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Biology

माउस अग्नाशय आइलेट कोशिकाओं की उपआबादी में इमेजिंग कैल्शियम गतिशीलता

Published: November 26, 2019 doi: 10.3791/59491
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 1,4,5
1Oxford Centre for Diabetes, Endocrinology and Metabolism, University of Oxford, 2Lund University Diabetes Centre, Unit of Molecular Metabolism, Clinical Research Centre, Malmö University HospitalMalmö, 3Institute of Neuroscience of Physiology, Department of Physiology, Metabolic Research Unit, University of Göteborg, 4Oxford National Institute for Health Research, Biomedical Research Centre, 5Life and Medical Sciences, University of Hertfordshire

Summary

यहां, हम विषम कोशिका आबादी में कैल्शियम गतिशीलता की मात्रा और मात्रा के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं, जैसे अग्नाशय आइलेट कोशिकाएं। फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स को आइलेट के भीतर कोशिकाओं की परिधीय परत में वितरित किया जाता है, जिसे तब स्थिर और इमेजकिया जाता है, और फ्लोरेसेंस तीव्रता की गतिशीलता का प्रति-सेल विश्लेषण किया जाता है।

Abstract

अग्नाशय आइलेट हार्मोन रक्त ग्लूकोज होमोस्टोसिस को विनियमित करते हैं। रक्त ग्लूकोज में परिवर्तन अग्नाशय आइलेट कोशिकाओं में साइटोसोलिक कैल्शियम के दोलनों को प्रेरित करता है जो तीन मुख्य हार्मोन के स्राव को ट्रिगर करता है: इंसुलिन (कोशिकाओं से), ग्लूकागन (α-कोशिकाओं) और सोमाटोस्टैटिन (कोशिकाओं)। कोशिकाएं, जो आइलेट कोशिकाओं के बहुमत को बनाती हैं और विद्युत रूप से एक दूसरे के साथ मिलकर होती हैं, ग्लूकोज उत्तेजना को एक एकल इकाई के रूप में प्रतिक्रिया देती हैं। मामूली उपआबादी, α-कोशिकाओं और कोशिकाओं की स्थिरता (लगभग 20% (30%) और 4% (10%) कुल कृंतक1 (मानव2)आइलेट सेल संख्या में से क्रमशः कम उम्मीद के मुताबिक है और इसलिए विशेष रुचि है।

कैल्शियम सेंसर को अलग आइलेट के भीतर कोशिकाओं की परिधीय परत में वितरित किया जाता है। आइलेट या आइलेट्स के एक समूह को तब एक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके स्थिर और चित्रित किया जाता है। इमेजिंग मोड का चुनाव उच्च थ्रूपुट (वाइड-फील्ड) और बेहतर स्थानिक रिज़ॉल्यूशन (कॉन्फोकल) के बीच है। परंपरागत रूप से, लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग इमेजिंग ऊतक के लिए किया जाता है, क्योंकि यह पड़ोसी कोशिकाओं के बीच संकेत का सबसे अच्छा पृथक्करण प्रदान करता है। एक व्यापक क्षेत्र प्रणाली का भी उपयोग किया जा सकता है, अगर कोशिकाओं की हावी आबादी से दूषित संकेत को कम किया जाता है।

एक बार विशिष्ट उत्तेजनाओं के जवाब में कैल्शियम गतिशीलता दर्ज की गई है, डेटा फ्लोरेसेंस तीव्रता बनाम समय के रूप में संख्यात्मक रूप में व्यक्त कर रहे हैं, प्रारंभिक फ्लोरेसेंस और बेसलाइन को सही करने के लिए सामान्यीकृत, के ब्लीचिंग से जुड़े प्रभावों को दूर करने के लिए फ्लोरोफोर। संगति (pAUC) के तहत स्पाइक आवृत्ति या आंशिक क्षेत्र में परिवर्तन की गणना की जाती है बनाम समय, मनाया प्रभाव की मात्रा निर्धारित करने के लिए । PAUC अधिक संवेदनशील और काफी मजबूत है जबकि स्पाइकिंग आवृत्ति कैल्शियम वृद्धि के तंत्र के बारे में अधिक जानकारी प्रदान करता है ।

माइनर सेल उपआबादी को मार्कर यौगिकों, जैसे एड्रेनालाईन और घरेलिन के कार्यात्मक प्रतिक्रियाओं का उपयोग करके पहचाना जा सकता है, जो आइलेट कोशिकाओं की एक विशिष्ट आबादी में साइटोसोलिक कैल्शियम में परिवर्तन को प्रेरित करते हैं।

Introduction

विधि का उद्देश्य अग्नाशय आइलेट कोशिकाओं की मामूली उपआबादी में साइटोसोलिक कैल्शियम एकाग्रता ([सीए2 +]साइट)में वास्तविक समय में परिवर्तन की छवि बनाना है। यह इन कोशिकाओं में हार्मोन स्राव को नियंत्रित करने वाले तंत्रों को उजागर करने की अनुमति देता है, विभिन्न सेल प्रकारों के बीच क्रॉस-टॉक के बारे में विवरण प्रकट करता है और संभावित रूप से आइलेट सिग्नलिंग की बड़ी तस्वीर में एक जनसंख्या आयाम पेश करता है।

आइलेट्स में कई सेल प्रकार होते हैं। अधिक प्रसिद्ध इंसुलिन-स्राव-कोशिकाओं के अलावा, कम से कम दो उपआबादी हैं जो रक्त ग्लूकोज3को विनियमित करने में भी महत्वपूर्ण हैं। α-कोशिकाएं (जो आइलेट कोशिकाओं के लगभग 17% बनाती हैं) ग्लूकागन को स्रावित करती हैं जब रक्त ग्लूकोज बहुत कम हो जाता है, जो जिगर में डिपो से खून में ग्लूकोज की रिहाई के लिए संकेत देता है। अत्यधिक ग्लूकागन स्तर (हाइपरग्लूकागोनेमिया) और ग्लूकागन-रिलीज के बिगड़ा नियंत्रण (और, तकनीकी रूप से, बिगड़ा इंसुलिन संवेदनशीलता4की प्रीमधुमेह स्थिति) में योगदान कर सकते हैं। कोशिकाएं (लगभग 2%) ग्लूकोज ऊंचाई के जवाब में सोमाटोस्टेटिन को स्रावित करें। यह सर्वव्यापी पेप्टाइड हार्मोन आइलेट्स के भीतर α-और'-कोशिकाओं के आसपास के क्षेत्र में उच्च सांद्रता पर मौजूद होने की संभावना है, जिसमें ग्लूकागन और इंसुलिन स्राव दोनों पर एक मजबूत जीआई रिसेप्टर-मध्यस्थता क्षीण प्रभाव पड़ता है।

α-कोशिकाओं और कोशिकाओं को अपने करीबी वंश रिश्तेदारों, कोशिकाओं के साथ ग्लूकोज संवेदन मशीनरी का एक बड़ा हिस्सा साझा करते हैं । सभी तीन कोशिकाएं प्रकार एटीपी-संवेदनशीलK+ चैनलों, विस्तृत मेटाबोलिक सेंसर5 से लैस हैं जो इन उत्तेजनीय कोशिकाओं की प्लाज्मा झिल्ली क्षमता को नियंत्रित करती हैं। साथ ही, इंसुलिन, सोमाटोस्टेटिन और ग्लूकागन के स्राव को ग्लूकोज द्वारा अलग ढंग से विनियमित किया जाता है। आइलेट कोशिकाओं की दो छोटी उपआबादी में सीए2 + गतिशीलता की इमेजिंग इसलिए रक्त ग्लूकोज और आइलेट गुप्त उत्पादन के बीच क्रॉस-टॉक में एक अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती है।

पैच-क्लैंप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी का उपयोग करके α-और कोशिकाओं की स्थिरता की निगरानी के शुरुआती प्रयासों को जल्द ही एकल α-और कोशिकाओं में सीए2 + की इमेजिंग के बाद किया गया। इन प्रयोगों में कोशिकाओं की पहचान विरोधी ग्लूकागन या विरोधी somatostatin एंटीबॉडी के साथ एक पीछे धुंधला के माध्यम से सत्यापित किया गया था । इन प्रयासों को अक्सर खोज है कि आइलेट कोशिकाओं आइलेट के भीतर और एकल कोशिकाओं के रूप में बहुत अलग व्यवहार से बाधित थे । यद्यपि कोशिकाएं आइलेट व्यवस्था के मुख्य कल्याणकारी प्रतीत हो सकती हैं (उनके भारी बहुमत के कारण जो उनके मजबूत विद्युत युग्मन को रेखांकित करती है), मुख्य विसंगति आश्चर्यजनक रूप से, α-कोशिकाओं में पाई जाती थी। बरकरार आइलेट के भीतर, इन कोशिकाओं को लगातार और लगातार कम ग्लूकोज पर सक्रिय किया जाता है, जो केवल एक फैलाया α-कोशिकाओं6के लगभग 7% के लिए सच है । इसलिए माना जाता है कि अक्षुण्ण आइलेट्स के भीतर α-और कोशिकाओं की गतिविधि की रिपोर्ट करना विवो स्थितियों में करीब से अनुमान का प्रतिनिधित्व करता है।

