Summary
Her præsenterer vi en protokol for billeddannelse og kvantificering af calcium dynamik i heterogene cellepopulationer, såsom pancreas-ø-celler. Fluorescerende reportere leveres ind i det perifere lag af celler inden for øen, som derefter er immobiliseret og imaged, og per-celle analyse af dynamikken i fluorescens intensitet udføres.
Abstract
Pancreas ø hormoner regulere blodglucose homøostase. Ændringer i blodglucose inducere svingninger af cytosolisk calcium i bugspytkirtlen ø-celler, der udløser sekretion af tre vigtigste hormoner: insulin (fra β-celler), Glucagon (α-celler) og Somatostatin (δ-celler). β-celler, som udgør størstedelen af ø-celler og er elektrisk koblet til hinanden, reagerer på glukose stimulus som en enkelt enhed. Excitabiliteten af de mindre delpopulationer, α-celler og δ-celler (udgør ca. 20% (30%) og 4% (10%) af de samlede henholdsvis gnaver1 (2) ø-cellenumre) er mindre forudsigelige og derfor af særlig interesse.
Calcium sensorer leveres ind i det perifere lag af celler inden for den isolerede ø. Den ø eller en gruppe af Holme er derefter immobiliseret og afbildet ved hjælp af en fluorescens mikroskop. Valget af Imaging mode er mellem højere gennemløb (Wide-felt) og bedre rumlig opløsning (confocal). Konventionelt, Laserscanning confokal mikroskopi bruges til billedbehandlings vævet, da det giver den bedste adskillelse af signalet mellem de tilstødende celler. Et bredt felt system kan også udnyttes, hvis det kontaminerende signal fra den dominerende population af β-celler minimeres.
Når calcium dynamikken som reaktion på specifikke stimuli er blevet registreret, udtrykkes data i numerisk form som fluorescens intensitet vs. tid, normaliseret til den oprindelige fluorescens og baseline-korrigeret, for at fjerne virkningerne forbundet med blegning af fluoroforet. Ændringer i spids frekvensen eller delarealet under kurven (pAUC) er beregnet til at kvantificere de observerede virkninger. pAUC er mere følsom og ganske robust mens spiking frekvens giver mere information om mekanismen af calcium stigning.
Mindre celle delpopulationer kan identificeres ved hjælp af funktionelle reaktioner på markør forbindelser, såsom adrenalin og ghrelin, der inducerer ændringer i cytosolisk calcium i en bestemt population af ø-celler.
Introduction
Formålet med metoden er at billede real-time ændringer i cytosolisk calciumkoncentration ([ca2 +]Cyt) i mindre delpopulationer af bugspytkirtel ø-celler. Dette gør det muligt at afdække de mekanismer, der styrer hormon sekretion i disse celler, afslørende detaljer om krydstale mellem forskellige celletyper og potentielt introducere en populationel dimension i det større billede af ø-signalering.
Holme består af flere celletyper. Ud over de mere velkendte insulin-udskilning β-celler, der er mindst to subpopulationer, der er også afgørende for reguleringen af blodglukose3. α-celler (der udgør omkring 17% af ø-celler) udskiller Glucagon, når blodglucose bliver for lav, hvilket signalerer frigivelse af glucose i blodbanen fra depoter i leveren. Overdreven Glucagon-niveauer (hyperglucagonæmi) og nedsat kontrol af Glucagon-Release ledsage (og, teknisk, kan bidrage til) den prædiab etiske tilstand af nedsat insulinfølsomhed4. δ-celler (ca. 2%) udskiller somatostatin som respons på glukose højde. Dette allestedsnærværende peptidhormon vil sandsynligvis være til stede ved høje koncentrationer i nærheden af α-og β-celler inden for Holme, som har en stærk Gi Receptor-medieret formildende virkning på både Glucagon og insulinsekretion.
α-celler og δ-celler deler en stor del af de glukose-sensing maskiner med deres nære afstamning slægtninge, β-celler. Alle tre celler typer er udstyret med ATP-følsomme K+ kanaler, udførlige metaboliske sensorer5 , der styrer plasma membranpotentialet i disse overgearet celler. Samtidig reguleres udskillelsen af insulin, somatostatin og Glucagon forskelligt af glucose. Billeddannelse af ca2 + dynamik i de to mindre delpopulationer af ø-celler kan derfor give et indblik i Cross-Talk mellem blodglukose og ø-sekretions produktion.
Tidlige forsøg på at overvåge excitabiliteten af α-og δ-celler ved hjælp af patch-clamp Elektrofysiologi blev snart efterfulgt af billeddannelse af ca2 + i enkelt α-og δ-celler. Identiteten af celler i disse eksperimenter blev verificeret via en efterfølgende farvning med anti-Glucagon eller anti-somatostatin antistoffer. Disse bestræbelser blev ofte hæmmet af konstateringen af, at ø-celler opfører sig meget forskelligt inden for øen og som enkeltceller. Selv om β-celler kan synes at være de vigtigste velgørere af øen arrangement (på grund af deres overvældende flertal, der ligger til grund for deres stærke elektriske kobling), den største uoverensstemmelse var, overraskende, fundet i α-celler. Inden for den intakte ø er disse celler konstant og vedvarende aktiveret ved lavt glucose, hvilket kun gælder for ca. 7% af enkelt dispergerede α-celler6. Indberetning af aktiviteten af α-og δ-celler inden for intakte Holme menes derfor at repræsentere en tættere tilnærmelse af in vivo-betingelser.
Generelt er der to måder at rapportere ca2 + dynamik specifikt fra α-celle eller δ-celle delpopulationer: (i) at udtrykke en genetisk kodet ca2 + sensor via en vævs specifik promotor eller (II) ved hjælp af markør forbindelser. Den mere elegante tidligere tilgang tilføjer den betydelige fordel af ægte 3D-billeddannelse og dermed studere celle fordeling inden for øen. Det kan dog ikke anvendes på intakt menneskeligt ømateriale. En anden potentiel bekymring er den "lækage" af arrangøren, især når β-/α-celle-Trans differentiering eller α-celle respons på høj glukose er på plads. Sidstnævnte fremgangsmåde kan anvendes med frisk isoleret væv, herunder humane prøver eller dyrkede Holme. Dataene indsamles dog udelukkende fra det perifere lag af ø-celler, da det er udfordrende at levere farvestof/markør molekyle i dybere lag uden at ændre den ø-arkitektur. En uventet fordel ved sidstnævnte fremgangsmåde er kompatibiliteten med Wide-Field Imaging mode, som tillader opskalering af eksperimenter til simultan billeddannelse af titusinder eller hundredvis af Holme (dvs. tusinder til titusinder af celler).
