Summary
Hier presenteren we een protocol voorbeeld vorming en kwantificeren van de calcium dynamica in heterogene celpopulaties, zoals de eiland cellen van de alvleesklier. Fluorescerende verslaggevers worden geleverd in de perifere laag van cellen binnen het eilandje, die vervolgens wordt geïmmobiliseerd en imaged, en per-cel analyse van de dynamiek van de intensiteit van de fluorescentie wordt uitgevoerd.
Abstract
Pancreatic Islet hormonen reguleren bloedglucose homeostase. Veranderingen in bloedglucose induceren oscillaties van cytosolische calcium in de cellen van de eiland alvleesklier die leiden tot afscheiding van drie belangrijke hormonen: insuline (uit β-cellen), glucagon (α-cellen) en Somatostatine (δ-cellen). β-cellen, die de meerderheid van de eiland cellen vormen en elektrisch aan elkaar zijn gekoppeld, reageren als één enkele entiteit op de glucose stimulus. De prikkelbaarheid van de kleine subpopulaties, α-cellen en δ-cellen (die ongeveer 20% (30%) en 4% (10%) van de totale celaantallen van knaagdieren1 (menselijk2) is minder voorspelbaar en daarom van bijzonder belang.
Calcium sensoren worden geleverd in de perifere laag van cellen binnen het geïsoleerde eilandje. Het eilandje of een groep eilandjes wordt vervolgens geïmmobiliseerd en afgebeeld met behulp van een fluorescentiemicroscoop. De keuze van de Imaging-modus is tussen een hogere doorvoer (breed veld) en een betere ruimtelijke resolutie (confocale). Conventioneel, laser scanning confocale microscopie wordt gebruikt voorbeeld vormende weefsel, als het biedt de beste scheiding van het signaal tussen de naburige cellen. Een breed-veld systeem kan ook worden gebruikt, als het contaminerende signaal van de dominante populatie van β-cellen wordt geminimaliseerd.
Zodra de calcium dynamiek in reactie op specifieke prikkels is geregistreerd, worden de gegevens uitgedrukt in numerieke vorm als fluorescentie intensiteit versus tijd, genormaliseerd naar de initiële fluorescentie en baseline-gecorrigeerd, om de effecten te verwijderen die verband houden met het bleken van de de. Veranderingen in de Spike frequentie of gedeeltelijke oppervlakte onder de curve (pAUC) worden berekend versus tijd, om de waargenomen effecten te kwantificeren. pauc is gevoeliger en behoorlijk robuust, terwijl de stekelige frequentie meer informatie biedt over het mechanisme van calcium toename.
Secundaire subpopulaties van cellen kunnen worden geïdentificeerd met behulp van functionele reacties op markerings verbindingen, zoals adrenaline en ghrelin, die veranderingen in cytosolische calcium veroorzaken in een specifieke populatie van eiland cellen.
Introduction
Het doel van de methode is om real-time veranderingen in cytosolische calciumconcentratie ([CA2 +]CYT) in kleine subpopulaties van eiland cellen van de alvleesklier te beeld. Dit maakt het onthullen van de mechanismen voor de secretie van hormonen in deze cellen, onthullen details over de cross-talk tussen verschillende celtypen en, potentieel, de invoering van een populationeel dimensie in de grotere afbeelding van eilandje signalering.
Islets bestaan uit verschillende celtypen. Naast de meer bekende insuline-afscheidende β-cellen, zijn er ten minste twee subpopulaties die ook kritisch zijn in het reguleren van bloedglucose3. α-cellen (die ongeveer 17% van de eiland cellen vormen) scheiden glucagon wanneer bloedglucose te laag wordt, wat signalen voor het vrijkomen van glucose in de bloedbaan van depots in de lever. Overmatige glucagon spiegels (hyperglucagonemie) en verminderde controle van glucagon-afgifte begeleiden (en, technisch, kunnen bijdragen aan) de prediabetische aandoening van verminderde insulinegevoeligheid4. δ-cellen (ongeveer 2%) afscheiden Somatostatine in reactie op verhoging van de glucose. Dit alomtegenwoordige peptide hormoon is waarschijnlijk aanwezig bij hoge concentraties in de nabijheid van α-en β-cellen binnen eilandjes, die een sterke Gi receptor-gemedieerde verzachtende werking op zowel glucagon als insuline secretie heeft.
α-cellen en δ-cellen delen een groot deel van de glucose-sensing machines met hun naaste afstamming verwanten, β-cellen. Alle drie de cellen typen zijn uitgerust met ATP-gevoelige K+ kanalen, uitgebreide metabole sensoren5 die het potentieel van de plasma membraan van deze prikkelbaar cellen controleren. Tegelijkertijd wordt de secretie van insuline, Somatostatine en glucagon anders gereguleerd door glucose. Beeldvorming van CA2 + dynamiek in de twee kleine subpopulaties van eiland cellen kan daarom een inzicht geven in de cross-talk tussen bloedglucose en eilandje secretoire output.
Vroege pogingen om de prikkelbaarheid van α-en δ-cellen te monitoren met behulp van Patch-clamp elektrofysiologie werden al snel gevolgd door beeldvorming van CA2 + in enkelvoudige α-en δ-cellen. De identiteit van cellen in deze experimenten werd geverifieerd via een achteraf-kleuring met anti-glucagon-of anti-Somatostatine-antilichamen. Deze inspanningen werden vaak gehinderd door de bevinding dat de cellen van het eiland zich heel anders gedragen binnen het eilandje en als alleenstaande cellen. Hoewel β-cellen de belangrijkste weldoeners van de eiland regeling lijken te zijn (vanwege hun overweldigende meerderheid die ten grondslag ligt aan hun sterke elektrische koppeling), was de belangrijkste discrepantie verrassend in α-cellen te vinden. Binnen het ongeschonden eilandje worden deze cellen voortdurend en aanhoudend geactiveerd bij lage glucose, wat alleen geldt voor ongeveer 7% van de enkelvoudige verspreide α-cellen6. Het rapporteren van de activiteit van α-en δ-cellen binnen intacte eilandjes wordt daarom verondersteld een nauwere benadering van de in vivo omstandigheden te vormen.
Over het algemeen zijn er twee manieren om ca2 + Dynamics specifiek van de α-cel-of δ-celsubpopulaties te rapporteren: (i) een genetisch gecodeerde CA2 + -sensor uitdrukken via een Weefselspecifieke promotor of (II) het gebruik van marker verbindingen. De elegantere, vroegere aanpak voegt het aanzienlijke voordeel van echte 3D-beeldvorming toe en bestudeert daarom de celverdeling binnen het eilandje. Het kan echter niet worden toegepast voor intact menselijk eilandje materiaal. Een andere potentiële zorg is de "ledigheid" van de organisator, met name wanneer de β-/α-Celtransdifferentiatie of α-celrespons op hoge glucose is uitgevoerd. Deze laatste benadering kan worden gebruikt met vers geïsoleerd weefsel, waaronder menselijke monsters of gekweekte eilandjes. De gegevens worden echter uitsluitend verzameld van de perifere laag van eiland cellen, zoals het leveren van de kleurstof/marker molecuul in diepere lagen zonder wijziging van de Islet architectuur is uitdagend. Een onverwacht voordeel van deze laatste benadering is de compatibiliteit met Wide-Field Imaging mode, waardoor de experimenten kunnen worden geschaald naar gelijktijdige beeldvorming van tientallen of honderden eilandjes (d.w.z. duizenden tot tienduizenden cellen).