सामान्य तौर पर, विशेष रूप से α-सेल या"-सेल उपआबादी से सीए2 + गतिशीलता की रिपोर्ट करने के दो तरीके हैं: (i) मार्कर यौगिकों का उपयोग करके ऊतक-विशिष्ट प्रमोटर या (ii) के माध्यम से आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड सीए2 + सेंसर व्यक्त करना। अधिक सुरुचिपूर्ण पूर्व दृष्टिकोण सच 3 डी इमेजिंग का पर्याप्त लाभ जोड़ता है और इसलिए आइलेट के भीतर सेल वितरण का अध्ययन करता है। हालांकि इसे बरकरार मानव आइलेट सामग्री के लिए लागू नहीं किया जा सकता है। एक अन्य संभावित चिंता प्रमोटर की 'leakiness' है, खासकर जब उच्च ग्लूकोज के लिए α-/α-सेल प्रतिक्रिया लागू होती है। बाद के दृष्टिकोण का उपयोग मानव नमूनों या सुसंस्कृत आइलेट्स सहित ताजा अलग ऊतक के साथ किया जा सकता है। हालांकि, डेटा पूरी तरह से आइलेट कोशिकाओं की परिधीय परत से एकत्र किया जाता है, क्योंकि आइलेट वास्तुकला में फेरबदल किए बिना गहरे परतों में रंग/मार्कर अणु को वितरित करना चुनौतीपूर्ण है । उत्तरार्द्ध दृष्टिकोण का एक अप्रत्याशित लाभ व्यापक क्षेत्र इमेजिंग मोड के साथ अनुकूलता है, जो प्रयोगों को दसियों या सैकड़ों आइलेट्स (यानी, हजारों से हजारों कोशिकाओं) की एक साथ इमेजिंग करने की अनुमति देता है।

कैल्शियम को आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड जीसीएएमपी7 (या पेरिकैम8)परिवार सेंसर का उपयोग करके वीवो में चित्रित किया गया है, जो गोलाकार रूप से पार किए गए हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) के वेरिएंट हैं जो कैल्शियम-बाध्यकारी प्रोटीन कैलोडुलिन और इसके लक्ष्य अनुक्रम, मायोसिन लाइट चेन काइनेस7,9के M13 खंड से जुड़े हैं। जीसीएएमपीएस में नैनोमोलर सीए2 + सांद्रता और एक उच्च 2-फोटॉन क्रॉस-सेक्शन की सीमा में शानदार सिग्नल-टू-शोर अनुपात है, जो उन्हें वीवो वर्क10,11में एक आदर्श विकल्प बनाता है। पुनः संयोजन सेंसर का उपयोग करने का चुनौतीपूर्ण पहलू कोशिकाओं में उनकी डिलीवरी है। हेटेरोलोगस अभिव्यक्ति के लिए वायरल वेक्टर और मल्टी-ऑवर पूर्व वीवो कत्लिंग का उपयोग करने की आवश्यकता होती है, जो अक्सर संभावित डी-भेदभाव या कोशिका कार्यों के गिरावट के बारे में चिंताएं उठाती है। हालांकि माउस मॉडल पूर्व GCaMP इस समस्या का समाधान व्यक्त करने के लिए इंजीनियर, वे नेतृत्व समय काफी वृद्धि और एक गैर मानव मॉडल के लिए काम सीमित द्वारा नई चुनौतियों को जोड़ने । इंट्रासेलर पीएच के परिवर्तनों के प्रति बहुत अधिक संवेदनशीलता प्रोटीन आधारित सेंसर12का एक और प्रतिकूल पक्ष है, जो हालांकि, सीए2 +जैसे दोलन संकेतों को संवेदन के लिए एक समस्या से कम है।

ट्रैपेबल रंगों (जैसे ग्रीन फ्लोरोसेंट फ्लू4) का लाभ यह है कि उन्हें लगभग एक घंटे के भीतर हौसले से अलग ऊतक में लोड किया जा सकता है। जाहिर है, ट्रैपेबल रंगों में कम सिग्नल-टू-शोर अनुपात और (बहुत) उनके पुनर्संयोजन समकक्षों की तुलना में कम फोटोस्थिरता होती है। हम13 ट्रैपेबल रंगों14की विषाक्तता की रिपोर्ट की पुष्टि नहीं कर सकते, हालांकि, रंग ओवरलोडिंग एक बार समस्या है ।

परिपत्र क्रमपरिवर्तन पर आधारित लाल पुनर्संयोजन सीए2 + सेंसर 201115से तेजी से विकसित हो रहे हैं, और हाल के अधिकांश घटनाक्रम लाल बत्ती के प्रवेश की उच्च गहराई को देखते हुए ऊतक इमेजिंग के लिए जीपीएस16 के लिए एक मजबूत प्रतिस्पर्धा पेश करते हैं। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध लाल ट्रैपेबल रंगों का उपयोग एकल-कोशिका इमेजिंग के लिए मज़बूती से किया जा सकता है लेकिन ऊतक स्तर पर, हरे रंग के अनुरूप के साथ अच्छी तरह से प्रतिस्पर्धा नहीं कर सकते हैं।

ऊतक में प्रयोगों के लिए इमेजिंग प्रौद्योगिकी का बहुत कम विकल्प प्रतीत होता है जहां आउट-ऑफ-फोकस लाइट एक महत्वपूर्ण समस्या बन जाती है। कॉन्फोकल सिस्टम 0.3 से ऊपर एनए (GCaMP6 के मामले के लिए) या 0.8 (ट्रैपेबल डाये) पर किसी भी उद्देश्य के साथ आउट-ऑफ-फोकस लाइट को रद्द करके स्वीकार्य एकल-सेल रिज़ॉल्यूशन प्रदान करता है। तकनीकी अर्थों में, एक पारंपरिक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग सैकड़ों (जीसीएएमपी) या दसियों आइलेट्स (ट्रैपेबल डाये) से [सीए2+]साइट के एक साथ इमेजिंग के लिए किया जा सकता है। ऊतक में सेंसर की 3 डी अभिव्यक्ति के मामले में कॉन्फोकल मोड का एकमात्र यथार्थवादी विकल्प शायद लाइट-शीट माइक्रोस्कोपी है।

मामले के लिए चीजें थोड़ी अलग होती हैं जब सेंसर आइलेट ऊतक के भीतर कोशिकाओं की परिधीय परत में व्यक्त किया जाता है। उज्ज्वल पुनर्संयोजन सेंसर ों के लिए जिनके पास एक ज्वलंत इंट्रासेलुलर अभिव्यक्ति पैटर्न है, कम-एनए उद्देश्य के साथ एक व्यापक क्षेत्र इमेजिंग मोड का उपयोग करने से पर्याप्त गुणवत्ता प्रदान की जा सकती है और शोधकर्ता को देखने के क्षेत्र में पर्याप्त वृद्धि के साथ पुरस्कृत किया जा सकता है और इसलिए प्रवाह. एक व्यापक क्षेत्र प्रणाली गरीब स्थानिक संकल्प प्रदान करता है, के रूप में बाहर के ध्यान प्रकाश रद्द नहीं है; इसलिए, उच्च-एनए (क्षेत्र की कम गहराई) उद्देश्यों के साथ इमेजिंग ऊतक कम जानकारीपूर्ण है, क्योंकि एकल-सेल संकेत पड़ोसी कोशिकाओं द्वारा काफी दूषित है। संदूषण कम-एनए (क्षेत्र की उच्च गहराई) उद्देश्यों के लिए बहुत छोटा है।

