straks legge 300 µL av cellen/agarose blandingen i hver brønn (figur 1 c). Figur 1 c viser tre celle betingelser og en media tilstand, hver belagt med og uten en eggstokk.
- Inkuber lysbildet på 37 ° C og 5% CO2 i en fuktet inkubator.
-
Delt Cocultures.
- Kuttet skillevegger fra tynn, glatt plast (figur 2A).
Merk: Dette eksperimentet bruker sidene av en steril fjerning media bassenget fordi de er flatt og tynn. Skjær dem akkurat bred nok til å passe perfekt til hypotenus av brønnen (~ 13 mm). - Gjør flytende agarose på 70 ° C på en kokeplate.
- Plass 8-vel delelinjen på ITO-behandlet lysbildet (figur 2B). Gummi nederst på delelinjen hjelpemidler i vedheft til lysbildet, men sørg for å bruke kontinuerlig milde press under agarose plating å sikre ikke lekker eller blanding mellom brønner.
- Samle celler i en 15 mL konisk tube, sentrifuger (5 min på 800 rpm), og resuspend til 50k celler per 150 µL i 1 x DMEM medier. Hvis en annen celle tetthet er optimal, kontroller at på dette trinnet celle suspensjon er 2 x siste tetthet ønsket (f.eks for en siste konsentrasjon av 50 000 celler i 300 µL, celle tetthet på dette trinnet er 50 000 celler i 150 µL).
- Sett inn plast skillevegger diagonalt i brønner (figur 2C).
- Legge til agarose til hver celle suspensjon en samtidig like før plating. For hver brønn, kombinere 100 µL av cellen suspensjon og 100 µL av flytende agarose i en 2 mL tube. For eksempel fire brønner, kombinere 400 µL med cellekulturer og 400 µL av 2% agarose. Noen celle/agarose blandingen vil være igjen, men å gjøre litt mer enn nødvendig unngår luftbobler under pipettering.
- Legge til agarose i individuelle cellekulturer umiddelbart før plating at cellekultur. Agarose vil kjølig i under et minutt, så være forberedt på plate raskt.
- På den ene siden av delelinjen plate 150 µL av cellen/agarose blanding. Tillate agarose å kjøle og stivne (ca ett min) og deretter fjerne skillet (figur 2D).
- Plass eggstokk explant midt i den tomme delen av brønnen. Sted 150 µL media/agarose blandingen over toppen av eggstokkene, og bare i riktig side av brønnen (figur 2E).
- Inkuber lysbildet på 37 ° C og 5% CO2 i en fuktet inkubator.
- Kuttet skillevegger fra tynn, glatt plast (figur 2A).
4. tørking lysbilde og forberede for MALDI-TOF MS
- Etter fire dager (eller helst ønsket tidspunkt), fjerne kammer skillet fra agarose pluggene og lysbildet (figur 1 d). Koble forsiktig fra sidene av agarose fra kammer med en flat slikkepott og trekk forsiktig kammeret oppover, være forsiktig med å flytte noen agarose plugger. Hvis de gjøre flytte, forsiktig flytte dem slik at de ikke berører hverandre.
- Sett lysbildet i en 37 ° C ovnen ca 4 h, roterer 90° hver h.
Merk: Rotasjon av lysbildet er viktig å sikre selv varmefordeling hele utvalget. - Når tørr, fjerne lysbildet fra ovnen (figur 1E).
- Bruk matrise løsning ved hjelp av sprøyta (figur 1F), med følgende parametere: temperatur = 30 ° C, strømningshastighet = 0,2 mL/min, antall passerer = 8, retning = kopi og munnstykke avstanden = 40 mm.