Calcium wordt in vivo met behulp van genetisch gecodeerde gcamp7 (of pericam8) familie sensoren, die varianten van circulair permutated groen fluorescerende eiwit (GFP) gesmolten aan de calcium-bindende proteïne Calmoduline en de doel volgorde, M13 fragment van myosin lichte keten kinase7,9. Gcamps hebben uitstekende signaal-ruis verhoudingen in het bereik van nanomolair CA2 + concentraties en een hoge 2-Fobe dwarsdoorsnede, wat ze een ideale keuze maakt voor in vivo werk10,11. Het uitdagende aspect van het gebruik van recombinant sensoren is hun levering in de cellen. Heterologeuze expressie vereist het gebruik van een virale vector en multi-hour ex vivo culturing, die vaak bezorgdheid oproept over mogelijke de-differentiatie of verslechtering van de celfuncties. Hoewel Muismodellen die zijn ontworpen om GCaMP te uiten dit probleem aanpakken, voegen ze nieuwe uitdagingen toe door de doorlooptijd substantieel te verhogen en het werk te beperken tot een niet-menselijk model. Zeer hoge gevoeligheid voor veranderingen van intracellulaire pH is een andere nadelige kant van eiwit-gebaseerde sensoren12, dat is echter minder een probleem voor sensing oscillerende signalen, zoals CA2 +.
Het voordeel van aftrap bare kleurstoffen (zoals groen fluorescerende Fluo4) is dat ze binnen ongeveer een uur in vers geïsoleerd weefsel kunnen worden geladen. Voorspelbare, te onderscheppen kleurstoffen hebben lagere signaal-ruis verhoudingen en (veel) lagere foto stabiliteit dan hun recombinante tegenhangers. We kunnen niet bevestigen13 de meldingen van toxiciteit van de te onderscheppen kleurstoffen14, echter, kleurstof overbelasting is een frequent probleem.
Rode recombinant CA2 + sensoren op basis van circulaire permutatie zijn snel in ontwikkeling sinds 201115, en de meest recente ontwikkelingen presenteren een sterke concurrentie voor gcamps16 voor weefsel beeldvorming, gezien een hogere diepte van penetratie van rood licht. In de handel verkrijgbare rode, te onderscheppen kleurstoffen kunnen betrouwbaar worden gebruikt voor eencellige beeldvorming, maar op weefselniveau kan het niet goed concurreren met de groene analogen.
Er is schijnbaar zeer weinig keuze van Imaging technologie voor experimenten in weefsel waar out-of-focus licht een kritisch probleem wordt. Het confocale systeem biedt aanvaardbare eencellige resolutie door annulering van het out-of-focus licht met enige doelstelling op de NA boven 0,3 (voor het geval van GCaMP6) of 0,8 (aftrap bare kleurstof). In technische zin kan een conventionele confocale Microscoop worden gebruikt voor gelijktijdige beeldvorming van [ca.2 +]CYT uit honderden (gcamp) of tientallen eilandjes (trappelijke kleurstof). Het enige realistische alternatief voor confocale modus in het geval van 3D-expressie van de sensor in weefsel is misschien licht-Sheet microscopie.
Dingen zijn iets anders voor het geval wanneer de sensor wordt uitgedrukt in de perifere laag van cellen in het eilandje weefsel. Voor heldere recombinant sensoren die een levendig intracellulaire expressie patroon hebben, kan het gebruik van een Wide-Field Imaging-modus met een lage-NA-doelstelling voldoende kwaliteit bieden en de onderzoeker belonen met een substantiële toename van het gezichtsveld en daarmee de Doorvoer. Een breed-veld systeem biedt een slechtere ruimtelijke resolutie, omdat het out-of-focus licht niet wordt geannuleerd; Daarom is Imaging weefsel met High-NA (lage scherptediepte) doelstellingen minder informatief, omdat het eencellige signaal sterk verontreinigd is door naburige cellen. De verontreiniging is veel kleiner voor de lage-NA (hoge scherptediepte) doelstellingen.
Er zijn echter taken waarvoor hoge doorvoer en/of samplingfrequentie een belangrijk voordeel worden. α-en δ-cellen vertonen een aanzienlijke heterogeniteit, die een vraag naar hoge steekproefgroottes creëert om de bijdrage van de subpopulaties te onthullen. Beeldvorming in brede velden is snel en gevoeliger, met een grote industriële schaal met een groot gezichtsveld voor het weergeven van honderden (GCaMP) of TENS (Fluo4) van eilandjes op dezelfde signaal-ruis verhouding als de confocale experimenten op tien of een enkel eilandje. Dit verschil in doorvoer maakt het Wide-Field-systeem voordelig voor populationele beeldvorming met een resolutie met één cel, wat vooral cruciaal kan zijn voor kleine subpopulaties zoals de δ-cel één. Evenzo, pogingen om elektrische activiteit te reconstrueren van CA2 + stekelige17 zou profiteren van de hogere samplefrequentie geboden door een Wide-veld Imaging mode. Tegelijkertijd vereisen verschillende "niche"-problemen zoals de activiteit van de alvleesklier α-cellen bij stimulatie van de dominante β-cel subpopulatie, het gebruik van een confocale systeem. Een factor die van invloed is op de beslissing naar de confocale modus is de aanwezigheid van een substantieel verontreinigend signaal van de β-cel subpopulatie.
Hoewel het gebruik van hormoonspecifieke antilichaam kleuring om de identiteit van de cellen te verifiëren na de Imaging-experimenten nog steeds een optie is, kunnen kleine celsubpopulaties worden geïdentificeerd met behulp van functionele marker verbindingen, zoals adrenaline en ghreline die werden aangetoond dat ze selectief de CA2 + -dynamiek in α-18 -en δ-cellen19,20, respectievelijk hebben gestimuleerd.
De analyse van time-lapse Imaging data is bedoeld om informatie te verschaffen die verder gaat dan triviale farmacologie, zoals populationele heterogeniteit, correlatie en interactie van verschillende signalen. Conventioneel worden Imaging gegevens geanalyseerd als intensiteit versus tijd en genormaliseerd naar de initiële fluorescentie (F/F0). Baseline correctie is vaak nodig, als gevolg van het bleken van het de signaal of verontreiniging door veranderingen in autofluorescentie of pH (meestal geïnduceerd door millimolaire spiegels van glucose12). CA2 + gegevens kunnen op veel verschillende manieren worden geanalyseerd, maar drie belangrijke trends zijn het meten van veranderingen in de Spike frequentie, de plateau breuk of het gebied onder de curve, berekend versus tijd. We vonden de laatste aanpak voordelig, vooral in toepassing op zwaar ondergesamplede confocale gegevens. Het voordeel van de pAUC metriek is de gevoeligheid voor beide veranderingen in signaalfrequentie en amplitude, terwijl het berekenen van de frequentie vereist een aanzienlijk aantal oscillaties21, dat is moeilijk te bereiken met behulp van conventionele beeldvorming. De beperkende factor van de pAUC-analyse is de hoge gevoeligheid voor Baseline veranderingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle hier beschreven methoden zijn ontwikkeld in overeenstemming met de wet op de dieren (wetenschappelijke procedures) van het Verenigd Koninkrijk (1986) en de ethische richtlijnen van de Universiteit van Oxford.
