Summary
Burada, pankreas adacık hücreleri gibi heterojen hücre popülasyonlarında kalsiyum dinamiğinin görüntülenmesi ve ölçülmesi için bir protokol saklıyız. Floresan muhabirler adacık içindeki hücrelerin periferik tabakasına teslim edilir, daha sonra hareketsiz hale getirilir ve görüntülenir ve floresan yoğunluğunun dinamiğinin hücre başına analizi yapılır.
Abstract
Pankreas adacık hormonları kan şekeri homeostazı düzenler. Kan şekerindeki değişiklikler, pankreas adacık hücrelerinde sitosolik kalsiyum salınımlarına neden olur ve bu da üç ana hormonun salgısını tetikler: insülin (β-hücrelerden), glukagon (α-hücrelerden) ve somatostatin (δ-hücreler). β-Adacık hücrelerinin çoğunluğunu oluşturan ve elektriksel olarak birbiriyle birleşen hücreler, glikoz uyarıcısına tek bir varlık olarak yanıt verir. Küçük alt popülasyonların, α-hücrelerin ve δ-hücrelerinin uyarılabilirliği (%20 civarında (%30) ve %4 (%10) toplam kemirgen1 (insan2) adacık hücre numaraları, sırasıyla) daha az tahmin edilebilir ve bu nedenle özel ilgi olduğunu.
Kalsiyum sensörleri izole izalet içindeki hücrelerin periferik tabakasına teslim edilir. Adacık veya bir grup adacık daha sonra hareketsiz hale getirilir ve floresan mikroskobu kullanılarak görüntülenir. Görüntüleme modunun seçimi daha yüksek iş ortası (geniş alan) ve daha iyi uzamsal çözünürlük (konfokal) arasındadır. Geleneksel olarak, lazer tarama konfokal mikroskopisi görüntüleme dokusu için kullanılır, bu komşu hücreler arasında sinyal in en iyi ayrımı nı sağlar gibi. Β-hücrelerin hakim popülasyonundan gelen kirletici sinyal en aza indirgenmişse, geniş alan sistemi de kullanılabilir.
Belirli uyaranlara yanıt olarak kalsiyum dinamiği kaydedildikten sonra, veriler floresan şiddeti vs zaman olarak sayısal olarak ifade edilir, ilk floresan normalleştirilmiş ve taban çizgisi düzeltilmiş, beyazlatma ile bağlantılı etkileri kaldırmak için florofor. Eğrinin altındaki ani frekanstaki veya kısmi alandaki değişiklikler (pAUC) gözlenen etkileri ölçmek için zamana göre hesaplanır. pAUC daha duyarlı ve oldukça sağlam ise spiking frekans kalsiyum artış mekanizması hakkında daha fazla bilgi sağlar.
Küçük hücre alt popülasyonları, adacık hücrelerinin belirli popülasyonlarında sitosolik kalsiyumda değişikliklere neden olan adrenalin ve ghrelin gibi marker bileşiklerine verilen fonksiyonel yanıtlar kullanılarak tanımlanabilir.
Introduction
Yöntemin amacı pankreas adacık hücrelerinin küçük alt popülasyonlarında sitosolik kalsiyum konsantrasyonundaki gerçek zamanlı değişiklikleri ([Ca2+]sit)görüntülemektir. Bu, bu hücrelerde hormon salgısını yöneten mekanizmaların ortaya çıkarılmasını, farklı hücre tipleri arasındaki çapraz konuşmanın ayrıntılarının ortaya çıkarılmasını ve potansiyel olarak adacık sinyalinin daha büyük resmine bir popülasyon boyutu getirilmesine olanak sağlar.
Adacıklar çeşitli hücre tiplerinden oluşur. Daha iyi bilinen insülin salgılayan β-hücrelerin yanı sıra, kan şekeri nin düzenlenmesinde de kritik olan en az iki alt popülasyon vardır3. α-Hücreler (adacık hücrelerinin yaklaşık% 17'sini oluşturan) kan şekeri çok düşük aldığında glukagon salgılar, karaciğerdepolarından kan dolaşımına glikoz salınımı sinyalleri. Aşırı glukagon düzeyleri (hiperglukagomi) ve glukagon salınımı eşlik bozulmuş kontrolü (ve, teknik olarak, katkıda bulunabilir) bozulmuş insülin duyarlılığı prediyabetik durum4. δ-Hücreler (%2 civarı) glikoz yüksekliğine yanıt olarak somatostatin salgılar. Bu her yerde bulunan peptit hormonu, hem glukagon hem de insülin salgılanması üzerinde güçlü birG i reseptör aracılı zayıflatıcı etkiye sahip adacıklar içinde α ve β-hücrelerin çevresinde yüksek konsantrasyonlarda mevcut olması muhtemeldir.
α-Hücreler ve δ-hücreler glikoz algılama makinelerinin büyük bir kısmını yakın soy akrabaları, β-hücreleri ile paylaşırlar. Her üç hücre tipi de ATP'ye duyarlı K+ kanalları ile donatılmıştır, bu heyecanlı hücrelerin plazma membran potansiyelini kontrol eden ayrıntılı metabolik sensörler5. Aynı zamanda, insülin salgıları, somatostatin ve glukagon glikoz tarafından farklı düzenlenir. Bu nedenle adacık hücrelerinin iki küçük alt popülasyonundaki Ca2+ dinamiğinin görüntülenmesi, kan şekeri ve adacık salgı çıkışı arasındaki çapraz konuşma hakkında bir fikir verebilir.
Yama-kıskaç elektrofizyolojisi kullanılarak α ve δ-hücrelerinin uyarılabilirliğini izleme ye yönelik ilk girişimler, kısa bir süre sonra tek α- ve δ-hücrelerde Ca2+ görüntülemesi ile takip edildi. Bu deneylerdeki hücrelerin kimliği anti-glukagon veya anti-somatostatin antikorları ile posteriori boyama yoluyla doğrulandı. Bu çabalar, adacık hücrelerinin adacık içinde ve tek hücre olarak çok farklı davrandığının bulunmasıyla sık sık engellenmiştir. Β-hücreler adacık düzenlemesinin ana bağışçıları gibi görünse de (güçlü elektriksel bağlantılarının altında yatan ezici çoğunluk nedeniyle), ana tutarsızlık şaşırtıcı bir şekilde α-hücrelerde bulunmasıydı. Bozulmamış adacık içinde, bu hücreler sürekli ve sürekli düşük glikoz, sadece tek dağılmış α-hücrelerin yaklaşık% 7 için geçerlidir aktive6. Bu nedenle, bozulmamış adacıklar içindeki α ve δ-hücrelerinin aktivitesinin raporlanması, in vivo koşulların daha yakın bir yakını olduğuna inanılmaktadır.