Merk: I stedet for en matrise sprøyta, spraymaling kunstneriske kan brukes til å bruke flytende matrise. Den samme matrix-løsningen kan brukes å spray, men omtrent dobbelt så mye løsning er påkrevd. Lysbilde festet slik at den henger vertikalt, spray lysbildet fra en 90-graders vinkel fra ca en fot bort (tilpasset fra Hoffmann15) til matrisen lag er synlig. - Legge 1 µL av calibrant (fosfor rød for mål < 500 Da, en peptid blanding (se Tabell for materiale) for mål < 5000 Da) å klare flekk på lysbildet. Fosfor Red krever ingen blande med matrix, men peptid blandingen krever 1:1 blanding med matrix å hjelpe ionisering. Vent til calibrant tørke.
- Tegne en X med et permanent markør i hvert hjørne av lysbildet og ta en optisk image bruker et kamera eller en skanner med 1200 ppt.
5. imaging massespektrometri datainnsamling
- Åpne en ny serie på IMS data analyseprogramvare (se Tabell for materiale). Angi raster bredden til ønsket romlig oppløsning, minst 50 µm.
- Laste opp optisk lysbildet analyseprogramvare og sett tre lærer ved hjelp veikryssene i den x i hvert hjørne.
- Angi områder av interesse for bildebehandling i oppkjøpet programvaren og navngi dem tilsvarende.
- Kalibrere instrumentet med den oppkjøp programvaren (se Tabell av materialer) innen 5 ppm feil.
- Lagre metoden optimalisert og starte løpe. Dette eksperimentet optimalisert følgende parametere: polaritet = Positive, detektor = Reflectron, Laser størrelse = 2, Laser makt = 50%, reflektor modus detektor gevinst = 3 x.
6. behandling IMS Data
- Importfilen .mis i statistisk programvare (se Tabell for materiale) for analyse av betydning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et optimalt tørket ITO lysbilde vil resultere i en flat desiccated prøve med minimal å ingen rynker over overflaten av agarose og agarose stykker som opprettholde romlige separasjon på lysbildet (Figur 3). Figur 3A viser optimale tørking, mens figur 3B viser rynker som bør unngås. Optimeringen krever nøye overvåking av lysbildet i ovnen, eksakte tider kan variere basert på relativ fuktighet. Mens rynker kan lett påvirke høyden, og derfor masse nøyaktigheten av IMS signaler, vil liten rynker ikke påvirke kvaliteten på dataene. Derfor, noen agarose som til slutt har liten rynker kan fremdeles analyseres via MALDI-TOF MS. Lysbildet må være helt tørt, eller dette kan føre til en eksplosjon av prøven i høy vakuum miljøet i MALDI-TOF masse spectrometer.
Andre substrater bortsett fra agarose kan fungere, men ofte opprettholde ikke deres konstruksjonssikkerhet tørking eller fjerning av godt kammeret, som resulterer i spredning over ITO lysbilde og tap av romlig informasjon. For eksempel vi har tidligere testet kollagen som et substrat og dette resulterte i å spre og tap av romlig informasjon når godt kammeret ble fjernet (data ikke vist). Vevet brukes bør være i midten av brønnen hvis det udelt eller i sentrum av halv trekanten hvis det er delt, slik at oppkjøpet av IMS data ikke er forurenset med kanteffekter. Figur 4 viser eksempler på optimalt plassert vev (panel A) og dårlig plassert vev (panel B). Figur 4Bvevet ligger i utkanten av agarose som når imaged, kan føre til falsk masse signaler fra er kanteffektene og tillater ikke brukernes å image agarose omkringliggende vev, som betyr at utskilles signaler kan bli savnet under analyse. Vev bør være så nær midten som mulig, som vist i figur 4A.