1. Isoleer muizen pancreas eilandjes
- Bereid het kweekmedium en de isolatie oplossing voor.
- Make-up van de cultuurmedium: RMPI1640 (Zie tabel van de materialen), aangevuld met 10% van foetaal kalf serum, 100 eenheden/ml penicillaire, 100 μg/ml streptomycine. Verdeel het medium in 2 60 mm plastic Petri schaaltjes (niet behandeld met lijm) en bewaar de gerechten in de incubator (37 °C, 5% CO2, absolute vochtigheid).
- Maak de isolatie oplossing (50 mL/muis): Hanks ' medium met 5 mM glucose, 100 eenheden/mL penicillaire 100 μg/mL streptomycine. Blijf op ijs (4 °C).
- Maak de enzym oplossing (bv. Liberase): 0,2 mg/mL in de isolatie oplossing, 2 mL per muis. Blijf op ijs (4 °C). U desgewenst de activiteit van liberase vooraf testen en de incubatie parameters voor elke batch van het enzym22optimaliseren.
- Injecteer de enzym oplossing in het galkanaal van de muis.
- Offer de muis (12-week oud vrouwtje, C57Bl/6J) via cervicale dislocatie.
- Onder een dissectie Microscoop, snijd Open de huid en spier lagen met behulp van fijne schaar en zoek de galkanaal.
- Ligate de darm aan beide zijden van de kruising met de galkanaal, met behulp van een katoenen draad.
- Til het galkanaal zachtjes op met de Tang van een gebogen fijne horlogemaker en introduceer de ijskoude enzym oplossing in het kanaal met behulp van een 2 mL spuit met een 30G naald. In dit stadium moet een inflatie van de alvleesklier worden waargenomen.
- Verzamel de opgeblazen alvleesklier met behulp van een combinatie van bot-nosed duim Tang en fijne horlogemaker van de Tang in een 15 mL Falcon buis en houd het op ijs (4 °C). Voeg 1 mL van de enzym oplossing toe aan de buis.
- Bevrijd en verzamel de pancreas eilandjes uit de alvleesklier.
- Inbroed de pancreata opgeblazen met de enzym oplossing voor 16 min in een waterbad, bij 37 °C. Zacht schudden kan worden gebruikt, maar is niet kritisch, op voorwaarde dat de inflatie goed is geweest.
- Stop de spijsvertering door toevoeging van ijskoude isolatie oplossing, tot 10 mL. Schud voorzichtig de Digest: het moet in kleine stukjes vallen.
- Was de samenvatting drie keer in 10 mL van de isolatie oplossing, laat 5 min bij 1 x g staan om de bevrijde eilandjes op ijs te bezinksel. Zuig de supernatant zachtjes op, met een serologische Pipet van 10 mL.
- Voeg koude RPMI toe aan de Digest (om tot 10 mL te maken).
- Gebruik plastic Petri schalen (stap 1.1.1) om de eilandjes te kiezen. Decanteren van de RMPI medium uit een van de Petri schalen, en giet voorzichtig sommige (4-5 mL) van de Digest in plaats daarvan. Verzamel de bevrijde eilandjes die verschijnen als ronde, gladde en high-density stukken, met een P10 pipet in de tweede Petri schaal.
- Cultuur de eilandjes in de incubator (37 °C, 5% CO2, absolute vochtigheid). Het experiment kan in dit stadium worden onderbroken. Het verlaten van de eilandjes voor 1-2 uur wordt verondersteld door sommigen om te helpen om te herstellen van de mechanische stress tijdens de isolatie.
2. plaats de kleurstof of druk de sensor
- Bereid de te trap bare kleurstof.
- Los het aliquot (normaal, 50 μg) van de te onderscheppen kleurstof (bv. fluo-4) in DMSO op tot een voorraad concentratie van 2 mM. Voeg pluronic acid toe aan een uiteindelijke concentratie van 1% (met een voorraad van 20% in DMSO), om de solubilisatie van de kleurstof te verbeteren.
- Aliquot de kleurstof in kleine PCR-buisjes (2 μL in elk). De kleurstof kan gedurende enkele weken bevroren (-20 °C) worden bewaard.
- U ook de recombinant sensor bereiden.
- Verdeel de sensor (bv. adenovirale vector codering GCaMP6f) in 10 μL aliquots en bewaar bij-80 °C.
- (Optioneel) pre-test de titer van de virale voorraad door het infecteren van eilandjes (zoals hieronder) met behulp van verschillende seriële verdunningen, om de optimale concentratie voor infectie te onthullen.
Opmerking: recombinante sensoren gecodeerd door verschillende vectoren (lentivirus, BacMam, AAV) vereisen een ander infectie protocol. Zorg ervoor dat u dit controleert met de vector provider en Optimaliseer de werkverhouding voor uw behoeften. De "Working" voorraad van de adenovirus kan worden opgeslagen bij-20 °C en bevroren/ontdooid meerdere malen. Overmatig bevriezen-ontdooien fietsen vermindert de effectieve titer van het virus.
- Bereid de Imaging-oplossing voor.
- Maak de beeldvormings oplossing, mM: 140 NaCl, 4,6 KCl, 2,6 CaCl2, 1,2 MgCl2, 1 Nah2po4, 5 NaHCO3, 10 HEPES (pH 7,4, met NaOH).
- Maak een voorraad glucose (0,5 M) en mannitol (0,5 M) in de beeldvormings oplossing. De kolf kan gedurende enkele weken in de koelkast (4 °C) worden bewaard.
- Laad de te onderscheppen kleurstof.
- Maak de kleurstof werkoplossing door 2 μL van de kleurstof op te lossen in 600 μL van de beeldvormings oplossing met een glucose van 6 mM. De oplossing kan worden opgewarmd of getexed om de solubilization te verbeteren.
- Laad de eilandjes geïsoleerd in stap 1 in de werkoplossing van de kleurstof. Het laden kan worden gedaan met behulp van een multi well plate of een Petri schaal. Plaats in het laatste geval een druppel van 100 μL van de werkoplossing op de bodem van een niet-klevende Petri schaal (35-of 60-mm) en Pipetteer 10-30 eilandjes in de druppel.
- In het geval van verschillende groepen van eilandjes (bijvoorbeeld wild-type/knock-out), meerdere putten en meerdere druppels te regelen, zodat het laden kan gelijktijdig worden gedaan.