Genel olarak, ca2+ dinamiklerini özellikle α-hücre veya δ-hücre alt popülasyonlarından bildirmenin iki yolu vardır: (i) dokuya özgü bir promotör veya (ii) marker bileşikleri kullanarak genetik olarak kodlanmış bir Ca2+ sensörünü ifade etmek. Daha zarif eski yaklaşım gerçek 3D görüntüleme önemli avantajı ekler ve dolayısıyla adacık içinde hücre dağılımı nın incelenmesi. Ancak bozulmamış insan adacık malzemesi için uygulanamaz. Bir diğer potansiyel endişe, özellikle β-/α-hücre transdifferentiasyonu veya yüksek glikoza α-hücre yanıtı yerinde olduğunda, organizatörün 'sızıntı'sidir. İkinci yaklaşım insan örnekleri veya kültürlü adacıklar da dahil olmak üzere taze izole doku ile kullanılabilir. Ancak veriler sadece adacık hücrelerinin çevresel katmanından toplanır, çünkü boya/marker molekülünün adacık mimarisini değiştirmeden daha derin katmanlarda teslim edilmesi zordur. İkinci yaklaşımın beklenmeyen bir avantajı, deneylerin onlarca veya yüzlerce adacık (yani binlerce ila on binlerce hücre) eşzamanlı olarak görüntülenmesiiçin ölçeklenmesine olanak tanıyan geniş alan görüntüleme moduyla uyumluluktır.
Kalsiyum, genetik olarak kodlanmış GCaMP7 (veya pericam8)aile sensörleri kullanılarak, kalsiyum bağlayıcı protein calmodulin ve hedef dizisi, miyozin ışık zinciri kimyaz7M13parçası na bağlı dairesel olarak permuted yeşil floresan protein (GFP) varyantları olan canlı olarak görüntülenmiştir 7 ,9. GCaMPs nanomolar Ca2 + konsantrasyonları ve yüksek 2-foton kesit aralığında mükemmel sinyal-gürültü oranları var, hangi onları in vivo iş için ideal bir seçim yapar10,11. Rekombinant sensörler kullanmanın zor yönü hücrelere ulaştırılmasıdır. Heterolog ifade, sık sık hücre fonksiyonlarının potansiyel de-farklılaşması veya bozulması ile ilgili endişeleri yükseltir bir viral vektör ve çok saatlik ex vivo culturing kullanarak gerektirir. GCaMP'nin bu sorunu gidermek üzere önceden tasarlanmış fare modelleri bu sorunu gidermesine rağmen, müşteri adayı süresini önemli ölçüde artırarak ve çalışmayı insan olmayan bir modelle sınırlandırarak yeni zorluklar eklerler. Hücre içi pH değişikliklerine karşı çok yüksek duyarlılık protein bazlı sensörlerin başka bir olumsuztarafıdır 12, ancak, ca2gibi salınım sinyalleri algılama için bir sorun daha az.
Trappable boyalar avantajı (yeşil floresan Fluo4 gibi) onlar yaklaşık bir saat içinde taze izole doku içine yüklenebilir olmasıdır. Tahmin edilebileceği gibi, bısılabilir boyalar, rekombinant karşılıklarına göre daha düşük sinyal-gürültü oranlarına ve (çok) daha düşük fotostabiliteye sahiptir. Biz tuzak boyalar14toksisite13 raporları teyit edemez, ancak, boya aşırı yükleme sık sık bir sorundur.
Dairesel permütasyona dayalı kırmızı rekombinant Ca2+ sensörleri 201115'tenberi hızla gelişmektedir ve en son gelişmeler, kırmızı ışığın daha yüksek penetrasyon derinliği göz önüne alındığında, doku görüntülemesi için16 GCaMPs için güçlü bir rekabet sunar. Ticari olarak mevcut kırmızı trappable boyalar tek hücreli görüntüleme için güvenilir bir şekilde kullanılabilir ancak doku düzeyinde, yeşil analogları ile iyi rekabet edemez.
Odak dışı ışığın kritik bir sorun haline geldiği doku deneyleri için görüntüleme teknolojisinin çok az bir seçenek olduğu ortaya çıkmaktadır. Konfokal sistem, 0,3 (GCaMP6 durumunda) veya 0,8 (trappable boya) üzerinde NA herhangi bir hedef ile odak dışı ışık iptali ile kabul edilebilir tek hücreçözünürlüğü sağlar. Teknik anlamda, geleneksel bir konfokal mikroskop yüzlerce [Ca2 +]cyt eşzamanlı görüntüleme için kullanılabilir (GCaMP) veya adacıklar onlarca (trappable boya). Dokuda sensörün 3Boyutlu ekspresyonu durumunda konfokal modiçin tek gerçekçi alternatif belki de Hafif sac mikroskopidir.
Sensör adacık dokusu içindeki hücrelerin periferik tabakasında ifade edildiğinde durum için işler biraz farklıdır. Canlı hücre içi ifade deseni olan parlak rekombinant sensörler için, düşük NA hedefine sahip geniş alan görüntüleme modu kullanmak yeterli kaliteyi sağlayabilir ve araştırmacıyı görüş alanında önemli bir artışla ödüllendirebilir ve dolayısıyla Verim. Geniş alan lı bir sistem, odak dışı ışık iptal edilmedikçe daha zayıf uzamsal çözünürlük sağlar; bu nedenle, yüksek NA (alan derinliği düşük) hedefleri ile görüntüleme doku daha az bilgilendirici, tek hücreli sinyal büyük ölçüde komşu hücreler tarafından kontamine olduğu gibi. Kontaminasyon düşük NA (yüksek alan derinliği) hedefleri için çok daha küçüktür.
Ancak, yüksek iş ve/veya örnekleme oranının kritik bir avantaj haline geldiği görevler vardır. α- ve δ-hücreler önemli heterojenlik sergilerler, bu da alt popülasyonların katkısını ortaya çıkarmak için yüksek örneklem boyutlarına talep oluşturur. Geniş alan görüntüleme, sırasıyla on veya tek bir adacık üzerinde konfokal deneylerle aynı sinyal-gürültü oranıyla yüzlerce (GCaMP) veya onlarca (Fluo4) adacıkları görüntüleme, endüstriyel ölçekli geniş görüş alanı sistemi ile hızlı ve daha duyarlıdır. Elde edilen bu fark, geniş alan sistemini tek hücreçözünürlüğü ile popülasyonsal görüntüleme için avantajlı hale getirir ve bu da δ-hücre gibi küçük alt popülasyonlar için özellikle kritik olabilir. Aynı şekilde, Ca2+ spiking17'den gelen elektriksel aktiviteyi yeniden yapılandırma girişimleri, geniş alan görüntüleme modunun sağladığı daha yüksek örnekleme hızından yararlanacaktır. Aynı zamanda, hakim β-hücre alt popülasyonunun uyarılması üzerine pankreas α-hücrelerinin aktivitesi gibi çeşitli "niş" sorunlar, bir konfokal sistem kullanımını gerektirir. Konfokal mod doğru karar etkileyen bir faktör β-hücre alt popülasyonundan önemli kirletici sinyal varlığıdır.
Görüntüleme deneylerinden sonra hücrelerin kimliğini doğrulamak için hormona özgü antikor boyama kullanımı hala bir seçenek olmasına rağmen, küçük hücre alt popülasyonları α-18 ve δ-hücreleri19,20, sırasıyla Ca2 + dinamikleri seçici uyarmak için gösterilmiştir adrenalin ve ghrelin gibi fonksiyonel marker bileşikleri kullanılarak tespit edilebilir.