En rekke eksperimenter fastslått at en 8-vel kammer var beste fartøyet for inkubering, sammenlignet med en 6-vel plate og en 24-vel plate, fordi 8-vel kammeret gir minimale forstyrrelser på cellene, mens andre større kamrene kreve agarose plater skal overføres til et ITO eller rustfritt stål lysbilde etter inkubasjon16. 8-vel kamrene fra flere merker kammer lysbilder kan brukes, men med en selvklebende gummi nederst og parallelle sider av lette lett innføring og fjerning av en plast skillevegger for delt brønnene. 6-vel platen kreves mye mer materiale og møtt problemer med tørking store områder. 24-vel kammeret hadde også problemer under tørking, fordi menisk effekten var tydelig i brønnene og derfor pluggene tørket med betydelig høyere kanter. 8-vel kammer fører ikke menisk effekten når agarose er belagt direkte i midten av brønnen, og agarose plugger har ikke overføres. I tillegg gir 8-vel kammeret 8 forhold testet eller kontrollert i ett enkelt eksperiment. Det kan være viktig å inkludere kontroller som (1) brønner uten ovarian explants eller celler, (2) brønner med bare celler, eller (3) brønner med ovarian explants bare avhengig av eksperimentet. Fordi eksempel utarbeidelsen (nøyaktig media og agarose konsentrasjon, matrix beløpet, etc.) varierer litt mellom kjøres, skal betingelsene sammenlignes når de er kjøpt i samme lysbilde.
Ytterligere eksperimenter at et ITO-belagt lysbilde var den beste plattformen for inkubasjon i forhold til en stålplate i MALDI fordi lysbildet gir visuell bekreftelse av cellen tilstand og plassering. For eksempel kan bruker ITO lysbildet, vi bekrefte at cellene har normal morfologi og det de vedlikeholde homogen distribusjon gjennom agarose før og følgende uttørking16. Lysbildet vil også tillate innlemmelse av fluorescerende linjer etter behov. I tillegg, er fjerning av kammeret før uttørking forpliktet til helheten av agarose. Hvis lysbildet er desiccated med 8-vel kammeret overholdt, plast trekker agarose plug fra hverandre og resultater i store sprekker i pluggene. Figur 5 viser problemer når kammeret ikke fjernes før tørking.
Når analysere celle populasjoner, er det viktig at romlig oppløsning er minst 50 µm å fange den lille størrelsen på vev og cellular samhandlinger. Med sprayet matrise, er det mulig å oppnå 5 µm oppløsning, men dette forlenger den totale tiden å samle massespektrometri dataene samtidig gir sammenlignbare resultater. Romlig oppløsning er også avhengig av evnen til å fokusere laseren i MALDI-TOF masse spectrometer.
Vi har samlet optimalisert dette lysbildet oppsettet for å finne beste utvekslet små molekyler i coculture. Derfor under dataanalyse søker vi molekylær funksjoner som bare er tilstede eller er betydelig mer rikelig i en agarose plugg som representerer den biologiske tilstanden av interesse. Fordi det er muligheten til å ta syv andre kontroller og forholdene på lysbildet, kan dette oppnås visuelt og ved hjelp av statistisk programvare laget for IMS data. Dereplication prosessen etter oppdagelsen av romlig relevante massene er omfattende slik at vi får ortogonalt datatypen for høyoppløselig masse og fragmentering. Det første trinnet som vi tar for dereplication er et søk av nominell massen gjennom en database, som menneskelige Metabolome databasen (HMDB) for pattedyr metabolitter. De fleste av molekylene i databasen har et betydelig antall spectra dekker mange teknikker for sammenligning med eksperimentelle data. Når nominell massene har potensiell kandidat molekyler som deres antatte identitet, er det ofte mulig å sammenligne fysiske data som MS-/ MS fragmentering, UV profil og tiden mellom kandidat strukturen og standard.
For eksempel har identifikasjon av noradrenalin i coculture tumorigenic FTE celler inkubert med ovarian vev validert at denne IMS metoden er stand til å oppdage relevant små molekyler fra dette systemet16. Figur 6 viser følsomheten av IMS går, viser hvilken datatype som man kan forvente etter protokollen for udelt kamre. Figur 7 viser tilsvarende representant data for delt kammer oppsett.