- Inbroed de eilandjes in de kleurstof werkoplossing bij kamertemperatuur in de duisternis gedurende 70-90 minuten. Niet overdreven inbroed.
- Controleer het laden onder de fluorescentiemicroscoop; de eilandjes moeten een milde fluorescentie krijgen, waarbij sommige cellen helderder zijn dan de rest. Afronding van cellen en nucleaire lokalisatie van de kleurstof zijn tekenen van overbelasting.
- Breng de eilandjes over in een kleurstof vrije beeldvormings oplossing met een glucose van 6 mm. De eilandjes kunnen direct worden gebruikt voor Imaging, maar optioneel kan de kleurstof nog eens 10-15 minuten aan de-esterify worden overgelaten. Islets behouden de kleurstof gedurende enkele uren en kunnen daarom worden gebruikt voorbeeld vorming in verschillende ploegendiensten.
- U ook de eilandjes infecteren met de recombinant vector.
- Plaat de eilandjes in druppels in RPMI-kweekmedium (stap 1.1.1) (bijvoorbeeld 30 μL), om het volume van de vector die nodig is te minimaliseren.
- Voeg de vector in een verhouding van ongeveer 105 infectieuze eenheden/eilandje die idealiter moet resulteren in multipliciteit van infectie > 2. Idealiter moet de verhouding worden geoptimaliseerd tot de minimale verhouding die uitdrukking zou geven in de perifere laag. Pre-titratie (stap 2.2.3) kan helpen.
- Introduceer 20-50 eilandjes in de druppel en cultuur voor 8-48 uur. (Idealiter, 's nachts). Islets moeten in de meeste cellen een flauwte groene fluorescentie ontwikkelen, zonder veranderingen in celmorfologie.
Opmerking: het succes van de infectie en expressie is afhankelijk van de tijd van blootstelling aan de virusoplossing. Idealiter moet het virus 's nachts in de oplossing blijven maar kan optioneel worden verwijderd na slechts 15 minuten. Echter, infectiviteit, en dus uitdrukking, is waarschijnlijk aanzienlijk lager.
3. Imaging CA2 + Dynamics
- Immobiliseer de eilandjes onder de (omgekeerde) Microscoop.
- Monteer de Imaging kamer voor omgekeerde microscopie. Plaats de glazen afdekplaat (dikte 1 of 1,5) in de kamer en zorg ervoor dat de glazen kamer interface waterdicht is. Controleer of de dekslip binnen het bereik van de Microscoop-doelstelling valt (kritisch voor het geval van een omvangrijk High-NA-objectief).
- Bereid de immobilisatie accessoires voor. Snijd kleine rechthoeken (20 mm x 20 mm) van het fijne gaas en het grove gaas. Introduceer twee spacer "wanden" op het fijne gaas met behulp van een 45-50 μm dikke plakband. Gebruik dubbele lagen van de Spacer als de grootte van de eilandjes te-worden imaged aanzienlijk groter is dan de conventionele 100 μm.
- Dompel de mazen en het gewicht onder in de Imaging-oplossing met een 35 mm Petri schaal. Zorg ervoor dat de kunststof en het metaal nat zijn.
- Onder een dissectie Microscoop, draai het fijne gaas met de Spacer "wanden" ondersteboven, de spacers naar boven gericht. Kies verschillende eilandjes geladen met de te onderscheppen kleurstof of uitdrukken van de recombinant sensor met een P20-pipet en plaats ze zachtjes bovenop het fijne gaas, tussen de twee spacers. Zorg ervoor dat het gaas en de ringen geen overmatige hoeveelheden van de beeldvormings oplossing op hen bevatten.
- Pak het gaas met de eilandjes, gebruik de Tang van de horlogemaker en Positioneer het ondersteboven in de Imaging kamer, zodat de spacers naar beneden gericht zijn en direct op de afdekplaat van de kamer zitten. Zorg ervoor dat de eilandjes tussen de spacers en het gaas, in het midden van de dekslip, zitten.
- Plaats de grove mesh en het gewicht bovenop het fijne gaas in de kamer. Introduceer de Imaging-oplossing in de kamer. Zorg ervoor dat de eilandjes zijn geïmmobiliseerd en klaar om te worden gefotografeerd. Vermijd overmatig schudden van de kamer (kleine perturbaties zoals het dragen van de kamer naar de Microscoop en het inbrengen in een verwarmde fase zijn aanvaardbaar).
Opmerking: een soortgelijke immobilisatie regeling kan worden toegepast voor een rechtopstaand systeem.
- Stel de Microscoop in.
- Kies de Imaging mode en de doelstelling, Positioneer de kamer met de eilandjes uit stap 3,1 op de temperatuurgestuurde fase van de Microscoop.
- Stel de temperatuurregeling in (idealiter tussen 30 °C en 36 °C) en de perifusie. Voor een omgekeerd systeem plaatst u de instroom lager dan de uitstroom in de kamer en stelt u de uitstroom stroom in op groter dan die van de instroom (die meestal wordt bereikt door een slang van een bredere binnendiameter op een peristaltische pomp te gebruiken).
- Zorg ervoor dat de uitstroom een minimaal contactoppervlak met de oplossing heeft, zodat het de oplossing in meerdere opeenvolgende kleine druppels verwijdert, waardoor lange intervallen van continue verwijdering van de oplossing worden vermeden. De laatste is de belangrijkste bron van artefact in time-lapse beeldvorming van de periodieke signalen als ze verschijnen als regelmatige periodieke intensiteit oscillaties van elke afbeelding gemaakt pixel en worden vaak geïnterpreteerd als "Slow Waves".
- Initieer de perifusion met de beeldvormings oplossing die 3 mM glucose bevat.
- Kies het lichtpad en filters voor de beeldvorming van de groene fluophores; excitatie tussen 470 en 500 en de uitstoot tussen 505 en 550 zou voor elk van hen werken.
- Voer Live Imaging uit om de imaging parameters in te stellen. Pas de weergave aan om de eilandjes van belang vast te leggen.
- Optimaliseer de signaal-ruis verhouding van de afbeelding. Pas daartoe de intensiteit van de excitatie licht, de belichtingstijd en de binning aan. Zorg ervoor dat de instellingen een afzonderlijke visualisatie van elke cel binnen het eilandje mogelijk maken met de minimale lichtintensiteit en belichting.
- Voer Image Acquisition uit. Afhankelijk van de taak, kunnen beelden worden genomen op 0,1 aan 5 Hz. Dit is ruim onder de Nyquist-criteria voor de snelle na+-gedreven oscillaties in α-en δ-cellen (≫ 300 Hz), wat betekent dat de gegevens standaard onderbemonsterd zijn. Het verhogen van de overnamefrequentie om aan deze vraag te voldoen, is echter niet haalbaar bij beeldvorming met multicellulaire/multi-eilandje met een groot gezichtsveld. GCaMP kan sneller worden gefotografeerd, terwijl Fluo4 onvermijdelijk bleken onder snelle acquisitie condities.