Zaman atlamalı görüntüleme verilerinin analizi, popülasyonal heterojenite, korelasyon ve farklı sinyallerin etkileşimi gibi önemsiz farmakolojinin ötesinde bilgi sağlamayı amaçlamaktadır. Geleneksel olarak, görüntüleme verileri zamana göre yoğunluk olarak analiz edilir ve ilk floresansa normalleşir (F/F0). Florofor sinyalinin beyazlatma veya otofloresan veya pH'daki değişikliklerle kontaminasyon nedeniyle (genellikle milimolar glikoz düzeyleri tarafından indüklenen12)bazal düzeltmeye sık lıkla ihtiyaç vardır. Ca2+ verileri birçok farklı şekilde analiz edilebilir, ancak üç ana eğilim, zamana göre hesaplanan başak frekansı, plato fraksiyonu veya eğrinin altındaki alandaki değişiklikleri ölçmektir. İkinci yaklaşımı, özellikle de yoğun olarak örneklenmiş konfokal verilere uygulamada avantajlı bulduk. pAUC ölçümünün avantajı sinyal frekansı ve genlikteki her iki değişikliğe karşı hassasiyetidir, oysa frekansı hesaplamak önemli sayıda salınım gerektirir21, geleneksel görüntüleme kullanarak elde edilmesi zor. pAUC analizinin sınırlayıcı faktörü temel değişikliklere karşı yüksek duyarlılığıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada açıklanan tüm yöntemler Birleşik Krallık Hayvanlar (Bilimsel Prosedürler) Yasası (1986) ve Oxford Üniversitesi etik kurallarına uygun olarak geliştirilmiştir.
1. Fare pankreas adacıkları izole
- Kültür ortamını ve izolasyon çözümlerini hazırlayın.
- Kültür ortamını oluşturan: RMPI1640 (Bkz. Malzeme Tablosu),fetal buzağı serumunun %10'u, 100 ünite/mL penisilin, 100 μg/mL streptomisin ile desteklenmiştir. Orta yığma iki adet 60 mm plastik Petri kabına dağıtın (herhangi bir yapıştırıcı yla tedavi edilmez) ve bulaşıkları kuvözde tutun (37 °C, %5 CO2, mutlak nem).
- İzolasyon çözeltisini (50 mL/fare) yapın: Hanks'in 5 mM glikoz, 100 birim/mL penisilin 100 μg/mL streptomisin içeren orta aracı. Buzda (4 °C) tutun.
- Enzim çözeltisini (örn. Liberaz): izolasyon çözeltisinde 0.2 mg/mL, fare başına 2 mL. Buzda (4 °C) tutun. İsteğe bağlı olarak, liberaz aktivitesini önceden test edin ve enzim22'ninher bir partisi için kuluçka parametrelerini optimize edin.
- Enzim çözeltisini fare safra kanalına enjekte edin.
- Servikal çıkış yoluyla fareyi (12 haftalık dişi, C57Bl/6J) kurban edin.
- Bir diseksiyon mikroskobu altında, ince makas kullanarak deri ve kas tabakalarını açın ve safra kanalını bulun.
- Bir pamuk ipliği kullanarak, safra kanalı ile kavşak her iki tarafında bağırsak ligate.
- Eğri ince saat çicitleri ile safra kanalını hafifçe kaldırın ve 30G iğneli 2 mL şırınga kullanarak buz gibi enzim çözeltisini kanala tanıtın. Pankreas bir enflasyon bu aşamada gözlenmelidir.
- 15 mL şahin tüp içine künt burunlu başparmak forceps ve ince saatçi's forceps bir arada kullanarak şişirilmiş pankreas toplamak ve buz (4 °C) üzerinde tutmak. Tüpiçine enzim çözeltisinin 1 mL ekleyin.
- Liberate ve pankreas adacıkları toplamak.
- 37 °C'de bir su banyosunda 16 dakika boyunca enzim çözeltisi ile şişirilmiş pankreata inkübül. Nazik sallayarak kullanılabilir ama kritik değildir, enflasyon iyi olması koşuluyla.
- 10 mL'ye kadar buz gibi izolasyon çözeltisi ekleyerek sindirimi durdurun. Yavaşça sindirimi sallayın: küçük parçalara düşmelidir.
- İzolasyon çözeltisinin 10 mL'lik sindirimi üç kez yıkayın, 5 dk 1 x g kalınlığında durun ve kurtarılmış adacıkları buz üzerinde tortulayın. 10 mL serolojik pipet ile süpernatant'ı hafifçe aspire edin.
- Sindirim (10 mL kadar yapmak için) soğuk RPMI ekleyin.
- Adacıkları almak için plastik Petri kapları (adım 1.1.1) kullanın. RMPI ortamıpetri tabaklarından birinden çıkarve hafifçe sindirimin (4-5 mL) bir kısmını dökün. İkinci Petri kabına P10 pipetiyle yuvarlak, pürüzsüz ve yüksek yoğunluklu parçalar olarak görünen kurtarılmış adacıkları toplayın.
- Kültür kuluçka adacıkları (37 °C, 5% CO2, mutlak nem). Deneme bu aşamada duraklatılmış olabilir. Adacıkları 1-2 saat bırakmak, izolasyon sırasında mekanik stresten kurtulmaya yardımcı olduğuna inanılmaktadır.
2. Boyayı yükleyin veya sensörü ifade edin
- Trappable boya hazırlayın.
- DMSO'daki trappable boyanın (örneğin, Fluo-4) aliquotunu (normalde 50 μg) 2 mM'lik bir stok konsantrasyonuna eritin. Boyanın çözünürasyonunu iyileştirmek için %1'lik (DMSO'da %20 hisse senedi kullanarak) son konsantrasyonuna pluronik asit ekleyin.
- Küçük PCR tüpler (her içine 2 μL) boya Aliquot. Boya birkaç hafta dondurulmuş (-20 °C) saklanabilir.
- Alternatif olarak, rekombinant sensörü hazırlayın.
- Sensörü (örn. adenoviral vektör kodlama GCaMP6f) 10 μL aliquots'a dağıtın ve -80 °C'de saklayın.
- (İsteğe bağlı olarak) enfeksiyon için en uygun konsantrasyonu ortaya çıkarmak için, birkaç seri seyreltme kullanarak adacıklar (aşağıdaki gibi) enfekte ederek viral stok titresini önceden test edin.
NOT: Farklı vektörler (lentivirus, BacMam, AAV) tarafından kodlanmış rekombinant sensörler farklı bir enfeksiyon protokolü gerektirir. Bunu vektör sağlayıcısına kontrol ettiğinizden ve ihtiyaçlarınız için çalışma oranını optimize ettiğinizden emin olun. Adenovirüsün "çalışma" stoku -20 °C'de depolanabilir ve birkaç kez dondurulabilir/çözülebilir. Aşırı donma-çözülme bisiklet virüsün etkili titresini azaltır.
- Görüntüleme çözümlerini hazırlayın.
- Görüntüleme solüsyonu, mM makyaj: 140 NaCl, 4.6 KCl, 2.6 CaCl2, 1.2 MgCl2, 1 NaH2PO4, 5 NaHCO3, 10 HEPES (pH 7.4, NaOH ile).
- Görüntüleme çözeltisinde glikoz (0,5 M) ve mannitol (0,5 M) stoku hazırlayın. Stok buzdolabında (4 °C) birkaç hafta saklanabilir.
- Trappable boya yükleyin.
- 6 mM glukoz içeren görüntüleme çözeltisinin 600 μL'lik boyasının 2 μL'sini eriterek boya çalışma çözeltisini yapın. Çözelti ısıtılabilir veya çözünürasyonu artırmak için girdap.
- 1. adımda izole edilen adacıkları boyanın çalışma çözümüne yükleyin. Yükleme çok kuyulu bir plaka veya Petri kabı kullanılarak yapılabilir. İkinci durumda, yapışmaz petri kabının (35 veya 60 mm) altına çalışma çözeltisinin 100 μL'lik damlacıkını ve damlacık içine pipet 10-30 adacık yerleştirin.
