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Biology

마우스 췌도 세포의 하위 집단에 있는 화상 진찰 칼슘 역학

Published: November 26, 2019 doi: 10.3791/59491
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 1,4,5
1Oxford Centre for Diabetes, Endocrinology and Metabolism, University of Oxford, 2Lund University Diabetes Centre, Unit of Molecular Metabolism, Clinical Research Centre, Malmö University HospitalMalmö, 3Institute of Neuroscience of Physiology, Department of Physiology, Metabolic Research Unit, University of Göteborg, 4Oxford National Institute for Health Research, Biomedical Research Centre, 5Life and Medical Sciences, University of Hertfordshire

Summary

여기에서, 우리는 췌도 세포와 같은 이기종 세포 집단에 있는 칼슘 역학을 화상 진찰 그리고 정량화하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 형광 기자는 그 때 고정화되고 심상되는, 그리고 형광 강렬의 역학의 세포 당 분석이 수행되는 작은 틀 내의 세포의 말초 층으로 전달됩니다.

Abstract

췌도 호르몬은 혈당 항상성을 조절합니다. 혈당의 변화는 세 가지 주요 호르몬의 분비를 유발하는 췌도 세포에서 세포칼슘의 진동을 유도합니다: 인슐린 (β 세포에서), 글루카곤 (α 세포) 및 소마토스타틴 (δ 세포). β 세포는 대부분의 아일렛 세포를 구성하고 전기적으로 서로 결합되어 하나의 단일 개체로서 포도당 자극에 반응합니다. 사소한 소집단, α 세포 및 δ 세포의 흥분성 (약 20 % (30 %)을 구성 4% (10%) 총 설치류1 (인간2)아일렛 세포 번호각각 예측하기 어렵고 따라서 특별한 관심사입니다.

칼슘 센서는 분리된 아일렛 내의 세포의 주변 층으로 전달됩니다. 섬 또는 작은 섬의 그룹은 그 때 형광 현미경을 사용하여 고정되고 화상화됩니다. 이미징 모드의 선택은 더 높은 처리량(광시야)과 더 나은 공간 해상도(공초점) 사이에서 선택됩니다. 종래, 레이저 스캐닝 공초점 현미경은 이미징 조직에 사용되며, 이는 인접한 세포 들 사이의 신호를 가장 잘 분리하는 것을 제공하기 때문에. β 세포의 지배적인 집단으로부터의 오염 신호가 최소화되는 경우, 광시야 시스템도 활용할 수 있다.

특정 자극에 반응하는 칼슘 역학이 기록되면, 데이터는 형광 강도 대 시간으로 수치 형태로 표현되고, 초기 형광및 기준선 보정으로 정규화되어, 표백에 연결된 효과를 제거하기 위해, 형광소. 곡선(pAUC) 아래의 스파이크 주파수 또는 부분 영역의 변화는 관찰된 효과를 정량화하기 위해 시간 대비 계산됩니다. pAUC는 더 민감하고 매우 강력한 반면 급증 주파수는 칼슘 증가의 메커니즘에 대한 자세한 정보를 제공합니다.

작은 세포 소집단은 아일렛 세포의 특정 집단에서 세포질 칼슘의 변화를 유도하는 아드레날린과 그렐린과 같은 마커 화합물에 대한 기능적 반응을 사용하여 식별될 수 있습니다.

Introduction

이 방법의 목적은 췌도 세포의 작은 소집단에서 세포질 칼슘 농도 ([Ca2+]cyt)의실시간 변화를 이미지화하는 것입니다. 이것은 이 세포에 있는 호르몬 분비를 지배하는 기계장치를 폭로하는 것을 허용합니다, 다른 세포 모형 사이 상호 이야기에 관하여 세부사항을 드러내고, 잠재적으로, 작은 쪽지 신호의 더 큰 그림으로 인구 차원을 소개합니다.

작은 섬은 여러 세포 유형으로 구성되어 있습니다. 더 잘 알려진 인슐린 분비 β 세포 외에, 혈액 포도당 조절에 또한 중요한 적어도 2개의 소집단이있습니다 3. α-세포 (그 주위 구성 17% 작은 연세포의) 혈액 포도 당이 너무 낮아질 때 글루카곤을 분비, 이는 간에서 창고에서 혈류로 포도당의 방출을위한 신호. 과도 한 글루카곤 수준 (hyperglucagonemia) 및 글루카곤 방출의 장애인 제어 동반 (그리고, 기술적으로, 에 기여할 수 있습니다) 장애인인슐린 감수성의 당뇨병 상태4. δ-세포 (약 2%) 포도당 상승에 반응하여 소마토스타틴을 분비합니다. 이러한 유비쿼터스 펩티드 호르몬은 아일렛 내α 세포 및 β 세포 부근에서 고농도로 존재할 가능성이 높으며, 이는 글루카곤 및 인슐린 분비 모두에 강한 Gi 수용체 매개 감쇠 효과를 갖는다.

α-세포 및 δ 세포는 그들의 가까운 혈통 친척, β 세포와 포도당 감지 기계의 큰 부분을 공유합니다. 모든 3개의 세포 모형은 ATP 에 민감한 K+ 채널을, 이 흥분성 세포의 혈장 막 전위를 통제하는 정교한 신진 대사 센서5를 갖추고 있습니다. 동시에, 인슐린의 분 비, 소마토 스타 틴과 글루카곤포도당에 의해 다르게 조절됩니다. 따라서 작은 소집단인 작은 소집단에서 Ca2+ 역학의 이미징은 따라서 혈당과 아일레 분비 출력 사이의 교차 토크에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

패치 클램프 전기 생리학을 사용하여 α- 및 δ 세포의 흥분성을 모니터링하는 초기 시도는 곧 단일 α- 및 δ 세포에서Ca2+의 이미징이 뒤따랐다. 이러한 실험에서 세포의 동일성항글루카곤 또는 항소마토스타틴 항체로 염색된 후세를 통해 세포의 동일을 검증하였다. 이러한 노력은 종종 아일렛 세포가 아일렛 내에서 단일 세포로서 매우 다르게 행동한다는 발견에 의해 방해되었습니다. β 세포가 작은 살레기 배열의 주요 후원자인 것처럼 보일 수 있지만 (그들의 강한 전기 결합의 기초가 되는 그들의 압도적인 대다수 때문에), 주요 불일치는, 놀랍게도, α 세포에서 찾아냈습니다. 본래 본래 의 본체 내에서, 이 세포는 단 하나 분산된 α 세포의 약 7%에 대해서만 사실인 낮은 포도당에서 지속적으로 지속적으로 활성화됩니다6. 따라서 본래 섬 내에서 α- 및 δ-세포의 활성을 보고하는 것은 생체 내 상태의 근사치를 나타내는 것으로 여겨진다.