Opmerking: gezien het feit dat [CA2 +]CYT oscillaties in de eilandje cellen worden aangedreven door elektrische activiteit, kan het gebruik van lage acquisitie percentages contraproductief klinken. In werkelijkheid is het echter mogelijk dat de acquisitie percentages rond of boven 1 Hz voldoende zijn voor het oplossen van β-celspiking gedrag13, terwijl de drempel voor het opsporen van natrium kanaal-gestuurde oscillaties in α-en δ-cellen ruim boven de 300 Hz ligt. Of de α-of δ-cel [CA2 +]CYT -oscillaties worden verkregen bij 1 Hz of 0,1 Hz, ze zullen zwaar onderbemonsterd zijn en een weerspiegeling zijn van CA2 + handling door de cel in plaats van elektrische activiteit.- Controleer de kwaliteit van de verkregen gegevens: bij een glucose van 3 mM moet de activiteit van α-cellen duidelijk zichtbaar/detecteerbaar zijn. Zorg ervoor dat dit het geval is en ga door naar volledige time-lapse-beeldvorming.
- Kies de Imaging mode en de doelstelling, Positioneer de kamer met de eilandjes uit stap 3,1 op de temperatuurgestuurde fase van de Microscoop.
- Time-lapse Imaging
- Maak gebruik van een online grafiek van de signaaldynamiek, geïmplementeerd in de acquisitie software als dit beschikbaar is. Als online grafieken geen optie is, past u een look-up-Table toe die de signaalintensiteit op de meest uitgebreide manier weergeeft (zoals "Rainbow").
- Breng de stimuli op een omkeerbare manier aan: Noteer het herstel van het signaal naar het basale niveau. Negeer de artefacten aan het begin en het einde van de opname; de laatste kan uitzien als onomkeerbare "verhoging"/"afname" van de sonde fluorescentie als gevolg van veranderingen in de pH of celdood.
- Differentiëren α-cellen door oscillerende CA2 + dynamiek, bij lage glucose. Introduceren adrenaline of glutamaat in de badoplossing, omkeerbaar voor 2-5 min. Een snelle sprong in [CA2 +]CYT gevolgd door een vertraging of annulering van de oscillaties zal volgen.
Opmerking: adrenaline is een erkende marker verbinding voor α-cellen, die een selectief positief effect heeft op deze subpopulatie van eiland cellen, gemedieerd door de afgifte van CA2 + van intracellulaire depots18. Glutamaat is uiteengezet als een andere α-cel-specifieke agonist23. - Toevoegen/verwijderen ghrelin, die onlangs is gemeld om te activeren δ-cel selectief19,20. Observeer een snelle omkeerbare toename van [CA2 +]CYT in een kleine subpopulatie van eiland cellen.
- Toevoegen/verwijderen 20 mM glucose. Observeer een gecoördineerde oscillatoire respons in de β-cel subpopulatie. Opmerking de reactie van cellen die eerder zijn geactiveerd door adrenaline of glutamaat en ghrelin.
- Sla de Afbeeldingsvolgorde op. Overweeg het gebruik van "automatisch opslaan" tijdens de opname.
4. analyseren van de gegevens
- Analyseer de timelapse-afbeelding.
- Importeer de timelapse-afbeelding in een beeldanalyse software, zoals een open-source ImageJ/FIJI.
- Als er tijdens de opname substantiële/snelle bewegingen zijn opgetreden, gooi de gegevens dan weg als onherstelbaar. Gebruik StackReg of TurboReg plugins24 om kleine Drifts te corrigeren.
- Maak een maskerafbeelding voor celdetectie en toewijzing van regio van belang (ROI). De beste manier om dit te bereiken is om een stapel afbeelding te maken met behulp van een van de functies zoals "gemiddelde intensiteit" of "maximale intensiteit". De te gebruiken functie is degene die de beste herkenning van individuele cellen zal bieden.
- Drempel de maskerafbeelding, verwijder alle gegevens buiten het gebied van het eiland Islet. De functie werkt in de automatische modus voor 32-bits afbeeldingen.
- Detecteert maxima in de drempel afbeelding. De maxima kunnen worden weergegeven door punten, regio's of zelfs sectoren, als het beeld is dicht.
- Pas de ' Find maxima ' functie toe zonder enige groottebeperkingen en plak de gedetecteerde maxima in de regio van belang (ROI) editor.
- Vloeiend/interpoleren elk van de ROIs in kaart gebracht; misschien, de ROIs zal uitbreiding nodig. Een eenvoudig script kan worden geschreven voor (4.1.6-4.1.8) en meerdere malen worden uitgevoerd om de beste celdetectie resultaten te bieden. Verschillende ROIs kunnen overlappen, maar dit is zeldzaam.
- Analyseer de positie van de ROIs en plak de respectievelijke X-en Y-gegevens in de elektronische tabel software (bijvoorbeeld Microsoft Excel).
- Analyseer de grijze intensiteit versus de tijd voor alle ROIs en plak de gegevens in de elektronische tabel software.
- Analyseer de numerieke gegevens.
- Importeer de gegevens in de software voor gegevensanalyse. Afhankelijk van de keuze van de software en de duur/bemonstering/grootte van het experiment, kan dit een eenvoudige bewerking voor kopiëren en plakken of een zelfstandige procedure zijn. Zorgen voor de indeling en opslag van de numerieke gegevens.
- Importeer de tijdstempels of de tijd notities, indien beschikbaar.
- Normaliseer de ruwe fluorescentie intensiteitsgegevens ("F") tot de beginwaarde van fluorescentie ("F0"). Dit hoeft niet de fluorescentie te zijn in het allereerste punt, maar zou het gemiddelde van een aantal eerste punten kunnen zijn. De normalisatie moet de variabiliteit van de gegevens verminderen en in een ideaal geval (geen drifting baseline) resulteren in een analyseerbaar DataSet ("F/F0").
- Als de variabiliteit van de cel-naar-cel van de gegevensset F/F0 nog steeds substantieel is (lange opname, bleaching), voert u de basislijn correctie uit. Definieer daartoe een ' controle'-gebied, d.w.z. het tijdsbereik waarbinnen de controleoplossing (voor muizen pancreas Islets, 3 mM glucose zonder agonisten/antagonisten) werd toegepast.
- Als het controlegebied een duidelijk niet-oscillerend signaal heeft, wordt ervan uitgegaan dat F/F0 terugkeerde naar de beginwaarde (F/f0= 1) na elke toepassing van de controle-oplossing. Corrigeer de timelapse-gegevens voor elke cel door de gegevens in segmenten te splitsen, gescheiden door de punten wanneer de besturingsoplossing is toegevoegd, en lineaire correctie toe te passen op elk segment. Gebruik geen polynomiale of andere niet-lineaire correctie als dit resulteert in artefacten.
- Als het controle bereik duidelijke oscillaties of extra factoren (zoals FAD-autofluorescentie) bevat, gebruik dan een Spike-detectie-algoritme17. Een triviale en snelle rondloop hiervoor is een maxima-Sensitive wavelet transformatie (Figuur 3a).