- Farklı adacık grupları (örn. yabani tip/nakavt) durumunda, yüklemenin aynı anda yapIlebilmesi için birden fazla kuyu ve birden fazla damlacık düzenleyin.
- Boya çözeltisindeki adacıkları 70-90 dakika karanlıkta oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın. Aşırı kuluçkaya yatmayın.
- Floresan mikroskobu altında yükleme kontrol edin; adacıklar hafif floresan kazanmalıdır, bazı hücreler diğerlerinden daha parlak olmak. Hücrelerin yuvarlanması ve boyanın nükleer lokalizasyonu aşırı yüklemenin işaretleridir.
- Adacıkları 6 mM glikoz içeren boyasız görüntüleme solüsyonuna aktarın. Adacıklar hemen görüntüleme için kullanılabilir, ancak isteğe bağlı boya başka bir 10-15 dakika için esterify için bırakılabilir. Adacıklar boyayı birkaç saat boyunca saklar lar ve bu nedenle birkaç vardiyada görüntüleme için kullanılabilirler.
- Alternatif olarak, rekombinant vektör ile adacıklar bulaştırmak.
- RpMI culturing orta (adım 1.1.1) (örneğin, 30 μL) damlacıkları plaka gerekli vektör hacmini en aza indirmek için.
- Vektörü, ideal olarak enfeksiyon çokluğu ile sonuçlanması gereken yaklaşık 105 enfeksiyöz birim/adacık oranında ekleyin >2. İdeal olarak oran, çevresel katmanda ifade sağlayacak en az orana göre optimize edilmelidir. Ön titrasyon (adım 2.2.3) yardımcı olabilir.
- 8-48 saat boyunca damlacık ve kültür içine 20-50 adacıklar tanıtın. (İdeal olarak, bir gecede). Adacıklar hücre morfolojisinde değişiklik olmadan, hücrelerin çoğunda soluk yeşil floresan geliştirmek gerekir.
NOT: Enfeksiyonun ve ekspresyonun başarısı virüs çözeltisine maruz kalma süresine bağlıdır. İdeal olarak, virüs bir gecede çözüm de kalmalıdır ama isteğe bağlı olarak 15 dakika gibi kısa bir süre sonra kaldırılabilir. Ancak, enfektelik, ve bu nedenle ifade, önemli ölçüde daha düşük olması muhtemeldir.
3. Görüntüleme Ca2+ dinamiği
- (ters) mikroskop altında adacıkları hareketsiz hale getirin.
- Ters mikroskopi için görüntüleme odasını birleştirin. Cam kapak kaymasını (kalınlık 1 veya 1,5) haznenin içine yerleştirin ve cam haznesinin su geçirmez olduğundan emin olun. Kapak kaymasının mikroskop hedefinin ulaşabileceği bir yerde olup olmadığını kontrol edin (hantal bir yüksek NA hedefi için kritik önem).
- Immobilizasyon aksesuarlarını hazırlayın. İnce örgü ve kaba örgüden küçük dikdörtgenler (20 mm x 20 mm) kesin. 45-50 μm kalınlığında yapışkan bant kullanarak ince örgü üzerinde iki spacer "duvarlar" tanıtın. Görüntülenecek adacıkların boyutu geleneksel 100 μm'yi önemli ölçüde aşıyorsa, spacer'ın çift katmanlarını kullanın.
- 35 mm Petri kabı kullanarak meshes ve ağırlığı görüntüleme çözeltisine batırın. Plastik ve metal ıslak olduğundan emin olun.
- Bir diseksiyon mikroskobu altında, spacer "duvarlar" baş aşağı, spacers yukarı bakan ince örgü açın. Trappable boya ile yüklü veya p20 pipet ile rekombinant sensörü ifade birkaç adacıkları seçin ve yavaşça ince örgü üstüne, iki boşluk arasında konumlandırılmış. Kafes ve yıkıtaçların üzerlerinde aşırı miktarda görüntüleme solüsyonu içermediğinden emin olun.
- Saatçi nin ponp'larını kullanarak adacıklarla kafesi toplayın ve görüntüleme odasının içine ters konuma getirin, böylece boşluklar aşağı doğru yüzyüze gelip doğrudan oda örtüsünün üzerine oturun. Adacıkların boşluk ve kafes arasında, kapak kaymasının ortasında sıkışıp kaldığından emin olun.
- Kaba örgü ve oda içinde ince örgü üstüne ağırlık yerleştirin. Görüntüleme solüsyonunu odaya tanıtın. Adacıkların hareketsiz ve görüntülenmeye hazır olduğundan emin olun. Haznenin aşırı sallanmasından kaçının (odayı mikroskoba taşımak ve ısıtmalı bir aşamaya yerleştirmek gibi küçük tedirginlikler kabul edilebilir).
NOT: Dik sistem için benzer bir immobilizasyon düzenlemesi uygulanabilir.
- Mikroskobu hazırla.
- Görüntüleme modunu ve amacı seçin, mikroskobun sıcaklık kontrollü aşamasında adım 3.1 adacıkları ile oda konumlandırmak.
- Sıcaklık kontrolünü (ideal olarak, 30 °C ile 36 °C arasında) ve perifüzyonu ayarlayın. Ters bir sistem için, girişodası içindeki çıkıştan daha düşük bir konuma yerleştirin ve çıkış akışını girişinkinden daha büyük olacak şekilde ayarlayın (genellikle peristaltik pompada daha geniş bir iç çapın bir borusu kullanılarak elde edilir).
- Çıkışın çözümle minimum temas yüzeyine sahip olduğundan emin olun, böylece çözeltiyi birden fazla sıralı küçük damlacıklarda kaldırarak uzun aralıklardan sürekli çözüm çıkarmadan kaçının. Her görüntülenmiş pikselin düzenli periyodik yoğunluk salınımları olarak görünen ve sık sık "yavaş dalgalar" olarak yorumlanan periyodik sinyallerin hızlandırılmış görüntülemesinde en önemli eser kaynağıdır.
- 3 mM glukoz içeren görüntüleme solüsyonu ile perifüzyonu başlatın.
- Yeşil floroforların görüntülenmesi için ışık yolunu ve filtreleri seçin; 470 ile 500 arasında uyarma ve 505 ile 550 arasında emisyon her biri için çalışacak.
- Görüntüleme parametrelerini ayarlamak için canlı görüntüleme çalıştırın. İlgi çekici adacıkları yakalamak için görünümü ayarlayın.
- Görüntünün sinyal-gürültü oranını optimize edin. Bu amaçla, uyarma ışık yoğunluğunu, pozlama süresini ve binning'i ayarlayın. Ayarların, adacık içindeki her hücrenin mümkün olan en az ışık yoğunluğu ve pozlamada ayrı bir görselleştirilmesine izin verdiğinden emin olun.
- Görüntü edinimi gerçekleştirin. Göreve bağlı olarak, görüntüler 0,1 ile 5 Hz arasında alınabilir. Bu, α ve δ-hücrelerdeki (>300 Hz) hızlı Na+-tahrikli salınımlar için Nyquist kriterlerinin çok altındadır, bu da verilerin varsayılan olarak az örneklendiği anlamına gelir. Ancak, bu talebe uygun edinme frekansını artırmak, geniş bir görüş alanına sahip çok hücreli/çok adacıklı görüntülemede mümkün değildir. GCaMP daha hızlı görüntülenebilir, Fluo4 ise hızlı edinme koşullarında kaçınılmaz çamaşır suyu olacaktır.