हालांकि, ऐसे कार्य हैं जिनके लिए उच्च थ्रूपुट और/या नमूना दर एक महत्वपूर्ण लाभ बन जाती है । α-और कोशिकाएं पर्याप्त विषमता प्रदर्शित करती हैं, जो उपआबादी के योगदान को प्रकट करने के लिए उच्च नमूना आकार की मांग पैदा करती है। वाइड-फील्ड इमेजिंग तेज और अधिक संवेदनशील है, जिसमें औद्योगिक पैमाने पर बड़े क्षेत्र-दृश्य प्रणाली इमेजिंग सैकड़ों (GCaMP) या दसियों (Fluo4) आइलेट्स के साथ क्रमशः दस या एक आइलेट पर कॉन्फोकल प्रयोगों के रूप में एक ही संकेत-से-शोर अनुपात में है। थ्रूपुट में यह अंतर एक एकल-सेल रिज़ॉल्यूशन के साथ जनसंख्या इमेजिंग के लिए व्यापक क्षेत्र प्रणाली को लाभप्रद बनाता है, जो छोटे उपआबादी जैसे सेल एक के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण हो सकता है। इसी तरह, सीए2 + स्पाइकिंग17 से विद्युत गतिविधि के पुनर्निर्माण के प्रयासों से एक व्यापक क्षेत्र इमेजिंग मोड द्वारा प्रदान की गई उच्च नमूना दर से लाभ होगा। साथ ही, हावी कोशिका उपजनसंख्या की उत्तेजना पर अग्नाशय की α-कोशिकाओं की गतिविधि जैसी कई "आला" समस्याओं को कॉन्फोकल सिस्टम के उपयोग की आवश्यकता होती है। एक कारक जो कॉन्फोकल मोड की दिशा में निर्णय को प्रभावित करता है, वह है कोशिका उपजनसंख्या से पर्याप्त दूषित संकेत की उपस्थिति।

हालांकि इमेजिंग प्रयोगों के बाद कोशिकाओं की पहचान को सत्यापित करने के लिए हार्मोन-विशिष्ट एंटीबॉडी धुंधला का उपयोग करना अभी भी एक विकल्प है, मामूली सेल उपआबादी की पहचान कार्यात्मक मार्कर यौगिकों का उपयोग करके की जा सकती है, जैसे एड्रेनालाईन और घेलिन जिन्हें क्रमशःα-18 और कोशिकाओं19,20में सीए2 + गतिशीलता को प्रोत्साहित करने के लिए दिखाया गया था।

समय-चूक इमेजिंग डेटा के विश्लेषण का उद्देश्य विभिन्न संकेतों की जनसंख्या विषमता, सहसंबंध और बातचीत जैसे तुच्छ फार्माकोलॉजी से परे जानकारी प्रदान करना है। परंपरागत रूप से, इमेजिंग डेटा तीव्रता बनाम समय के रूप में विश्लेषण किया जाता है और प्रारंभिक फ्लोरेसेंस (एफ/एफ0)को सामान्यीकृत किया जाता है। ऑटोफ्लोरोसेंस या पीएच (आमतौर पर ग्लूकोज12के मिलीमोलर स्तर से प्रेरित) में परिवर्तन द्वारा फ्लोरोफोर सिग्नल या संदूषण की ब्लीचिंग के कारण बेसलाइन सुधार की अक्सर आवश्यकता होती है। Ca2 + डेटा कई अलग अलग तरीकों से विश्लेषण किया जा सकता है, लेकिन तीन मुख्य प्रवृत्तियों स्पाइक आवृत्ति, पठार अंश, या वक्र के तहत क्षेत्र में परिवर्तन को मापने के लिए कर रहे हैं, समय बनाम गणना की। हमने बाद के दृष्टिकोण को लाभप्रद पाया, विशेष रूप से आवेदन में भारी कम नमूना कॉन्फोकल डेटा के लिए। PAUC मीट्रिक का लाभ संकेत आवृत्ति और आयाम में दोनों परिवर्तनों के प्रति इसकी संवेदनशीलता है, जबकि आवृत्ति की गणना के लिए पर्याप्त संख्या में दोलनों की आवश्यकता होती है21,जो पारंपरिक इमेजिंग का उपयोग करके प्राप्त करना कठिन है। PAUC विश्लेषण का सीमित कारक आधाररेखा परिवर्तन के लिए इसकी उच्च संवेदनशीलता है।

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Protocol

यहां वर्णित सभी तरीकों को यूनाइटेड किंगडम एनिमल्स (साइंटिफिक प्रोसीजर) एक्ट (1 9 86) और ऑक्सफोर्ड यूनिवर्सिटी ऑफ ऑक्सफोर्ड एथिकल गाइडलाइंस के अनुसार विकसित किया गया था।

1. माउस अग्नाशय आइलेट्स को अलग करें

  1. संस्कृति माध्यम और अलगाव समाधान तैयार करें।
    1. संस्कृति माध्यम बनाओ: RMPI1640 (सामग्री की तालिकादेखें), भ्रूण बछड़ा सीरम, १०० इकाइयों/mL पेनिसिलिन, १०० μg/mL स्ट्रेप्टोमाइसिन के 10% के साथ पूरक । मध्यम को दो 60 मिमी प्लास्टिक पेट्री व्यंजन (किसी भी चिपकने वाला के साथ इलाज नहीं) में वितरित करें, और व्यंजनों को इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2,पूर्ण आर्द्रता) में रखें।
    2. अलगाव समाधान (५० mL/माउस): 5 mM ग्लूकोज, १०० इकाइयों/mL पेनिसिलिन १०० μg/mL स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ हैंक्स ' माध्यम बनाओ । बर्फ (4 डिग्री सेल्सियस) पर रखें।
    3. एंजाइम समाधान (जैसे, Liberase): 0.2 मिलीग्राम/आइसोलेशन समाधान में mL, माउस प्रति 2 मिलीग्राम बनाओ। बर्फ (4 डिग्री सेल्सियस) पर रखें। वैकल्पिक रूप से, लिबेरेज़ की गतिविधि का पूर्व-परीक्षण करें, और एंजाइम22के प्रत्येक बैच के लिए ऊष्मायन मापदंडों का अनुकूलन करें।
  2. एंजाइम समाधान को माउस पित्त वाहिनी में इंजेक्ट करलें।
    1. गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के माध्यम से माउस (12 सप्ताह पुरानी महिला, C57Bl/6J) बलिदान ।
    2. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, ठीक कैंची का उपयोग कर त्वचा और मांसपेशियों की परतों को खोलें और पित्त वाहिनी का पता लगाएं।
    3. एक सूती धागे का उपयोग कर, पित्त वाहिनी के साथ जंक्शन के दोनों किनारों पर आंत लिगेट।
    4. घुमावदार ठीक घड़ीसाज के संदंश के साथ धीरे से पित्त वाहिनी लिफ्ट और एक 30G सुई के साथ एक 2 mL सिरिंज का उपयोग कर वाहिनी में बर्फ ठंडा एंजाइम समाधान परिचय । इस स्तर पर अग्न्याशय की मुद्रास्फीति देखी जानी चाहिए ।
    5. एक 15 mL फाल्कन ट्यूब में कुंद-नग अंगूठे संदंश और ठीक वॉचमेकर के संदंश के संयोजन का उपयोग करफुल अग्न्याशय ले लीजिए और यह बर्फ (4 डिग्री सेल्सियस) पर रखने के लिए । ट्यूब में एंजाइम समाधान का 1 mL जोड़ें।
  3. अग्न्याशय से अग्नाशय आइलेट्स को आजाद करके इकट्ठा करें।
    1. अग्नाशयको 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में 16 मिन के लिए एंजाइम समाधान के साथ फुला हुआ अग्नाशयको बढ़ा दें। कोमल मिलाते हुए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन महत्वपूर्ण नहीं है, बशर्ते मुद्रास्फीति अच्छी रही है ।
    2. 10 मिलीआर तक बर्फ-ठंडे अलगाव समाधान के अलावा पाचन बंद करें। धीरे-धीरे डाइजेस्ट को हिलाएं: यह छोटे टुकड़ों में गिरना चाहिए।
    3. आइसोलेशन समाधान के 10 मिलील में तीन बार डाइजेस्ट को धोएं, बर्फ पर मुक्त आइलेट्स को तलछट करने के लिए 1 x ग्राम पर 5 मिन खड़े होने दें। 10 मीटर सीरोलॉजिकल पिपेट के साथ, सुपरनेटेंट को धीरे से एस्पिरेट करें।
    4. डाइजेस्ट (10 मिलील तक बनाने के लिए) में ठंडा आरपीएमआई जोड़ें।
    5. आइलेट्स लेने के लिए प्लास्टिक पेट्री व्यंजन (चरण 1.1.1) का उपयोग करें। पेट्री व्यंजनों में से एक से आरएमपीआई माध्यम को डिडेंट करें, और धीरे-धीरे इसके बजाय डाइजेस्ट के कुछ (4-5 मिलील) डालें। दूसरी पेट्री डिश में P10 पिपेट के साथ, गोल, चिकनी और उच्च घनत्व वाले टुकड़ों के रूप में दिखाई देने वाले मुक्त आइलेट्स को इकट्ठा करें।
    6. इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2,पूर्ण आर्द्रता) में आइलेट्स संस्कृति। प्रयोग को इस स्तर पर रोका जा सकता है। आइलेट्स को 1-2 घंटे के लिए छोड़ना कुछ लोगों द्वारा अलगाव के दौरान यांत्रिक तनाव से उबरने में मदद करने के लिए माना जाता है।