Figur 1: arbeidsflyt for eksempel utarbeidelsen av udelt coculture. (A) Adhere 8-vel kammer til ledende side ITO-belagt lysbilde. (B) sted halvert eggstokkene i midten av brønner for coculture forhold. (C) legger 300 µL av agarose/cell suspensjon direkte i brønner. Kontroller at det er ingen luftbobler og at eggstokken forblir i midten av brønnen. Hvis pipetted agarose forstyrret eggstokken, forsiktig bruke Pipetter spissen sentrere det før agarose kjøler. (D) etter fire dager med inkubering (eller ellers optimalisert tid) fjerne 8-vel kammer fra lysbildet. Hvis agarose fortsatt festet til kammer, forsiktig løsne agarose pluggen fra kammeret ved hjelp av en slikkepott og sted på lysbildet. Agarose vil ikke overholder lysbildet slik at det blir enkelt å flytte. Trekke en "X" i hvert hjørne på lysbildet og ta et bilde. (E) tørr lysbildet i 37 ° C ovn 4 h, roterer 90 ° hver time. Agarose bør være fullt desiccated og bør ligge flatt på lysbildet. (F) bruk matrise valg via en sprøyta eller airbrush å skyve. Matrix lag skal vises som gule. Skanne lysbildet på en skanner med 1200 ppt og legge calibrants eller standarder for MALDI-TOF MS analyse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: arbeidsflyt for eksempel utarbeidelsen av delt coculture. (A) kuttet tabs av media bassenget (~ 13 mm) og sikre at sidene er rett. (B) fest 8-vel kammer til ledende side ITO-belagt lysbilde. (C) sett inn skillevegger diagonalt i brønner. (D) legge 150 µL cellekultur i agarose til en side av skillelinjen, tillate agarose å kjøle og fjerne skillelinjen. (E) Legg til eggstokken til midten av Tom godt halv og dekk med 150 µL av media og agarose suspensjon. Dette tallet gjengitt med tillatelse fra Zink et al. 201816. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: rynker i agarose plugger. Rynker kan danne i agarose pluggene Hvis lysbildet igjen i ovnen for lenge. Dette vil ikke utelukke prøven fra MALDI-TOF MS analyse, men kan påvirke kvaliteten på dataene. (A) bilde av et optimalt tørket lysbilde. Alle agarose rundt ovarian vevet er helt flat og fri for rynker, gir rikelig området for IMS analyse. (B) bilde av et dårlig tørket lysbilde med rynket agarose hele utvalget. Dette tallet gjengitt med tillatelse fra Zink et al. 201816. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: plassering av vev. Plasseringen av vev i tørket prøve er svært viktig for datainnsamling. (A) tørket agarose plugger av delt kamre Vis eggstokken i midten av en halvdel av brønnen, som er optimal for bildebehandling. (B) tørket agarose plugger på delt kammer hvor eggstokk ikke var sentrert inkubasjon eller tørke. Ovarian vevet tørket på omkretsen av agarose pluggene, og derfor kan ikke analyseres. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: tørking lysbilder med kammeret. Når lysbildet er satt i ovnen før kammer fjerning, agarose pluggene overholde sterkere plast enn seg selv og begynne å trekke hverandre i varmen. Dette resulterer i alvorlige sprekker i agarose og liten vedheft til selve lysbildet. Sprekk dette store er ikke bidrar til IMS analyse. Topp: Lysbildet etter 2t uttørking med 8-vel kammer overholdt. Alle agarose plugger, men to sprakk gjennom midten på grunn av vedheft til 8-vel kammeret. Bunnen: Lysbildet etter fjerning av 8-vel kammer. Bare en agarose plugg forble på lysbildet. Dette tallet gjengitt med tillatelse fra Zink et al. 201816. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: oppdage unike signaler. Når sammenlignende 8 forhold, er det mulig å oppdage signaler som er unike for én enkelt betingelse. (A) tørrfisk lysbildet brukes til å lære MALDI-TOF masse spectrometer hvilke områder å image. Her har vi valgt mindre regioner rundt ovarian vevet IMS på 50 µm. (B) A representativt bilde av et m/z -signal som er upregulated i en stand mot alle åtte i samme lysbilde. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: representant data fra delt kammer oppsett. Ovarian vev er skissert i hvitt. M/z 112 skilles ut fra delen av den også inneholder eggstokken. IMS ble utført på 50 µm. Dette tallet gjengitt med tillatelse fra Zink et al. 201816. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er en voksende mengde bevis implicates noradrenalins rolle i HGSOC12,17,18, og denne teknikken har bidratt mer mekanistisk informasjon. Med minst åtte biologiske forhold finnes i samme lysbilde, kan metoden konto for biologiske kontroller som gene og celle spesifisitet samt media kontrollene i en enkelt IMS kjøre. Mens metoden var optimalisert for å evaluere utvekslet små molekyler i en modell av primære metastasering i HGSOC, en celle eller vev type som kan plasseres i agarose kan erstattes for å analysere en rekke biologiske spørsmål og sykdomstilstander.