NOT: [Ca2+] adacık hücrelerindekisit salınımlarının elektriksel aktivite ile yönlendirildiği göz önüne alındığında, düşük alım oranları nın kullanılması ters gelebilir. Gerçekte, 1 Hz civarında veya üzerinde edinme oranları β-hücre spiking davranış13çözmek için yeterli olabilir , α sodyum kanal odaklı salınımların tespiti için eşik ise- ve δ-hücreler de 300 Hz üzerindedir. Α- veya δ-hücre [Ca2+]cyt salınımları 1 Hz veya 0,1 Hz'de elde edilsin, bunlar ciddi şekilde az örneklenecek ve elektriksel aktivite yerine ca2+ kullanımını yansıtacaktır.- Elde edilen verilerin kalitesini kontrol edin: 3 mM glikozda α-hücre aktivitesi açıkça görülebilmeli/tespit edilebilir olmalıdır. Durumun böyle olduğundan emin olun ve tam ölçekli hızlandırılmış görüntülemeye geçin.
- Görüntüleme modunu ve amacı seçin, mikroskobun sıcaklık kontrollü aşamasında adım 3.1 adacıkları ile oda konumlandırmak.
- Hızlandırılmış görüntüleme
- Bu varsa, satın alma yazılımında uygulanan sinyal dinamiklerinin çevrimiçi grafiğinden yararlanın. Çevrimiçi grafik bir seçenek değilse, sinyal yoğunluğunu en kapsamlı şekilde görüntüleyen bir arama tablosu uygulayın (örneğin"gökkuşağı").
- Uyaranları geri döndürülebilir bir şekilde uygulayın: sinyalin iyileşmesini bazal seviyeye kaydedin. Kaydın başında ve sonundaki eserleri yoksay; ikincisi pH veya hücre ölümü değişiklikleri nedeniyle prob floresan geri dönüşümsüz "artış" / "azalma" gibi görünebilir.
- Α-hücreleri düşük glikozda oscillatory Ca2+ dinamikleri ile ayırt edin. Banyo çözeltisi içine adrenalin veya glutamat tanıtın, 2-5 dakika için geri dönülmez. [Ca2+]cyt'de hızlı bir sıçrama ve ardından salınımların yavaşlaması veya iptali takip edecektir.
NOT: Adrenalin α hücreleri için tanınan bir belirteç bileşiktir, adacık hücrelerinin bu alt popülasyonüzerinde seçici bir pozitif etkiye sahiptir, hücre içi depolardan Ca2 + serbest bırakılması aracılık18. Glutamat başka bir α-hücre spesifik agonist23olarak ortaya konulmuştur. - Add / kaldırmak ghrelin, hangi son δ-hücre seçici19,20etkinleştirmek için bildirilmiştir . [Ca2+]cyt'inde küçük bir adacık hücresi alt popülasyonunda hızlı bir geri dönüşümlü artış gözlemleyin.
- 20 mM glikoz ekleyin/çıkarın. Β-hücre alt popülasyonunda eşgüdümlü bir salınım yanıtı gözlemleyin. Daha önce adrenalin veya glutamat ve ghrelin tarafından aktive edilmiş hücrelerin yanıtı na dikkat edin.
- Görüntü dizisini kaydedin. Kayıt sırasında "AutoSave" kullanmayı düşünün.
4. Verilerin analizi
- Hızlandırılmış görüntüyü analiz edin.
- Hızlandırılmış görüntüyü açık kaynak görüntü/FIJI gibi bir görüntü çözümleme yazılımına aktarın.
- Kayıt sırasında önemli/hızlı hareket oluştuysa, verileri onarılamaz olarak atın. Küçük sürüklenmeleri düzeltmek için StackReg veya TurboReg eklentileri24'üni kullanın.
- Hücre algılama ve ilgi alanı (YG) eşleme için bir maske görüntüsü oluşturun. Bunu başarabilmek için tercih edilen yol, "ortalama yoğunluk" veya "maksimum yoğunluk" gibi işlevlerden birini kullanarak bir yığın görüntüsü yapmaktır. Kullanılacak işlev, tek tek hücrelerin en iyi şekilde tanınmasını sağlayacak işlevdir.
- Maske görüntüsünü eşiğine çıkarın, adacık bölgesi dışındaki tüm verileri kaldırın. İşlev 32 bit görüntüler için otomatik modda çalışır.
- Eşik görüntüsünde maxima'yı algıla. Maksima, görüntü yoğunsa noktalar, bölgeler ve hatta sektörlerle temsil edilebilir.
- Herhangi bir boyut kısıtlaması olmadan 'maxima bul' işlevini uygulayın ve algılanan maxima'yı ilgi bölgesine yapıştırın (RoI) düzenleyicisine.
- Düzgün / enterpolasyon her ROI eşlenen; muhtemelen, ROI genişleme gerektirir. Basit bir komut dosyası için (4.1.6-4.1.8) yazılabilir ve en iyi hücre algılama sonuçlarını sağlamak için birkaç kez çalıştırılabilir. Birkaç ROI çakışabilir ama bu nadirdir.
- ROI'ların konumunu analiz edin ve ilgili X ve Y verilerini elektronik tablo yazılımına (örneğin, Microsoft Excel) yapıştırın.
- Tüm ROI'lar için gri yoğunluk ve zaman karşılaştırmasını analiz edin ve verileri elektronik tablo yazılımına yapıştırın.
- Sayısal verileri analiz edin.
- Verileri veri çözümleme yazılımına aktarın. Yazılımın seçimine ve denemenin süresine/örneklemeye/boyutuna bağlı olarak, bu basit bir kopyala-yapıştır işlemi veya bağımsız bir yordam olabilir. Sayısal verilerin düzenlenmesini ve depolanmasını sağlayın.
- Varsa zaman damgalarını veya zaman notlarını içeri aktarın.
- Ham floresan yoğunluk verilerini ("F") floresan ilk değerine ("F0") normalleştirin. Bu ilk noktada floresan olması gerekmez ama birkaç ilk nokta nın ortalaması olabilir. Normalleştirme, verilerin değişkenliğini azaltmalı ve ideal bir durumda (sürüklenen taban çizgisi yok) analiz edilebilir bir veri kümesiyle sonuçlanmalıdır ("F/F0").
- F/F0 veri kümesinin hücreden hücreye değişkenliği hala önemliyse (uzun kayıt, beyazlatma), temel düzeltmeyi gerçekleştirin. Bu amaçla, bir 'kontrol' bölgesi, yani kontrol çözeltisi (fare pankreas adacıkları için, herhangi bir agonist/antagonist olmadan 3 mM glikoz) uygulandığı zaman aralığıtanımlayın.
- Kontrol bölgesinin salınımsız net bir sinyali varsa, f/f0'ın kontrol çözeltisinin her uygulamasından sonra başlangıç değerine (F/F0=1) geri döndüğünü varsayalım. Denetim çözümü eklendiğinde ki noktalara ayrılan verileri parçalara bölerek ve her segmente doğrusal düzeltme uygulayarak her hücre için hızlandırılmış verileri düzeltin. Bu, eserlerle sonuçlanmadan polinom veya diğer doğrusal olmayan düzeltmeleri kullanmayın.