일반적으로 α 세포 또는 δ 세포 하위 집단으로부터Ca2+ 역학을 보고하는 두 가지 방법이 있습니다: (i) 조직 특이적 프로모터를 통해 유전자 로 코딩된Ca2+ 센서를 발현하거나 (ii) 마커 화합물을 사용하여. 더 우아한 전자 접근은 실제 3D 화상 진찰의 실질적인 이점을 추가하고 따라서 작은 쪽안에 세포 분포의 공부합니다. 그러나 그대로 인간 본도 재료에 적용 할 수 없습니다. 또 다른 잠재적관심사는 프로모터의 '누설'이며, 특히 β-/α 세포 분화 또는 높은 포도당에 대한 α 세포 반응이 제자리에 있을 때이다. 후자의 접근법은 인간 샘플 또는 배양된 섬을 포함하는 신선하게 단리된 조직과 함께 사용될 수 있다. 그러나 이 데이터는 아일렛 구조를 변경하지 않고 더 깊은 층으로 염료/마커 분자를 전달하는 것이 쉽지 않은 것처럼, 아일렛 세포의 주변 층에서만 수집됩니다. 후자의 접근 법의 예기치 않은 장점은 광시야 이미징 모드와의 호환성으로, 실험을 확장하여 수십 또는 수백 개의 섬(즉, 수천에서 수만 개의 셀)을 동시에 이미징할 수 있다는 것입니다.

칼슘은 유전자 부호인 GCaMP7(또는 페리캠8)패밀리 센서를 사용하여 생체 내에서 이미지화되며, 이는 칼슘 결합 단백질 칼모둘린과 그 표적 서열에 융합된 원형 변광녹색 형광 단백질(GFP)의 변이체인 미오신 경전사슬 키나아제 의 M13 단편7,9. GCaMP는 나노 몰 Ca2 + 농도및 높은 2 광자 단면 범위에서 뛰어난 신호 대 잡음 비율을 가지고 있어 생체 내 작업10,11에이상적인 선택입니다. 재조합 센서를 사용하는 도전적인 측면은 세포로의 전달입니다. 이종발현은 바이러스 벡터 및 다시간 생체배구를 사용하여 세포 기능의 잠재적 탈분화 또는 악화에 관한 우려를 자주 제기한다. GCaMP를 표현하기 위해 미리 설계된 마우스 모델은 이 문제를 해결하지만 리드 타임을 크게 늘리고 작업을 비인간 모델로 제한하여 새로운 과제를 추가합니다. 세포내 pH의 변화에 대한 매우 높은 민감도는 단백질 기반센서(12)의또 다른 불리한 측면이며, 이는Ca2+와같은 진동 신호를 감지하는 데 문제가 적다.

트랩형 염료(예: 녹색 형광 Fluo4)의 장점은 약 1시간 이내에 새로 단리된 조직으로 적재할 수 있다는 것입니다. 예측할 수 있듯이, 트랩형 염료는 신호 대 잡음 비가 낮고 재조합 에 비해 광안정성이 훨씬 낮습니다. 13의 염료의 독성보고는 확인할 수없지만,염료 과부하가 빈번한 문제점이 있다.

원형 순열에 기초한 적색 재조합 Ca2+ 센서는 2011년15년이후 급속히 진화해 왔으며, 가장 최근의 발전은 적색광의 침투 깊이가 높은 조직 이미징을 위한 GCaMP16에 대한 강력한 경쟁을 제시합니다. 시판되는 적색 트랩포블 염료는 단세포 이미징에 안정적으로 사용될 수 있지만 조직 수준에서는 녹색 유사체와 잘 경쟁할 수 없습니다.

초점이 다른 빛이 중요한 문제가되는 조직에서 실험을위한 이미징 기술의 선택은 거의 없습니다. 공초점 시스템은 0.3(GCaMP6의 경우) 또는 0.8(트랩 가능한 염료)의 경우 NA에서 임의의 목표와 함께 초점이 벗어난 빛을 취소하여 허용 가능한 단일 셀 분해능을 제공한다. 기술적 의미에서, 기존의 공초점 현미경은 수백 (GCaMP) 또는 수십 개의 섬 (트랩 가능한 염료)에서[Ca2+]방사체의 동시 이미징에 사용될 수 있습니다. 조직에서 센서를 3D 로 표현하는 경우 공초점 모드에 대한 유일한 현실적인 대안은 아마도 가벼운 시트 현미경 검사법일 것입니다.

센서가 아일렛 조직 내의 세포의 주변 층에서 발현되는 경우 상황은 약간 다릅니다. 생생한 세포내 발현 패턴을 가진 밝은 재조합 센서의 경우, 낮은 NA 목표를 가진 광시야 이미징 모드를 사용하면 충분한 품질을 제공하고 시야영역이 크게 증가하여 연구자가 보상을 할 수 있습니다. 처리량. 광시야 시스템은 초점이 벗어난 조명이 취소되지 않기 때문에 더 낮은 공간 해상도를 제공합니다. 따라서, 높은 NA (낮은 피사계 심도) 목표를 가진 화상 진찰 조직은 단세포 신호가 이웃 세포에 의해 엄청나게 오염하기 때문에, 보다 적게 유익합니다. 저NA(높은 피사계 심도) 목표에 대해서는 오염이 훨씬 작습니다.