En av de viktigste trinnene i protokollen er å sikre at hvilke vev eller celle i nærheten til hverandre og i midten av agarose. En annen viktig faktor er optimalisering av tørking tiden for hele lysbildet. Denne metoden var optimalisert ved hjelp av eggstokkene vev, som tørket enkelt og med liten størrelse resulterte i liten tørking komplikasjoner. Men andre vev, med ulike sammensetning som fett, har svært forskjellige tørking profiler og krever derfor mer omfattende uttørking optimalisering. Etter tørking er optimalisert for biologiske prøven, bør gjenværende arbeidsflyten krever bare minimal endring.
Under masse spectral oppkjøpet er det sannsynlig at mange prosjekter krever analyse av sammensatte grupper enn små molekyler. IMS parameterne for oppkjøp og valg av matrix, derfor bør tilpasses generere beste data for respektive mål, hvis det er kjent. I tillegg, vi bare har utført datainnsamling i positiv modus med en 50/50 CHCA:DHB matrise, men negative modus eksperimenter kanskje foretrekke en annen type matrise, og større molekyler ville bli lettere oppdaget i en annen matrise også. Metoden kan brukes med et bredt masse område i uønskede tilnærming eller en smalere massen utvalg målrettede søk. Hvis det over omtalte metoden var små molekyler mål av interesse fordi fokus var å oppdage molekyler som ble utvekslet gjennom agarose mellom celler og vev representanter. Selv om vi ikke kreve begrensningene størrelse og struktur som hemmer bevegelse gjennom agarose, var vårt mål å oppdage små molekyler, så vår matrise avgjørelse og MALDI-TOF MS parametere ble optimalisert for målet. Senere eksperimenter blir utviklet til lipider og proteiner som kan ha vært savnet i vår opprinnelige anskaffelsesmetoden.
I tillegg til begrensningen av sammensatt klasse krever denne metoden også at cellene være kompatibel med agarose, og at Vevsprøve (hvis brukt) være tilpasset for å passe inn en Åttebrønners kammeret. Visse vev kan tilpasses større brønner hvis færre biologiske forhold er nødvendig for sammenligning, men det er avgjørende at valgte vevet er i stand til å tørke en jevn høyde på mindre enn 100 til 200 µm etter uttørking4. Flere biologiske prøver kan bli vurdert som mer enn én celle type i kommunikasjon med en vev. Fordi eksempel utarbeidelsen er kjøpedyktig skille romlig agarose-baserte cellekulturer, er det mulig å tilordne visualisert m/z 's til celle kultur kilden basert på observerte diffusjon mønstre.