- De gegevens kwantificeren. Hoewel CA2 + een zeer dynamisch signaal is, is het presenteren van de CA2 + -gegevens in termen van absolute f/f0 -waarden algemeen aanvaardbaar in de biomedische literatuur. Als de resultaten van meerdere experimenten moeten worden vergeleken, kiest u een metrische waarde.
- Meet de frequentie van CA2 + spikes (Figuur 4A, D) en de respons op toevoeging van (Ant) agonisten. Om dat te bereiken, splitst u de opname in gelijke tijdsintervallen en bereken het tijdschrift van de gedeeltelijke frequentie (stekende frequentie in elk van de intervallen) door pieken binnen het interval te tellen en de interval duur te normaliseren.
- U ook de drempelwaarde instellen en de plateau breuk (PF) berekenen voor elk van de hierboven gedefinieerde intervallen (Figuur 4B, F). De breuk geeft het percentage van de tijd binnen het interval dat de cel doorgebracht in de status ' opgewonden '.
- U ook het gedeeltelijke gebied onder de curve (pAUC) berekenen voor elk van de hierboven gedefinieerde intervallen (Figuur 4C, G). Deze statistiek is gevoelig voor veranderingen in zowel de frequentie als de amplitude van spiking.
Opmerking: een voorbehoud voor het meten van de frequentie is het gebrek aan gevoeligheid voor de Spike duur en slechte stabiliteit. Omdat de gegevens zwaar onderbemonsterd versus de elektrische spiking, het aantal pieken per interval is vrij klein en dus een enige extra piek kan dramatisch invloed hebben op het resultaat. De ' bottleneck ' van de pAUC is de gevoeligheid voor veranderingen in de baseline. Hoewel minder vatbaar voor artefacten en gevoeliger voor veranderingen in [CA2 +]CYT dan frequentie, is pauc niettemin niet erg informatief over de aard van CA2 + dynamiek. Plateau breuk is een uitbreiding van het open waarschijnlijkheids concept naar het hele celsysteem. Het is echter minder robuust dan pAUC, vanwege de afhankelijkheid van de drempelwaarde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Islets kunnen vrij goed worden geladen met de te onderscheppen kleurstoffen (Figuur 1A), tenzij de lipide samenstelling van het membraan is aangetast (bijv. door chronische blootstelling aan vetzuren). De menselijke adenovirus type 5 (Ad5) vector is ook gericht op alle eiland cellen (Figuur 1B). Er kunnen zich problemen voordoen wanneer meer dan één recombinant sensor in dezelfde cel wordt uitgedrukt. Bovendien zijn eilandjes meestal zeer goed geïmmobiliseerd met behulp van de hierboven beschreven technologie, die uitzonderlijke stabiliteit en toegang tot de oplossing biedt.
CA2 + stekelige in α-cellen kan gemakkelijk worden gedetecteerd bij lage glucosespiegels (Figuur 2). Er is een hoge cel-per-cel correlatie tussen de activiteit bij lage glucose en de reactie op adrenaline en glutamaat. Ghrelin activeert sommige adrenaline-responsieve cellen (α-cellen?) bij lage glucose maar het heeft geen effect op ca2 + dynamiek in de meeste cellen die worden geactiveerd door lage glucose (β-cellen).
Wanneer ze worden geanalyseerd in termen van partiële frequentie (Figuur 4A, C), vertonen adrenaline-of ghrelin-gestimuleerde cellen een substantiële toename onder de alles-of-niets-omstandigheden. Dat is, een cel met lage basale activiteit die wordt geactiveerd door adrenaline of ghreline vertoont een dramatische toename van deze metriek. Echter, de algemene veranderingen tussen basale stekelige en de adrenaline effect zijn zeer subtiel (Figuur 4A, C). Gedeeltelijke AUC is daarentegen gevoelig voor de veranderingen die door adrenaline in alle cellen worden geïntroduceerd, zelfs wanneer de basale activiteit hoog is (Figuur 4B, D).
Figuur 1: laden van de te onderscheppen kleurstof en de expressie van de recombinant-sensor in eilandjes. Typische muis eilandjes geladen met de aftrap bare kleurstof fluo-4 (a) of het uitdrukken van de recombinant sensor GCaMP6 in de perifere laag van cellen (B) of in de diepere laag (C). De Polar Tracer sulforhodamine B (SRB, afgebeeld als wit) is gebruikt om individuele cellen binnen elk eilandje25te schetsen. D) representatieve kinetiek van CA2 + in reactie op glucose opgenomen uit individuele cellen binnen het eilandje met behulp van Fluo4. Noteer de heterogeniteit binnen kleine celpopulaties. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: typische CA2 + reactie van eilandje cellen naar verschillende stimuli. Typische α-cel (A) en δ-cel (B) CA2 + dynamiek, in reactie op adrenaline, glutamaat, ghrelin, glucose. (C)-(d) Heatmaps van de celrespons op het eilandje die adrenaline-positieve (C) en ghrelin-positieve (d) subpopulaties vertoont. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Baseline correctie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: analyse van de timelapse-gegevens. Analyse van de CA2 + dynamiek in α-cellen. Partiële frequentie (A), plateau fractie (B) en gebied onder de kromme (C) van een α-cel [CA2 +]i Trace. Populational [CA2 +]i gegevens van een muis-alvleesklier eilandje uitgedrukt als RAW (f/f0) (D), partiële frequentie (E), plateau fractie (f) en gebied onder de kromme (G). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er zijn drie fasen in het protocol die essentieel zijn voor het algehele succes. Succesvolle injectie van het Liberase-enzym in het galkanaal bepaalt niet alleen het kwantitatieve succes van de isolatie procedure, maar beïnvloedt ook de kwaliteit van de geïsoleerde eilandjes. Niet-opgeblazen pancreata kan resulteren in het ontbreken van een aantal belangrijke metabole reacties in de geïsoleerde eilandjes. Ten tweede definieert het laden van de kleurstof/de expressie van de sensor de signaal-ruis verhouding van de timelapse-opname. Signalen zijn afwezig of verzwakt in overbelaste eilandjes. Tot slot is een succesvolle en dichte positionering van het weefsel in de beeldvormings kamer een bepalende moment voor zinvolle en analyseerbaar experimenten. Slecht gepositioneerd of bewegend weefsel resulteert in verspilde experimentele tijd en/of onduidelijke gegevens.
De methode kan worden gewijzigd om rekening te kunnen maken met meerdere signalen (met behulp van het confocale systeem) en meerdere groepen eilandjes (bijv. van verschillend genotype). Beeldvorming van meerdere signalen veronderstelt de levering van een tweede sensor in elke cel van het eilandje, spectraal compatibel met de CA2 + Reporter (zoals een pH-sensor SNARF5f26,27). Daartoe kunnen eilandjes worden co-loaded/co-geïnfecteerd met CA2 + en pH-sensoren, die vervolgens binnen elke tijdsbestek sequentieel worden gefotografeerd.