그러나 높은 처리량 및/또는 샘플링 속도가 중요한 이점이 되는 작업이 있습니다. α- 및 δ 세포는 상당한 이질성을 나타내며, 이는 하위 집단의 기여도를 밝히기 위해 높은 샘플 크기에 대한 수요를 생성합니다. 광시야 이미징은 10개 또는 단일 섬에 대한 공초점 실험과 동일한 신호 대 잡음 비로 수백(GCaMP) 또는 수십(Fluo4) 규모의 대규모 시야 시스템 이미징을 통해 빠르고 민감합니다. 처리량의 이러한 차이는 단일 셀 해상도를 가진 인구 이미징에 대한 광시야 시스템을 유리하게 만들며, 이는 δ 셀 과 같은 작은 하위 집단에 특히 중요할 수 있습니다. 마찬가지로 Ca2+ 스파이크17에서 전기 활동을 재구성하려는 시도는 광시야 이미징 모드에서 제공하는 더 높은 샘플링 속도의 이점을 누릴 수 있습니다. 동시에, 지배적인 β 세포 소집단의 자극시 췌장 α 세포의 활성과 같은 몇몇 "틈새" 문제는 공초점 시스템의 사용을 필요로 한다. 공초점 모드로의 결정에 영향을 미치는 요인은 β 세포 하위 집단으로부터 실질적인 오염 신호의 존재이다.

이미징 실험 후 세포의 정체성을 확인하기 위해 호르몬 특이적 항체 염색을 사용하더라도, 작은 세포 소집단은 α-18 및 δ-세포19,20에서Ca2+ 역학을 선택적으로 자극하는 것으로 나타난 아드레날린 및 그렐린과 같은 기능적 마커 화합물을 사용하여 식별될 수 있다.

타임랩스 이미징 데이터의 분석은 인구 이질성, 상관 관계 및 다른 신호의 상호 작용과 같은 사소한 약리학 을 넘어서는 정보를 제공하는 것을 목표로합니다. 종래, 이미징 데이터는 강도 대 시간으로 분석되고 초기 형광(F/F0)으로정규화된다. 기저선 보정은 자가형광 또는 pH의 변화에 의한 형광포 신호의 표백 또는 오염으로 인해 빈번하게 필요하다(전형적으로 포도당12의밀리몰 수준에 의해 유도된다). Ca2+ 데이터는 여러 가지 방법으로 분석할 수 있지만, 세 가지 주요 추세는 스파이크 주파수, 고원 분획 또는 곡선 아래의 영역의 변화를 측정하여 계산된 시간대 계산하는 것입니다. 특히 샘플링이 부족한 공초점 데이터에 대한 응용 분야에서 후자의 접근 방식이 유리하다는 것을 발견했습니다. pAUC 메트릭의 장점은 신호 주파수와 진폭의 변화에 대한 민감도이며, 주파수를 계산하려면 상당한 수의진동(21)이필요하며, 이는 기존의 이미징을 사용하여 달성하기 어렵다는 것입니다. pAUC 분석의 제한 요인은 기준선 변화에 대한 높은 민감도입니다.

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Protocol

여기에 설명된 모든 방법은 영국 동물(과학 절차) 법(1986)과 옥스포드 대학교 윤리 지침에 따라 개발되었습니다.

1. 마우스 췌장 섬을 격리

  1. 배양 배지 및 격리 솔루션을 준비합니다.
    1. 배양 배지를 구성합니다: RMPI1640 (재료 표참조), 태아 송아지 세럼 10%, 페니실린 100 단위/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신으로 보충. 매체를 60mm 플라스틱 페트리 접시 2개(접착제로 처리하지 않음)에 분배하고 인큐베이터(37°C, 5%CO2,절대 습도)에 보관합니다.
    2. 절연 용액 (50 mL / 마우스) 구성 : 5 mMM 포도당, 100 단위 / mL 페니실린 100 μg / mL 스트렙토 마이신행크의 배지. 얼음 (4 °C)에 보관하십시오.
    3. 효소 용액(예를 들어, Liberase): 분리 용액에서 0.2 mg/mL, 마우스 당 2 mL를 구성합니다. 얼음 (4 °C)에 보관하십시오. 선택적으로, 해방효소의 활성을 미리 시험하고,효소(22)의각 배치에 대한 인큐베이션 파라미터를 최적화한다.
  2. 효소 용액을 마우스 담관에 주입하십시오.
    1. 자궁 경부 탈구를 통해 마우스 (12 주 된 여성, C57Bl / 6J)를 희생하십시오.
    2. 해부 현미경에서 미세 한 가위를 사용하여 피부와 근육 층을 열고 담관을 찾습니다.
    3. 면실을 사용하여 담관접점 의 양쪽에 있는 장내를 리게이트합니다.
    4. 구부러진 고급 워치메이커의 집게로 담관을 부드럽게 들어 올리고 30G 바늘이 달린 2mL 주사기를 사용하여 얼음 차가운 효소 용액을 덕트에 넣습니다. 췌장의 인플레이션은이 단계에서 관찰되어야한다.
    5. 무딘 코가 있는 엄지 집게와 미세 워치메이커의 집게를 15mL 팔콘 튜브에 넣고 얼음(4°C)에 보관하여 팽창된 췌장을 모읍니다. 효소 용액 1 mL을 튜브에 넣습니다.
  3. 해방하고 췌장에서 췌장 섬을 수집합니다.
    1. 37 °C에서 수조에서 16 분 동안 효소 용액으로 팽창 된 췌장을 배양하십시오. 부드러운 흔들림은 사용할 수 있지만 인플레이션이 양호하다면 중요하지 않습니다.
    2. 최대 10 mL의 얼음 냉분리 용액을 첨가하여 소화를 중단하십시오. 부드럽게 다이제스트를 흔들어 : 그것은 작은 조각으로 떨어질 것입니다.
    3. 절연 용액의 10 mL에서 소화를 세 번 씻어 얼음에 해방 된 섬을 퇴적시키기 위해 1 x g에서 5 분 동안 방치하십시오. 10 mL 의 혈청피펫으로 상한체를 부드럽게 흡인합니다.
    4. 다이제스트에 차가운 RPMI를 추가합니다(최대 10mL).
    5. 플라스틱 페트리 접시(1.1.1단계)를 사용하여 작은 섬을 선택합니다. RMPI 배지를 페트리 접시 중 하나에서 꺼내고, 대신 다이제스트의 일부(4-5 mL)를 부드럽게 붓습니다. P10 피펫을 두 번째 페트리 접시에 넣고 둥글고 매끄럽고 고밀도로 보이는 해방된 섬을 수집합니다.
    6. 배양 섬인 인큐베이터(37°C, 5%CO2,절대 습도). 이 단계에서 실험을 일시 중지할 수 있습니다. 섬을 1-2 시간 동안 떠나는 것은 격리 중에 기계적 스트레스에서 회복하는 데 도움이되는 것으로 여겨져 있습니다.

2. 염료를 로드하거나 센서를 표현하십시오.