2. रंग े लोड या सेंसर व्यक्त

  1. ट्रैपेबल डाया तैयार करें।
    1. डीएमएसओ में 2 एमएम की स्टॉक एकाग्रता के लिए ट्रैप करने योग्य रंग (जैसे, फ्लो-4) के एलिकोट (सामान्य रूप से, 50 μg) को भंग करें। रंग के घुलनशीलता में सुधार करने के लिए 1% (डीएमएसओ में 20% स्टॉक का उपयोग करना) की अंतिम एकाग्रता में प्लूरोनिक एसिड जोड़ें।
    2. अलीकोट छोटी पीसीआर ट्यूबों में रंग (प्रत्येक में 2 μL) । इस डाया को कई हफ्तों तक फ्रोजन (-20 डिग्री सेल्सियस) स्टोर किया जा सकता है।
  2. वैकल्पिक रूप से, रिकॉम्बिनेंट सेंसर तैयार करें।
    1. सेंसर (जैसे एडेनोवायरल वेक्टर एनकोडिंग जीसीएएमपी6एफ) को 10 माइक्रोन एलिकोट में वितरित करें और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    2. (वैकल्पिक रूप से) संक्रमण के लिए इष्टतम एकाग्रता प्रकट करने के लिए, कई धारावाहिक कमजोर होने का उपयोग करके आइलेट्स (नीचे के रूप में) को संक्रमित करके वायरल स्टॉक के टिटर का पूर्व परीक्षण करें।
      नोट: विभिन्न वैक्टर (लेंटिवायरस, बैक्मम, एएवी) द्वारा एन्कोड किए गए रिकॉम्बिनेंट सेंसर को एक अलग संक्रमण प्रोटोकॉल की आवश्यकता होती है। वेक्टर प्रदाता के साथ इसकी जांच करना सुनिश्चित करें और अपनी आवश्यकताओं के लिए कार्य अनुपात का अनुकूलन करें। एडेनोवायरस के "वर्किंग" स्टॉक को -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है और कई बार जमे हुए/गल जा सकता है। अत्यधिक फ्रीज-गल साइकिल िंग वायरस के प्रभावी टिटर को कम कर देता है।
  3. इमेजिंग सॉल्यूशन तैयार करें।
    1. इमेजिंग समाधान, एमएम: 140 एनसीएल, 4.6 केसीएल, 2.6 सीएसीएल2,1.2 एमजीसीएल2,1 नाह2पीओ4,5 नाहको3,10 हेप्स (पीएच 7.4, नाओएच के साथ)।
    2. इमेजिंग समाधान में ग्लूकोज (0.5 एम) और मैनिटॉल (0.5 एम) का स्टॉक बनाएं। स्टॉक को फ्रिज (4 डिग्री सेल्सियस) में कई हफ्तों तक स्टोर किया जा सकता है।
  4. ट्रैपकरने योग्य रंग लोड।
    1. 6 एमएम ग्लूकोज युक्त इमेजिंग समाधान के 600 माइक्रोन में रंगे के 2 माइक्रोन को भंग करके रंगे काम करने का समाधान बनाएं। समाधान को गर्म किया जा सकता है या घुलनशीलता में सुधार करने के लिए भंवर किया जा सकता है।
    2. साये के कामकाजी समाधान में चरण 1 में अलग-थलग पड़े आइलेट्स को लोड करें। लोडिंग एक मल्टीवेल प्लेट या पेट्री डिश का उपयोग करके किया जा सकता है। उत्तरार्द्ध मामले में, एक गैर-चिपकने वाली पेट्री डिश (35- या 60-मिमी) के नीचे काम करने वाले समाधान का 100 माइक्रोन ड्रॉपलेट रखें और बूंदों में 10-30 आइलेट रखें।
    3. आइलेट्स के विभिन्न समूहों (जैसे जंगली प्रकार/नॉक आउट) के मामले में, कई कुओं और कई बूंदों की व्यवस्था करें ताकि लोडिंग एक साथ की जा सके ।
    4. 70-90 मिनट के लिए अंधेरे में कमरे के तापमान पर रंग काम समाधान में आइलेट्स इनक्यूबेट। अधिक इनक्यूबेट न करें।
    5. फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के नीचे लोडिंग की जांच करें; आइलेट्स को हल्के फ्लोरेसेंस हासिल करना चाहिए, जिसमें कुछ कोशिकाएं बाकी की तुलना में उज्जवल हैं। कोशिकाओं की पूर्णाहुति और रंग के परमाणु स्थानीयकरण ओवरलोडिंग के संकेत हैं ।
    6. आइलेट्स को 6 एमएम ग्लूकोज वाले रंग-मुक्त इमेजिंग समाधान में स्थानांतरित करें। आइलेट्स का उपयोग तुरंत इमेजिंग के लिए किया जा सकता है, लेकिन वैकल्पिक रूप से रंगको एक और 10-15 मिनट के लिए डी-एस्टरिफाई करने के लिए छोड़ा जा सकता है। आइलेट्स कई घंटों तक रंगे बनाए रखेगा और इसलिए कई पारियों में इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  5. वैकल्पिक रूप से, आइलेट्स को रिकॉम्बिनेंट वेक्टर से संक्रमित करें।
    1. आवश्यक वेक्टर की मात्रा को कम करने के लिए आरपीएमआई पुलिया माध्यम (चरण 1.1.1) (जैसे, 30 माइक्रोन) में बूंदों में आइलेट्स को प्लेट करें।
    2. लगभग 105 संक्रामक इकाइयों/आइलेट के अनुपात में वेक्टर जोड़ें जिसके परिणामस्वरूप संक्रमण और gt;2 की बहुलता होनी चाहिए। आदर्श रूप से अनुपात को न्यूनतम अनुपात में अनुकूलित किया जाना चाहिए जो परिधीय परत में अभिव्यक्ति प्रदान करेगा। प्री-टिट्रेशन (चरण 2.2.3) मदद कर सकता है।
    3. 8-48 घंटे के लिए बूंद और संस्कृति में 20-50 आइलेट्स का परिचय दें। (आदर्श रूप में, रातोंरात)। आइलेट्स को सेल आकृति विज्ञान में परिवर्तन के बिना अधिकांश कोशिकाओं में एक बेहोश हरे रंग की फ्लोरेसेंस विकसित करना चाहिए।
      नोट: संक्रमण और अभिव्यक्ति की सफलता वायरस समाधान के संपर्क में आने के समय पर निर्भर करती है। आदर्श रूप से, वायरस को रात भर समाधान में रहना चाहिए लेकिन वैकल्पिक रूप से 15 मिनट के रूप में कम के बाद हटाया जा सकता है। हालांकि, संक्रामकता, और इसलिए अभिव्यक्ति, नाटकीय रूप से कम होने की संभावना है ।