Calcium er afbildet in vivo ved hjælp af genetisk kodet gcamp7 (eller pericam8) familie sensorer, som er varianter af cirkulært permuteret grønt fluorescerende protein (gfp) smeltet til calcium bindende protein calmodulin og dets mål sekvens, M13 fragment af myosin lyskæde kinase7,9. Gcamps har fremragende signal-til-støj-forhold i rækken af nanomolær ca2 + koncentrationer og et højt 2-foton tværsnit, hvilket gør dem til et ideelt valg til in vivo arbejde10,11. Det udfordrende aspekt ved at bruge rekombinante sensorer er deres levering i cellerne. Heterologe udtryk kræver brug af en viral vektor og multi-time ex vivo-dyrkning, som ofte giver anledning til betænkeligheder med hensyn til potentiel afsondring eller forringelse af celle funktioner. Selvom musemodeller, der er udviklet til at udtrykke GCaMP, løser dette problem, tilføjer de nye udfordringer ved at øge gennemløbstiden betydeligt og begrænse arbejdet til en ikke-menneskelig model. Meget høj følsomhed over for ændringer af intracellulær pH er en anden negativ side af protein-baserede sensorer12, hvilket dog er mindre af et problem for at detektere oscillatoriske signaler, såsom ca2 +.
Fordelen ved opfanges farvestoffer (såsom grøn fluorescerende Fluo4) er, at de kan indlæses i frisk isoleret væv inden for omkring en time. Forudsigeligt, opfanges farvestoffer har lavere signal-til-støj nøgletal og (meget) lavere foto stabilitet end deres rekombinante modparter. Vi kan ikke bekræfte13 rapporterne om toksicitet af de opfanges farvestoffer14, men farvestof overbelastning er et hyppigt problem.
Røde rekombinante ca2 + sensorer baseret på cirkulær permutation har udviklet sig hurtigt siden 201115, og den seneste udvikling udgør en stærk konkurrence til gcamps16 for vævs Imaging, givet højere dybde penetration af rødt lys. Kommercielt tilgængelige rød opfanges farvestoffer kan anvendes pålideligt til enkelt celle-billeddannelse, men på vævsniveau, kan ikke konkurrere godt med de grønne analover.
Der er tilsyneladende meget lidt valg af billedteknologi til eksperimenter i væv, hvor out-of-fokus lys bliver et kritisk problem. Konfokale system giver acceptabel enkelt celle opløsning ved annullering af out-of-fokus lys med ethvert mål på Na over 0,3 (for tilfælde af GCaMP6) eller 0,8 (trappable farvestof). I teknisk forstand kan et konventionelt Konfokal mikroskop anvendes til simultan billeddannelse af [ca2 +]Cyt fra hundredvis (gcamp) eller snesevis af Holme (trappable Dye). Det eneste realistiske alternativ til konfokale mode i tilfælde af 3D-ekspression af sensoren i væv er måske lysplade mikroskopi.
Tingene er lidt anderledes for tilfældet, når sensoren er udtrykt i det perifere lag af celler inden for ø-vævet. For lyse rekombinante sensorer, der har et levende intracellulært udtryks mønster, kan brug af en Wide-Field Imaging-tilstand med en lav-NA-målsætning give tilstrækkelig kvalitet og belønne forskeren med en betydelig stigning i synsfeltet område og dermed Overførselshastighed. Et bredt felt system giver dårligere rumlig opløsning, da ikke-fokus lyset ikke annulleres; Derfor er billedbehandlings vævet med høj-NA (lav dybde af felt) mål mindre informativ, da single-celle signalet er voldsomt forurenet af tilstødende celler. Forureningen er meget mindre for lav-NA (høj dybde af felt) mål.
Der er dog opgaver, hvor høj dataoverførselshastighed og/eller samplingsfrekvens bliver en kritisk fordel. α-og δ-celler udviser betydelig heterogenitet, hvilket skaber en efterspørgsel efter høje stikprøvestørrelser for at afsløre subpopulationernes bidrag. Wide-felt Imaging er hurtig og mere følsom, med en industriel skala store Field-of-View system Imaging hundredvis (gcamp) eller TENS (Fluo4) af Holme ved samme signal-støj-forhold som de konfokale eksperimenter på ti eller en enkelt ø, hhv. Denne forskel i gennemløb gør det brede felt system fordelagtigt for befolkningsmæssige Imaging med en enkelt celle opløsning, som kan være særligt kritisk for små subpopulationer som δ-celle en. På samme måde vil forsøg på at rekonstruere elektrisk aktivitet fra ca2 + spiking17 drage fordel af den højere samplingfrekvens, der leveres af en Wide-Field Imaging-tilstand. På samme tid, flere "niche" problemer som aktiviteten af bugspytkirtel α-celler ved stimulering af den dominerende β-celle subpopulation, kræver brug af en konfokale system. En faktor, der påvirker beslutningen mod konfokale mode er tilstedeværelsen af betydelige kontaminerende signal fra β-celle subpopulation.
Selv om du bruger hormon-specifik antistof farvning til at kontrollere identiteten af cellerne efter billeddannelse eksperimenter er stadig en mulighed, kan mindre celle delpopulationer identificeres ved hjælp af funktionelle markør forbindelser, såsom adrenalin og ghrelin, der blev vist at selektivt stimulere ca2 + dynamik i α-18 og δ-celler19,20, hhv.
Analysen af tidsforskudt billeddata har til formål at give oplysninger ud over triviel farmakologi, såsom populationelle heterogenitet, korrelation og interaktion mellem forskellige signaler. Konventionelt, imaging data analyseres som intensitet vs. tid og normaliseret til den oprindelige fluorescens (F/F0). Der er ofte behov for korrektion ved baseline på grund af blegning af fluoroforet-signalet eller kontaminering ved ændringer i autofluorescens eller ph (typisk induceret af millimolære niveauer af glucose12). Ca2 + data kan analyseres på mange forskellige måder, men tre vigtigste tendenser er at måle ændringer i Spike frekvens, plateau fraktion, eller område under kurven, beregnet vs. tid. Vi fandt den sidstnævnte fremgangsmåde fordelagtig, især i anvendelse på stærkt under samplede konfokale data. Fordelen ved pAUC metrisk er dens følsomhed over for både ændringer i signal frekvens og amplitude, hvorimod beregning af frekvensen kræver et betydeligt antal oscillationer21, hvilket er svært at opnå ved hjælp af konventionel billeddannelse. Den begrænsende faktor for pAUC analyse er dens høje følsomhed over for baseline ændringer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder, der er beskrevet her, er udviklet i overensstemmelse med Det Forenede Kongeriges lov (videnskabelige procedurer) Act (1986) og University of Oxford etiske retningslinjer.