  1. 트랩 가능한 염료를 준비합니다.
    1. DMSO에서 트랩가능 염료(예를 들어, Fluo-4)의 aliquot(일반적으로 50 μg)를 2 mM의 재고 농도로 용해시킨다. 염료의 용해도를 개선하기 위해 1 %의 최종 농도 (DMSO의 20 % 재고 사용)에 플루 론산을 첨가하십시오.
    2. 작은 PCR 튜브에 염료를 알리쿼트 (각각 2 μL). 염료는 몇 주 동안 냉동(-20°C)으로 보관할 수 있다.
  2. 대안적으로, 재조합 센서를 준비한다.
    1. 센서(예: GCaMP6f를 코딩하는 아데노바이러스 벡터)를 10 μL aliquots에 분배하고 -80°C에 보관한다.
    2. (선택적으로) 여러 직렬 희석제를 사용하여 섬(아래와 같이)을 감염시켜 바이러스 성 스톡의 역가를 사전 테스트하여 감염에 대한 최적의 농도를 밝혀냅니다.
      참고: 상이한 벡터(렌티바이러스, BacMam, AAV)에 의해 인코딩된 재조합 센서는 상이한 감염 프로토콜을 필요로 한다. 벡터 공급자와 함께 이를 확인하고 필요에 따라 작업 비율을 최적화하십시오. 아데노바이러스의 "작동" 스톡은 -20°C에 저장되고 여러 번 동결/해동될 수 있다. 과도한 동결 해동 사이클링은 바이러스의 효과적인 적기를 감소시킵니다.
  3. 이미징 솔루션을 준비합니다.
    1. 이미징 용액, mM: 140 NaCl, 4.6 KCl, 2.6 CaCl2,1.2 MgCl2,1 NaH2PO4,5 NaHCO3,10 HEPES (pH 7.4, NaOH 포함).
    2. 이미징 용액에서 포도당 (0.5 M)과 만니톨 (0.5 M)의 주식을 구성합니다. 스톡은 몇 주 동안 냉장고(4°C)에 보관할 수 있다.
  4. 트랩 가능한 염료를 적재하십시오.
    1. 6 mM 포도당을 함유하는 이미징 용액의 600 μL에서 염료의 2 μL을 용해시킴으로써 염료 작업 용액을 구성한다. 용액은 용해성을 개선하기 위해 가열되거나 소용돌이될 수 있다.
    2. 1단계에서 분리된 섬을 염료의 작동 용액에 로드합니다. 적재는 멀티웰 플레이트 또는 페트리 접시를 사용하여 수행 할 수 있습니다. 후자의 경우, 비 접착제 페트리 접시 (35- 또는 60 mm)의 바닥에 작업 용액의 100 μL 방울을 놓고 파이펫 10-30 작은 섬을 물방울에 넣습니다.
    3. 다른 섬 그룹(예: 야생 형/녹아웃)의 경우, 여러 개의 우물과 여러 방울을 배치하여 적재를 동시에 수행할 수 있습니다.
    4. 70-90 분 동안 어둠 속에서 실온에서 염료 작업 용액에 섬을 배양. 과도하게 배양하지 마십시오.
    5. 형광 현미경 하에서 하중을 확인; 작은 섬은 온화한 형광을 얻어야 합니다, 몇몇 세포는 나머지 보다는 밝기 와. 세포의 반올림과 염료의 핵 국소화는 과부하의 징후입니다.
    6. 6 mM 포도당을 포함하는 염료 없는 화상 진찰 해결책으로 섬을 전송하십시오. 작은 섬은 즉시 화상 진찰을 위해 이용될 수 있습니다, 그러나 선택적으로 염료는 또 다른 10-15 분 동안 에스테르를 탈염하기 위하여 남겨질 수 있습니다. 섬은 몇 시간 동안 염료를 유지하므로 여러 교대에서 이미징에 사용할 수 있습니다.
  5. 대안적으로, 재조합 벡터로 섬을 감염시다.
    1. RPMI 배양 배지(step 1.1.1)(예를 들어, 30 μL)에서 액적내의 섬을 플레이트하여 필요한 벡터의 부피를 최소화한다.
    2. 이상적으로 감염의 복합성을 초래해야 약 105 감염 단위 / 아일렛의 비율로 벡터를 추가 >2. 이상적으로 는 비율은 주변 층에서 식을 제공하는 최소 비율로 최적화되어야 합니다. 사전 적정(단계 2.2.3)이 도움이 될 수 있습니다.
    3. 8-48 시간 동안 물방울과 문화에 20-50 개의 섬을 소개하십시오. (이상적으로, 하룻밤). 섬은 세포 형태에 있는 변경 없이, 세포의 대부분에 있는 희미한 녹색 형광을 개발해야 합니다.
      참고 : 감염 및 발현의 성공은 바이러스 솔루션에 노출되는 시간에 따라 달라집니다. 이상적으로, 바이러스는 하룻밤 솔루션에 남아 있어야하지만 선택적으로 15 분 후 제거 할 수 있습니다. 그러나, 감염성, 그러므로 표현은, 극적으로 더 낮을 확률이 높습니다.