3. इमेजिंग Ca2+ गतिशीलता

  1. आइलेट्स को (उल्टे) माइक्रोस्कोप के नीचे स्थिर करें।
    1. उल्टे माइक्रोस्कोपी के लिए इमेजिंग चैंबर को इकट्ठा करें। कक्ष के अंदर ग्लास कवरस्लिप (मोटाई 1 या 1.5) की स्थिति और सुनिश्चित करें कि ग्लास-चैंबर इंटरफ़ेस पानी-तंग है। जांच लें कि कवरस्लिप माइक्रोस्कोप उद्देश्य की पहुंच के भीतर है (एक भारी उच्च एनए उद्देश्य के मामले के लिए महत्वपूर्ण)।
    2. इम्मोबिलाइजेशन एक्सेसरीज तैयार करें। ठीक जाल और मोटे जाल से छोटे आयत (20 मिमी x 20 मिमी) काटें। 45-50 माइक्रोन मोटी चिपचिपा टेप का उपयोग करके ठीक जाल पर दो स्पेसर "दीवारों" का परिचय दें। स्पेसर की डबल लेयर का उपयोग करें यदि आइलेट्स का आकार काफी हद तक पारंपरिक 100 माइक्रोन से अधिक है।
    3. 35 मिमी पेट्री डिश का उपयोग करके मेशे सज और वजन को इमेजिंग समाधान में विसर्जित करें। सुनिश्चित करें कि प्लास्टिक और धातु गीले हैं।
    4. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे, स्पेसर "दीवारों" उल्टा, ऊपर की ओर सामना कर रहे spacers के साथ ठीक जाल बारी । ट्रैपकरने योग्य रंग से भरे हुए कई आइलेट्स चुनें या पी20 पिपेट के साथ रिकॉम्बिनेंट सेंसर को व्यक्त करें और धीरे-धीरे उन्हें दो स्पेसर्स के बीच ठीक जाल के शीर्ष पर रखें। सुनिश्चित करें कि जाल और वाशर उन पर इमेजिंग समाधान की अत्यधिक मात्रा में शामिल नहीं है।
    5. आईलेट्स के साथ जाल उठाओ, घड़ीसाज के संदंश का उपयोग कर, और यह इमेजिंग चैंबर के अंदर उल्टा स्थिति है, ताकि spacers नीचे की ओर चेहरा और चैंबर कवरस्लिप पर सीधे बैठते हैं । सुनिश्चित करें कि आइसलेट कवरस्लिप के बीच में स्पेसर्स और जाल के बीच फंस गए हैं।
    6. मोटे जाल और कक्ष के भीतर ठीक जाल के शीर्ष पर वजन की स्थिति। कक्ष में इमेजिंग समाधान पेश करते हैं। सुनिश्चित करें कि आइलेट्स स्थिर हैं और छवि बनने के लिए तैयार हैं। कक्ष के अत्यधिक मिलाते हुए से बचें (चैंबर को माइक्रोस्कोप पर ले जाने और गर्म चरण में डालने जैसे छोटे क्षोभ स्वीकार्य हैं)।
      नोट: एक ईमानदार प्रणाली के लिए एक समान स्थिरीकरण व्यवस्था लागू की जा सकती है।
  2. माइक्रोस्कोप स्थापित करें।
    1. इमेजिंग मोड और उद्देश्य चुनें, माइक्रोस्कोप के तापमान नियंत्रित चरण पर चरण 3.1 से आइलेट्स के साथ कक्ष की स्थिति।
      1. तापमान नियंत्रण (आदर्श रूप से, 30 डिग्री सेल्सियस और 36 डिग्री सेल्सियस के बीच) और पेरिफ्यूजन सेट करें। एक उलटा प्रणाली के लिए, कक्ष के भीतर बहिर्वाह से कम प्रवाह की स्थिति, और बहिर्वाह प्रवाह की तुलना में अधिक होने के लिए निर्धारित (जो आम तौर पर एक पेरिटैटिक पंप पर एक व्यापक आंतरिक व्यास के ट्यूबिंग का उपयोग करके हासिल की है) ।
      2. सुनिश्चित करें कि बहिर्वाह में समाधान के साथ न्यूनतम संपर्क सतह है, ताकि यह निरंतर समाधान हटाने के लंबे अंतराल से बचते हुए कई अनुक्रमिक छोटी बूंदों में समाधान को हटा दे। उत्तरार्द्ध आवधिक संकेतों की समय-चूक इमेजिंग में कलाकृतियों का प्रमुख स्रोत है क्योंकि वे हर छवि वाले पिक्सेल के नियमित आवधिक तीव्रता दोलनके रूप में दिखाई देते हैं और अक्सर "धीमी तरंगों" के रूप में व्याख्या की जाती है।
      3. 3 mM ग्लूकोज युक्त इमेजिंग समाधान के साथ पेरिफ्यूजन शुरू करें।
    2. हरे फ्लोरोफोरस की इमेजिंग के लिए प्रकाश पथ और फिल्टर चुनें; ४७० और ५०० के बीच उत्तेजना और ५०५ और ५५० के बीच उत्सर्जन उनमें से प्रत्येक के लिए काम करेंगे ।
    3. इमेजिंग मापदंडों को स्थापित करने के लिए लाइव इमेजिंग चलाएं। ब्याज के आइलेट्स को कैप्चर करने के लिए दृश्य को समायोजित करें।
    4. छवि के सिग्नल-टू-शोर अनुपात को अनुकूलित करें। उस अंत तक, उत्तेजना प्रकाश तीव्रता, एक्सपोजर समय और बिनिंग को समायोजित करें। सुनिश्चित करें कि सेटिंग्स कम से कम संभव प्रकाश तीव्रता और जोखिम पर आइलेट के भीतर प्रत्येक कोशिका के एक अलग दृश्य की अनुमति देते हैं।
    5. छवि अधिग्रहण करें। कार्य के आधार पर, छवियों को 0.1 से 5 हर्ट्ज पर लिया जा सकता है। यह α-और कोशिकाओं (>300 Hz) में तेजी से एनए+-चालितदोलनों के लिए Nyquist मानदंडों से काफी नीचे है, जिसका अर्थ है कि डेटा डिफ़ॉल्ट रूप से कम नमूना है। हालांकि, इस मांग से मेल खाने के लिए अधिग्रहण आवृत्ति बढ़ाना बहुकोशिकीय/बहु-आइलेट इमेजिंग में एक बड़े क्षेत्र को देखने के साथ व्यवहार्य नहीं है । GCaMP तेजी से छवि जा सकता है, जबकि Fluo4 तेजी से अधिग्रहण की स्थिति के तहत विरंजन अपरिहार्य होगा ।
      नोट: यह देखते हुए कि आइलेट कोशिकाओं में [Ca2+]साइट दोलन विद्युत गतिविधि से प्रेरित होते हैं, कम अधिग्रहण दरों का उपयोग उल्टा लग सकता है । वास्तव में, हालांकि, 1 हर्ट्ज के आसपास या उससे ऊपर अधिग्रहण दरें13के सेल स्पाइकिंग व्यवहार को हल करने के लिए पर्याप्त हो सकती हैं, जबकि α-और कोशिकाओं में सोडियम चैनल-चालित दोलनों का पता लगाने की सीमा 300 हर्ट्ज से ऊपर है। चाहे α-या-सेल [Ca2+]साइट दोलन 1 हर्ट्ज या 0.1 हर्ट्ज पर अधिग्रहीत किए जाते हैं, वे गंभीर रूप से कम नमूना होंगे और विद्युत गतिविधि के बजाय सेल द्वारा सीए2 + हैंडलिंग को प्रतिबिंबित करेंगे।
      1. अधिग्रहीत डेटा की गुणवत्ता की जांच करें: 3 mM ग्लूकोज पर, α-सेल गतिविधि स्पष्ट रूप से दिखाई/पता लगाने योग्य होना चाहिए । सुनिश्चित करें कि यह मामला है और पूर्ण पैमाने पर समय चूक इमेजिंग के लिए आगे बढ़ें ।
  3. समय-चूक इमेजिंग
    1. यदि यह उपलब्ध है तो अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में लागू किए गए सिग्नल गतिशीलता के ऑनलाइन चार्ट का उपयोग करें। यदि ऑनलाइन चार्टिंग एक विकल्प नहीं है, तो एक लुक-अप-टेबल लागू करें जो सिग्नल तीव्रता को सबसे व्यापक तरीके से प्रदर्शित करता है (जैसे "इंद्रधनुष")।
    2. उत्तेजनाओं को प्रतिवर्ती तरीके से लागू करें: बेसल स्तर तक सिग्नल की वसूली रिकॉर्ड करें। रिकॉर्डिंग के प्रारंभ और अंत में कलाकृतियों पर ध्यान न दें; बाद पीएच या सेल मौत में परिवर्तन के कारण जांच फ्लोरेसेंस की अपरिवर्तनीय "वृद्धि"/"कमी" की तरह लग सकता है ।
    3. कम ग्लूकोज पर दोलन सीए 2+ गतिशीलता द्वारा α-कोशिकाओं में अंतर करें। स्नान समाधान में एड्रेनालाईन या ग्लूटामेट का परिचय दें, जो 2-5 मिन के लिए श्रद्धापूर्वक है। [Ca2+]साइट में एक तेजी से कूद एक धीमी गति से नीचे या दोलनों के रद्द करने के बाद का पालन करेंगे ।
      नोट: एड्रेनालाईन α-कोशिकाओं के लिए एक मान्यता प्राप्त मार्कर यौगिक है, जिसका आइलेट कोशिकाओं की इस उपजनसंख्या पर एक चयनात्मक सकारात्मक प्रभाव पड़ता है, जो इंट्रासेलर डिपो18से सीए2 + की रिहाई से मध्यस्थता करता है। ग्लूटामेट को एक और α-सेल विशिष्ट एगोनिस्ट23के रूप में रखा गया है ।
    4. हाल ही में चुनिंदा19,20को सक्रिय करने के लिए सूचित किया गया है, जो ghrelin जोड़ें/हटा दें । आइलेट कोशिकाओं की एक छोटी सी उपआबादी में [Ca2+]साइट में तेजी से प्रतिवर्ती वृद्धि का निरीक्षण करें।
    5. 20 एमएम ग्लूकोज जोड़ें/निकालें। सेल उपजनसंख्या में एक समन्वित दोलन प्रतिक्रिया का निरीक्षण करें। कोशिकाओं की प्रतिक्रिया पर ध्यान दें जो पहले एड्रेनालाईन या ग्लूटामेट और घरेलिन द्वारा सक्रिय किए गए हैं।
    6. छवि अनुक्रम को बचाओ। रिकॉर्डिंग के दौरान "ऑटोसेव" का उपयोग करने पर विचार करें।