1. Isoler mus bugspytkirtel Holme
- Forbered dyrkningsmediet og isolations opløsningen.
- Udgør dyrkningsmediet: RMPI1640 (Se tabel over materialer), suppleret med 10% af føtal kalv serum, 100 enheder/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin. Udlad mediet til 2 60 mm plastik Petri skåle (ikke behandlet med klæbemiddel), og opbevar skålene i inkubator (37 °C, 5% CO2, absolut fugtighed).
- Opløsningen isoleres (50 mL/mus): Hanks medium med 5 mM glucose, 100 enheder/mL penicillin 100 μg/mL streptomycin. Opbevares på is (4 °C).
- Opløsningen af enzymet (f. eks. Liberase): 0,2 mg/mL i isolations opløsningen, 2 mL pr. mus. Opbevares på is (4 °C). Valgfrit, pre-test aktiviteten af liberase, og optimere inkubations parametrene for hver batch af enzymet22.
- Injicer enzymopløsningen i muse galde kanalen.
- Ofrer musen (12-ugers gammel kvinde, C57Bl/6J) via livmoderhals dislokation.
- Under en dissektion mikroskop, skåret åbne huden og muskellag ved hjælp af fine saks og lokalisere galde kanalen.
- Ligate tarmen på begge sider af krydset med galde kanalen, ved hjælp af en bomuldstråd.
- Løft galde kanalen forsigtigt med buede fine urmager pincet og introducere den iskold enzym opløsning i kanalen ved hjælp af en 2 mL sprøjte med en 30G nål. En inflation i bugspytkirtlen bør observeres på dette stadium.
- Saml den oppustet bugspytkirtel ved hjælp af en kombination af stump-nosed tommel pincet og fine urmager pincet i en 15 mL Falcon tube og holde det på is (4 °C). Tilsæt 1 mL enzymopløsningen til røret.
- Befri og indsamle bugspytkirtlen Holme fra bugspytkirtlen.
- Der inkubateres i bugspytkirtlen med enzymopløsningen i 16 minutter i et vandbad ved 37 °C. Blid rystelser kan bruges, men er ikke kritisk, forudsat at inflationen har været god.
- Stop fordøjelsen ved tilsætning af iskold isolations opløsning, op til 10 mL. Ryst forsigtigt fordøje: det bør falde i små stykker.
- Opsamningen skylles tre gange i 10 mL af isolations opløsningen, lad det stå 5 min ved 1 x g til sediment de befriede Holme, på is. Supernatanten Aspirér forsigtigt med en 10 mL serologisk pipette.
- Tilsæt kold RPMI til Digest (for at lave op til 10 mL).
- Brug plastik Petri skåle (trin 1.1.1) til at vælge ølets. Decant RMPI medium fra en af de Petri skåle, og forsigtigt hælde nogle (4-5 mL) af Digest i stedet. Saml de befriede Holme, der vises som runde, glatte og high-density stykker, med en P10 pipette i den anden Petri skål.
- Kultur Holme i inkubator (37 °c, 5% Co2, absolut fugtighed). Eksperimentet kan stoppes midlertidigt på dette stadie. Forlader Holme for 1-2 timer menes af nogle til at hjælpe med at inddrive fra den mekaniske stress under isolation.
2. Læg farvestoffet eller udtryk sensoren
- Forbered det opfanges farvestof.
- Alikvot (normalt 50 μg) af det opfanges farvestof (f. eks. fluo-4) opløses i DMSO til en lager koncentration på 2 mm. Tilsæt pluronsyre til en endelig koncentration på 1% (ved hjælp af en 20% bestand i DMSO), at forbedre solubilisering af farvestoffet.
- Alikvot farvestof i små PCR-rør (2 μL ind i hver). Farvestoffet kan opbevares frosset (-20 °C) i flere uger.
- Alternativt kan du tilberede den rekombinante sensor.
- Fordel sensoren (f. eks. adenovirale vektor kodning GCaMP6f) i 10 μL aliquoter og opbevares ved-80 °C.
- (Valgfrit) pre-test titer af viral bestand ved at inficere Holme (som nedenfor) ved hjælp af flere serielle fortyndinger, at afsløre den optimale koncentration for infektion.
Bemærk: rekombinante sensorer kodet af forskellige vektorer (lentivirus, BacMam, AAV) kræver en anden infektion protokol. Sørg for at tjekke dette med vektor udbyderen og optimere arbejdsforholdet for dine behov. Den "arbejdende" bestand af adenovirus kan opbevares ved-20 °C og frosset/optøet flere gange. Overdreven fryse-tø cykling reducerer den effektive titer af virussen.
- Klargør billedbehandlings opløsningen.
- Udgør opløsningen, mM: 140 NaCl, 4,6 KCl, 2,6 CaCl2, 1,2 mgcl2, 1 Nah2po4,5NaHCO3, 10 Hepes (pH 7,4, med NaOH).
- Der udgør en bestand af glucose (0,5 M) og Mannitol (0,5 M) i billedopløsningen. Bestanden kan opbevares i køleskab (4 °C) i flere uger.
- Læg det opfanges farvestof.
- Opløsningen af farvestoffet opløses ved at opløse 2 μL af farvestoffet i 600 μL af den billedopløsning, der indeholder 6 mM glucose. Opløsningen kan opvarmes eller vortexes at forbedre solubilization.
- Læg Holme isoleret i trin 1 i arbejdsopløsningen af farvestoffet. Indlæsningen kan ske ved hjælp af en multiwell plade eller en Petri skål. I sidstnævnte tilfælde placeres en 100 μL dråbe af arbejdsopløsningen på bunden af en ikke-klæbende Petri skål (35-eller 60 mm), og der afpipetteres 10-30-Holme i dråben.
- I tilfælde af forskellige grupper af Holme (f. eks. vild-type/knock-out), arrangere flere brønde og flere dråber, så belastningen kan gøres samtidigt.
- Inkuber Holme i farvestoffet arbejdsopløsning ved stuetemperatur i mørket i 70-90 minutter. Må ikke over-inkubere.