3. 이미징 Ca2+ 다이내믹

  1. (반전) 현미경의 밑에 작은 섬을 고정시.
    1. 반전 된 현미경 검사법용 이미징 챔버를 조립하십시오. 유리 커버 슬립(두께 1 또는 1.5)을 챔버 내부에 배치하고 유리 챔버 인터페이스가 수밀되어 있는지 확인합니다. 커버슬립이 현미경 목표범위 내에 있는지 확인합니다(부피가 큰 높은 NA 목표의 경우 중요).
    2. 고정 액세서리를 준비합니다. 미세한 메쉬와 거친 메쉬에서 작은 사각형(20mm x 20mm)을 자른다. 45-50 μm 두께의 끈적끈적한 테이프를 사용하여 미세 한 메쉬에 두 개의 스페이서 "벽"을 소개합니다. 스페이서의 이중 층을 사용하면 작은 섬의 크기가 종래의 100 μm를 실질적으로 초과하는 경우 이미지화될 수 있다.
    3. 35mm 페트리 접시를 사용하여 메쉬와 무게를 이미징 솔루션에 담급감하십시오. 플라스틱과 금속이 젖은지 확인하십시오.
    4. 해부 현미경에서 스페이서 "벽"을 거꾸로 놓고 스페이서가 위쪽을 향하게하는 미세 한 메쉬를 돌립니다. 트랩 가능한 염료가 적재된 여러 개의 섬을 선택하거나 P20 파이펫으로 재조합 센서를 표현하고 두 스페이서 사이에 미세한 메쉬 위에 부드럽게 놓습니다. 메쉬와 와셔에 이미징 용액이 과도하게 포함되어 있지 않은지 확인합니다.
    5. 워치메이커의 집게를 사용하여 작은 섬으로 메쉬를 집어 들고 이미징 챔버 내부에 거꾸로 배치하여 스페이서가 아래쪽을 향하고 챔버 커버 슬립에 직접 앉을 수 있도록 합니다. 작은 섬이 커버 슬립의 중간에 스페이서와 메쉬 사이에 갇혀 있는지 확인합니다.
    6. 거친 메쉬와 무게를 챔버 내의 미세 메시 위에 배치합니다. 이미징 솔루션을 챔버에 도입합니다. 섬을 고정하고 이미지화할 준비가 되었는지 확인합니다. 챔버의 과도한 흔들림을 피하십시오 (챔버를 현미경으로 운반하고 가열 된 단계에 삽입하는 것과 같은 작은 교란이 허용됩니다).
      참고: 수직 시스템에도 유사한 고정 배열을 적용할 수 있습니다.
  2. 현미경을 설정합니다.
    1. 이미징 모드와 목적을 선택하고, 현미경의 온도 제어 단계에서 단계 3.1에서 섬과 챔버를 배치합니다.
      1. 온도 제어(이상적으로는 30°C에서 36°C 사이)와 회수를 설정합니다. 반전된 시스템의 경우, 챔버 내 유출보다 유입량을 낮게 배치하고 유출 플럭스가 유입량보다 큰 것으로 설정합니다(일반적으로 연동 펌프에서 더 넓은 내경의 튜브를 사용하여 달성됩니다).
      2. 유출이 솔루션과의 최소한의 접촉 면이 있는지 확인하여 연속 용액 제거의 긴 간격을 피하면서 여러 순차적 작은 물방울로 용액을 제거합니다. 후자는 모든 이미지 픽셀의 정기적 인 주기적 강도 진동으로 나타나고 자주 "느린 파도"로 해석되기 때문에 주기적 신호의 시간 경과 이미징의 주요 소스입니다.
      3. 3 mM 포도당을 포함하는 화상 진찰 해결책으로 회후를 시작합니다.
    2. 녹색 형광단의 이미징을위한 광 경로 및 필터를 선택; 470에서 500 사이 흥분과 505와 550 사이 방출은 그들 각각을 위해 작동할 것입니다.
    3. 라이브 이미징을 실행하여 이미징 매개 변수를 설정합니다. 관심 있는 섬을 캡처하려면 뷰를 조정합니다.
    4. 이미지의 신호 대 잡음 비율을 최적화합니다. 이를 위해 여기 광 강도, 노출 시간 및 비닝을 조정합니다. 설정이 가능한 최소한의 광 강도 및 노출로 작은 작은 도미 내에서 각 셀의 뚜렷한 시각화를 허용하는지 확인합니다.
    5. 이미지 수집을 수행합니다. 작업에 따라 0.1~5Hz에서 이미지를 촬영할 수 있습니다. 이는 α- 및 δ 셀(>300 Hz)의 빠른 Na+구동 진동에 대한 나이퀴스트 기준보다 훨씬 낮으며, 이는 데이터가 기본적으로 샘플링되지 않는다는 것을 의미합니다. 그러나 이러한 요구에 맞게 수집 빈도를 늘리는 것은 넓은 시야를 가진 다세포/다중 아일렛 이미징에서는 불가능합니다. GCaMP는 더 빠르게 이미지화할 수 있는 반면, Fluo4는 빠른 수집 조건에서 불가피한 표백제를 제공합니다.
      참고: 아일렛 셀의 [Ca2+]사이트 진동이 전기 적 활동에 의해 구동된다는 점을 감안할 때, 낮은 획득 률을 사용하면 비생산적으로 들릴 수 있습니다. 그러나 실제로는 1Hz 전후 또는 그 이상의 획득률이 β 세포 스위킹거동(13)을해결하기에 충분할 수 있지만 α-및 δ-셀에서 나트륨 채널 구동 진동의 검출 임계값은 300Hz를 훨씬 초과합니다. α- 또는 δ 셀[Ca2+]사이트 진동이 1Hz 또는 0.1 Hz에서 획득되든, 그들은 심각하게 샘플링되고 전기 적 활성보다는 셀에 의한Ca2+ 처리를 반영합니다.
      1. 획득 한 데이터의 품질을 확인하십시오 : 3 mM 포도당에서 α 세포 활성은 명확하게 표시 / 감지 가능해야합니다. 이러한 경우인지 확인하고 본격적인 타임랩스 이미징을 진행합니다.
  3. 타임랩스 이미징
    1. 이 사용 가능한 경우 수집 소프트웨어에 구현 된 신호 역학의 온라인 차트를 사용합니다. 온라인 차트가 옵션이 아닌 경우 가장 포괄적인 방법(예: "무지개")으로 신호 강도를 표시하는 조회 테이블을 적용합니다.
    2. 가역적 인 방식으로 자극을 적용 : 기저 수준으로 신호의 회복을 기록합니다. 레코딩의 시작과 끝에 있는 아티팩트를 무시합니다. 후자는 pH 또는 세포 사멸의 변화로 인해 프로브 형광의 돌이킬 수없는 "증가"/ "감소"처럼 보일 수 있습니다.
    3. 낮은 포도당에서 진동Ca2+ 역학으로 α 세포를 분화합니다. 아드레날린이나 글루타민산염을 목욕 용액에 2-5 분 동안 가역적으로 넣습니다. [Ca2+]cyt의 빠른 점프와 진동의 감속 또는 취소가 뒤따릅니다.
      참고: 아드레날린은 α 세포에 대한 인식된 마커 화합물이며, 이는 세포 내 창고18에서Ca2+의 방출에 의해 매개되는 이 아일렛 세포의 하위 집단에 선택적 양성 효과를 갖는다. 글루타민산염은 또 다른 α 세포 특이적작용제(23)로서내놓어왔다.
    4. 추가/제거 ghrelin, 최근 보고 된 δ 세포를 활성화 선택적으로19,20. 작은 아일렛 세포에서[Ca2+]방신기의 급속한 가역적 증가를 관찰하십시오.
    5. 20 mM 포도당을 추가 /제거하십시오. β 세포 하위 모집단에서 조정된 진동 반응을 관찰합니다. 이전에 아드레날린 또는 조미료와 그렐린에 의해 활성화 된 세포의 반응을 참고.
    6. 이미지 시퀀스를 저장합니다. 녹화 중에 "자동 저장"을 사용하는 것이 좋습니다.