Beeldvorming van het signaal in groepen van eilandjes met een resolutie met één cel vereist een brede doelstelling van het gezichtsveld. Het doel is waarschijnlijk een lagere vergroting en numerieke diafragma (NA), waardoor de ruimtelijke resolutie wordt verminderd. Door de toegenomen scherptediepte van de low-NA-doelstelling, kan Imaging worden uitgevoerd op een breed-veld systeem. De nadelen van deze regeling zijn celceloverschrijdende besmetting van het lichtsignaal en verminderd vermogen om het 3D-signaal te beeld (bijv. muizen die de CA2 + -sensor onder de insuline promoters uitdrukken). Tegelijkertijd kan het signaal uit de oppervlakte-eilandjes cellen perfect worden opgelost met een hoge temporele resolutie van groepen, waaronder tientallen tot honderden eilandjes18.
Hoewel het klinkt misschien vervelend, maar het uitvoeren van beeldanalyse en numerieke data-analyse in afzonderlijke softwarepakketten is een goed idee. Op het huidige moment domineert ImageJ/FIJI de wetenschappelijke beeldanalyse. De meest populaire omgevingen voor wetenschappelijke codering zijn python en MATLAB, maar er zijn ook bekende inspanningen om de CA2 + gegevens in R28te analyseren. De beste bruikbaarheid wordt geboden door meer niche-pakketten zoals IgorPro. Onze keuze is om prototype in MATLAB/python en vervolgens de code te implementeren in IgorPro voor ' pipeline ' gebruik. Het aanpassen van signaalanalyse pakketten voor elektrofysiologie (bijv. Clampfit, neuro Explorer) voor analytische behoeften kan nuttig zijn voor eencellige beeldvorming, maar is moeilijk op te schalen. Veel opties die door dergelijke pakketten worden geboden, zijn niet van toepassing op eiland beeldvorming vanwege een lage bemonsteringssnelheid.
Het is belangrijk om te onthouden dat deze methodologie wordt beperkt door een aantal factoren. Ten eerste, zoals hierboven vermeld, is Imaging grotendeels gebaseerd op het ondersamplen van de gegevens, wat betekent dat het niet aangeeft en daarom niet direct kan worden vergeleken met de elektrische activiteit van de cel. Ten tweede zijn de gegevens afkomstig van de periferie van het eiland en weerspiegelen niet belangrijke koppelings processen die in het algemeen driedimensionaal zijn. Ten derde, het niveau van de belasting/expressie beïnvloedt de perceptie van de intensiteit van de sensor. Ten slotte kan de activering van minder goed onderzochte eilandje-celsubpopulaties (bijv. PP-cellen & ε-cellen) door de marker verbindingen niet worden uitgesloten, hoewel de mogelijke verontreiniging door de lage aantallen van deze cellen binnen het eilandje minimaal zal zijn.
De methode is een echte ' kampioen ' in termen van visueel effect, als de oscillerende processen een sterke indruk van een echt levend weefsel te leveren. Toegepast op kleine celsubpopulaties, controleert de methode de functie van elk betrouwbaar, waardoor identificatie van subgroepen mogelijk is en de heterogeniteit wordt weerspiegelen.
Calcium dynamica is bestudeerd in de alvleesklier eilandje β-cellen voor meer dan 40 jaar, meestal gedreven door de vooruitgang in acquisitie/detectietechnologie. Vroege studies gebruikten atomaire absorptie spectroscopie29, maar het was niet tot de komst van fluorescerende CA2 + sensoren30 die gedetailleerde kinetiek kunnen worden opgelost in individuele eilandje cellen, met behulp van fotometrie31,32,33. Kort daarna werd de ruimtelijke component van CA2 + Kinetics verbeterd als CA2 + Imaging34,35,36 werd een routine technologie, dankzij de dan nieuw beschikbare charge-gekoppelde apparaat (CCD) detectoren. Het probleem van out-of-focus licht, dat de beeldvorming van het signaal van individuele cellen in het weefsel belemmerd, werd vervolgens opgelost in het midden van de jaren 1990 via laser scanning confocale microscopie (LSCM)37 en totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie (tirfm)38. Beide methoden, aangevuld met de komst van een nieuwe generatie fluorescerende CA2 + sensoren prikkelbaar met een 488 nm laser, zijn met succes gebruikt om de afbeelding van CA2 + dynamiek in de eilandje cel subpopulaties39,40,41.
De nieuwe eeuw bracht twee nieuwe trends naar voren die voortvloeide uit de neurowetenschapgerelateerde technologische ontwikkelingen. Ten eerste, recombinant fluorescerende sensoren op basis van circulaire permutatie van GFP varianten aanzienlijk toegenomen signaal-ruis verhouding voor CA2 + detectie, effectief brengen van de studies naar het niveau van de grote celpopulaties, waarin de dynamiek van [CA2 +]CYT in elke cel kan worden opgelost. Ten tweede is het gebruik van Weefselspecifieke promotors toegestaan om de sensor expressie te richten op kleine subpopulaties.
Hoewel over het algemeen gedacht om de ontwikkelingen in de neurowetenschappen weerspiegelen, studies op eilandje CA2 + dynamiek hebben twee belangrijke verschillen. Ten eerste, technologisch gezien is elke in vivo beeldvorming van eilandje signalering complexer dan beeldvorming in de hersenen als gevolg van de onvoorspelbare anatomie van de alvleesklier en de locatie van de eilandjes42. Ten tweede maakt een uitstekende elektrische koppeling tussen het eilandje β-cellen in wezen eilandjes in elektrisch inerte populaties die een schijnbaar perfecte alles-of-niets respons vertonen op de hoge glucose stimulus. We geloven dat studies van [CA2 +]i kinetiek in kleine eilandje subpopulaties, zoals δ-cellen, gebaseerd op Weefselspecifieke targeting, waarschijnlijk onze kennis van hun farmacologie/fysiologie zullen verbreden. Tegelijkertijd maken zeer gevoelige sondes het mogelijk om de statistische kracht van dergelijke metingen uit te breiden, om de variabiliteit van eilandje-naar-eilandje te vergroten en om beeldvorming van eilandjes uit verschillende groepen binnen één parallel experiment mogelijk te maken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten.
Acknowledgments
AH was de ontvanger van een diabetes UK PhD studentship, EV werd gesteund door het OXION-Wellcome Trust trainingsprogramma, AIT held een Oxford biomedische Onderzoeksraad Postdoctoral Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40x/1.3 objective | |||
| Axiovert 200 microscope | |||
| emission | |||
| Excitation | |||
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F7524-500ML | |
| Fluo4 | Thermo Fisher (Life Technologies) | F14201 | |
| GCaMP6f, in (human type 5) adenoviral vector | Vector Biolabs | 1910 | |
| Hanks' solution | Thermo Fisher (GibCo, Life Technologies) | ||
| Liberase | Sigma-Aldrich | 5401020001 | |
| penicillin/streptomycin | Thermo Fisher (GibCo, Life Technologies) | 15140122 | |
| RPMI medium | Thermo Fisher (GibCo, Life Technologies) | 61870044 | |
| Zeiss LSM510-META confocal system | Carl Zeiss |
References
- Elayat, A. A., el-Naggar, M. M., Tahir, M. An immunocytochemical and morphometric study of the rat pancreatic islets. Journal of Anatomy. 186, Pt 3 629 (1995).