4. डेटा का विश्लेषण

  1. समय-चूक छवि का विश्लेषण करें।
    1. टाइम-लैप्स इमेज को इमेज एनालिसिस सॉफ्टवेयर में आयात करें, जैसे ओपन-सोर्स इमेजजे/फिजी ।
    2. यदि रिकार्डिंग के दौरान पर्याप्त/तीव्र गति हुई है, तो डेटा को मरम्मत योग्य के रूप में छोड़ दें । छोटे बहाव को सही करने के लिए स्टैकरेग या टर्बोरेग प्लगइन्स24 का उपयोग करें।
    3. सेल डिटेक्शन और इंटरेस्ट के क्षेत्र (आरओआई) मैपिंग के लिए मास्क इमेज बनाएं। इसे प्राप्त करने का पसंदीदा तरीका "औसत तीव्रता" या "अधिकतम तीव्रता" जैसे कार्यों में से एक का उपयोग करके एक स्टैक छवि बनाना होगा। उपयोग किया जाने वाला कार्य वह है जो व्यक्तिगत कोशिकाओं की सर्वोत्तम मान्यता प्रदान करेगा।
    4. मुखौटा छवि को दहलीज करें, आइलेट क्षेत्र के बाहर के सभी डेटा को हटा दें। समारोह 32-बिट छवियों के लिए स्वचालित मोड में काम करता है।
    5. दहलीज छवि में मैक्सिमा का पता लगाएं। यदि छवि घनी है तो अधिकतम ा ओं को अंकों, क्षेत्रों या यहां तक कि क्षेत्रों द्वारा दर्शाया जा सकता है।
    6. किसी भी आकार प्रतिबंध के बिना 'खोजें मैक्सिमा" फ़ंक्शन लागू करें और पता लगाए गए मैक्सिमा को ब्याज क्षेत्र (आरओआई) संपादक में चिपकाएं।
    7. प्रत्येक आरओआई मैप किए गए स्मूद/इंटरपोलेट; संभवतः, आरओआई को विस्तार की आवश्यकता होगी। एक साधारण स्क्रिप्ट (4.1.6-4.1.8) के लिए लिखी जा सकती है और सबसे अच्छा सेल डिटेक्शन परिणाम प्रदान करने के लिए कई बार चलती है। कई आरओआई ओवरलैप हो सकते हैं लेकिन यह दुर्लभ है।
    8. आरओआई की स्थिति का विश्लेषण करें और संबंधित एक्स और वाई डेटा को इलेक्ट्रॉनिक टेबल सॉफ्टवेयर (जैसे, माइक्रोसॉफ्ट एक्सेल) में चिपकाएं।
    9. सभी आरओआई के लिए ग्रे तीव्रता बनाम समय का विश्लेषण करें और डेटा को इलेक्ट्रॉनिक टेबल सॉफ्टवेयर में चिपका दें।
  2. संख्यात्मक डेटा का विश्लेषण करें।
    1. डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर में डेटा आयात करें। सॉफ्टवेयर की पसंद और प्रयोग की अवधि/नमूना/आकार के आधार पर, यह एक साधारण कॉपी-पेस्ट ऑपरेशन या स्टैंडअलोन प्रक्रिया हो सकती है । संख्यात्मक डेटा की व्यवस्था और भंडारण सुनिश्चित करें।
    2. यदि उपलब्ध हो तो समय-टिकटों या समय नोटों का आयात करें।
    3. कच्चे फ्लोरेसेंस तीव्रता डेटा ("एफ") को फ्लोरेसेंस ("एफ0")के प्रारंभिक मूल्य के लिए सामान्य करें। यह बहुत पहले बिंदु में फ्लोरेसेंस होने की जरूरत नहीं है, लेकिन कई पहले अंक का औसत हो सकता है । सामान्यीकरण डेटा की परिवर्तनशीलता को कम करना चाहिए और, एक आदर्श मामले में (कोई बहती बेसलाइन नहीं) परिणामस्वरूप एक विश्लेषण योग्य डेटासेट ("एफ/एफ0")होता है।
    4. यदि एफ/एफ0 डेटासेट की सेल-टू-सेल परिवर्तनशीलता अभी भी पर्याप्त है (लंबी रिकॉर्डिंग, ब्लीचिंग), बेसलाइन सुधार करें । इस उद्देश्य के लिए, एक 'नियंत्रण' क्षेत्र को परिभाषित करें, यानी समय की सीमा जिसके दौरान नियंत्रण समाधान (माउस अग्नाशय आइलेट्स के लिए, बिना किसी एगोनिस्ट/विरोधी के 3 एम ग्लूकोज) लागू किया गया था।
      1. यदि नियंत्रण क्षेत्र में एक स्पष्ट गैर-दोलन संकेत है, तो मान लें कि नियंत्रण समाधान के प्रत्येक आवेदन के बाद एफ/एफ0 प्रारंभिक मूल्य (एफ/एफ0= 1) पर लौट रहा था । डेटा को सेगमेंट में विभाजित करके प्रत्येक सेल के लिए समय-चूक डेटा को सही करें, जब नियंत्रण समाधान जोड़ा गया था, और प्रत्येक सेगमेंट में रैखिक सुधार लागू किया गया था। पॉलीनोमियल या अन्य nonlinear सुधार का उपयोग न करें क्योंकि इसके परिणामस्वरूप कलाकृतियां होती हैं।
      2. यदि नियंत्रण सीमा में स्पष्ट दोलन या अतिरिक्त कारक हैं (जैसे एफएडी ऑटोफ्लोरेसेंस) मौजूद हैं, तो स्पाइक डिटेक्शन एल्गोरिदम17का उपयोग करें। इसके लिए एक तुच्छ और तेजी से रन-अराउंड एक मैक्सिमा-संवेदनशील तरंग रूपांतरित होता है(चित्रा 3ए)।
    5. डेटा की मात्रा निर्धारित करें। हालांकि Ca2 + एक अत्यधिक गतिशील संकेत है, निरपेक्ष एफ के संदर्भ में सीए2 + डेटा पेश/ यदि कई प्रयोगों के परिणामों की तुलना की जानी चाहिए, तो एक मीट्रिक चुनें।
      1. सीए2 + स्पाइक्स(चित्रा 4ए, डी)की आवृत्ति और (चींटी) एगोनिस्टके अलावा इसकी प्रतिक्रिया को मापें। इस उद्देश्य के लिए, रिकॉर्डिंग को समान समय अंतराल में विभाजित करें और अंतराल के भीतर स्पाइक्स की गिनती करके और अंतराल अवधि को सामान्य बनाकर आंशिक आवृत्ति (प्रत्येक अंतराल में स्पाइकिंग आवृत्ति) के टाइमकोर्स की गणना करें।
      2. वैकल्पिक रूप से, सीमा निर्धारित करें और ऊपर परिभाषित अंतराल(चित्रा 4बी, एफ)में से प्रत्येक के लिए पठार अंश (पीएफ) की गणना करें। अंश अंतराल के भीतर समय के प्रतिशत को इंगित करता है कि सेल "उत्तेजित" राज्य में खर्च किया।
      3. वैकल्पिक रूप से, ऊपर परिभाषित अंतराल(चित्रा 4सी, जी)में से प्रत्येक के लिए वक्र (pAUC) के तहत आंशिक क्षेत्र की गणना करें। यह मीट्रिक स्पाइकिंग की आवृत्ति और आयाम दोनों में परिवर्तन के प्रति संवेदनशील है।
        नोट: आवृत्ति को मापने के लिए एक चेतावनी स्पाइक अवधि और खराब स्थिरता के लिए संवेदनशीलता की कमी है । चूंकि डेटा को विद्युत स्पाइकिंग बनाम भारी कम नमूना दिया जाता है, इसलिए प्रति अंतराल स्पाइक्स की संख्या काफी छोटी होती है और इसलिए एक एकमात्र अतिरिक्त स्पाइक नाटकीय रूप से परिणाम को प्रभावित कर सकता है। पीएयूसी की 'अड़चन' बेसलाइन में बदलाव के प्रति इसकी संवेदनशीलता है। हालांकि कलाकृतियों के लिए कम प्रवण और आवृत्ति की तुलना में [Ca2 +]साइट में परिवर्तन के प्रति अधिक संवेदनशील है, फिर भी PAUC सीए2 + गतिशीलता की प्रकृति के बारे में बहुत जानकारीपूर्ण नहीं है । पठार अंश पूरे सेल प्रणाली के लिए खुली संभावना अवधारणा का विस्तार है । हालांकि, दहलीज मूल्य पर निर्भरता के कारण यह PAUC की तुलना में कम मजबूत है।