4. 데이터 분석

  1. 타임랩스 이미지를 분석합니다.
    1. 타임랩스 이미지를 오픈 소스 ImageJ/FIJI와 같은 이미지 분석 소프트웨어로 가져옵니다.
    2. 기록 중에 상당한/빠른 이동이 발생한 경우 데이터를 복구할 수 없는 것으로 폐기하십시오. StackReg 또는 TurboReg 플러그인24를 사용하여 사소한 드리프트를 수정하십시오.
    3. 셀 감지 및 ROI(관심 지역) 매핑을 위한 마스크 이미지를 만듭니다. 이를 달성하는 가장 바람직한 방법은 "평균 강도" 또는 "최대 강도"와 같은 함수 중 하나를 사용하여 스택 이미지를 만드는 것입니다. 사용할 기능은 개별 셀의 최상의 인식을 제공하는 기능입니다.
    4. 마스크 이미지를 임계값으로 하고, 아일렛 영역 외부의 모든 데이터를 제거합니다. 이 기능은 32비트 이미지의 자동 모드에서 작동합니다.
    5. 임계값 이미지에서 최대값을 감지합니다. 이미지가 조밀한 경우 최대값은 점, 영역 또는 섹터로 나타낼 수 있습니다.
    6. 크기 제한 없이 '최대 값 찾기' 기능을 적용하고 감지된 최대를 관심 영역(ROI) 편집기에 붙여넣습니다.
    7. 매핑된 각 ROI를 매끄럽게/보간합니다. ROI는 확장이 필요할 수 있습니다. 간단한 스크립트(4.1.6-4.1.8)를 작성하고 여러 번 실행하여 최상의 셀 검색 결과를 제공할 수 있습니다. 여러 ROI가 겹칠 수 있지만 드문 경우입니다.
    8. ROI의 위치를 분석하고 전자 테이블 소프트웨어(예: Microsoft Excel)에 각각의 X 및 Y 데이터를 붙여넣습니다.
    9. 모든 ROI에 대한 회색 강도 대 시간을 분석하고 전자 테이블 소프트웨어에 데이터를 붙여 넣습니다.
  2. 숫자 데이터를 분석합니다.
    1. 데이터를 데이터 분석 소프트웨어로 가져옵니다. 소프트웨어 의 선택과 실험의 기간 / 샘플링 / 크기에 따라 간단한 복사 - 붙여 넣기 작업 또는 독립 실행 형 절차일 수 있습니다. 수치 데이터의 배열 과 저장을 확인합니다.
    2. 사용 가능한 경우 타임스탬프 또는 타임 노트를 가져옵니다.
    3. 원시 형광 강도 데이터("F")를 형광의 초기 값("F0")으로 정규화합니다. 이것은 첫 번째 지점에서 형광일 필요는 없지만 여러 첫 번째 점의 평균일 수 있습니다. 정규화는 데이터의 가변성을 줄이고 이상적인 경우(드리프트 기준선 없음) 분석 가능한 데이터 집합("F/F0")을생성합니다.
    4. F/F0 데이터 세트의 셀 간 변동성이 여전히 상당한 경우(긴 기록, 표백) 기준선 보정을 수행합니다. 이를 위해, '대조군' 영역, 즉 대조판용액(마우스 췌장 섬, 작용제/길항제 없이 3 mMM 포도당)이 적용된 시간의 범위를 정의한다.
      1. 제어 영역에 명확한 비진동 신호가 있는 경우 F/F0이 제어 솔루션의 각 적용 후 초기 값(F/F0=1)으로 반환되었다고 가정합니다. 제어 솔루션이 추가될 때 점으로 구분하고 각 세그먼트에 선형 보정을 적용하여 데이터를 세그먼트로 분할하여 각 셀에 대한 시간 경과 데이터를 수정합니다. 다항식 또는 기타 비선형 보정을 사용하면 아티팩트가 생성됩니다.
      2. 제어 범위에 명확한 진동이 있거나 추가 인자(예: FAD 자가형광)가 존재하는 경우 스파이크 감지 알고리즘17을사용하십시오. 그에 대한 사소하고 빠른 실행 주위에 는 최대 에 민감한 웨이브 렛 변환(그림 3A).
    5. 데이터를 정량화합니다. Ca2+는 매우 동적인 신호이지만 절대 F/F0 값측면에서 Ca2+ 데이터를 제시하는 것은 생물 의학 문헌에서 널리 허용됩니다. 여러 실험의 결과를 비교해야 하는 경우 메트릭을 선택합니다.
      1. Ca2+ 스파이크의 빈도를 측정(그림 4A, D),그리고 (개미) 작용제의 추가에 대한 응답. 이를 위해 레코딩을 동일한 시간 간격으로 분할하고 간격 내의 스파이크를 계산하고 간격 지속 시간으로 정규화하여 부분 주파수(각 간격의 스파이크 주파수)의 시간 흐름을 계산합니다.
      2. 대안적으로, 임계값을 설정하고 위에 정의된 각 간격에 대해 고원 분수(pf)를 계산한다(도4B,F). 분수는 셀이 "흥분된" 상태에서 소비한 간격 내의 시간 백분율을 나타냅니다.
      3. 또는 위에 정의된 각 간격에 대해 곡선(pAUC) 아래의 부분 영역을 계산합니다(그림4C,G). 이 메트릭은 급증 빈도와 진폭의 변화에 민감합니다.
        참고: 주파수 측정시 주의해야 할 점은 스파이크 지속 시간에 대한 민감도가 부족하고 안정성이 좋지 못하다는 점입니다. 데이터가 전기 스파이크와 크게 언더샘플링되므로 간격당 스파이크 수가 매우 적기 때문에 단독 추가 스파이크가 결과에 큰 영향을 줄 수 있습니다. pAUC의 '병목 현상'은 기준선의 변화에 대한 민감도입니다. 비록 아티팩트에 덜 수그리고 주파수보다 [Ca2+]cyt의 변화에 더 민감하지만, pAUC는 그럼에도 불구하고Ca2+ 역학의 특성에 대해 매우 유익하지 않습니다. 고원 분획은 전체 세포 시스템으로의 개방 확률 개념의 확장이다. 임계값에 대한 의존성으로 인해 pAUC보다 덜 강력합니다.