- Cabrera, O., et al. The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (7), 2334-2339 (2006).
- Brereton, M. F., Vergari, E., Zhang, Q., Clark, A. Alpha-, delta-and PP-cells: are they the architectural cornerstones of islet structure and co-ordination. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 63 (8), 575-591 (2015).
- Færch, K., et al. Insulin resistance is accompanied by increased fasting glucagon and delayed glucagon suppression in individuals with normal and impaired glucose regulation. Diabetes. 65 (11), 3473-3481 (2016).
- Dabrowski, M., Tarasov, A., Ashcroft, F. M. Mapping the architecture of the ATP-binding site of the KATP channel subunit Kir6 2. The Journal of Physiology. 557 (2), 347-354 (2004).
- Liu, Y. J., Vieira, E., Gylfe, E. A store-operated mechanism determines the activity of the electrically excitable glucagon-secreting pancreatic alpha-cell. Cell Calcium. 35 (4), 357-365 (2004).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca 2+ probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137 (2001).
- Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (6), 3197-3202 (2001).
- Broussard, G. J., Liang, R., Tian, L. Monitoring activity in neural circuits with genetically encoded indicators. Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, 97 (2014).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Rodriguez, E. A., et al. The growing and glowing toolbox of fluorescent and photoactive proteins. Trends in Biochemical Sciences. 42 (2), 111-129 (2017).
- Tarasov, A. I., Rutter, G. A. Methods in enzymology. 542, Elsevier. 289-311 (2014).
- Tarasov, A. I., et al. Frequency-dependent mitochondrial Ca(2+) accumulation regulates ATP synthesis in pancreatic β cells. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 465 (4), 543-554 (2013).
- Smith, N. A., et al. Fluorescent Ca2+ indicators directly inhibit the Na, K-ATPase and disrupt cellular functions. Science Signal. 11 (515), 2039 (2018).
- Zhao, Y., et al. An expanded palette of genetically encoded Ca2+ indicators. Science. 333 (6051), 1888-1891 (2011).
- Dana, H., et al. Sensitive red protein calcium indicators for imaging neural activity. Elife. 5, 12727 (2016).
- Theis, L., et al. Benchmarking Spike Rate Inference in Population Calcium Imaging. Neuron. 90 (3), 471-482 (2016).
- Hamilton, A., et al. Adrenaline Stimulates Glucagon Secretion by Tpc2-Dependent Ca(2+) Mobilization From Acidic Stores in Pancreatic alpha-Cells. Diabetes. 67 (6), 1128-1139 (2018).
- Adriaenssens, A. E., et al. Transcriptomic profiling of pancreatic alpha, beta and delta cell populations identifies delta cells as a principal target for ghrelin in mouse islets. Diabetologia. 59 (10), 2156-2165 (2016).
- DiGruccio, M. R., et al. Comprehensive alpha, beta and delta cell transcriptomes reveal that ghrelin selectively activates delta cells and promotes somatostatin release from pancreatic islets. Molecular Metabolism. 5 (7), 449-458 (2016).
- Mourao, M., Satin, L., Schnell, S. Optimal experimental design to estimate statistically significant periods of oscillations in time course data. PloS One. 9 (4), 93826 (2014).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).
- Cabrera, O., et al. Glutamate is a positive autocrine signal for glucagon release. Cell Metabolism. 7 (6), 545-554 (2008).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
- Tarasov, A. I., et al. Monitoring real-time hormone release kinetics via high-content 3-D imaging of compensatory endocytosis. Lab on a Chip. 18 (18), 2838-2848 (2018).
- Knudsen, J. G., et al. Dysregulation of Glucagon Secretion by Hyperglycemia-Induced Sodium-Dependent Reduction of ATP Production. Cell Metabolism. , (2018).
- Adam, J., et al. Fumarate hydratase deletion in pancreatic β cells leads to progressive diabetes. Cell Reports. 20 (13), 3135-3148 (2017).
- Wills, Q. F., et al. Statistical approaches and software for clustering islet cell functional heterogeneity. Islets. 8 (2), 48-56 (2016).
- Berggren, P. O., Ostenson, C. G., Petersson, B., Hellman, B. Evidence for divergent glucose effects on calcium metabolism in pancreatic beta- and alpha 2-cells. Endocrinology. 105 (6), 1463-1468 (1979).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
- Longo, E. A., et al. Oscillations in cytosolic free Ca2+, oxygen consumption, and insulin secretion in glucose-stimulated rat pancreatic islets. The Journal of Biological Chemistry. 266 (14), 9314-9319 (1991).
- Johansson, H., Gylfe, E., Hellman, B. Cyclic AMP raises cytoplasmic calcium in pancreatic alpha 2-cells by mobilizing calcium incorporated in response to glucose. Cell Calcium. 10 (4), 205-211 (1989).
- Grapengiesser, E., Gylfe, E., Hellman, B. Three types of cytoplasmic Ca2+ oscillations in stimulated pancreatic β-cells. Archives of Biochemistry and Biophysics. 268 (1), 404-407 (1989).
- Okamoto, Y., et al. Role of cytosolic Ca2+ in impaired sensitivity to glucose of rat pancreatic islets exposed to high glucose in vitro. Diabetes. 41 (12), 1555-1561 (1992).
- Gilon, P., Henquin, J. C. Influence of membrane potential changes on cytoplasmic Ca2+ concentration in an electrically excitable cell, the insulin-secreting pancreatic B-cell. The Journal of Biological Chemistry. 267 (29), 20713-20720 (1992).
- Valdeolmillos, M., Nadal, A., Soria, B., Garcia-Sancho, J. Fluorescence digital image analysis of glucose-induced [Ca2+]i oscillations in mouse pancreatic islets of Langerhans. Diabetes. 42 (8), 1210-1214 (1993).
- Cheng, H., Lederer, W. J., Cannell, M. B. Calcium sparks: elementary events underlying excitation-contraction coupling in heart muscle. Science. 262 (5134), 740-744 (1993).
- Stout, A. L., Axelrod, D. Evanescent field excitation of fluorescence by epi-illumination microscopy. Applied Optics. 28 (24), 5237-5242 (1989).
- Stozer, A., Dolensek, J., Rupnik, M. S. Glucose-stimulated calcium dynamics in islets of Langerhans in acute mouse pancreas tissue slices. PloS One. 8 (1), 54638 (2013).
- Tian, G., Sandler, S., Gylfe, E., Tengholm, A. Glucose- and hormone-induced cAMP oscillations in alpha- and beta-cells within intact pancreatic islets. Diabetes. 60 (5), 1535-1543 (2011).
- Benninger, R. K., Zhang, M., Head, W. S., Satin, L. S., Piston, D. W. Gap junction coupling and calcium waves in the pancreatic islet. Biophysical Journal. 95 (11), 5048-5061 (2008).
- van Gurp, L., et al. Sequential intravital imaging reveals in vivo dynamics of pancreatic tissue transplanted under the kidney capsule in mice. Diabetologia. 59 (11), 2387-2392 (2016).