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Representative Results

आइलेट्स ट्रैप करने योग्य रंगों(चित्रा 1ए)के साथ काफी अच्छी तरह से लोड करते हैं, जब तक कि झिल्ली की लिपिड संरचना प्रभावित नहीं हुई है (उदाहरण के लिए, फैटी एसिड के पुराने जोखिम से)। मानव एडेनोवायरस प्रकार 5 (Ad5) वेक्टर भी सभी आइलेट कोशिकाओं(चित्र ा 1बी)को लक्षित करता है। समस्याएं तब पैदा हो सकती हैं जब एक ही सेल में एक से अधिक रिकॉम्बिनेंट सेंसर व्यक्त किए जा रहे हैं। इसके अलावा, आइलेट्स आमतौर पर ऊपर वर्णित तकनीक का उपयोग करके बहुत अच्छी तरह से स्थिर होते हैं, जो असाधारण स्थिरता और समाधान का उपयोग प्रदान करता है।

कै.2 + α-कोशिकाओं में स्पाइकिंग को कम ग्लूकोज स्तर(चित्रा 2)पर आसानी से पता लगाया जा सकता है। कम ग्लूकोज पर गतिविधि और एड्रेनालाईन और ग्लूटामेट की प्रतिक्रिया के बीच एक उच्च सेल-बाय-सेल सहसंबंध है। Ghrelin कम ग्लूकोज पर कुछ एड्रेनालाईन-उत्तरदायी कोशिकाओं (α-कोशिकाओं?) को सक्रिय करता है फिर भी कम ग्लूकोज (कोशिकाओं) द्वारा सक्रिय अधिकांश कोशिकाओं में सीए2 + गतिशीलता पर इसका कोई प्रभाव नहीं पड़ता है।

आंशिक आवृत्ति(चित्रा 4ए, सी),एड्रेनालाईन या घरेलिन-उत्तेजित कोशिकाओं के संदर्भ में विश्लेषण किए जाने पर सभी या कुछ भी नहीं स्थितियों के तहत पर्याप्त वृद्धि प्रदर्शित होती है। यही है, कम बेसल गतिविधि वाला एक सेल जो एड्रेनालाईन या घरेलिन द्वारा सक्रिय हो जाता है, इस मीट्रिक में नाटकीय वृद्धि को दर्शाता है। हालांकि, बेसल स्पाइकिंग और एड्रेनालाईन प्रभाव के बीच समग्र परिवर्तन बहुत सूक्ष्म हैं(चित्र4ए, सी)। इसके विपरीत, आंशिक एयूसी सभी कोशिकाओं में एड्रेनालाईन द्वारा शुरू किए गए परिवर्तनों के प्रति संवेदनशील है, भले ही बेसल गतिविधि अधिक हो(चित्रा 4बी, डी)।

Figure 1
चित्रा 1: फंसाने योग्य रंगऔर आइलेट्स में पुनः संयोजन सेंसर की अभिव्यक्ति की लोडिंग। ट्रैप करने योग्य डाया फ्लू-4(ए)से भरे हुए विशिष्ट माउस आइलेट्स या कोशिकाओं की परिधीय परत में रिकॉम्बिनेंट सेंसर GCaMP6 को व्यक्त करते हैं(बी)या गहरी परत(सी)में। ध्रुवीय ट्रेसर सल्फोधोडामाइन बी (एसआरबी, सफेद के रूप में दिखाया गया है) प्रत्येक आइलेट25के भीतर व्यक्तिगत कोशिकाओं की रूपरेखा के लिए उपयोग किया गया है । (D)फ्लो4 का उपयोग करके आइलेट के भीतर व्यक्तिगत कोशिकाओं से दर्ज ग्लूकोज के जवाब में सीए2 + के प्रतिनिधि काइनेटिक्स। मामूली सेल आबादी के भीतर विषमता पर ध्यान दें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: विभिन्न उत्तेजनाओं के लिए आइलेट कोशिकाओं की विशिष्ट Ca2 + प्रतिक्रिया। एड्रेनालाईन, ग्लूटामेट, घेलिन, ग्लूकोज के जवाब में विशिष्ट α-सेल(A)औरबी (B)Ca2+ गतिशीलता। (C)-(D)आइलेट सेल प्रतिक्रिया के हीट नक्शे एड्रेनालाईन-पॉजिटिव(सी)और ghrelin-पॉजिटिव(डी)उपआबादी दिखा । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: बेसलाइन सुधार। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: समय चूक डेटा का विश्लेषण। α-कोशिकाओं में सीए2 + गतिशीलता का विश्लेषण। आंशिक आवृत्ति(ए),पठार अंश(बी)और एक α-कोशिकाओं के वक्र(सी)के तहत क्षेत्र [Ca2 +]मैं ट्रेस । जनसंख्या [Ca2+]मैं कच्चे (एफ/एफ0)(डी),आंशिक आवृत्ति(ई),पठार अंश (एफ) और वक्र(जी)के तहत क्षेत्र के रूप में व्यक्त एक माउस अग्नाशय आइलेट से डेटा । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

प्रोटोकॉल में तीन चरण हैं जो समग्र सफलता के लिए महत्वपूर्ण हैं। पित्त वाहिनी में लिबेरेज़ एंजाइम का सफल इंजेक्शन न सिर्फ अलगाव प्रक्रिया की मात्रात्मक सफलता को निर्धारित करता है बल्कि अलग-थलग पड़े आइलेट्स की गुणवत्ता को भी प्रभावित करता है। अनइन्फ्लेट अग्नाशयके परिणामस्वरूप अलग-थलग पड़े आइलेट्स में कुछ महत्वपूर्ण मेटाबोलिक प्रतिक्रियाओं की कमी हो सकती है। दूसरा, सेंसर की डीवाई/एक्सप्रेशन की लोडिंग टाइम-लैप्स रिकॉर्डिंग के सिग्नल-टू-नॉमिनेशन रेशियो को परिभाषित करती है । सिग्नल ओवरलोडेड आइलेट्स में नदारद या तनु होते हैं । अंत में, इमेजिंग चैंबर के अंदर ऊतक की सफल और सघन स्थिति सार्थक और विश्लेषणयोग्य प्रयोगों के लिए एक निर्णायक क्षण है। खराब तैनात या चलती ऊतक बर्बाद प्रयोगात्मक समय और/या अस्पष्ट डेटा में परिणाम है ।

विधि को कई संकेतों (कॉन्फोकल सिस्टम का उपयोग करके) और आइलेट्स के कई समूहों (उदाहरण के लिए, विभिन्न जीनोटाइप के) के लिए खाते में संशोधित किया जा सकता है। कई संकेतों की इमेजिंग आइलेट के प्रत्येक सेल में एक दूसरे सेंसर की डिलीवरी को मानता है, सीए2 + रिपोर्टर (जैसे पीएच सेंसर SNARF5f26,27)के साथ संगत होती है। इस उद्देश्य के लिए, आइलेट्स को सीए 2+ और पीएच सेंसर ों से सह-लोड/सह-संक्रमित किया जा सकता है, जिन्हें फिर प्रत्येक समय-सीमा के भीतर क्रमिक रूप से चित्रित किया जाता है ।

एकल सेल संकल्प के साथ आइलेट्स के समूहों में संकेत इमेजिंग के लिए एक व्यापक क्षेत्र-दृश्य उद्देश्य का उपयोग करने की आवश्यकता होती है। इसके उद्देश्य में कम आवर्धन और संख्यात्मक अपर्चर (एनए) होने की संभावना है, जिससे स्थानिक संकल्प में कमी आई है । कम-एनए उद्देश्य की बढ़ी हुई गहराई-ध्यान के कारण, इमेजिंग को व्यापक क्षेत्र प्रणाली पर किया जा सकता है। इस व्यवस्था के नुकसान प्रकाश संकेत के सेल-सेल क्रॉस-संदूषण और 3 डी सिग्नल (जैसे, इंसुलिन प्रमोटरों के तहत सीए2 + सेंसर को व्यक्त करने वाले चूहों) को छवि देने की क्षमता कम है। इसके साथ ही, सतह आइलेट कोशिकाओं से व्यक्त संकेत को पूरी तरह से समूहों से उच्च लौकिक संकल्प के साथ हल किया जा सकता है जिसमें दसियों से सैकड़ोंआइलेट्स 18शामिल हैं।