Bruk av IMS vev inndelinger fra menneskelige prøver eller transgene musen modeller viser kompleksiteten i vev. Men er prøver fra mennesker vanskelig å få, som kan dramatisk begrense muligheten til å studere ting som sykdomsprogresjon. Vev fra transgene musen modeller kan samles på veldefinerte tidspunkt. Men musen modeller kan være tidkrevende og kostbar å utvikle. I tillegg kan full kompleksiteten av ekte vev i begge disse modellene gjøre det vanskelig å vurdere nøyaktig kommunikasjon mellom bestemte eller vev. Metoden som presenteres her er derimot en høylig praktisk. Ulike vev eller linjer kan være cocultured i samme lysbilde undersøke forskjeller i kommunikasjon. For eksempel kan normale celler eller tumorceller fra samme vev bli kultivert på samme lysbildet å forstå forskjellene skyldes transformasjon. Gang løpet studier kan avdekke romanen signalnettverk cascades mellom celler eller lite molekyl hemmere og/eller RNAi kunne bli tatt for å undersøke rollen av bestemte signalnettverk molekyler eller metabolitter. Vi tror disse mulighetene vil gjøre denne teknikken nyttig for studerer celle til celle kommunikasjon i en rekke sammenhenger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre
Acknowledgments
Midler ble gitt av Chicago biomedisinsk Consortium med støtte fra Searle midlene på The Chicago samfunnet Trust (C-076) (L.M.S.); University of Illinois at Chicago oppstart midler (L.M.S.); Gi 543296 fra Ovarian Cancer Research Fund Alliansen (MD); og UG3 ES029073 (J.E.B.) og National Center for fremme translasjonsforskning Sciences, National Institute of Health, gjennom stipend UL1TR002003 (JEB & LMS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Falcon tubes | Denville | C1017-O | To collect cells |
| 8-well chamber (Millipore EZ-slide chamber) | Millipore | PEZGS0816 | Repurposed from Millipore Millicell EZ-slide chamber slide |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998-4L | Solvent for sprayed matrix |
| Alpha Minimum Essential Medium (αMEM) | Fisher | 10-022-CV | Cell culture media |
| Autoflex speed MALDI-TOF LRF | Bruker | For IMS data analysis | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | To collect cells and remove supernatant |
| CHCA Matrix | Bruker Daltonic | 8201344 | Matrix sprayed onto dried slide |
| DHB Matrix | Bruker Daltonic | 8201346 | Matrix sprayed onto dried slide |
| Disposable Scalpels | Fisher | 22-079-707 | For removal of the ovaries |
| Dissecting Scissors | Fisher | 13-804-6 | For removal of the ovaries |
| DMEM Media | Gibco | 11995-065 | Media mixed with agarose |
| epidermal growth factor | Peprotech Inc. | 100-15 | Cell culture media supplement |
| Eppendorf tubes | Genesee Scientific | 22-282 | For agarose aliquots |
| Estradiol-17β | Simga-Aldrich | E2758 | Cell culture media supplement |
| Fetal Bovine Serum | Denville | fb5001 | Cell culture media supplement |
| FlexControl 3.4 | Bruker Daltonic | IMS data acquisition software | |
| FlexImaging 4.1 | Bruker Daltonic | IMS data analysis software | |
| Forceps (fine) | Fsiher | 22-327379 | For removal of the ovaries |
| Gentamycin | Cellgro | 30-005-CR | Cell culture media supplement |
| Insulin, Transferrin, Selenium (ITS) | Sigma-Aldrich | 11074547001 | Cell culture media supplement |
| ITO-coated slide | Bruker | 8237001 | Platform for co-culture incubation |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 11415064 | Media used during tissue dissection |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | Cell culture media supplement |
| Low-melting agarose | Sigma-Aldrich | A9414-10G | Mixed with media for plating |
| Media basin | Corning | 4870 | Used to cut plastic dividers for divided chambers |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | Cell culture media supplement |
| Peptide Calibration Standard | Bruker Daltonic | 8206195 | Calibrant for medium mass range |
| Phophorus red | Sigma-Aldrich | 343-242-5G | Calibrant for low mass range |
| SCiLS Lab 2015 | Bruker Daltonic | IMS data statistical analysis | |
| Surgical Forceps (blunt) | Fisher | 08-875-8B | For removal of the ovaries |
| TFA | Fisher Technologies | A116-50 | Added to matrix solution |
| TM Sprayer | HTX Technologies | For applying matrix |
References
- Paine, M. R., et al. Whole Reproductive System Non-Negative Matrix Factorization Mass Spectrometry Imaging of an Early-Stage Ovarian Cancer Mouse Model. PLoS One. 11 (5), e0154837 (2016).