- Kontroller indlæsningen under fluorescens mikroskop; Holme bør få mild fluorescens, med nogle celler er lysere end resten. Afrunding af celler og nuklear lokalisering af farvestoffet er tegn på overbelastning.
- Holme overføres til en farve fri billedbehandlings løsning, der indeholder 6 mm glucose. Holme kan bruges til Imaging med det samme, men valgfrit farvestof kan overlades til de-Esterify for en anden 10-15 minutter. Holme vil beholde farvestoffet i flere timer og kan derfor bruges til billeddannelse i flere Skift.
- Alternativt inficere Holme med den rekombinante vektor.
- Plade Holme i dråber i rpmi dyrkning medium (trin 1.1.1) (fx 30 μl), for at minimere mængden af vektor behov.
- Tilsæt vektoren i et forhold på ca. 105 infektiøse enheder/ø, der ideelt set bør resultere i en mangfoldighed af infektion > 2. Ideelt set bør forholdet optimeres til det minimale forhold, der ville give udtryk i det perifere lag. Prætitrering (trin 2.2.3) kan hjælpe.
- Introducere 20-50 Holme i dråbe og kultur i 8-48 timer. (Ideelt set natten over). Holme bør udvikle en svag grøn fluorescens i de fleste af cellerne, uden ændringer i cellernes morfologi.
Bemærk: succesen af infektionen og udtryk afhænger af tidspunktet for udsættelse for virus løsning. Ideelt, virussen bør forblive i løsningen natten over, men kan eventuelt fjernes efter så lidt som 15 minutter. Infektivitet, og derfor udtryk, vil sandsynligvis være dramatisk lavere.
3. Imaging ca2 + dynamik
- Immobiliserer Holme under (inverteret) mikroskop.
- Saml billed kammeret for inverteret mikroskopi. Placer glas dæksedlen (tykkelse 1 eller 1,5) inde i kammeret, og sørg for, at glas kammerets grænseflade er vandtæt. Kontrollér, at dæksedlen er inden for rækkevidden af mikroskopet (kritisk for et voluminøst High-NA-mål).
- Forbered immobilisering tilbehør. Skær små rektangler (20 mm x 20 mm) fra det fine mesh og det grove mesh. Introducere to spacer "vægge" på det fine mesh ved hjælp af en 45-50 μm tykt klæbrig tape. Brug dobbelte lag af spacer, hvis størrelsen af Holme to-be-imaged væsentligt overstiger den konventionelle 100 μm.
- Opsænk maskerne og vægten i billedopløsningen ved hjælp af en 35 mm Petri skål. Sørg for, at plastik og metal er våde.
- Under en dissektion mikroskopet, drej det fine mesh med spacer "vægge" på hovedet, afstandsholdere vender opad. Vælg flere Holme, der er fyldt med det opfanges farvestof, eller udtryk den rekombinante sensor med en P20-pipette, og Placer dem forsigtigt oven på det fine mesh mellem de to afstandsstykker. Sørg for, at masken og Spændeskiver ikke indeholder for store mængder af billedopløsningen på dem.
- Pick up mesh med Holme, ved hjælp af urmager pincet, og Placer den på hovedet inde i billed kammeret, således at Spacers ansigt nedad og sidde direkte på kammeret coverslip. Sørg for, at Holme er fanget mellem afstandsstykker og mesh, midt i dæksedlen.
- Placer den grove maske og vægten oven på det fine net i kammeret. Indfør billedopløsningen i kammeret. Sørg for, at øletterne er immobiliserede og klar til at blive imaged. Undgå overdreven omrystning af kammeret (små forstyrrelser som transporterer kammeret til mikroskopet og indsættelse i en opvarmet fase er acceptable).
Bemærk: en lignende immobilisering arrangement kan anvendes til en opretstående system.
- Konfigurer mikroskopet.
- Vælg billedtilstand og mål, Placer kammeret med Holme fra trin 3,1 på det temperaturstyrede trin af mikroskopet.
- Indstil temperaturstyringen (ideelt set mellem 30 °C og 36 °C) og perifusion. For et inverteret system, positionere indstrømningen lavere end udstrømningen i kammeret, og indstille udstrømning flux til at være større end den af tilstrømning (som typisk opnås ved hjælp af en slange af en bredere indre diameter på en peristaltisk pumpe).
- Sørg for, at udstrømningen har en minimal kontaktflade med opløsningen, så den fjerner opløsningen i flere sekventielle små dråber, så du undgår lange intervaller af kontinuerlig fjernelse af opløsningen. Sidstnævnte er den vigtigste kilde til artefakt i tidsforskudt billeddannelse af de periodiske signaler, da de optræder som regelmæssige periodiske intensitets svingninger i hver afbildet pixel og ofte tolkes som "langsomme bølger".
- Start perifusion med den billedopløsning, der indeholder 3 mM glucose.
- Vælg lysvej og filtre til billeddannelse af de grønne fluorophorer; excitation mellem 470 og 500 og emission mellem 505 og 550 ville arbejde for hver af dem.
- Kør Live imaging for at konfigurere billedbehandlings parametrene. Juster visningen for at fange Holme af interesse.
- Optimer signal-til-støj-forholdet i billedet. Til dette formål, justere excitation lysintensitet, eksponeringstid og Binning. Sørg for, at indstillingerne tillader en tydelig visualisering af hver celle i den lille ø ved den minimale mulige lysintensitet og eksponering.
- Udføre billed erhvervelse. Afhængigt af opgaven kan billeder tages ved 0,1 til 5 Hz. Dette er langt under Nyquist kriterier for de hurtige na+-drevne svingninger i α-og δ-celler (≫ 300 Hz), hvilket betyder, at dataene er undersamplet som standard. Det er dog ikke muligt at øge anskaffelses frekvensen, så den svarer til denne efterspørgsel, i multi-og multi-Islet Imaging med et stort synsfelt. Gcamp kan blive afbildet hurtigere, mens Fluo4 vil uundgåeligt blegemiddel under hurtige erhvervelse betingelser.
Bemærk: da [ca2 +]Cyt -svingninger i ø-cellerne drives af elektrisk aktivitet, kan det lyde kontraproduktivt at bruge lave anskaffelses hastigheder. I virkeligheden kan erhvervelses rater på omkring eller over 1 Hz være tilstrækkelige til at løse β-celle spiking adfærd13, mens tærsklen for påvisning af natrium kanal drevne svingninger i α-og δ-celler er langt over 300 Hz. Hvorvidt α-eller δ-celle [ca2 +]Cyt -svingningerne erhverves ved 1 Hz eller 0,1 Hz, vil de blive alvorligt undersamplet og afspejle ca2 + håndtering af cellen i stedet for elektrisk aktivitet.- Kontroller kvaliteten af de erhvervede data: ved 3 mM glucose skal α-celle aktivitet være klart synlig/detekterbar. Sørg for, at dette er tilfældet, og Fortsæt til fuld skala tidsforskudt billeddannelse.