हालांकि यह अप्रिय लग सकता है लेकिन अलग सॉफ्टवेयर संकुल में छवि विश्लेषण और संख्यात्मक डेटा विश्लेषण प्रदर्शन एक अच्छा विचार है। वर्तमान समय में, ImageJ/FIJI वैज्ञानिक छवि विश्लेषण पर हावी है । वैज्ञानिक कोडिंग के लिए सबसे लोकप्रिय वातावरण पायथन और मैटलैब हैं, फिर भी आर28में सीए2 + डेटा का विश्लेषण करने के लिए ज्ञात प्रयास हैं। सबसे अच्छा प्रयोज्य इगोरप्रो जैसे अधिक आला पैकेजद्वारा प्रदान किया जाता है। हमारी पसंद मैटलैब/पायथन में प्रोटोटाइप करना और फिर 'पाइपलाइन' उपयोग के लिए इगोर्प्रो में कोड को लागू करना है। विश्लेषणात्मक जरूरतों के लिए इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी (जैसे, क्लैंपफिट, न्यूरोएक्सप्लोरर) के लिए सिग्नल विश्लेषण पैकेज को अनुकूलकरना एकल-कोशिका इमेजिंग के लिए उपयोगी हो सकता है लेकिन इसे बढ़ाना मुश्किल है। कम सैंपलिंग रेट की वजह से आइलेट इमेजिंग के लिए ऐसे पैकेज्स द्वारा दिए गए कई विकल्प लागू नहीं होते हैं।

यह याद रखना महत्वपूर्ण है कि यह कार्यप्रणाली कई कारकों द्वारा सीमित है। सबसे पहले, जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, इमेजिंग काफी हद तक डेटा को कम नमूना देने पर आधारित है, जिसका अर्थ है कि यह इंगित नहीं करता है और इसलिए सीधे कोशिका की विद्युत गतिविधि की तुलना में नहीं किया जा सकता है। दूसरे, डेटा आइलेट परिधि से आता है और महत्वपूर्ण युग्मन प्रक्रियाओं को प्रतिबिंबित नहीं करता है जो आम तौर पर, त्रि-आयामी हैं । तीसरा, लोडिंग/अभिव्यक्ति का स्तर संवेदक तीव्रता की धारणा को प्रभावित करता है। अंत में, मार्कर यौगिकों द्वारा कम अच्छी तरह से शोध किए गए आइलेट सेल उपआबादी (जैसे, पीपी कोशिकाओं और ε-कोशिकाओं) की सक्रियता से इनकार नहीं किया जा सकता है, हालांकि आइलेट के भीतर इन कोशिकाओं की कम संख्या के कारण किसी भी संभावित संदूषण न्यूनतम हो जाएगा।

विधि दृश्य प्रभाव के मामले में एक सच्ची 'चैंपियन' है, क्योंकि दोलन प्रक्रियाएं वास्तव में जीवित ऊतक ों की एक मजबूत छाप देती हैं। मामूली सेल उपआबादी पर लागू, विधि हर एक के कार्य की मज़बूती से जांच करती है, जिससे उपसमूहों की पहचान की अनुमति होती है और विषमता को दर्शाती है।

कैल्शियम गतिशीलता अग्नाशय आइलेट में अध्ययन किया गया है-कोशिकाओं को ४० से अधिक वर्षों के लिए, ज्यादातर अधिग्रहण में प्रगति से प्रेरित/ शुरुआती अध्ययनों में परमाणु अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी29का उपयोग किया गया था, लेकिन यह फ्लोरोसेंट सीए2 + सेंसर30 के आगमन तक नहीं था कि फोटोमेट्री31,32,33का उपयोग करके विस्तृत गतिज को व्यक्तिगत आइलेट कोशिकाओं में हल किया जा सकता है। इसके तुरंत बाद, सीए2 + काइनेटिक्स के स्थानिक घटक में सुधार किया गया क्योंकि सीए 2+ इमेजिंग34,35,36 एक नियमित तकनीक बन गई, जो तत्कालीन नए उपलब्ध चार्ज-युग्मित डिवाइस (सीसीडी) डिटेक्टरों की बदौलत थी। बाहर के फोकस प्रकाश की समस्या है, कि ऊतक के भीतर व्यक्तिगत कोशिकाओं से संकेत इमेजिंग बाधित, तो 1990 के दशक के मध्य में लेजर स्कैनिंग confocal माइक्रोस्कोपी (LSCM)३७ और कुल आंतरिक प्रतिबिंब फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी (TIRFM)३८के माध्यम से हल किया गया था । दोनों तरीकों, फ्लोरोसेंट सीए2 + सेंसर एक 488 एनएम लेजर के साथ उत्तेजनीय की एक नई पीढ़ी के आगमन से पूरित, सफलतापूर्वक आइलेट सेल उपआबादी39,40,41में सीए2 + गतिशीलता छवि के लिए इस्तेमाल किया गया है।

नई सदी ने न्यूरोसाइंस से संबंधित तकनीकी विकास से उपजी दो नए रुझानों को आगे लाया । सबसे पहले, जीएफपी वेरिएंट के परिपत्र क्रमपरिवर्तन के आधार पर पुनः संयोजन फ्लोरोसेंट सेंसर ने सीए2 + डिटेक्शन के लिए सिग्नल-टू-शोर अनुपात में काफी वृद्धि की, प्रभावी रूप से अध्ययन को बड़ी कोशिका आबादी के स्तर पर लाया, जिसमें हर कोशिका में [सीए2 +]साइट की गतिशीलता का समाधान किया जा सकता है। दूसरे, ऊतक-विशिष्ट प्रमोटरों के उपयोग ने लघु उपआबादी के लिए सेंसर अभिव्यक्ति को लक्षित करने की अनुमति दी ।

हालांकि आम तौर पर तंत्रिका विज्ञान में विकास को प्रतिबिंबित करने के लिए सोचा, आइलेट Ca2 + गतिशीलता पर अध्ययन दो प्रमुख मतभेद है । सबसे पहले, तकनीकी रूप से, आइलेट सिग्नलिंग के वीवो इमेजिंग में कोई भी अग्न्याशय की अप्रत्याशित शरीर रचना और आइलेट्स के स्थान42के कारण मस्तिष्क में इमेजिंग से अधिक जटिल है। दूसरे, आइलेट-कोशिकाओं के बीच उत्कृष्ट विद्युत युग्मन अनिवार्य रूप से बिजली के निष्क्रिय आबादी में आइलेट्स प्रदान करता है जो उच्च ग्लूकोज उत्तेजना के लिए प्रतीत होता है सही सभी या कुछ भी प्रतिक्रिया प्रदर्शित करता है। हमारा मानना है कि ऊतक-विशिष्ट लक्ष्यीकरण के आधार पर मामूली आइलेट उपआबादी में [सीए2 +]आई काइनेटिक्स के अध्ययन से उनके फार्माकोलॉजी/फिजियोलॉजी के बारे में हमारे ज्ञान को व्यापक बनाने की संभावना है । इसके साथ ही, अत्यधिक संवेदनशील जांच ऐसे मापनों की सांख्यिकीय शक्ति का विस्तार करने, आइलेट-टू-आइलेट परिवर्तनशीलता के लिए लेखांकन और एक समानांतर प्रयोग के भीतर विभिन्न समूहों से आइलेट्स की इमेजिंग की अनुमति देने की अनुमति देती है ।

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Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते ।

Acknowledgments

आह एक मधुमेह ब्रिटेन पीएचडी Studentship के एक प्राप्तकर्ता था, EV OXION-वेलकम ट्रस्ट प्रशिक्षण कार्यक्रम द्वारा समर्थित था, एआईटी एक ऑक्सफोर्ड बायोमेडिकल रिसर्च काउंसिल पोस्टडॉक्टोरल फैलोशिप आयोजित की ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
40x/1.3 objective
Axiovert 200 microscope
emission
Excitation
Fetal bovine serum Sigma-Aldrich F7524-500ML
Fluo4 Thermo Fisher (Life Technologies) F14201
GCaMP6f, in (human type 5) adenoviral vector Vector Biolabs 1910
Hanks' solution Thermo Fisher (GibCo, Life Technologies)
Liberase Sigma-Aldrich 5401020001
penicillin/streptomycin Thermo Fisher (GibCo, Life Technologies) 15140122
RPMI medium Thermo Fisher (GibCo, Life Technologies) 61870044
Zeiss LSM510-META confocal system Carl Zeiss

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References

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Hamilton, A., Vergari, E., Miranda, C., Tarasov, A. I. Imaging Calcium Dynamics in Subpopulations of Mouse Pancreatic Islet Cells. J. Vis. Exp. (153), e59491, doi:10.3791/59491 (2019).

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