- Kontrol aralığında net salınımlar varsa veya ek faktörler (FAD otofloresans gibi) varsa, bir başak algılama algoritması kullanın17. Bunun için önemsiz ve hızlı bir şekilde dolaşmamak maksima duyarlı bir dalga dalgası dönüşümüdür (Şekil 3A).
- Verileri ölçün. Ca2+ son derece dinamik bir sinyal olmasına rağmen, Ca2+ verilerini mutlak F/F0 değerleri açısından sunmak biyomedikal literatürde yaygın olarak kabul edilebilir. Birden çok denemenin sonuçlarının karşılaştırılması gerekiyorsa, bir metrik seçin.
- Ca2+ ani artışlarının(Şekil 4A,D)sıklığını ve (karınca) agonistlerin eklenmesine verdiği yanıtı ölçün. Bu amaçla, kaydı eşit zaman aralıklarına bölün ve aralık içindeki ani artışları sayarak ve aralık süresine normalleştirerek kısmi frekansın zaman aralığını (aralıkların her birinde artış frekansı) hesapla.
- Alternatif olarak, eşiği ayarlayın ve yukarıda tanımlanan aralıkların her biri için plato fraksiyonu (pf) hesaplayınız(Şekil 4B,F). Kesir, hücrenin "heyecanlı" durumda geçirdiği aralık taki zaman yüzdesini gösterir.
- Alternatif olarak, yukarıda tanımlanan aralıkların her biri için eğrinin (pAUC) altındaki kısmi alanı hesaplayınız(Şekil 4C,G). Bu metrik, hem frekans hem de spiking genlik değişikliklere duyarlıdır.
NOT: Frekansı ölçmek için bir uyarı başak süresi ve zayıf stabilite için duyarlılık eksikliğidir. Veriler elektrik spiking karşı ağır undersampled olduğundan, aralık başına ani sayısı oldukça küçük ve bu nedenle tek bir ekstra başak önemli ölçüde sonucu etkileyebilir. pAUC'nin 'darboğaz'ı, taban çizgisindeki değişikliklere karşı hassasiyetidir. Her ne kadar eserlere daha az yatkın ve [Ca2+]sitdeki değişikliklere frekanstan daha duyarlı olsa da, pAUC yine de Ca2+ dinamiğinin doğası hakkında pek bilgilendirici değildir. Plato fraksiyonu, açık olasılık kavramının tüm hücre sistemine genişlemesidir. Eşik değerine olan bağımlılığı nedeniyle pAUC'den daha az sağlamdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Adacıklar trappable boyalar ile oldukça iyi yük(Şekil 1A), membran lipid bileşimi etkilenmedikçe (örneğin, yağ asitlerine kronik maruz kalma ile). İnsan adenovirüs tip 5 (Ad5) vektörü de tüm adacık hücrelerini hedefler (Şekil 1B). Aynı hücrede birden fazla rekombinant sensör ifade edildiğinde sorunlar ortaya çıkabilir. Ayrıca, adacıklar genellikle çok iyi olağanüstü istikrar ve çözüm erişim sağlar yukarıda açıklanan teknoloji kullanılarak hareketsiz vardır.
Α-hücrelerde Ca2+ spiking düşük glikoz seviyelerinde kolayca tespit edilebilir(Şekil 2). Düşük glikoz aktivitesi ile adrenalin ve glutamata yanıt arasında yüksek hücre-hücre korelasyonu vardır. Ghrelin düşük glikozbazı adrenalin duyarlı hücreleri aktive (α-hücreleri?) ancak düşük glikoz tarafından aktive hücrelerin çoğunda Ca2 + dinamikleri üzerinde hiçbir etkisi yoktur (β-hücreler).
Kısmi frekans(Şekil 4A,C)açısından analiz edildiğinde, adrenalin veya ghrelin ile uyarılmış hücreler ya hep ya hiç koşulları altında önemli bir artış gösterirler. Yani, adrenalin veya ghrelin ile aktive olur düşük bazal aktivite ile bir hücre bu metrik dramatik bir artış sergiler. Ancak, bazal spiking ve adrenalin etkisi arasındaki genel değişiklikler çok ince(Şekil 4A,C). Buna karşılık, kısmi AUC tüm hücrelerde adrenalin tarafından tanıtılan değişikliklere duyarlıdır, bazal aktivite yüksek olsa bile(Şekil 4B,D).
Şekil 1: Balıcı boyanın yüklenmesi ve rekombinant sensörün adacıklarda ifadesi. Trappable boya Fluo-4(A)ile yüklenen veya hücrelerin periferik tabakasında(B)veya daha derin tabakada(C)rekombinant sensörü GCaMP6'yı ifade eden tipik fare adacıkları . Polar tracer sulforhodamine B (SRB, beyaz olarak gösterilmiştir) her adacık içinde tek tek hücreleri anahat kullanılmıştır25. (D) Fluo4 kullanarak adacık içindeki hücrelerden kaydedilen glikoza yanıt olarak Ca2+'nın temsili kinetikleri. Küçük hücre popülasyonları içindeki heterojenliğe dikkat edin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Adacık hücrelerinin çeşitli uyaranlara tipik Ca2+ tepkisi. Tipik α-hücre (A) ve δ-cell (B) Ca2+ dinamiği, adrenalin, glutamat, ghrelin, glukoz. (C)-(D)Adrenalin pozitif(C)ve ghrelin-pozitif (D) alt popülasyonlarını gösteren adacık hücre yanıtının ısı haritaları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Temel düzeltme. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Hızlandırılmış verilerin analizi. Α-hücrelerdeki Ca2+ dinamiklerinin analizi. Kısmi frekans (A), plato fraksiyonu (B) ve bir α-hücrenin eğrisi(C)altındaki alan [Ca2+]i iz. Popülasyonal [Ca2+]i verileri ham olarak ifade edilen bir fare pankreas adacık (F/F0) (D), kısmi frekans(E), plato fraksiyonu (F) ve eğrinin altındaki alan(G). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokolün genel başarı için kritik olan üç aşaması vardır. Liberase enziminin safra kanalına başarılı bir şekilde enjekte edilmesi sadece izolasyon işleminin kantitatif başarısını değil, aynı zamanda izole adacıkların kalitesini de etkiler. Uninflated pankreata izole adacıklarda bazı önemli metabolik yanıtların eksikliğine neden olabilir. İkinci olarak, boyanın/sensörün ifadesinin yüklenmesi, zaman atlamalı kaydın sinyal-gürültü oranını tanımlar. Sinyaller aşırı yüklü adacıklarda yok veya zayıflatılır. Son olarak, görüntüleme odası içinde doku başarılı ve yoğun konumlandırma anlamlı ve analiz edilebilir deneyler için belirleyici bir andır. Kötü konumlandırılmış veya hareketli doku, harcanan deneysel zaman ve/veya belirsiz verilerle sonuçlanır.
Yöntem birden fazla sinyal (konfokal sistem kullanılarak) ve birden fazla adacık grubu (örneğin, farklı genotip) için hesap için değiştirilebilir. Birden fazla sinyalin görüntülenmesi, ca2+ muhabiriyle uyumlu olan adacık hücresine ikinci bir sensör teslim ini varsayar (pH sensörü SNARF5f26,27gibi). Bu amaçla, adacıklar ca2+ ve pH sensörleri ile birlikte yüklenebilir/birlikte enfekte olabilir ve bu sensörler her zaman çerçevesi içinde sırayla görüntülenebilir.