- Vælg billedtilstand og mål, Placer kammeret med Holme fra trin 3,1 på det temperaturstyrede trin af mikroskopet.
- Tidsforskudt billedbehandling
- Gør brug af en online diagram af signal dynamik, implementeret i købet software, hvis dette er til rådighed. Hvis online kortlægning ikke er en mulighed, anvende en look-up-tabel, der viser signal intensiteten på den mest omfattende måde (såsom "Rainbow").
- Anvende stimuli i en reversibel måde: registrere inddrivelse af signalet til basal niveau. Ignorer artefakterne i starten og slutningen af optagelsen; sidstnævnte kan ligne irreversibel "stigning"/"fald" af sonde fluorescens på grund af ændringer i pH eller celledød.
- Skelne α-celler ved oscillerende ca2 + dynamik, ved lavt glukose. Introducere adrenalin eller glutamat i badet løsning, reversibelt for 2-5 min. En hurtig hoppe i [ca2 +]Cyt efterfulgt af en langsom-ned eller annullering af svingningerne vil følge.
Bemærk: adrenalin er en anerkendt markør forbindelse for α-celler, der har en selektiv positiv effekt på denne delpopulation af ø-celler, medieret af frigivelsen af ca2 + fra intracellulære depoter18. Glutamat er blevet sat frem som en anden α-celle specifik agonist23. - Tilføj/Fjern Ghrelin, som for nylig er blevet rapporteret til at aktivere δ-Cell selektivt19,20. Observere en hurtig reversibel stigning i [ca2 +]Cyt i en lille delpopulation af ø-celler.
- Tilsæt/Fjern 20 mM glukose. Overhold en koordineret oscillatorisk respons i β-cellernes subpopulation. Bemærk reaktionen af celler, der tidligere er blevet aktiveret af adrenalin eller glutamat og ghrelin.
- Gem billedsekvensen. Overvej at bruge "AutoSave" under optagelsen.
4. analyse af data
- Analysér tidsforskudt billede.
- Importer tidsforskudt billede til en billedanalyse software, såsom en open source ImageJ/FIJI.
- Hvis der er sket væsentlig/hurtig bevægelse under optagelsen, skal du kassere dataene som ikke kan repareres. Brug StackReg eller TurboReg plugins24 til at korrigere mindre driver.
- Opret et maske billede til celle registrering og tilknytning af interesseområde (ROI). Den foretrukne måde at opnå dette ville være at gøre en stak billede ved hjælp af en af de funktioner, såsom "gennemsnitlig intensitet" eller "maksimal intensitet". Den funktion, der skal anvendes, er den, som vil give den bedste anerkendelse af individuelle celler.
- Tærskel maske billedet, fjerne alle data uden for den ø-region. Funktionen fungerer i automatisk tilstand for 32-bit-billeder.
- Detektér Maxima i tærskel billedet. Den Maxima kan repræsenteres af punkter, regioner eller endda sektorer, hvis billedet er tæt.
- Anvend funktionen ' Find Maxima ' uden størrelsesbegrænsninger, og Indsæt den detekterede Maxima i den region af interesse (ROI) editor.
- Glat/interpolere hver af ROIs kortlagt; muligvis, ROIs vil kræve ekspansion. En simpel skrift kan skrevet nemlig (4.1.6-4.1.8) og opstille adskillige gange hen til levere bedst celle opdagelse resultater. Flere ROIs kan overlappe, men det er sjældent.
- Analysér placeringen af ROIs, og indsæt de respektive X-og Y-data i den elektroniske tabel software (f. eks.
- Analysér den grå intensitet vs. tid for alle ROIs og Indsæt data i den elektroniske tabel software.
- Analysér de numeriske data.
- Importer dataene til dataanalyse softwaren. Afhængigt af valget af softwaren og varigheden/prøveudtagningen/størrelsen af forsøget, kan dette være en simpel copy-paste operation eller en standalone procedure. Sørg for at arrangere og opbevare de numeriske data.
- Importer tidsstempler eller tids noter, hvis de er tilgængelige.
- Normalisere de rå fluorescens intensitets data ("F") til den oprindelige værdi af fluorescens ("F0"). Dette behøver ikke at være fluorescens i det allerførste punkt, men kunne være gennemsnittet af flere første punkter. Normaliseringen bør reducere variabiliteten af dataene og i et ideelt tilfælde (ingen drivende baseline) resultere i et analyserbart datasæt ("F/F0").
- Hvis celle-til-celle variabiliteten i F/F0 -datasættet stadig er betydeligt (lang optagelse, blegning), skal du udføre den oprindelige korrektion. Med henblik herpå defineres en "kontrol region", nemlig det tidsrum, hvori kontrol opløsningen (for musens pancreas-Holme, 3 mM glucose uden agonister/antagonister) blev anvendt.
- Hvis kontrolområdet har et klart ikke-oscillatorisk signal, antages det, at F/F0 vendte tilbage til startværdien (F/f0= 1) efter hver anvendelse af kontrol opløsningen. Ret timelapse-dataene for hver celle ved at opdele dataene i segmenter, adskilt af de punkter, hvor kontrol løsningen blev tilføjet, og anvende lineær korrektion på hvert segment. Brug ikke polynomiel eller anden ikke-lineær korrektion, da dette resulterer i artefakter.
- Hvis kontrolområdet har klare svingninger eller yderligere faktorer (som f. eks. FAD-autofluorescens) er til stede, skal du bruge en spids detekterings algoritme17. En triviel og hurtig løbe-around for det er en Maxima-følsom Wavelet transformation (figur 3a).
- Kvantificere dataene. Selvom ca2 + er et meget dynamisk signal, er det almindeligt acceptabelt at præsentere ca2 +- data i form af absolutte f/f0 -værdier i biomedicinsk litteratur. Hvis det er nødvendigt at sammenlignes med resultaterne fra flere eksperimenter, skal du vælge en Metric.
- Målefrekvensen af ca2 + pigge (figur 4A, D), og dens respons på tilsætning af (ANT) agonister. Til dette formål opdeles optagelsen i lige tidsintervaller og beregner forløbet af delfrekvensen (spiking frekvens i hver af intervallerne) ved at tælle pigge inden for intervallet og normalisere til intervallet varighed.