- Yang, Y. L., Xu, Y., Straight, P., Dorrestein, P. C. Translating Metabolic Exchange with Imaging Mass Spectrometry. Nature Chemical Biology. 5 (12), 885-887 (2009).
- Li, H., Hummon, A. B. Imaging Mass Spectrometry of Three-Dimensional Cell Culture Systems. Analytical Chemistry. 83 (22), 8794-8801 (2011).
- Yang, J. Y., et al. Primer on Agar-Based Microbial Imaging Mass Spectrometry. Journal of Bacteriology. 194 (22), 6023-6028 (2012).
- Coscia, F., et al. Integrative Proteomic Profiling of Ovarian Cancer Cell Lines Reveals Precursor Cell Associated Proteins and Functional Status. Nature Communications. 7, 12645 (2016).
- Labidi-Galy, S. I., et al. High Grade Serous Ovarian Carcinomas Originate in the Fallopian Tube. Nature Communications. 8 (1), (2018).
- Klinkebiel, D., Zhang, W., Akers, S. N., Odunsi, K., Karpf, A. R. DNA Methylome Analyses Implicate Fallopian Tube Epithelia as the Origin for High-Grade Serous Ovarian Cancer. Molecular Cancer Research. 14 (9), 787-794 (2016).
- Falconer, H., Yin, L., Gronberg, H., Altman, D. Ovarian Cancer Risk After Salpingectomy: A Nationwide Population-Based Study. JNCI Journal of the National Cancer Institute. 107 (2), dju410 (2015).
- Dean, M., Davis, D. A., Burdette, J. E. Activin A Stimulates Migration of the Fallopian Tube Epithelium, an Origin of High-Grade Serous Ovarian Cancer, through Non-Canonical Signaling. Cancer Letters. 391, 114-124 (2017).
- King, S. M., Burdette, J. E. Evaluating the Progenitor Cells of Ovarian Cancer: Analysis of Current Animal Models. BMB Reports. 44 (7), 435 (2011).
- Reznik, E., et al. Landscape of Metabolic Variation across Tumor Types. Cell Systems. 6 (3), 301-313 (2018).
- Watkins, J. L., et al. Clinical Impact of Selective and Nonselective Beta-Blockers on Survival in Patients with Ovarian Cancer: Beta-Blockers and Ovarian Cancer Survival. Cancer. 121 (19), 3444-3451 (2015).
- Lutgendorf, S. K., et al. Stress-Related Mediators Stimulate Vascular Endothelial Growth Factor Secretion by Two Ovarian Cancer Cell Lines. Clinical Cancer Research. 9 (12), 4514-4521 (2003).
- Sood, A. K. Stress Hormone-Mediated Invasion of Ovarian Cancer Cells. Clinical Cancer Research. 12 (2), 369-375 (2006).
- Hoffmann, T., Dorrestein, P. C. Homogeneous Matrix Deposition on Dried Agar for MALDI Imaging Mass Spectrometry of Microbial Cultures. Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 26 (11), 1959-1962 (2015).
- Zink, K. E., Dean, M., Burdette, J. E., Sanchez, L. M. Imaging Mass Spectrometry Reveals Crosstalk between the Fallopian Tube and the Ovary That Drives Primary Metastasis of Ovarian Cancer. ACS Central Science. 4 (10), 1360-1370 (2018).
- Armaiz-Pena, G. N., et al. Src Activation by β-Adrenoreceptors Is a Key Switch for Tumour Metastasis. Nature Communications. 4, 1403 (2013).
- Choi, M. J., et al. HTERT Mediates Norepinephrine-Induced Slug Expression and Ovarian Cancer Aggressiveness. Oncogene. 34 (26), 3402 (2015).