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Representative Results

아일렛은 막의 지질 조성이 영향을 받지 않는 한(예: 지방산에 대한 만성 노출에 의해) 트랩 가능한 염료(그림1A)와상당히 잘 로드됩니다. 인간 아데노바이러스 타입-5(Ad5) 벡터는 또한 모든 섬 세포를 표적으로한다(도 1B). 하나 이상의 재조합 센서가 동일한 셀에서 발현될 때 문제가 발생할 수 있습니다. 또한, 섬은 일반적으로 매우 잘 뛰어난 안정성과 솔루션 액세스를 제공하는 위에서 설명한 기술을 사용하여 고정된다.

α 세포에서의Ca2+ 스파이크는 낮은 포도당 수준에서 쉽게 검출될 수있다(그림 2). 낮은 포도당에서활동과 아드레날린과 글루타민산염에 대한 반응 사이의 높은 세포별 상관관계가 있다. 그렐린은 낮은 포도당에서 아드레날린 반응 세포 (α 세포?)를 활성화하지만 낮은 포도당 (β 세포)에 의해 활성화되는 대부분의 세포에서 Ca2 + 역학에 영향을 미치지 않습니다.

부분 주파수의 관점에서 분석할 때(그림 4A, C),아드레날린- 또는 그렐린 자극 세포는 전부 또는 전혀 조건 하에서 상당한 증가를 표시한다. 즉, 아드레날린 또는 그렐린에 의해 활성화되는 낮은 기저 활성을 가진 세포는이 메트릭에서 극적인 증가를 나타낸다. 그러나, 기저 스파이크와 아드레날린 효과 사이의 전반적인 변화는 매우 미묘하다(그림 4A, C). 대조적으로, 부분 AUC는 기저 활성이 높은 경우에도 모든 세포에서 아드레날린에 의해 도입된 변화에 민감하다(도4B,D).

Figure 1
도 1: 섬내의 재조합 센서의 트랩가능 염료 및 발현의 하중. 전형적인 마우스 섬은 트랩가능한 염료 플루오-4(A)로 적재하거나 재조합 센서GCaMP6를 세포의 주변층(B)에서 또는 더 깊은층(C)에서 발현한다. 폴라 트레이서 설포호다민 B(SRB, 흰색으로 나타짐)는 각 아일렛25내에서 개별 세포를 윤곽을 그리는 데 활용되고 있다. (D)Fluo4를 사용하여 췌도 내의 개별 세포로부터 기록된 포도당에 반응하여Ca2+의 대표적인 역학. 작은 세포 집단 내의 이질성을 주의하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
도 2: 다양한 자극에 대한 아일렛 세포의 전형적인Ca2+ 반응. 전형적인 α 세포(A)및 δ 세포(B)Ca2+ 역학, 아드레날린, 글루타민산염, 그렐린, 포도당에 반응한다. (C)-(D) 아일렛 세포 반응의 열 맵은 아드레날린양성(C)및 그렐린양성(D) 하위 모집단을 나타냈다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 기준선 보정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: 시간 경과 데이터 분석. α 세포에서Ca2+ 역학 분석. 부분 주파수(A),고원 분획(B)및 α 세포의 곡선 아래 영역(C)[Ca2+]i trace. 인구[Ca2+]i 데이터는 마우스 췌도로부터 원시(F/F 0)(D) (D),부분 주파수(E), 고원 분획(F) 및 곡선 아래의영역(G)으로 표현된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

프로토콜에는 전반적인 성공에 중요한 세 단계가 있습니다. 담관에 Liberase 효소를 성공적으로 주입하면 격리 절차의 양적 성공뿐만 아니라 고립 된 섬의 품질에도 영향을 미칩니다. 팽창되지 않은 췌장은 고립 된 섬에 있는 몇몇 중요한 신진 대사 반응의 부족 귀착될 수 있습니다. 둘째, 센서의 염료/표현의 로딩은 타임랩스 기록의 신호 대 잡음 비율을 정의합니다. 과부하된 섬에 신호가 없거나 감쇠됩니다. 마지막으로, 이미징 챔버 내부의 조직의 성공적이고 조밀한 위치는 의미 있고 분석 가능한 실험을 위한 결정적인 순간입니다. 제대로 배치되거나 조직을 이동하면 실험 시간 및/또는 불분명한 데이터가 낭비됩니다.

이 방법은 여러 신호(공초점 시스템 사용) 및 여러 아일렛 그룹(예를 들어, 다른 유전자형)을 고려하여 수정할 수 있습니다. 다중 신호의 이미징은 제2 센서를 본도의 각 셀내로 전달하는 것으로 가정하며,Ca2+ 리포터와 관발적으로 호환됩니다(예: pH 센서 SNARF5f26,27). 이를 위해, 섬은 Ca2+ 및 pH 센서에 공동 으로 감염될 수 있으며, 이 센서는 각 시간 프레임 내에서 순차적으로 이미지화됩니다.

단일 셀 해상도를 가진 작은 섬의 그룹에서 신호를 이미징하는 것은 넓은 시야 목표를 사용해야합니다. 이 목적은 배율과 수치 조리개(NA)가 낮아공간 해상도를 감소시킬 수 있습니다. 저NA 목표의 초점 심도가 증가하기 때문에 광시야 시스템에서 이미징을 수행할 수 있습니다. 이러한 배열의 단점은 광 신호의 세포-세포 교차 오염 및 3D 신호(예를 들어, 인슐린 프로모터 하에서Ca2+ 센서를 발현하는 마우스)를 이미지화하는 능력 감소이다. 동시에, 표면 섬 세포로부터 발현된 신호는 수십 에서 수백 개의섬(18)을포함하는 그룹에서 높은 시간적 분해능으로 완벽하게 해결될 수 있다.