- Alternativt kan du indstille tærsklen og beregne plateau fraktionen (PF) for hver af de intervaller, der er defineret ovenfor (figur 4B, F). Brøken angiver den procentdel af tiden inden for det interval, som cellen brugte i tilstanden "spændt".
- Alternativt kan du beregne det delvise område under kurven (pAUC) for hver af de intervaller, der er defineret ovenfor (figur 4C, G). Denne måling er følsom over for ændringer i både frekvens og amplitude af spiking.
Bemærk: en advarsel til måling af frekvens er dens manglende følsomhed for Spike varighed og dårlig stabilitet. Da dataene er stærkt undersamplet vs. den elektriske spiking, antallet af pigge pr interval er ganske lille og dermed en eneste ekstra Spike kan dramatisk påvirke resultatet. Den ' flaskehalsen ' af pAUC er dens følsomhed over for ændringer i den oprindelige plan. Selv om mindre tilbøjelige til artefakter og mere følsomme over for ændringer i [ca2 +]Cyt end frekvens, pauc ikke desto mindre er ikke meget informativ om karakteren af ca2 + dynamik. Plateau fraktion er en udvidelse af Open Sandsynligheds konceptet til hele celle systemet. Det er mindre robust end pAUC selv, på grund af sin afhængighed af tærskelværdien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Islets belastning ganske godt med de opfanges farvestoffer (figur 1A), medmindre lipid sammensætning afmembranener blevet påvirket (f. eks, ved kronisk eksponering for fedtsyrer). Den humane adenovirus type 5 (Ad5) vektor er også rettet mod alle ø-celler (figur 1B). Der kan opstå problemer, når mere end én rekombinant sensor udtrykkes i samme celle. Desuden er Holme typisk meget godt immobiliseret ved hjælp af teknologien beskrevet ovenfor, som giver enestående stabilitet og løsning adgang.
Ca2 + spiking i α-celler kan let påvises ved lave glukose niveauer (figur 2). Der er en høj celle-for-celle korrelation mellem aktiviteten ved lavt glucose og reaktionen på adrenalin og glutamat. Ghrelin aktiverer nogle adrenalin-Responsive celler (α-celler?) ved lavt glukose, men det har ingen effekt på ca2 + dynamik i de fleste af de celler, der aktiveres af lavt glukose (β-celler).
Når de analyseres i form af delvis hyppighed (figur 4A, C), adrenalin-eller Ghrelin-stimulerede celler viser en væsentlig stigning under alt-eller-ingenting betingelser. Det vil, en celle med lav basal aktivitet, der bliver aktiveret af adrenalin eller Ghrelin udviser en dramatisk stigning i denne måling. Men de overordnede ændringer mellem basal spiking og adrenalin effekten er meget subtile (figur 4A, C). I modsætning hertil er partiel AUC følsom over for de ændringer, der indføres af adrenalin i alle celler, selv når basal aktivitet er høj (figur 4B, D).
Figur 1: indlæsning af det opfanges farvestof og udtryk for den rekombinante sensor i Holme. Typiske mus Holme lastet med den opfanges Dye fluo-4 (A) eller udtrykker rekombinant sensor GCaMP6 i det perifere lag af celler (B) eller i det dybere lag (C). Polar Tracer sulforhodamin B (SRB, vist som hvid) er blevet udnyttet til at skitsere individuelle celler inden for hver ø25. D) repræsentativ kinetik på ca2 + som reaktion på glukose, som er registreret fra individuelle celler i den øø, som anvender Fluo4. Bemærk heterogeniteten inden for mindre cellepopulationer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: typisk ca2 + respons af ø-celler til forskellige stimuli. Typisk α-celle (A) og δ-celle (B) ca2 + dynamik, som reaktion på adrenalin, glutamat, Ghrelin, glucose. (C)-(d) varmekort over øcellernes respons, der viser adrenalin positive (c) og ghrelin-positive (d) subpopulationer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: korrektion ved baseline. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: analyse af tidsforskudt data. Analyse af ca2 + dynamikken i α-celler. Delvis hyppighed (A), plateau fraktion (B) og areal under kurven (C) af en α-celler [ca2 +]i Trace. Populational [ca2 +]i -data fra en musens pancreas-ø udtrykt som rå (f/f0) (D), delvis hyppighed (E), plateau fraktion (f) og areal under kurven (G). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der er tre stadier i protokollen, der er afgørende for den samlede succes. Vellykket injektion af Liberase enzym i galdegangen bestemmer ikke blot den kvantitative succes af isolations proceduren, men også påvirker kvaliteten af de isolerede Holme. Unoppustet pancreata kan resultere i mangel på nogle vigtige metaboliske reaktioner i de isolerede Holme. For det andet, lastning af farvestof/udtrykket af sensoren definerer signal-til-støj forholdet af time-lapse optagelse. Signaler er fraværende eller svækket i overbelastede Holme. Endelig er en vellykket og tæt positionering af vævet inde i billed kammeret et afgørende øjeblik for meningsfulde og analyserbare eksperimenter. Dårligt placerede eller bevægende væv resulterer i spildt eksperimentel tid og/eller uklare data.
Metoden kan ændres, så der tages højde for flere signaler (ved hjælp af konfokale-systemet) og flere grupper af Holme (f. eks. af forskellige genotyper). Billeddannelse af flere signaler forudsætter, at der leveres en anden sensor til hver celle i den pågældende ø, der er spektralt kompatibel med ca2 + reporter (f. eks. en pH-sensor SNARF5f26,27). Til det formål kan Holme blive medindlæst/Co-inficeret med ca2 + og ph-sensorer, som derefter sekventielt afbildet inden for hver tidsramme.
Billedbehandling af signalet i grupper af Holme med en enkelt celle opløsning kræver brug af en bred Field-of-View-målsætning. Målet vil sandsynligvis have en lavere forstørrelse og numerisk blænde (NA), hvilket reducerer den rumlige opløsning. På grund af den øgede dybde-af-fokus af low-NA mål, kan Imaging udføres på et bredt felt system. Ulemperne ved dette arrangement er celle-celle krydskontaminering af lyssignalet og reduceret evne til at afbilde 3D-signalet (f. eks. mus, der udtrykker ca2 + sensoren under insulin promotorerne). På samme tid kan signalet fra overfladen ø-celler løses perfekt med høj tidsmæssig opløsning fra grupper, herunder snesevis til hundredvis af Holme18.