Sinyalin tek hücre çözünürlüğü ile adacık grupları halinde görüntülenmesi geniş bir görüş alanı hedefi kullanılmasını gerektirir. Amaç daha düşük büyütme ve sayısal diyafram (NA) olması muhtemeldir, böylece mekansal çözünürlüğü azaltarak. Düşük NA hedefinin artan odak derinliği nedeniyle, görüntüleme geniş alan sistemi üzerinde gerçekleştirilebilir. Bu düzenlemenin dezavantajları, ışık sinyalinin hücre-hücre çapraz kontaminasyonu ve 3B sinyali görüntüleme yeteneğinin azalmasıdır (örneğin, insülin organizatörleri altında Ca2+ sensörünü ifade eden fareler). Aynı zamanda, yüzey adacık hücrelerinden ifade edilen sinyal, onlarca ila ve yüzlerce adacık18dahil olmak üzere gruplardan gelen yüksek zamansal çözünürlükle mükemmel bir şekilde çözülebilir.
Kulağa hoş gelmeyen ama görüntü analizi ve sayısal veri analizinin ayrı yazılım paketlerinde gerçekleştirilmesi iyi bir fikir olsa da. Şu anda, ImageJ/FIJI bilimsel görüntü analizine hakimdir. Bilimsel kodlama için en popüler ortamlar Python ve Matlab, henüz r28Ca2 + verileri analiz etmek için bilinen çabaları da vardır. En iyi kullanılabilirlik IgorPro gibi daha niş paketleri tarafından sağlanmaktadır. Bizim seçim Matlab / Python prototip ve daha sonra 'boru hattı' kullanımı için IgorPro kodu uygulamaktır. Analitik ihtiyaçlar için elektrofizyoloji (örneğin, Clampfit, Neuroexplorer) için sinyal analiz paketlerinin uyarlanması tek hücreli görüntüleme için yararlı olabilir, ancak ölçeklendirmesi zordur. Bu tür paketler tarafından sağlanan birçok seçenek, düşük örnekleme oranı nedeniyle adacık görüntüleme için geçerli değildir.
Bu metodolojinin bir dizi faktörle sınırlı olduğunu unutmamak önemlidir. İlk olarak, yukarıda da belirtildiği gibi, görüntüleme büyük ölçüde verilerin yetersiz örneklenmesi ne dayalı, bu nedenle doğrudan hücrenin elektriksel aktivitesi ile karşılaştırıldığında olamaz anlamına gelir. İkinci olarak, veriler adacık çevresinden gelir ve genellikle üç boyutlu olan önemli bağlantı süreçlerini yansıtmaz. Üçüncü olarak, yükleme/ifade düzeyi sensör yoğunluğualgısını etkiler. Son olarak, marker bileşikleri tarafından daha az araştırılmış adacık hücre alt popülasyonlarının (örneğin, PP hücreleri ve ε-hücreleri) aktivasyonu göz ardı edilemez, ancak adacık içindeki bu hücrelerin düşük sayıları nedeniyle herhangi bir potansiyel kontaminasyon en aza inecektir.
Salınım süreçleri gerçekten yaşayan bir doku güçlü bir izlenim sunmak gibi yöntem, görsel etki açısından gerçek bir 'şampiyon'dur. Küçük hücre alt popülasyonlarına uygulanan yöntem, alt grupların tanımlanmasına ve heterojenliğin yansıtılabilmesine olanak sağlayarak her birinin işlevini güvenilir bir şekilde inceler.
Kalsiyum dinamiği pankreas adacık β-hücreleri üzerinde 40 yılı aşkın bir süredir incelenmiştir, çoğunlukla satın alma/algılama teknolojisindeki ilerlemeden kaynaklanmıştır. Erken çalışmalar atomik absorpsiyon spektroskopisi29kullanılan , ama floresan Ca2 + sensörleri gelene kadar değildi 30 ayrıntılı kinetik bireysel adacık hücrelerinde çözülebilir, photometry kullanarak31,32,33. Bundan kısa bir süre sonra, Ca2 + kinetik mekansal bileşeni Ca2 + görüntüleme34olarak geliştirilmiş,35,36 rutin bir teknoloji oldu, sonra yeni kullanılabilir şarj-coupled cihaz sayesinde (CCD) dedektörleri. Odak dışı ışık sorunu, doku içindeki tek tek hücrelerden gelen sinyalgörüntüleme engel, daha sonra lazer tarama konfokal mikroskopi (LSCM)37 ve toplam iç yansıma floresan mikroskopi (TIRFM)38ile 1990'ların ortalarında çözüldü. Her iki yöntem, floresan Ca2 + sensörleri 488 nm lazer ile heyecanlanabilir yeni nesil gelişi ile tamamlanan, başarıyla adacık hücre alt popülasyonları Ca2 + dinamikleri görüntü için kullanılmıştır39,40,41.
Yeni yüzyıl, nörolojiile ilgili teknolojik gelişmelerden kaynaklanan iki yeni trendi öne çıkardı. İlk olarak, GFP varyantlarının dairesel permütasyonuna dayanan rekombinant floresan sensörler Ca2+ tespiti için sinyal-gürültü oranını önemli ölçüde artırarak, çalışmaları her hücredeki [Ca2+]cyt dinamiğinin çözülebileceği büyük hücre popülasyonları seviyesine getirerek etkili bir şekilde artırdı. İkinci olarak, dokuya özel organizatörlerin kullanımı küçük alt popülasyonlara sensör ekspresyonunun hedeflemesine izin verdi.
Genel olarak nörolojideki gelişmeleri yansıttığı düşünülse de, adacık Ca2+ dinamiği üzerine yapılan çalışmalarda iki temel fark vardır. İlk olarak, teknolojik olarak, adacık sinyalizasyonu herhangi bir in vivo görüntüleme pankreas ve adacıkların konumu42öngörülemeyen anatomisi nedeniyle beyinde görüntüleme daha karmaşıktır. İkinci olarak, adacık β-hücreler arasındaki mükemmel elektriksel bağlantı aslında yüksek glikoz uyaranlarına mükemmel bir all-or-nothing tepki gösteren elektriksel olarak inert popülasyonlar içine adacıklar işler. Dokuya özgü hedeflemeye dayalı δ-hücreleri gibi küçük adacık alt popülasyonlarında [Ca2+]i kinetik çalışmalarının farmakoloji/fizyoloji bilgimizi genişletme olasılığı olduğuna inanıyoruz. Aynı zamanda, son derece hassas problar bu tür ölçümlerin istatistiksel gücünün genişletilmesine, adacık-adacık değişkenliğine muhasebeleştirilmesine ve tek bir paralel deneyde farklı gruplardan adacıkların görüntülenmesine olanak sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması beyan etmezler.
Acknowledgments
AH Diabetes UK Doktora Öğrenciliği'ne katıldı, EV OXION-Wellcome Trust Eğitim Programı tarafından desteklendi, AIT Oxford Biyomedikal Araştırma Konseyi doktora sonrası burs düzenledi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40x/1.3 objective | |||
| Axiovert 200 microscope | |||
| emission | |||
| Excitation | |||
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F7524-500ML | |
| Fluo4 | Thermo Fisher (Life Technologies) | F14201 | |
| GCaMP6f, in (human type 5) adenoviral vector | Vector Biolabs | 1910 | |
| Hanks' solution | Thermo Fisher (GibCo, Life Technologies) | ||
| Liberase | Sigma-Aldrich | 5401020001 | |
| penicillin/streptomycin | Thermo Fisher (GibCo, Life Technologies) | 15140122 | |
| RPMI medium | Thermo Fisher (GibCo, Life Technologies) | 61870044 | |
| Zeiss LSM510-META confocal system | Carl Zeiss |
References
- Elayat, A. A., el-Naggar, M. M., Tahir, M. An immunocytochemical and morphometric study of the rat pancreatic islets. Journal of Anatomy. 186, Pt 3 629 (1995).