불쾌하게 들릴 지 모르지만 별도의 소프트웨어 패키지에서 이미지 분석 및 수치 데이터 분석을 수행하는 것이 좋습니다. 현재 ImageJ/FIJI는 과학적 이미지 분석을 지배합니다. 과학 적인 코딩에 대 한 가장 인기 있는 환경은 파이썬과 Matlab, 아직 또한 R28에서Ca2+ 데이터를 분석 하는 알려진된 노력. 최고의 유용성은 IgorPro와 같은 더 많은 틈새 패키지에 의해 제공됩니다. 우리의 선택은 Matlab / Python에서 프로토 타입을 한 다음 '파이프 라인'사용을 위해 IgorPro에서 코드를 구현하는 것입니다. 분석 적 요구에 대한 전기 생리학 (예를 들어, 클램프, 신경 탐색기)을 위한 신호 분석 패키지를 적응하는 것은 단세포 화상 진찰을 위해 유용할 수 있습니다 그러나 확장하기 어렵습니다. 이러한 패키지에서 제공하는 많은 옵션은 샘플링 속도가 낮기 때문에 아일렛 이미징에는 적용되지 않습니다.

이 방법론은 여러 가지 요인에 의해 제한된다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 첫째, 위에서 언급 한 바와 같이, 이미징은 주로 데이터를 샘플링에 기초, 그것은 표시하지 않으며, 따라서 셀의 전기 적 활동과 직접 비교 할 수 없음을 의미. 둘째, 데이터는 아일렛 주변에서 제공되며 일반적으로 3차원인 중요한 커플링 프로세스를 반영하지 않습니다. 셋째, 로딩/표현 수준은 센서 강도의 지각에 영향을 미칩니다. 마지막으로, 마커 화합물에 의한 덜 잘 연구된 아일렛 세포 하위 집단(예를 들어, PP 세포 및 θ-세포)의 활성화는 배제될 수 없지만, 비록 아일렛 내의 이들 세포의 수가 적기 때문에 잠재적인 오염은 최소화될 것이다.

이 방법은 진동 과정이 진정으로 살아있는 조직의 강한 인상을 전달하기 때문에 시각 효과 측면에서 진정한 '챔피언'입니다. 작은 세포 하위 집단에 적용된 이 방법은 각 세포의 기능을 안정적으로 프로브하여 하위 그룹을 식별하고 이질성을 반영합니다.

칼슘 역학은 40 년 이상 췌도 β 세포에서 연구되어 왔으며, 주로 획득 / 검출 기술의 진보에 의해 구동되었습니다. 초기 연구는 원자흡수분광법29를사용했지만,형광Ca2+ 센서30이 도착하기 전까지는 광도세포에서 상세한 역학을 해결할 수 있었고, 광도31,32,33을사용했다. 그 직후, Ca2+ 역학의 공간 구성 요소는 Ca2+ 이미징34,35,36이 그 때 새로 사용할 수있는 충전 결합 장치 (CCD) 검출기 덕분에 일상적인 기술이되었습니다. 조직 내의 개별 적인 세포에서 신호를 화상 진찰을 방해한 초점 부족 빛의 문제는, 그 때 레이저 스캐닝 공초점 현미경 검사법 (LSCM)37 및 총 내부 반사 형광 현미경 검사법 (TIRFM)38를통해 1990 년대 중반에 해결되었습니다. 두 방법, 형광Ca2+ 센서의 도착에 의해 보완 488 nm 레이저 흥분, 성공적으로 이미지Ca2+ 섬 세포 하위 인구에서 역학39,40,41.

새로운 세기는 신경 과학 관련 기술 발달에서 유래한 2개의 새로운 동향을 앞으로 가져왔습니다. 첫째, GFP 변이체의 원형 순열에 기초한 재조합 형광 센서는 Ca2+ 검출을 위한 신호 대 잡음 비를 실질적으로 증가시켜 모든 세포에서 [Ca2+]cyt의 역학을 해결할 수 있는 대규모 세포 집단 수준으로 연구를 효과적으로 가져왔습니다. 둘째, 조직 특이적 프로모터의 사용은 사소한 소집단에 대한 표적화 센서 발현을 허용했다.

비록 일반적으로 신경 과학의 발전을 반영 하는 생각, 아일렛 Ca에 대 한 연구2+ 역학두 가지 주요 차이점. 첫째, 기술적으로, 췌도 신호의 생체 내 이미징은 췌장 및 췌도의위치(42)의예측할 수 없는 해부학으로 인해 뇌의 이미징보다 더 복잡하다. 둘째, 섬 β 세포 사이의 우수한 전기 커플링은 본질적으로 높은 포도당 자극에 대한 겉보기에 완벽한 전부 또는 전혀 반응을 나타내는 전기불활성 집단으로 섬을 렌더링합니다. We believe that studies of [Ca2+]i kinetics in minor islet subpopulations, such as δ-cells, based on tissue-specific targeting are likely to broaden our knowledge of their pharmacology/physiology. 동시에, 매우 민감한 프로브는 이러한 측정의 통계적 힘을 확장하고, 섬-섬간 가변성을 회계하고, 하나의 병렬 실험 내에서 다른 그룹에서 작은 섬을 이미징할 수 있게 합니다.

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Disclosures

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

AH는 당뇨병 영국 박사 과정 학생의 수혜자, EV는 OXION-웰컴 신뢰 교육 프로그램에 의해 지원되었다, AIT는 옥스포드 생물 의학 연구 위원회 박사 후 펠로우십을 개최.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
40x/1.3 objective
Axiovert 200 microscope
emission
Excitation
Fetal bovine serum Sigma-Aldrich F7524-500ML
Fluo4 Thermo Fisher (Life Technologies) F14201
GCaMP6f, in (human type 5) adenoviral vector Vector Biolabs 1910
Hanks' solution Thermo Fisher (GibCo, Life Technologies)
Liberase Sigma-Aldrich 5401020001
penicillin/streptomycin Thermo Fisher (GibCo, Life Technologies) 15140122
RPMI medium Thermo Fisher (GibCo, Life Technologies) 61870044
Zeiss LSM510-META confocal system Carl Zeiss

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References

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생물학 문제 153 칼슘 역학 타임 랩스 이미징 랑거한스 섬 α 세포 레이저 스캐닝 공초점 현미경 타임 시리즈 신호 처리
마우스 췌도 세포의 하위 집단에 있는 화상 진찰 칼슘 역학
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Hamilton, A., Vergari, E., Miranda, C., Tarasov, A. I. Imaging Calcium Dynamics in Subpopulations of Mouse Pancreatic Islet Cells. J. Vis. Exp. (153), e59491, doi:10.3791/59491 (2019).

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