Selv om det kan lyde ubehageligt, men udfører billedanalyse og numerisk dataanalyse i separate softwarepakker er en god idé. På nuværende tidspunkt dominerer ImageJ/FIJI den videnskabelige billedanalyse. De mest populære miljøer til videnskabelig kodning er Python og MATLAB, men der er også en kendt indsats for at analysere ca2 + data i R28. Bedste brugervenlighed leveres af flere Niche pakker som IgorPro. Vores valg er at prototype i MATLAB/Python og derefter implementere koden i IgorPro for ' pipeline ' brug. Tilpasning af signal analyse pakker til Elektrofysiologi (f. eks. Clampfit, Neuroexplorer) til analytiske behov kan være nyttige for enkeltcellebilleddannelse, men det er vanskeligt at opskalere. Mange muligheder fra sådanne pakker er ikke gældende for Islet Imaging på grund af lav samplingfrekvens.
Det er vigtigt at huske på, at denne metode er begrænset af en række faktorer. For det første er billeddannelse, som nævnt ovenfor, i vid udstrækning baseret på undersampling af dataene, hvilket betyder, at det ikke indikerer og derfor ikke kan sammenlignes direkte med cellens elektriske aktivitet. For det andet kommer dataene fra øområderne og afspejler ikke vigtige koblingsprocesser, der generelt set er tredimensionale. For det tredje påvirker indlæsnings-/udtryks niveauet opfattelsen af sensor intensiteten. Endelig kan aktivering af mindre veldokumenterede delpopulationer af øceller (f. eks. PP-celler & ε-cells) af markerings forbindelserne ikke udelukkes, men på grund af det lave antal af disse celler inden for øen vil enhver potentiel kontaminering være minimal.
Metoden er en sand "mester" med hensyn til visuel effekt, da de oscillatoriske processer giver et stærkt indtryk af et ægte levende væv. Anvendes på mindre celle subpopulationer, metoden soner funktionen af hver enkelt pålideligt, gør det muligt at identificere undergrupper og afspejler heterogenitet.
Calcium dynamik er blevet undersøgt i bugspytkirtel β-celler i over 40 år, for det meste drevet af fremskridtene inden for erhvervelse/opdagelse teknologi. Tidlige undersøgelser anvendte atomabsorptionsspektroskopi29, men det var ikke før ankomsten af fluorescerendeca 2 + sensorer30 at detaljerede kinetik kunne løses i individuelle ø-celler, ved hjælp af fotometri31,32,33. Kort efter blev den rumlige komponent af ca2 + kinetik forbedret som ca2 + Imaging34,35,36 blev en rutinemæssig teknologi, takket være de dengang nyligt tilgængelige Charge-koblede Device (CCD) detektorer. Problemet med out-of-fokus lys, der hæmmet Imaging signalet fra individuelle celler i vævet, blev derefter løst i midten af 1990 ' erne via Laserscanning confokal mikroskopi (lscm)37 og samlede interne refleksion Fluorescens mikroskopi (tirfm)38. Begge metoder, suppleret med ankomsten af en ny generation af fluorescerende ca2 + sensorer overgearet med en 488 nm laser, er blevet anvendt med succes til at billede ca2 + dynamik i øcellen subpopulationer39,40,41.
Det nye århundrede frembragte to nye tendenser, der stammede fra Neuro videnskabeligt relaterede teknologiske udviklinger. For det første, rekombinant fluorescerende sensorer baseret på cirkulær permutation af GFP varianter væsentligt øget signal-til-støj ratio for ca2 + detektion, effektivt at bringe undersøgelserne til niveauet for store cellepopulationer, hvor dynamikken i [ca2 +]Cyt i hver celle kunne løses. For det andet tillod brug af vævsspecifikke initiativtagere målretning af sensor ekspression til mindre delpopulationer.
Selv om det generelt menes at afspejle udviklingen inden for neurovidenskab, har undersøgelser på Islet ca2 + dynamik to vigtige forskelle. For det første, teknologisk, enhver in vivo billeddannelse af Islet signalering er mere kompleks end Imaging i hjernen på grund af den uforudsigelige anatomi af bugspytkirtlen og holme ' placering42. For det andet fremragende elektrisk kobling mellem de ø β-celler i det væsentlige gør Holme i elektrisk inaktive populationer viser en tilsyneladende perfekt alt-eller-intet svar på den høje glukose stimulus. Vi mener, at undersøgelser af [ca2 +]i kinetik i mindre øgrupper, såsom δ-celler, baseret på vævs specifik målretning, sandsynligvis vil udvide vores viden om deres farmakologi/fysiologi. Samtidig giver meget følsomme sonder mulighed for at udvide den statistiske effekt af sådanne målinger, idet de tegner sig for en ø-til-ø-variation og tillader billeddannelse af Holme fra forskellige grupper inden for et parallelt eksperiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
AH var en modtager af en Diabetes UK PhD Studentship, EV blev støttet af OXION-Wellcome Trust træningsprogram, AIT afholdt en Oxford biomedicinsk Forskningsråd postdoc stipendium.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40x/1.3 objective | |||
| Axiovert 200 microscope | |||
| emission | |||
| Excitation | |||
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F7524-500ML | |
| Fluo4 | Thermo Fisher (Life Technologies) | F14201 | |
| GCaMP6f, in (human type 5) adenoviral vector | Vector Biolabs | 1910 | |
| Hanks' solution | Thermo Fisher (GibCo, Life Technologies) | ||
| Liberase | Sigma-Aldrich | 5401020001 | |
| penicillin/streptomycin | Thermo Fisher (GibCo, Life Technologies) | 15140122 | |
| RPMI medium | Thermo Fisher (GibCo, Life Technologies) | 61870044 | |
| Zeiss LSM510-META confocal system | Carl Zeiss |
References
- Elayat, A. A., el-Naggar, M. M., Tahir, M. An immunocytochemical and morphometric study of the rat pancreatic islets. Journal of Anatomy. 186, Pt 3 629 (1995).
- Cabrera, O., et al. The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (7), 2334-2339 (2006).
- Brereton, M. F., Vergari, E., Zhang, Q., Clark, A. Alpha-, delta-and PP-cells: are they the architectural cornerstones of islet structure and co-ordination. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 63 (8), 575-591 (2015).
- Færch, K., et al. Insulin resistance is accompanied by increased fasting glucagon and delayed glucagon suppression in individuals with normal and impaired glucose regulation. Diabetes. 65 (11), 3473-3481 (2016).