- Cabrera, O., et al. The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (7), 2334-2339 (2006).
- Brereton, M. F., Vergari, E., Zhang, Q., Clark, A. Alpha-, delta-and PP-cells: are they the architectural cornerstones of islet structure and co-ordination. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 63 (8), 575-591 (2015).
- Færch, K., et al. Insulin resistance is accompanied by increased fasting glucagon and delayed glucagon suppression in individuals with normal and impaired glucose regulation. Diabetes. 65 (11), 3473-3481 (2016).
- Dabrowski, M., Tarasov, A., Ashcroft, F. M. Mapping the architecture of the ATP-binding site of the KATP channel subunit Kir6 2. The Journal of Physiology. 557 (2), 347-354 (2004).
- Liu, Y. J., Vieira, E., Gylfe, E. A store-operated mechanism determines the activity of the electrically excitable glucagon-secreting pancreatic alpha-cell. Cell Calcium. 35 (4), 357-365 (2004).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca 2+ probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137 (2001).
- Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (6), 3197-3202 (2001).
- Broussard, G. J., Liang, R., Tian, L. Monitoring activity in neural circuits with genetically encoded indicators. Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, 97 (2014).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Rodriguez, E. A., et al. The growing and glowing toolbox of fluorescent and photoactive proteins. Trends in Biochemical Sciences. 42 (2), 111-129 (2017).
- Tarasov, A. I., Rutter, G. A. Methods in enzymology. 542, Elsevier. 289-311 (2014).
- Tarasov, A. I., et al. Frequency-dependent mitochondrial Ca(2+) accumulation regulates ATP synthesis in pancreatic β cells. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 465 (4), 543-554 (2013).
- Smith, N. A., et al. Fluorescent Ca2+ indicators directly inhibit the Na, K-ATPase and disrupt cellular functions. Science Signal. 11 (515), 2039 (2018).
- Zhao, Y., et al. An expanded palette of genetically encoded Ca2+ indicators. Science. 333 (6051), 1888-1891 (2011).
- Dana, H., et al. Sensitive red protein calcium indicators for imaging neural activity. Elife. 5, 12727 (2016).
- Theis, L., et al. Benchmarking Spike Rate Inference in Population Calcium Imaging. Neuron. 90 (3), 471-482 (2016).
- Hamilton, A., et al. Adrenaline Stimulates Glucagon Secretion by Tpc2-Dependent Ca(2+) Mobilization From Acidic Stores in Pancreatic alpha-Cells. Diabetes. 67 (6), 1128-1139 (2018).
- Adriaenssens, A. E., et al. Transcriptomic profiling of pancreatic alpha, beta and delta cell populations identifies delta cells as a principal target for ghrelin in mouse islets. Diabetologia. 59 (10), 2156-2165 (2016).
- DiGruccio, M. R., et al. Comprehensive alpha, beta and delta cell transcriptomes reveal that ghrelin selectively activates delta cells and promotes somatostatin release from pancreatic islets. Molecular Metabolism. 5 (7), 449-458 (2016).
- Mourao, M., Satin, L., Schnell, S. Optimal experimental design to estimate statistically significant periods of oscillations in time course data. PloS One. 9 (4), 93826 (2014).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).
- Cabrera, O., et al. Glutamate is a positive autocrine signal for glucagon release. Cell Metabolism. 7 (6), 545-554 (2008).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
- Tarasov, A. I., et al. Monitoring real-time hormone release kinetics via high-content 3-D imaging of compensatory endocytosis. Lab on a Chip. 18 (18), 2838-2848 (2018).
- Knudsen, J. G., et al. Dysregulation of Glucagon Secretion by Hyperglycemia-Induced Sodium-Dependent Reduction of ATP Production. Cell Metabolism. , (2018).
- Adam, J., et al. Fumarate hydratase deletion in pancreatic β cells leads to progressive diabetes. Cell Reports. 20 (13), 3135-3148 (2017).
- Wills, Q. F., et al. Statistical approaches and software for clustering islet cell functional heterogeneity. Islets. 8 (2), 48-56 (2016).
- Berggren, P. O., Ostenson, C. G., Petersson, B., Hellman, B. Evidence for divergent glucose effects on calcium metabolism in pancreatic beta- and alpha 2-cells. Endocrinology. 105 (6), 1463-1468 (1979).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
- Longo, E. A., et al. Oscillations in cytosolic free Ca2+, oxygen consumption, and insulin secretion in glucose-stimulated rat pancreatic islets. The Journal of Biological Chemistry. 266 (14), 9314-9319 (1991).
- Johansson, H., Gylfe, E., Hellman, B. Cyclic AMP raises cytoplasmic calcium in pancreatic alpha 2-cells by mobilizing calcium incorporated in response to glucose. Cell Calcium. 10 (4), 205-211 (1989).
- Grapengiesser, E., Gylfe, E., Hellman, B. Three types of cytoplasmic Ca2+ oscillations in stimulated pancreatic β-cells. Archives of Biochemistry and Biophysics. 268 (1), 404-407 (1989).
- Okamoto, Y., et al. Role of cytosolic Ca2+ in impaired sensitivity to glucose of rat pancreatic islets exposed to high glucose in vitro. Diabetes. 41 (12), 1555-1561 (1992).
- Gilon, P., Henquin, J. C. Influence of membrane potential changes on cytoplasmic Ca2+ concentration in an electrically excitable cell, the insulin-secreting pancreatic B-cell. The Journal of Biological Chemistry. 267 (29), 20713-20720 (1992).
- Valdeolmillos, M., Nadal, A., Soria, B., Garcia-Sancho, J. Fluorescence digital image analysis of glucose-induced [Ca2+]i oscillations in mouse pancreatic islets of Langerhans. Diabetes. 42 (8), 1210-1214 (1993).
- Cheng, H., Lederer, W. J., Cannell, M. B. Calcium sparks: elementary events underlying excitation-contraction coupling in heart muscle. Science. 262 (5134), 740-744 (1993).
- Stout, A. L., Axelrod, D. Evanescent field excitation of fluorescence by epi-illumination microscopy. Applied Optics. 28 (24), 5237-5242 (1989).
- Stozer, A., Dolensek, J., Rupnik, M. S. Glucose-stimulated calcium dynamics in islets of Langerhans in acute mouse pancreas tissue slices. PloS One. 8 (1), 54638 (2013).
- Tian, G., Sandler, S., Gylfe, E., Tengholm, A. Glucose- and hormone-induced cAMP oscillations in alpha- and beta-cells within intact pancreatic islets. Diabetes. 60 (5), 1535-1543 (2011).
- Benninger, R. K., Zhang, M., Head, W. S., Satin, L. S., Piston, D. W. Gap junction coupling and calcium waves in the pancreatic islet. Biophysical Journal. 95 (11), 5048-5061 (2008).
- van Gurp, L., et al. Sequential intravital imaging reveals in vivo dynamics of pancreatic tissue transplanted under the kidney capsule in mice. Diabetologia. 59 (11), 2387-2392 (2016).