- Dabrowski, M., Tarasov, A., Ashcroft, F. M. Mapping the architecture of the ATP-binding site of the KATP channel subunit Kir6 2. The Journal of Physiology. 557 (2), 347-354 (2004).
- Liu, Y. J., Vieira, E., Gylfe, E. A store-operated mechanism determines the activity of the electrically excitable glucagon-secreting pancreatic alpha-cell. Cell Calcium. 35 (4), 357-365 (2004).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca 2+ probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137 (2001).
- Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (6), 3197-3202 (2001).
- Broussard, G. J., Liang, R., Tian, L. Monitoring activity in neural circuits with genetically encoded indicators. Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, 97 (2014).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Rodriguez, E. A., et al. The growing and glowing toolbox of fluorescent and photoactive proteins. Trends in Biochemical Sciences. 42 (2), 111-129 (2017).
- Tarasov, A. I., Rutter, G. A. Methods in enzymology. 542, Elsevier. 289-311 (2014).
- Tarasov, A. I., et al. Frequency-dependent mitochondrial Ca(2+) accumulation regulates ATP synthesis in pancreatic β cells. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 465 (4), 543-554 (2013).
- Smith, N. A., et al. Fluorescent Ca2+ indicators directly inhibit the Na, K-ATPase and disrupt cellular functions. Science Signal. 11 (515), 2039 (2018).
- Zhao, Y., et al. An expanded palette of genetically encoded Ca2+ indicators. Science. 333 (6051), 1888-1891 (2011).
- Dana, H., et al. Sensitive red protein calcium indicators for imaging neural activity. Elife. 5, 12727 (2016).
- Theis, L., et al. Benchmarking Spike Rate Inference in Population Calcium Imaging. Neuron. 90 (3), 471-482 (2016).
- Hamilton, A., et al. Adrenaline Stimulates Glucagon Secretion by Tpc2-Dependent Ca(2+) Mobilization From Acidic Stores in Pancreatic alpha-Cells. Diabetes. 67 (6), 1128-1139 (2018).
- Adriaenssens, A. E., et al. Transcriptomic profiling of pancreatic alpha, beta and delta cell populations identifies delta cells as a principal target for ghrelin in mouse islets. Diabetologia. 59 (10), 2156-2165 (2016).
- DiGruccio, M. R., et al. Comprehensive alpha, beta and delta cell transcriptomes reveal that ghrelin selectively activates delta cells and promotes somatostatin release from pancreatic islets. Molecular Metabolism. 5 (7), 449-458 (2016).
- Mourao, M., Satin, L., Schnell, S. Optimal experimental design to estimate statistically significant periods of oscillations in time course data. PloS One. 9 (4), 93826 (2014).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).
- Cabrera, O., et al. Glutamate is a positive autocrine signal for glucagon release. Cell Metabolism. 7 (6), 545-554 (2008).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
- Tarasov, A. I., et al. Monitoring real-time hormone release kinetics via high-content 3-D imaging of compensatory endocytosis. Lab on a Chip. 18 (18), 2838-2848 (2018).
- Knudsen, J. G., et al. Dysregulation of Glucagon Secretion by Hyperglycemia-Induced Sodium-Dependent Reduction of ATP Production. Cell Metabolism. , (2018).
- Adam, J., et al. Fumarate hydratase deletion in pancreatic β cells leads to progressive diabetes. Cell Reports. 20 (13), 3135-3148 (2017).
- Wills, Q. F., et al. Statistical approaches and software for clustering islet cell functional heterogeneity. Islets. 8 (2), 48-56 (2016).
- Berggren, P. O., Ostenson, C. G., Petersson, B., Hellman, B. Evidence for divergent glucose effects on calcium metabolism in pancreatic beta- and alpha 2-cells. Endocrinology. 105 (6), 1463-1468 (1979).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
- Longo, E. A., et al. Oscillations in cytosolic free Ca2+, oxygen consumption, and insulin secretion in glucose-stimulated rat pancreatic islets. The Journal of Biological Chemistry. 266 (14), 9314-9319 (1991).
- Johansson, H., Gylfe, E., Hellman, B. Cyclic AMP raises cytoplasmic calcium in pancreatic alpha 2-cells by mobilizing calcium incorporated in response to glucose. Cell Calcium. 10 (4), 205-211 (1989).
- Grapengiesser, E., Gylfe, E., Hellman, B. Three types of cytoplasmic Ca2+ oscillations in stimulated pancreatic β-cells. Archives of Biochemistry and Biophysics. 268 (1), 404-407 (1989).
- Okamoto, Y., et al. Role of cytosolic Ca2+ in impaired sensitivity to glucose of rat pancreatic islets exposed to high glucose in vitro. Diabetes. 41 (12), 1555-1561 (1992).
- Gilon, P., Henquin, J. C. Influence of membrane potential changes on cytoplasmic Ca2+ concentration in an electrically excitable cell, the insulin-secreting pancreatic B-cell. The Journal of Biological Chemistry. 267 (29), 20713-20720 (1992).
- Valdeolmillos, M., Nadal, A., Soria, B., Garcia-Sancho, J. Fluorescence digital image analysis of glucose-induced [Ca2+]i oscillations in mouse pancreatic islets of Langerhans. Diabetes. 42 (8), 1210-1214 (1993).
- Cheng, H., Lederer, W. J., Cannell, M. B. Calcium sparks: elementary events underlying excitation-contraction coupling in heart muscle. Science. 262 (5134), 740-744 (1993).
- Stout, A. L., Axelrod, D. Evanescent field excitation of fluorescence by epi-illumination microscopy. Applied Optics. 28 (24), 5237-5242 (1989).
- Stozer, A., Dolensek, J., Rupnik, M. S. Glucose-stimulated calcium dynamics in islets of Langerhans in acute mouse pancreas tissue slices. PloS One. 8 (1), 54638 (2013).
- Tian, G., Sandler, S., Gylfe, E., Tengholm, A. Glucose- and hormone-induced cAMP oscillations in alpha- and beta-cells within intact pancreatic islets. Diabetes. 60 (5), 1535-1543 (2011).
- Benninger, R. K., Zhang, M., Head, W. S., Satin, L. S., Piston, D. W. Gap junction coupling and calcium waves in the pancreatic islet. Biophysical Journal. 95 (11), 5048-5061 (2008).
- van Gurp, L., et al. Sequential intravital imaging reveals in vivo dynamics of pancreatic tissue transplanted under the kidney capsule in mice. Diabetologia. 59 (11), 2387-2392 (2016).
